DD143179A1

DD143179A1 - Verfahren zur elektronischen thrombozytenzaehlung

Info

Publication number: DD143179A1
Application number: DD21290179A
Authority: DD
Inventors: Georg Diederich; Charlotte Neunzling; Peter Grothkopf; Karen Rudolf; Heiko-Gundmar Lestin; Marita Scherdin; Sylvia Michaelis
Original assignee: Georg Diederich; Charlotte Neunzling; Peter Grothkopf; Karen Rudolf; Lestin Heiko Gundmar; Marita Scherdin; Sylvia Michaelis
Priority date: 1979-05-16
Filing date: 1979-05-16
Publication date: 1980-08-06
Also published as: DE3008118A1; HU182113B; DD143179B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektronischen Zaehlung von Thrombozyten aus verduennten Venenblut, Kapillarblut oder plaettchenreichem Plasma, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und die nur mit einem unteren verstellbaren Diskriminator (Schwellenwert) ausgeruestet sind. Dabei kommt eine Methode zur Anwendung, nach der die Thrombozytenzahl aus der Zahl aller Vorhandenen Blutzellen minus der bei anderer Diskriminatorstellung gesondert ermittelten Zahl der Blutzellen, die groesser als Thrombozyten sind, erhalten wird (Differenzmethode). Diese Zaehlweise wird mit Verfahren zur schnellen Probenvorbereitung, wie Schraegsedimentation oder Zentrifugation kombiniert. Dabei kann diese Probenvorbereitung schon nach kurzer Frist in unvollkommenem Zustand abgebrochen werden, ohne dass eine Qualitaetseinbusse bei den Messergebnissen auftritt. Das Verfahren ist am ungarischen Teilchenzaehlgeraet PS-4 erprobt und durch umfassende Vergleiche mit der traditionellen Kammerzaehlung abgesichert.

Description

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Beschreibung der Erfindung

Titel der Erfindung

Verfahren zur elektronischen Thrombozytenzählung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zählung von Thrombozyten aus Venenblut, Kapillarblut oder plättchenreichem Plasma unter Anwendung von elektronischen Zähl™ geräten, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und nur mit einem unteren, verstellbaren Diskriminator ausgerüstet sind«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur elektronischen Zählung von Thrombozyten* mit nach dem Coulter-Prinzip arbeitenden Geräten sind schon seit einiger Zeit bekannt (B.S. BULL et al , Amer.J.ClinoPathol. 44(1965), 6?8~685 ; J.JÜRGENS, ÄrztlcLab. 14 (1968), 34-7-35'4)« Dabei sind diese Verfahren je nach Art der angewandten Probenvorbereitung und der von der technischen Ausführung der benutzten Zählgeräte abhängigen Zählweise verschieden· Von BULL und JURGEI]S wurden Zählverfahren entwickelt, die auf Geräten mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator Thrombozytenzählungen ermöglichen. Beide Verfahren arbeiten mit der Sedimentation als Probenvorbereitung.» Nach BULL wird die Schrägsedimentation von Vollblut durchgeführt«

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Dabei ist jedoch eine Umrechnung der Zählergebnisse mit einem hämatokritabhängigen Korrekturfaktor notwendig. Bei zu hohem oder zu niedrigem Hämatokrit.läßt sich diese Korrektur nicht durchführen (U,HOEFi¹LER u. K.OETTE; . z. Klin. Chem. Klin. Biochemie 12(1974) 198-206.

Ebenfalls nach HOEFFLER und OETTE ergibt sich ein relativ hoher Prozentsatz von Untersuchungsgutproben, bei denen aufgrund schlechter Sedimentationseigenschaften das Verfahren nicht angewandt werden kann· Das Verfahren nach JÜRGENS bereitet die Proben mit Hilfe der Spontansedimentation in verdünntem Zitratblut vor. Die Sedimentationszeit beträgt bei 5⁰C drei. Stunden, was zu unvertretbar langen Bearbeitungszeiten, sowohl für die EinzelbeStimmung, als auch für die Serie führt«

Die Zählung selbst wird nach der Differenzmethode durchgeführt. Zunächst ermittelt man bei geeigneter Diskriminatorstellung die Zahl aller in der Probe vorhandenen Blutzellen. Im zweiten Zählschritt wird bei veränderter Diskriminatorstellung die Zahl aller Zellen bestimmt, die größer als Thrombozyten sind (Erythrozyten, Leukozyten). Die Thrombozytenzahl resultiert aus der Differenz beider Zählungen.

Nach BULL sind wegen schwieriger Diskriminatorinstellung stets zwei Geräte für diese Zählweise notwendig. Die auch nach JÜRGENS laufend notwendige Neu eins teilung des Diskriminators ist ebenfalls schwierig. Die Umgehung dieses Problems durch geräteinterne Parallelzählung bringt jedoch erhebliche Qualitätsverluste bei den erhaltenen Ergebnissen, Sowohl nach BULL als auch nach JÜRGENS liegen die ermittelten Zählergebnisse signifikant über den Y/erten, die mit der bisher klinisch bewährten Kammerzählung (H.STOBBE, Z.med.Labortechnik 1(1960),79)^Q^s£i^mi&'& werden.

Mit der technischen Vervollkommnung der elektronisch arbeitenden Zählgeräte werden Verfahren in den Vordergrund gerückt, welche die Anwendung einer unteren und einer oberen Diskriminatorschwelle voraussetzen und damit die Möglichkeit bieten, die Thrombozyten in nur einem Zählschritt zu erfassen (W.ADAH u. Mitarb_0J Blut 32 (1976), 347; .E.BAUMGlRTMR u. C.MAURER, Ärztl. Lab. 24 (1978), 186-190; B.S.BULL et al, Amer.J.Klin. Pathol, 44 (1965), 678-685; K.EISBKBERG, Ärztl. Lab, 22 (1976), 263-266; M, de BRUIERE et al, Thrombos» Diathes₀ haemorrh.(Stuttg₉)" 32, 232 (1974); K.GADNER u. Mitarb«,, Schweiz.med.Wschr.104, 138-140 (1974); U.HOEEFLER u. K. OETOJB, Z. Klin. Chem. Elin. Biochem. 12 (1974) 198-206; R₀KITSE u. Mitarb», Blut 35 (1977), 253-259; R. van BUUL u_e Α*Ο_βΜ_β von OUDIiEUSEN, Ärztl. Lab. 21 ' (1975)» 418-428)ο Die dabei auftretenden Eehlermöglichkeiten verlangen eine hohe gerätetechnische Perfektion (DT-AS 1598292 W.ADiM u» Mitarb._Λ Blut 32 (1976)_s 347; R.IÜJSE u, Mitarb·, Blut 35 (1977), 235-259)

Als Probenvorbereitung findet oft die schnell durchführbare Zentrifugation Anwendung (M. de₀ BRUYERE et al, Thromboso Diathes» haeraorrh. (Stuttg.) 32, 232 (1974); H.GADlIER u. Mitarb,, Schweiz,med. Wsehr. 104, 138-140 (1974); R.KIJSE U₀ Mitarb., Blut 35 (1977)? 253-259). Auch ist ein Verfahren bekannt, nach welchem man direkt aus Vollblut mit Hilfe einer automatisierten Verhältnismethode Thrombozyten zählen kann (DT-AS 2 812^517)ο Hierbei muß jedoch eine vorhergehende Bestimmung der Erythrozytenzahl der jeweiligen Blutprobe erfolgen? was den durch Umgehung der Probenvorbereitung erhaltenen Zeitgewinn beträchtlich schmälert«, Jedoch werden die Vorteile aller genannten Verfahren durch die hohe Empfindlichkeit der benutzten Geräte, den damit verbundenen großen Wartungsauf wand und den sehr hohen Anschaffungspreis aufgewogen.

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So kommt es, daß sich die sehr objektiv und mit ausgezeichneter Präzision arbeitenden elektronische Thrombozytenzählung bisher in der Praxis wenig hat durchsetzen können«

Die ungarischen Medicor-Werke entwickelten mit dem elektronischen Teilchenzähler Picoscale (PS-4) ein Gerät, das in eigener technisch einfacher und leicht zu wartender Ausführung wieder das Zählprinzip mit nur einer unteren Diskriminatorschwelle zur Anwendung bringt (DL-PS 65681)_o Allerdings geht das vom Hersteller in der Bedienungsanleitung (Medicor-Werke Budapest, Bedienungsanleitung zum Teilchenzählgerät PS-4, 1976) verfaßte Zählverfahren von der falschen Voraussetzung einer möglichen, vollkommenen Spontansedimentation von Erythrozyten ^: und Leukozyten bei gleichzeitigem Erhalt der ursprünglichen Thrombozytendichte aus. Es liefert so keine akzeptablen, mit der Kammerzählung (H.STOBBE, Z.med.Labortechnik 1 (1960), 79) vergleichbaren Werte· Zudem ist eine Probenvorbereitungszeit von über zwei Stunden im Routinebetrieb eines Labors nicht vertretbar.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe, bei leicht durchführbarer, zeitsparender Probenvorbereitung, an Geräten, die nach dem Coulter-Prinzip arbeiten und nur einen unteren verstellbaren Diskriminator besitzen, Thrombozytenzahlen in einfacher Zählweise bestimmt werden können. Dabei muß eine gute Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse mit denen der bisher üblichen Kammerzählung gewährleistet sein. Das entwickelte Verfahren muß mit einer wesentlich besseren Präzision arbeiten als die manuell.-optische Zählmethode·

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Außerdem soll der Zeitaufwand für das entwickelte Verfahren möglichst dem anderer moderner "elektronischer Zählverfahren entsprechen und damit "bedeutend unter dem Zeitbedarf des traditionellen KammerZählverfahrens liegen.

· Darlegung des Wesens der Erfindung

Das Wesen der Erfindung besteht in der Entwicklung einer günstigen Kombination von schneller, unkomplizierter Probenvorbereitung mit einer, dem angewandten Zählgerät angepaßten Durchführung der Differenzmethode, die zur Be-Stimmung von Thrombozytenzahlen mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator unumgänglich ist. Erfindungsgemäße Voraussetzung ist es, daß eine vollständige Abtrennung der Erythrozyten und Leukozyten von den zu bestimmenden Thrombozyten ohne hohen technischen und methodischen Aufwand nicht nur nicht möglich, sondern auch in weitem'Maße nicht notwendig ist.

Die zur Anwendung gelangende Probenvorbereitungsart kann, sowohl als Sedimentation oder als Zentrifugation ausgeführt, in einem sehr unvollkommenden Zustand abgebrochen werden« Dadurch wird bei der Sedimentation eine große Zeitersparnis erzielt, bei der Zentrifugation die ausschließliche Anwendung spezieller, aufwendiger Technik umgangen«. Der Zeitpunkt, an dem der Abbruch der Probenvorbereitung gerade schon möglich ist, hängt ab von der Empfindlichkeit' des angewandten Zählgerätes, mit der es in der Lage ist, eine kleine Anzahl von Thrombozyten in einer ebenso großen oder größeren Anzahl von größeren.Zellen (z„B. Erythrozyten) quantitativ exakt mit zu erfassen© Es ergeben sich bei der in verdünntem Untersuchungsgut; ausgeführten Probenvorbereitung erfahrungsgemäß keine untersuchungsgutbedingten Ausnahmen, bei denen eine Zählung der Thrombozyten. unmöglich is Weiterhin ist das Verfahren erfindungsgemäß durch eine geeig große Verdünnung und durch unvollkommen ausgeführte Sediment tion oder Zentrifugation unabhängig von hämatokrit-spezifischen Korrekturfaktoren»

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An den technisch relativ einfach aufgebauten Zählgeräten mit nur einem unteren, verstellbaren Diskriminator, die "bisher vorrangig zur Zählung von Leukozyten und Erythrozyten eingesetzt sind, kann dann erfindungsgemäß aus dem nach obiger Beschreibung vorbereiteten, verdünnten Untersuchung-sgutproben die Thrombozytenzahl pro Volumeneinheit nach der Differenzmethode bestimmt werden, Voraussetzung ist dabei . die gerätetechnisch gegebene Möglichkeit, die Diskriminatorschwelle im ersten Zählschritt jeweils soweit abzusenken, daß auch die kleinsten Thrombozyten in entsprechend abgestimmten Meßöffnungen (Poren) erfaßt und vom Zählgerät registriert werden können, .

Bs werden zunächst bei abgesenkter Diskriminatorschwelle alle in der Suspension enthaltenen Blutzellen gezählt. Im zweiten Zählschritt erfaßt man bei erhöhter Diskriminatorschwelle alle Blutzellen, außer den Thrombozyten«, Die Thrombozytenzahl ergibt sich dann aus der Differenz beider Zählwerte,, abzüglich eventuell zu bestimmender Leerwerte·

Ausführungsbeispiel

Verfahren zur Thrombozytenzählung am ungarischen Teilchenzählgerät PS-4:

Probenvorbereitung:

Zu 6,100 ml filtrierter HPJ-Lösung (MEDICQR-Werke Budapest, Bedienungsanleitung zum Teilchenzählgerät PS-4, 1976), die in einem silikonisiertem Glasröhrchen vorgelegt sind, werden 0,200 ml EDTA-Blut pipettiert«, Nach gründlicher Durchmischung des Inhalts wird das Röhrchen um 45° geneigt und offen zur Sedimentation abgestellt. Ist die Sedimentationszeit von einer halben Stunde abgelaufen, pipettiert man vom klaren Überstand in ein weiteres silikonisiertes Glasröhrchen oder Plastgefäß ab₀ Hieraus werden zur. Messung am PS-4 0,050 ml entnommen, und in 9,950 ml mehrmals filtrierte HPJ-Lösung pipettiert (Endverdünnung 1:6 300)·

2 1 290 1 -7 - ..

Messung:

Alle Messungen für eine bestimmte Patientenprobe erfolgen aus ein und derselben Endverdünnung und werden mit einer. Meßöffnung (Meßrohr) vom Durchmesser 60 /um durchgeführt«, In der Erstverdünnung sind die Thrombozyten mindestens 8 h haltbar. Innerhalb dieser Frist muß die Messung erfolgen

Meßvorgang Discriminators teilung Meßer genis

1„ Leerwertbestimmung der Gesamtteilchen- . zählung	PBC t	LW_GTZ
2« LeerwertbeStimmung der Erythrozytenzählung	RBC j	^LWB2
3» Bestimmung der . Erythrozytenzahl	RBC j	BZ
4_# Bestimmung der mittleren
Gesamtteilchenzahl	PBC ,
f 400
f 400
f 400

t 400

Beide Leerwertbestimmungen erfolgen bei EinzeXbeStimmungen generell; bei der Durchführung von Serien entscheidet die Qualität der filtrierten Verdünnungslösung über die not~ wendige Häufigkeit dieser Meßvorgänge. Zur Bestimmung der mittleren Gesamtteilchenzahl wird der 4. Meßvorgang solange wiederholt, bis zwei aufeinanderfolgende Werte nicht mehr.als 10 % des kleineren Wertes voneinander abweichen«, Diese beiden Werte werden dann zur Mittelwertbildung herangezogen*

Berechnung der Thrombozytenzahl:

Die Zahl der Throinbozyten pro 1 Blut (X) wird nach folgender Formel berechnet: .

X = WZ - (EZ - LW_EZ) - LW_G{DZ

Eine Berücksichtigung des Hämatokritwertes der Blutprobe ist bei der vorgegebenen Erstverdünnung von 1s31*5 und dem unvollkommenen Stand der Sedimentation zur Zeit der Überstandsentnahme nicht erforderlich.

Claims

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Erfindungsanspruch

1, Verfahren zur elektronischen Zählung von Thrombozyten

mit Zählgeräten, die nach dem Prinzip, der Leitfähig-,225 keitsmessung in einer MikroÖffnung (Meßöffnung, Meßkanal, Pore), durch welche eine Suspension von nicht - oder schlechtteitenden Teilchen, suspendiert in einer leitenden Flüssigkeit, befördert wird, in der Lage sind, die durch die MikroÖffnung tretenden Teilchen zu zählen und damit die Teilchenzahl pro Volumeneinheit bestimmen können (Coulter-Prinzip), dadurch gekennzeichnet, daß diese Geräte nur mit einem unteren, diskontinuierlich oder kontinuierlich verstellbaren Diskriminator (Schwellenwert) ausgerüstet sind, wodurch erstens die Zählung der Gesamtzahl der suspendierten Blutzellen (Thrombozyten, Erythrozyten, Leukozyten u.a·) bei Einstellung einer die kleinsten Thrombozyten miterfassenden, das sogenannte Rauschen aber noch ausschließenden Diskriminatorstellung erfolgen muß, zweitens die Zählung aller Zellen, die größer als Thrombozyten sind, bei einer Diskriminatorstellung, mit der die größten Thrombozyten noch nicht erfaßt werden, notwendig wird und drittens die Thrombozytenzahl pro Volumeneinheit sich aus der Differenz beider Zählwerte, von denen vorher noch, entsprechend der Reinheit der Suspensions- oder Verdünnungsflüssigkeit, der bei der jeweiligen Diskriminatorstellung ermittelte Blind- oder Leerwert der Suspensionsflüssigkeit subtrahiert werden muß, ergibt,

gleichzeitig gekennzeichnet dadurch, daß die Bestimmung der Thrombozytenzahl aus verdünntem Untersuchungsmaterial (antikoaguliertes Veiienblut, Kapillarblut, plättchenreiches Plasma u.a.) vorgenommen wird, wobei die größeren Zellen (Erythrozyten, Leukozyten) durch unvollständige Sedimentation, insbesondere Schrägsedimentation, zum großen Teil abgetrennt werden, und aus der, die Thrombozyten in günstigem Verhältnis zu den anderen Zellen enthaltenden Schicht (visuell fast klarer Überstand), die eventuell weiter zu verdünnende Zählprobe entnommen werden muß·

Verfahren zur elektronischen Zählung von Thrombozyten nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Probenvorbereitung notwendige Sedimentation durch eine nichtquantitative Abzentrifugation der Zellen, die größer als Throrabozyten sind, durchgeführt in isotonem oder isopycnischem Milieu, ersetzt ist, wobei der größte Teil dieser Zellen aus einem nach der Zentrifugation bestehenden, visuell fast klaren Zentrifugation'ö- -überstand entfernt sein muß, ohne daß schon eine Abwanderung der Thrombozyten in die mit größeren Zellen angereicherte Schicht (Zentrifugationsrückstand) geschehen ist.