DD143179A1 - METHOD FOR THE ELECTRONIC THROMBOZYTE PAYMENT - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektronischen Zaehlung von Thrombozyten aus verduennten Venenblut, Kapillarblut oder plaettchenreichem Plasma, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und die nur mit einem unteren verstellbaren Diskriminator (Schwellenwert) ausgeruestet sind. Dabei kommt eine Methode zur Anwendung, nach der die Thrombozytenzahl aus der Zahl aller Vorhandenen Blutzellen minus der bei anderer Diskriminatorstellung gesondert ermittelten Zahl der Blutzellen, die groesser als Thrombozyten sind, erhalten wird (Differenzmethode). Diese Zaehlweise wird mit Verfahren zur schnellen Probenvorbereitung, wie Schraegsedimentation oder Zentrifugation kombiniert. Dabei kann diese Probenvorbereitung schon nach kurzer Frist in unvollkommenem Zustand abgebrochen werden, ohne dass eine Qualitaetseinbusse bei den Messergebnissen auftritt. Das Verfahren ist am ungarischen Teilchenzaehlgeraet PS-4 erprobt und durch umfassende Vergleiche mit der traditionellen Kammerzaehlung abgesichert.The invention relates to a method for the electronic counting of platelets from diseased venous blood, capillary blood or plasma rich in plaques, which work according to the Coulter principle and which are equipped only with a lower adjustable discriminator (threshold value). In this case, a method is used according to which the platelet count is obtained from the number of all existing blood cells minus the number of blood cells which are separately determined in another discriminator position and which are larger than platelets (difference method). This method of counting is combined with methods for rapid sample preparation, such as screw sedimentation or centrifugation. This sample preparation can be stopped after a short period of time in imperfect condition, without a loss of quality in the measurement results occurs. The method is tested on the Hungarian particle counter PS-4 and secured by extensive comparisons with the traditional Kammerzähler.
Description
4- 212901 4- 212901
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Titel der ErfindungTitle of the invention
Verfahren zur elektronischen ThrombozytenzählungMethod for electronic platelet counting
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zählung von Thrombozyten aus Venenblut, Kapillarblut oder plättchenreichem Plasma unter Anwendung von elektronischen Zähl™ geräten, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und nur mit einem unteren, verstellbaren Diskriminator ausgerüstet sind«The invention relates to a method for counting thrombocytes from venous blood, capillary blood or platelet-rich plasma using electronic counting devices which work according to the Coulter principle and are equipped only with a lower, adjustable discriminator.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Verfahren zur elektronischen Zählung von Thrombozyten* mit nach dem Coulter-Prinzip arbeitenden Geräten sind schon seit einiger Zeit bekannt (B.S. BULL et al , Amer.J.ClinoPathol. 44(1965), 6?8~685 ; J.JÜRGENS, ÄrztlcLab. 14 (1968), 34-7-35'4)« Dabei sind diese Verfahren je nach Art der angewandten Probenvorbereitung und der von der technischen Ausführung der benutzten Zählgeräte abhängigen Zählweise verschieden· Von BULL und JURGEI]S wurden Zählverfahren entwickelt, die auf Geräten mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator Thrombozytenzählungen ermöglichen. Beide Verfahren arbeiten mit der Sedimentation als Probenvorbereitung.» Nach BULL wird die Schrägsedimentation von Vollblut durchgeführt«Methods for electronically counting platelets * using Coulter-type devices have been known for some time (BS BULL et al., Amer.J.ClinoPathol., 44 (1965), 6-8685, J. JÜRGENS, ÄrztlcLab. 14 (1968), 34-7-35'4) "These methods are different depending on the type of sample preparation used and the method of counting depending on the technical design of the counting devices used. BULL and JURGEI] S have developed counting methods that are used on devices allow platelet counts with just one lower, adjustable discriminator. Both methods work with sedimentation as sample preparation. "According to BULL, diagonal sedimentation of whole blood is carried out«
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Dabei ist jedoch eine Umrechnung der Zählergebnisse mit einem hämatokritabhängigen Korrekturfaktor notwendig. Bei zu hohem oder zu niedrigem Hämatokrit.läßt sich diese Korrektur nicht durchführen (U,HOEFi1LER u. K.OETTE; . z. Klin. Chem. Klin. Biochemie 12(1974) 198-206.However, a conversion of the counting results with a hematocrit-dependent correction factor is necessary. This correction can not be carried out if the hematocrit is too high or too low (U, HOEFi 1 LER and K. OETTE, eg Klin. Chem. Klin. Biochemie 12 (1974) 198-206.
Ebenfalls nach HOEFFLER und OETTE ergibt sich ein relativ hoher Prozentsatz von Untersuchungsgutproben, bei denen aufgrund schlechter Sedimentationseigenschaften das Verfahren nicht angewandt werden kann· Das Verfahren nach JÜRGENS bereitet die Proben mit Hilfe der Spontansedimentation in verdünntem Zitratblut vor. Die Sedimentationszeit beträgt bei 50C drei. Stunden, was zu unvertretbar langen Bearbeitungszeiten, sowohl für die EinzelbeStimmung, als auch für die Serie führt«According to HOEFFLER and OETTE, too, a relatively high percentage of specimens are obtained which can not be used due to poor sedimentation properties · The JURGENS procedure prepares the specimens by means of spontaneous sedimentation in diluted citrated blood. The sedimentation time is at 5 0 C three. Hours, which leads to unacceptably long processing times, both for individual appointments and for the series. «
Die Zählung selbst wird nach der Differenzmethode durchgeführt. Zunächst ermittelt man bei geeigneter Diskriminatorstellung die Zahl aller in der Probe vorhandenen Blutzellen. Im zweiten Zählschritt wird bei veränderter Diskriminatorstellung die Zahl aller Zellen bestimmt, die größer als Thrombozyten sind (Erythrozyten, Leukozyten). Die Thrombozytenzahl resultiert aus der Differenz beider Zählungen.The count itself is performed according to the difference method. First, if the discriminator is suitable, the number of blood cells present in the sample is determined. In the second counting step, the number of all cells larger than platelets (erythrocytes, leucocytes) is determined when the discriminator position is changed. The platelet count results from the difference between the two counts.
Nach BULL sind wegen schwieriger Diskriminatorinstellung stets zwei Geräte für diese Zählweise notwendig. Die auch nach JÜRGENS laufend notwendige Neu eins teilung des Diskriminators ist ebenfalls schwierig. Die Umgehung dieses Problems durch geräteinterne Parallelzählung bringt jedoch erhebliche Qualitätsverluste bei den erhaltenen Ergebnissen, Sowohl nach BULL als auch nach JÜRGENS liegen die ermittelten Zählergebnisse signifikant über den Y/erten, die mit der bisher klinisch bewährten Kammerzählung (H.STOBBE, Z.med.Labortechnik 1(1960),79)^Qs£imi&'& werden.After BULL are due to difficult discriminator always two devices for this method of counting necessary. The reclassification of the discriminator, which is also necessary according to JÜRGENS, is also difficult. However, the circumvention of this problem by device-internal parallel counting results in considerable quality losses in the results obtained. Both after BULL and after JÜRGENS the determined counting results are significantly above the values determined with the hitherto clinically proven chamber counting (H.STOBBE, Z. med. Labortechnik 1 (1960), 79) ^ Q s £ i mi &'&.
Mit der technischen Vervollkommnung der elektronisch arbeitenden Zählgeräte werden Verfahren in den Vordergrund gerückt, welche die Anwendung einer unteren und einer oberen Diskriminatorschwelle voraussetzen und damit die Möglichkeit bieten, die Thrombozyten in nur einem Zählschritt zu erfassen (W.ADAH u. Mitarb0J Blut 32 (1976), 347; .E.BAUMGlRTMR u. C.MAURER, Ärztl. Lab. 24 (1978), 186-190; B.S.BULL et al, Amer.J.Klin. Pathol, 44 (1965), 678-685; K.EISBKBERG, Ärztl. Lab, 22 (1976), 263-266; M, de BRUIERE et al, Thrombos» Diathes0 haemorrh.(Stuttg9)" 32, 232 (1974); K.GADNER u. Mitarb«,, Schweiz.med.Wschr.104, 138-140 (1974); U.HOEEFLER u. K. OETOJB, Z. Klin. Chem. Elin. Biochem. 12 (1974) 198-206; R0KITSE u. Mitarb», Blut 35 (1977), 253-259; R. van BUUL ue Α*ΟβΜβ von OUDIiEUSEN, Ärztl. Lab. 21 ' (1975)» 418-428)ο Die dabei auftretenden Eehlermöglichkeiten verlangen eine hohe gerätetechnische Perfektion (DT-AS 1598292 W.ADiM u» Mitarb.Λ Blut 32 (1976)s 347; R.IÜJSE u, Mitarb·, Blut 35 (1977), 235-259)With the technical perfection of the electronically operating counting devices method are brought to the foreground, which require the application of a lower and an upper discriminator and thus offer the possibility to detect platelets in only one counting step (W.ADAH u. Al 0J Blood 32 ( 1976), 347; -E.BAUMGlRTMR and C.MAURER, Medical Lab 24 (1978), 186-190; BSBULL et al, Amer.J.Klin.Pathol, 44 (1965), 678-685; K .EISBKBERG, Ärztl. Lab, 22 (1976), 263-266; M, de BRUIERE et al, Thrombos "Diathes 0 haemorrh. (Stuttgart 9 )" 32, 232 (1974); K. GADNER et al. U.K. WE.E.W., 104, 138-140 (1974); U. H OEEFLER and K. OETOJB, Z. Klin Chem Chem., Biochem., 12 (1974) 198-206, R 0 KITSE et al. Blut 35 (1977), 253-259; R. van BUUL u e Α * Ο β Μ β by OUDIiEUSEN, Ärztl. Lab. 21 '(1975) »418-428) ο The error possibilities that occur in this case require a high level of equipment perfection ( DT-AS 1598292 W.ADiM u »co-workers Λ blood 32 (1976) s 347; R. JÜSE u, Mitarb., Blood 35 (1977), 235-259)
Als Probenvorbereitung findet oft die schnell durchführbare Zentrifugation Anwendung (M. de0 BRUYERE et al, Thromboso Diathes» haeraorrh. (Stuttg.) 32, 232 (1974); H.GADlIER u. Mitarb,, Schweiz,med. Wsehr. 104, 138-140 (1974); R.KIJSE U0 Mitarb., Blut 35 (1977)? 253-259). Auch ist ein Verfahren bekannt, nach welchem man direkt aus Vollblut mit Hilfe einer automatisierten Verhältnismethode Thrombozyten zählen kann (DT-AS 2 812^517)ο Hierbei muß jedoch eine vorhergehende Bestimmung der Erythrozytenzahl der jeweiligen Blutprobe erfolgen? was den durch Umgehung der Probenvorbereitung erhaltenen Zeitgewinn beträchtlich schmälert«, Jedoch werden die Vorteile aller genannten Verfahren durch die hohe Empfindlichkeit der benutzten Geräte, den damit verbundenen großen Wartungsauf wand und den sehr hohen Anschaffungspreis aufgewogen.Rapid preparation for centrifugation is often used as sample preparation (M. de 0 BRUYERE et al., Thromboso Diathes Haeraorrh. (Stuttg.) 32, 232 (1974); H. GADLEIER et al., Switzerland, med. Wsehr. 138-140 (1974); R. KIJSE U 0 col., Blood 35 (1977), 253-259). Also, a method is known, according to which one can count directly from whole blood using an automated ratio method platelets (DT-AS 2 812 ^ 517) ο However, a previous determination of the erythrocyte count of the respective blood sample must be done? However, the advantages of all these methods by the high sensitivity of the equipment used, the associated large maintenance costs and the very high purchase price are outweighed.
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So kommt es, daß sich die sehr objektiv und mit ausgezeichneter Präzision arbeitenden elektronische Thrombozytenzählung bisher in der Praxis wenig hat durchsetzen können«So it happens that the very objective and with excellent precision working electronic platelet count has been able to prevail so far in practice little
Die ungarischen Medicor-Werke entwickelten mit dem elektronischen Teilchenzähler Picoscale (PS-4) ein Gerät, das in eigener technisch einfacher und leicht zu wartender Ausführung wieder das Zählprinzip mit nur einer unteren Diskriminatorschwelle zur Anwendung bringt (DL-PS 65681)o Allerdings geht das vom Hersteller in der Bedienungsanleitung (Medicor-Werke Budapest, Bedienungsanleitung zum Teilchenzählgerät PS-4, 1976) verfaßte Zählverfahren von der falschen Voraussetzung einer möglichen, vollkommenen Spontansedimentation von Erythrozyten : und Leukozyten bei gleichzeitigem Erhalt der ursprünglichen Thrombozytendichte aus. Es liefert so keine akzeptablen, mit der Kammerzählung (H.STOBBE, Z.med.Labortechnik 1 (1960), 79) vergleichbaren Werte· Zudem ist eine Probenvorbereitungszeit von über zwei Stunden im Routinebetrieb eines Labors nicht vertretbar.The Hungarian Medicor-Werke developed with the electronic particle counter Picoscale (PS-4) a device that brings in its own technically simple and easy to maintain execution again the counting principle with only a lower discriminator threshold (DL-PS 65681) o However, that works Counting method written by the manufacturer in the instruction manual (Medicor-Werke Budapest, PS-4 Particle Counting Manual, 1976) was based on the false assumption of possible complete spontaneous sedimentation of erythrocytes : and leucocytes, while preserving the original platelet density. Thus, it provides no acceptable, with the chamber count (H. STOBBE, Z.med.Labortechnik 1 (1960), 79) comparable values · In addition, a sample preparation time of more than two hours in routine operation of a laboratory is not acceptable.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe, bei leicht durchführbarer, zeitsparender Probenvorbereitung, an Geräten, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und nur einen unteren verstellbaren Diskriminator besitzen, Thrombozytenzahlen in einfacher Zählweise bestimmt werden können. Dabei muß eine gute Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse mit denen der bisher üblichen Kammerzählung gewährleistet sein. Das entwickelte Verfahren muß mit einer wesentlich besseren Präzision arbeiten als die manuell.-optische Zählmethode·The aim of the invention is to develop a method by means of which, with easy-to-carry out, time-saving sample preparation, to devices which work according to the Coulter principle and have only a lower adjustable discriminator, platelet counts can be determined in simple counting. In this case, a good comparability of the results obtained must be ensured with those of the usual chamber count. The developed method must operate with a much better precision than the manual optical counting method.
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Außerdem soll der Zeitaufwand für das entwickelte Verfahren möglichst dem anderer moderner "elektronischer Zählverfahren entsprechen und damit "bedeutend unter dem Zeitbedarf des traditionellen KammerZählverfahrens liegen.In addition, the time required for the developed method should as far as possible correspond to that of other modern "electronic counting methods and thus" be significantly less than the time required by the traditional chamber counting method.
· Darlegung des Wesens der Erfindung· Presentation of the essence of the invention
Das Wesen der Erfindung besteht in der Entwicklung einer günstigen Kombination von schneller, unkomplizierter Probenvorbereitung mit einer, dem angewandten Zählgerät angepaßten Durchführung der Differenzmethode, die zur Be-Stimmung von Thrombozytenzahlen mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator unumgänglich ist. Erfindungsgemäße Voraussetzung ist es, daß eine vollständige Abtrennung der Erythrozyten und Leukozyten von den zu bestimmenden Thrombozyten ohne hohen technischen und methodischen Aufwand nicht nur nicht möglich, sondern auch in weitem'Maße nicht notwendig ist.The essence of the invention consists in the development of a favorable combination of fast, uncomplicated sample preparation with a, the counter used adapted implementation of the difference method, which is necessary for Be mood of platelet counts with only a lower, adjustable discriminator. A prerequisite according to the invention is that complete separation of the erythrocytes and leucocytes from the platelets to be determined is not only not possible without high technical and methodological effort, but is also not necessary by far.
Die zur Anwendung gelangende Probenvorbereitungsart kann, sowohl als Sedimentation oder als Zentrifugation ausgeführt, in einem sehr unvollkommenden Zustand abgebrochen werden« Dadurch wird bei der Sedimentation eine große Zeitersparnis erzielt, bei der Zentrifugation die ausschließliche Anwendung spezieller, aufwendiger Technik umgangen«. Der Zeitpunkt, an dem der Abbruch der Probenvorbereitung gerade schon möglich ist, hängt ab von der Empfindlichkeit' des angewandten Zählgerätes, mit der es in der Lage ist, eine kleine Anzahl von Thrombozyten in einer ebenso großen oder größeren Anzahl von größeren.Zellen (z„B. Erythrozyten) quantitativ exakt mit zu erfassen© Es ergeben sich bei der in verdünntem Untersuchungsgut; ausgeführten Probenvorbereitung erfahrungsgemäß keine untersuchungsgutbedingten Ausnahmen, bei denen eine Zählung der Thrombozyten. unmöglich is Weiterhin ist das Verfahren erfindungsgemäß durch eine geeig große Verdünnung und durch unvollkommen ausgeführte Sediment tion oder Zentrifugation unabhängig von hämatokrit-spezifischen Korrekturfaktoren»The sample preparation method used, either as sedimentation or as centrifugation, can be broken off in a very imperfect state. "This saves a great deal of time in sedimentation, in which centrifugation circumvents the exclusive use of special, complex technology." The point in time at which the abort of sample preparation is just possible depends on the sensitivity of the counter used, with which it is capable of measuring a small number of platelets in an equally large or larger number of larger cells "B. erythrocytes" quantitatively exactly to be recorded with © in the case of diluted specimens; According to experience, no sample exemptions were carried out, in which a count of the platelets. Furthermore, according to the invention, the process is independent of hematocrit-specific correction factors by a suitably large dilution and by imperfect sedimentation or centrifugation »
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An den technisch relativ einfach aufgebauten Zählgeräten mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator, die "bisher vorrangig zur Zählung von Leukozyten und Erythrozyten eingesetzt sind, kann dann erfindungsgemäß aus dem nach obiger Beschreibung vorbereiteten, verdünnten Untersuchung-sgutproben die Thrombozytenzahl pro Volumeneinheit nach der Differenzmethode bestimmt werden, Voraussetzung ist dabei . die gerätetechnisch gegebene Möglichkeit, die Diskriminatorschwelle im ersten Zählschritt jeweils soweit abzusenken, daß auch die kleinsten Thrombozyten in entsprechend abgestimmten Meßöffnungen (Poren) erfaßt und vom Zählgerät registriert werden können, .According to the invention, the platelet count per unit volume can then be determined according to the difference method from the dilution test samples prepared according to the above description on the comparatively simple counting apparatuses with only one lower, adjustable discriminator which were previously used primarily for the counting of leucocytes and erythrocytes the prerequisite is the possibility given by the device to lower the discriminator threshold in the first counting step to the extent that even the smallest platelets can be detected in correspondingly matched measuring openings (pores) and registered by the counting device,.
Bs werden zunächst bei abgesenkter Diskriminatorschwelle alle in der Suspension enthaltenen Blutzellen gezählt. Im zweiten Zählschritt erfaßt man bei erhöhter Diskriminatorschwelle alle Blutzellen, außer den Thrombozyten«, Die Thrombozytenzahl ergibt sich dann aus der Differenz beider Zählwerte,, abzüglich eventuell zu bestimmender Leerwerte·Bs are initially counted with lowered discriminator threshold all blood cells contained in the suspension. In the second counting step, all blood cells except the platelets are detected at an increased discriminator threshold. The platelet count then results from the difference between the two counts, minus any blank values to be determined.
Ausführungsbeispielembodiment
Verfahren zur Thrombozytenzählung am ungarischen Teilchenzählgerät PS-4:Method for platelet counting on the Hungarian particle counter PS-4:
Probenvorbereitung:Sample preparation:
Zu 6,100 ml filtrierter HPJ-Lösung (MEDICQR-Werke Budapest, Bedienungsanleitung zum Teilchenzählgerät PS-4, 1976), die in einem silikonisiertem Glasröhrchen vorgelegt sind, werden 0,200 ml EDTA-Blut pipettiert«, Nach gründlicher Durchmischung des Inhalts wird das Röhrchen um 45° geneigt und offen zur Sedimentation abgestellt. Ist die Sedimentationszeit von einer halben Stunde abgelaufen, pipettiert man vom klaren Überstand in ein weiteres silikonisiertes Glasröhrchen oder Plastgefäß ab0 Hieraus werden zur. Messung am PS-4 0,050 ml entnommen, und in 9,950 ml mehrmals filtrierte HPJ-Lösung pipettiert (Endverdünnung 1:6 300)·To 6,100 ml of filtered HPJ solution (MEDICQR Works Budapest, Particle Counter PS-4, 1976), placed in a siliconized glass tube, 0.200 ml of EDTA blood are pipetted. After thoroughly mixing the contents, the tube is rotated 45 ° inclined and open to sedimentation parked. If the sedimentation time of half an hour has expired, pipette from the clear supernatant into another siliconized glass tube or plastic vessel from 0 . Measured on PS-4 0.050 ml, and pipetted into 9.950 ml multiply filtered HPJ solution (final dilution 1: 6 300).
2 1 290 1 -7 - ..2 1 290 1 -7 - ..
Messung:Measurement:
Alle Messungen für eine bestimmte Patientenprobe erfolgen aus ein und derselben Endverdünnung und werden mit einer. Meßöffnung (Meßrohr) vom Durchmesser 60 /um durchgeführt«, In der Erstverdünnung sind die Thrombozyten mindestens 8 h haltbar. Innerhalb dieser Frist muß die Messung erfolgenAll measurements for a particular patient sample are made from one and the same final dilution and are combined with one. Measuring orifice (measuring tube) of diameter 60 / um carried out, "In the first dilution platelets are stable for at least 8 h. Within this period, the measurement must be made
Meßvorgang Discriminators teilung Meßer genis Measuring process Discriminator ting
Beide Leerwertbestimmungen erfolgen bei EinzeXbeStimmungen generell; bei der Durchführung von Serien entscheidet die Qualität der filtrierten Verdünnungslösung über die not~ wendige Häufigkeit dieser Meßvorgänge. Zur Bestimmung der mittleren Gesamtteilchenzahl wird der 4. Meßvorgang solange wiederholt, bis zwei aufeinanderfolgende Werte nicht mehr.als 10 % des kleineren Wertes voneinander abweichen«, Diese beiden Werte werden dann zur Mittelwertbildung herangezogen*Both blank value determinations are carried out in individual cases; When performing series, the quality of the filtered dilution solution determines the frequency of these measurements. To determine the average total particle number, the 4th measurement is repeated until two consecutive values do not deviate more than 10 % of the smaller value «, These two values are then used for averaging *
Berechnung der Thrombozytenzahl:Calculation of the platelet count:
Die Zahl der Throinbozyten pro 1 Blut (X) wird nach folgender Formel berechnet: .The number of throinocytes per 1 blood (X) is calculated according to the following formula:.
X = WZ - (EZ - LWEZ) - LWG{DZ X = WZ - (EZ - LW EZ ) - LW G {DZ
Eine Berücksichtigung des Hämatokritwertes der Blutprobe ist bei der vorgegebenen Erstverdünnung von 1s31*5 und dem unvollkommenen Stand der Sedimentation zur Zeit der Überstandsentnahme nicht erforderlich.A consideration of the hematocrit value of the blood sample is not necessary at the given initial dilution of 1s31 * 5 and the imperfect level of sedimentation at the time of supernatant removal.
Claims (1)
Priority Applications (3)
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