DD142973B1 - Enzymelektrode zur atp-bestimmung - Google Patents
Enzymelektrode zur atp-bestimmung Download PDFInfo
- Publication number
- DD142973B1 DD142973B1 DD21246579A DD21246579A DD142973B1 DD 142973 B1 DD142973 B1 DD 142973B1 DD 21246579 A DD21246579 A DD 21246579A DD 21246579 A DD21246579 A DD 21246579A DD 142973 B1 DD142973 B1 DD 142973B1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- atp
- electrode
- glucose
- enzyme
- enzyme electrode
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 12
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 11
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 11
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 10
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710163410 Probable glycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 description 1
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von ATP, Die Enzymelektrode ist besonders für den Einsatz im klinischen Labor, in der Arzneimittelforschung sowie der Mikrobiologie geeignet, wo auf der Basis der ATP-Messung die enzymatisch^ Aktivität von Kinasen sowie die Konzentration derer Substrate (z.B# Glyzerol, Kreatinin), die Aktivität von ATP-asen sowie deren Hemmstoffen (herzwirksame Medikamente) und die Keimzahl in physiologischen und Fermentationslösungen bestimmt werden kann·
Eine bekannte Methode zur ATP-Bestimmung beruht auf der ATP-abhängigen Lumineszenz von Luciferin in Gegenwart von Luciferase.· Der Nachteil dieser Methodik liegt in dem großen apparativen Aufwand (Flurometer) sowie dem hohen Preis von Luciferin und Luciferase.
Eine andere Methode koppelt die Reaktionen von Hexokinase und Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, wobei das in der
ersten Reaktion entstehende G-6-P unter Bildung von WADPH oxidiert wird. Die Messung der ATP-Konzentration erfolgt über die spektralphotometrisch gemessene NADPH-Menge. Der Nachteil dieser Methode liegt in der Notwendigkeit eines Spektralphotometers sowie des Verbrauchs von KADP. in jeder Messung (Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, G. Guilbault, M. Dekker Inc., New York 1976).
Das Ziel der Erfindung ist es, durch die Kombination billiger Enzyme die ATP-Konzentration mittels Enzymelektrode ohne Kofaktorverbrauch in physiologischen und mikrobiologischen Lösungen zu bestimmen»
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Kombination der Enzyme Glukoseoxidase (GOD) und Hexokinase (HK) ein Signal zu erhalten, das von der ATP-Konzentration abhängt. Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst, daß die beiden Enzyme gemeinsam in einer Schicht vor einer üblichen Sauerstoffelektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt ist. Ід Abwesenheit von ATP tritt durch die Glukoseoxidation ein Op-Verbrauch auf, der der zugesetzten Glukosemenge proportional ist (Prinzip der Glukoseelektrode (F. Scheller et al., Z.med.Lab.Diagn. 18, 312(1977)). Bei Zugabe von ATP zu dieser Lösung wird ein Teil der Glukose durch die HK vor der Elektrode zu G-6-P umgesetzt, so daß eine Verkleinerung des Signals für Glukose auftritt, die von der ATP-Menge abhängt.
GOD Glukose + Oo Glukonsäure + HpO2
HK Glukose + ATP G-6-P + ADP
Die erfindungsgemäße Enzymelektrode arbeitet also ohne die Verwendung eines Kofaktors. Sie erlaubt sowohl die kontinuierliche als auch die punktweise Bestimmung der ATP-Konzentration mit einfachen Geräten (pO2-Me-ter) und ersetzt
teure Enzyme durch GOD*
Zur Bestimmung von Substraten von Kinasen ist es zweckmäßig, daß die Enzymschicht zur Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich mit Glyzerol- oder Keratininkinase versehen ist·
Die Erfindung 'soll nachstehend an 3 Ausführungsbeispielen erläutert v/erden.
Л ·—^is PjL el
2000 U GOD und 300 U HK werden in 0,3 ml Lösung von 5 mg
Acrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von 8 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und phot©polymerisiert· Ein 3x3 mm großes Filmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelbar vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert, über di-e Enzymschicht wird ein Dialyseschlauch mit einem O-Ring über den Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6 mit 10 mM MgCIg und ist an ein pOg-Meter mit Schreiber angeschlossen.
Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hat}wird eine Menge an Glukose zugegeben, sodaß die Konzentration in der Meßlösung 0,5 mM beträgt. ITach 2 Minuten ist der stationäre Stromwert erreicht und es erfolgt 8-mal die Zugabe von jeweils 0,25 mM ATP (Aufnahme der Eichkurve)· Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung des Glukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach ATP-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt. Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete· Zur Messung der АТР-азе-Aktivität wird eine Lösung, die 0,5 mM Glukose und 2mM ATP enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitzt, wird die ATP-ase-Probe zugegeben. Durch die Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die ATP-Konzentration verkleinert wird. Aus der Eichkurve kann damit die ATP-ase-Aktivi· tat errechnet werden.
Der Zusatz von ATPase-Hemrnern, z.B. Ouabain, ruft eine Verkleinerung des Anstiegs hervor. Durch Variation der Inhibitor-
konzentration wird die notwendige Konzentration zur 50%igen Hemmung der ATP-ase ermittelt. Diese Größe ist ein Maß der Herzwirksamkeit von Medikamenten
Eine photopolymerisierte Enzymschicht, die nur GOD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die Og-Elektrode aufgebracht, Anschliessend wird eine zweite Polyacrylamidschicht von 100/U Dicke, die 30 U HK und 20 U Glyzerokinase je cm enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyseschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenmantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die 0,5 шМ Glukose, 1 mM ATP und 1 mM MgCl2 in 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 enthält. Nachdem sich der Strom stabilisiert hat werden 100/Ul der Glyzerol-haltigen Meßprobe zugegeben· In der Enzymreaktion wird ei.ne zur Ausgangskonzentration an Glyzerol proportionale ATP-Menge verbraucht, die aus der Änderung des Stromes über die Eichkurve bestimmt wird. Die Messung dauert 2 Minuten.
Über"den Elektrodenmantel wird ein Dialyseschlauch gespannt, auf dem eine Enzymschicht mit GOD und HK (wi« in Beispiel 1) mit einem zweiten Dialyseschlauch fixiert wird. Die Pt-Elektrode wird auf +-600 mV gegenüber der Bezugselektrode polarisiert, sodaß die HgOg-Oxidation erfaßt wird. Die Elektrode· ist an einen Analogdifferenzierer angeschlossen, der den maximalen Anstieg der Strom-Zeit-Kurve anzeigt« Der Grundstrom stellt sich in 2 ml einer Pufferlösung von pH mit 0,.5 mM Glukose, 1 mM MgGl2 ein· Danach erfolgt die Zugabe von 50/Ul des Filtrates, der mit Trichloressigsäure behandelten Fermentationslösung. Die Geschwindigkeit des Stromabfalls ist der ATP-Konzentration proportional, sodaß die Keimzahl über die ermittelte ATP-Konzentration erhalten wird. Bei glukosehaltigen Meßproben wird vor der ATP-Messung mit einer nur GOD-enthaltenden Enzymelektrode.die Glukosekonzentration ermittelt und bei der Auswertung berücksichtigt·
Claims (1)
- -S-Erfindungsanspruch1. Enzymelektrode zur Bestimmung von ATP in einer eine definierte Glukosemenge enthaltenden Meßlösung mittels einer О«- oder ELOp-anzeigenden Elektrode, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit einer Enzymschicht versehen ist, in der Glukoseoxidase und Hexokinase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und durch einen Dialyseschlauch abgedeckt sind.Enzymelektrode nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht zur Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich Glyzerol- oder Kreatininkinase enthält.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21246579A DD142973B1 (de) | 1979-04-25 | 1979-04-25 | Enzymelektrode zur atp-bestimmung |
| DE19803010119 DE3010119A1 (de) | 1979-04-25 | 1980-03-15 | Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren |
| FR8007590A FR2455279A1 (fr) | 1979-04-25 | 1980-04-03 | Electrode a base d'enzymes pour la determination de cofacteurs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21246579A DD142973B1 (de) | 1979-04-25 | 1979-04-25 | Enzymelektrode zur atp-bestimmung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD142973A1 DD142973A1 (de) | 1980-07-23 |
| DD142973B1 true DD142973B1 (de) | 1982-06-30 |
Family
ID=5517822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD21246579A DD142973B1 (de) | 1979-04-25 | 1979-04-25 | Enzymelektrode zur atp-bestimmung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD142973B1 (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62232555A (ja) * | 1986-04-02 | 1987-10-13 | Unitika Ltd | 酵素センサ |
| AT398003B (de) * | 1991-05-10 | 1994-08-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Vorrichtung zur bestimmung des materieflusses |
-
1979
- 1979-04-25 DD DD21246579A patent/DD142973B1/de unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD142973A1 (de) | 1980-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69615909T2 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Verringerung asymetrischer Fehler in amperometrischen Sensoren | |
| DE69822949T2 (de) | Verfahren zur quantitativen Messung eines Substrats | |
| DE3855714T2 (de) | Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten | |
| DE60317422T2 (de) | Mediator-stabilisierende Verbindung und Methoden zur Verwendung zur Detektion elektrochemischer Analyte | |
| DE69714322T2 (de) | Cholesterinsensor | |
| DE2940165B1 (de) | Glucoseindikator und Testvorrichtung mit dem Glucoseindikator | |
| DE2954385C2 (de) | ||
| EP1259800B1 (de) | Enzymatisch-elektrochemische messeinrichtung | |
| DE102006043718B4 (de) | Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen | |
| DE2818603A1 (de) | Kinetisches glucosereagens und dessen verwendung in einem kinetischen nachweisverfahren | |
| DE2415997A1 (de) | Biochemisches temperaturempfindliches fuehlergeraet und verfahren zur messung von reaktionsmittelkonzentrationen damit | |
| DE69129375T2 (de) | Hochpräzisionsbestimmung von glucose-6-phosphat und dafür geeignete zusammensetzung | |
| DD142973B1 (de) | Enzymelektrode zur atp-bestimmung | |
| DE3010119A1 (de) | Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren | |
| DE3905784A1 (de) | Verfahren zum messen der natriumkonzentration eines biologischen fluessigen mediums | |
| DE3614470A1 (de) | Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten | |
| DD241919A5 (de) | Verfahren zur bestimmung von creatinin | |
| DD143180A1 (de) | Enzymelektrode zur nad(p)-bestimmung | |
| DE10212570B4 (de) | Amperometrischer Dickschicht-Biosensor zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration in einer Lösung und Verfahren zur Herstellung des Sensors | |
| DE4118880C2 (de) | Verfahren zur selektiven Bestimmung der Konzentration gelöster Substanzen in enzymatischen Reaktionen | |
| DE60223295T2 (de) | Lactat-biosensor-streifen | |
| DE102017208461A1 (de) | Multianalytmessung | |
| DD291846A5 (de) | Verfahren zur empfindlichen bestimmung von substanzen mit einem biosensor | |
| DE3301655A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von ungesaettigten fettsaeuren | |
| DD224053A1 (de) | Biosensor und verfahren zur bestimmung von phosphaten und fluoriden |