DD143629A5

DD143629A5 - Reagenz zum nachweis von krebs beim menschen

Info

Publication number: DD143629A5
Application number: DD78206245A
Authority: DD
Inventors: Edsel T Bucovaz; John C Morrison; Walter D Whybrew; Jun Stanley J Tarnowski
Original assignee: Research Corp
Priority date: 1978-04-26
Filing date: 1978-06-23
Publication date: 1980-09-03
Also published as: DK233978A; BE868253A; IT1099584B; GB1602950A; AU517496B2; FR2424284A1; ATA437978A; DE2822842A1; JPS54143515A; FR2424283A1; NL7806621A; GB1602949A; IT7826418A0; AU3624078A; DE2822842C2; SE7806030L; CA1117879A; LU79828A1; ES470603A1; US4261967A

Description

-A-

CoA-SPC Bäckerhefeextrakt

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung; betrifft einen CoA-SPC Bäckerhefeextrakt. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf verbesserte Verfahrensweisen zur Herstellung von CoA-SPC. Sie besieht sich darüber hinaus auf eine niedermolekulare Substanz, welche das im rohen Bäckerhefe-Zellysat enthaltende CoA-SPC löslich nacht. Der erfindungsgemäße CoA-SPC Bäckerhefeextrakt wird ange™ Y/acdt als Reagenz für das Vorliegen von Krebs im frühen Entwicklungsstadium«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Morrison u„a_e beschreiben in der US-Patentanmeldung vom 29»9»1976 mit der Serial Number 727 633 ein Verfahren zur Kontrolle oder Reihenuntersuchung von Individuen auf Vorliegen von Krebs. Dieser Kontrolltest ist verläßlich und gestattet den Nachweis von Krebs in frühen Entwicklungsstadien₉ bevor irgendwelche leicht sichtbar beobachtbaren Symptome aufgetreten sind* Morrison u_ea„ haben entdeckt ₉ daß das Blutserum von Krebs aufweisenden Individuen das mit Krebs assoziierte B~Protein enthält* Durch eine einfache Analyse des Blutserums auf B~Protein ist es so möglich, festzustellen, ob ein Individuum Krebs hat.oder nicht, bevor irgendwelche sichtbaren Symptome auftreten*

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IP C12D/206 245

Eine von Morrison u.a, angegebene Hachweistechnik stützt sich auf ein Reagenz, das CoA-SPC (Coenzym A synthetisierender Proteinkomplex) Bäckerhefeextrakt und Substrate aufweist, die mit diesem'Extrakt zur Bildung eines Bindungsproteins in Wechselwirkung treten. Dieses Bindungsprotein kann sich an das Protein im Blutserum von Menschen unter Bildung eines Komplexes anlagern. Die Eigenschaften dieses Komplexes hängen davon ab, ob das B-Protein anwesend ist oder nicht. Die Anwendung dieses Reagenz bietet somit eine einfache Möglichkeit für Kontrolluntersuchungen von Individuen auf Krebs,

Each den von Morrison u*a. angegebenen Techniken für die Herstellung, des CoA-SPC Eäckerhefeextrakts wird ein Material erhalten, das eine bedeutende Menge Verunreinigungen, insbesondere andere Proteine, enthält, die in der Bäckerhefe vorhanden sind* Die von Morrison u.a. beschriebenen Reinigungs- . verfahren sind seitaufwendig und kostspielig.

Die Lagerungseigenschaften von nach dem Stande der Technik hergestelltem CoA-SPC sind unbefriedigend. Wenn das CoA-SPC gefriergetrocknet und gelagert wird, verliert es einen bedeutenden Anteil seiner Aktivität. Im übrigen sinkt "die Aktivität von CoA-SPC, das auf -20 ⁰C eingefroren gelagert wird, im Verlaufe der Zeit unannehmbar ab«

Tarnowski u.a_e beschreiben in einer beim I74_e American Chemical Society Meeting vom 28* August bis 3« Septemer 1977 verteilten Zusammenfassung mit dem Titel "Preparation of the Yeast Component of the B-Protein Assay", das das CoA-SPC und andere unlösliche Proteinkomponenten von Bäckerhefezellen durch eine Komponente der überstehenden Fraktion löslich gemacht werden. Der nach dieser Technik hergestellte CoA-SPO Bäckerhefeextrakt enthält jedoch CoA-SPC in einer Mischung

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mit anderen proteinartigen Materialien·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines OoA-SKJ Bäckerhefeextraktes von hoher Reinheit, der insbesondere frei ist von anderen proteinartigen Materialien bzw« proteolytischen Enzymen mit guter Lagerungsstabilität sov/ie.eines einfachen Verfahrens zur Herstellung dieses Extraktes« .

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Verfahren auszuarbeiten mit dem ein Bäckerhefeextakt mit ei™ mm gewünschten Pegel der CoA-SPC Aktivität in kürzerer Zeitdauer als bisher möglich war, gewonnen werden kann und der so gewonnene Extrakt gefriergetrocknet und ohne Aktivitätsverlust lagerfähig ist.

Mit dem erfindungsgemäß bereitzustellenden Verfahren soll eine Isolierung und Charakterisierung der Komponenten aus Bäckerhefe erfolgen, die das CoA-SPC, das darin enthalten ist, löslich machen*

Erfindungsgemäß wird ein CoA-SPC Bäckerhefeextrakt zur Verfügung gestelltj der frei von proteolytischen Enzymen, insbesondere .frei von nachweisbaren Gehalten an Proteasen A» B und C ist.

Ein solcher CoA-SPC Bäckerhefeextrakt wird erfindungsgemäß durch folgende Schritte hergestellt:

Lysis von Bäckerhefezellen;

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Trennung des Bäckerhefe-Zellysats. in feste und überstehende flüssige Fraktionen, von denen die feste Fraktion im wesentlichen t-faktorfrei ist?

Behandlung der festen Fraktion zum Löslichmachen unlöslicher., vom unlöslichen CoA-SPC verschiedener$» proteinartiger Materialien?

Abtrennung der löslich gemachten proteinartigen Materialien von der das unlösliche CoA-SK! enthaltenden Fraktion und

Kontakt der das unlösliche CoA-SPC enthaltenden Fraktion mit der t-faktorhaltigen überstehenden Fraktion zur rzeugung von löslichem CoA-SPC, und weist eine 45-fache Reinheit auf_β '

Erfindungsgemäß wird die den t-Faktor enthaltende.überstehende flüssige Fraktion vor dem Kontakt mit dem unlöslichen CoA-SPC denaturiert und die denaturierten Proteine von der überstehenden Fraktion vor deia Kontakt mit dem unlöslichen CiA-SPC abgetrennt.

Das unlösliche proteinartige Material wird durch Kontakt der festen Fraktionen mit einem anionenhaltigen wäßrigen Medium löslich gemacht, wobei die Anionenkonzentration bei zumindest 0,01 ff liegt.

Nach der Erfindung werden praktisch alle der proteolytischen Enzyme vom CoA-SPC abgesondert werden, bevor dieses löslich gemacht wird«

Die Erfindung betrifft weiterhin den t-Faktor, der gekennzeichnet ist durch die Bäckerhefefraktion mit einem Molekulargewicht von 400 bis 1000 _f die unlösliches CoA-SPC in Gegenwart, von Chloridionen löslich macht«,

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Der erfindungsgemäße t-Faktor ist im wesentlichen frei von wärmedenaturierbaren Bäckerhefekomponenten, insbesondere frei von Bäckerhefekomponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 und vorzugsweise mehr als 1 000 sowie von Bäckerhefekomponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 1 000 und weniger als 400,

Der erfindungsgemäße t-Eaktor weist eine Reinheit von zumindest 1,5-fach auf«

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen, das gekennzeichnet ist durch einen CoA-SFC Bäckerhefeextrakt, der im wesentlichen frei von proteolytischen Enzymen ist und Substratmengen für diesen Extrakt, die bezüglich einer Wechselwirkung mit dem Extrakt unter Bildung eines Bindungsproteins wirksam sind, das sich an Protein im Blutserum des Menschen unter Bildung eines Serumprotein/Bindungsprotein-Kbmplexes anlagert.

Dabei werden die Substrate durch .AIP oder ein Salz derselbe^ D-Pantothensäure oder ein Salz derselben bzw„ L-Cystein oder ein Salz desselben gebildet, davon.kann zumindest eines der Substrate radioaktiv markiert sein*

Bei dem.erfindungsgemäßen Reagenz liegt der pH-Wert bei 6,2 bis 7*6«, Es enthält eine zur. Auf recht erhaltung des pH-Wertes wirksame Menge eines Puffers«

Insbesondere enthält das erfindungsgemäße Reagenz O_SO1 bis 10 ml ATP oder /SP-SaIz; O_SO1 bis .1,0 mM. D-Pantothensäure oder D-Pantothensäuresalz und 0,01 bis O₉6 mM L-Cystein oder IXJysteinsalz·

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Das erfindungsgemäße Reagenz ist gekennzeichnet durch. 0,01 bis O₉1 ml des Extrakts und bis zu 0,8 ml des besagten Puffers pro ml Reagenz.

Das radioaktive Substrat wird bei dem erfindungsgemäßen Keagenz gebildet durch [^s]- oder L 'C-UJ- L-Cystein oder [/ -CJ-D-Pantothensäure gebildet wird»

Insbesondere ist das erfindungsgemäße Reagenz gekennzeichnet durch 0,04 bis 0,06 ml CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, der im wesentlichen frei von proteolytischen Enzymen ist; 1,5 bis 5 mM ATP oder ATP-SaIz; 0_$5 bis 0,6 mM D-Pantothensäure oder -Salze; Oj_O5 bis 0,15 mM L-Cystein oder L-Cysteinsalz; und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den pH-Wert des Reagenz, im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, pro 1 ml Lösung, während der Rest durch destilliertes Wasser gebildet wird; wobei das L-Cystein in der L Sj- oder L C-Uj-radioaktiven Form oder besagte D-Pantothensäure in der L Cj-radioaktiven Form vorliegen.

Dabei ist ATP als Dinatriumsalz und D-Pantothensäure als Hemicalciumsalz anwesend und der Puffer weist 0,001 bis.250 mM Tris-acetat; 0_S01 bis 50 mM Magnesiumacetat und 0,001 bis 250 inM KDl auf.

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Es wurde festgestellt, daß CoA-SPC mit zufriedenstellender Reinheit durch Einfrieren und nachfolgendes Auftauen von Bäckerhefe hergestellt werden kann. Die resultierenden flüssigen und festen·Phasen werden getrennt. Die feste Phase wird dann Bedingungen unterworfen, die bevorzugt vom CoA-SPC verschiedene unlösliche proteinartige Materialien löslich machen, die an die feste Phase des Hefematerials gebunden sind. Die resultierenden löslich gemachten proteinartigen Materialien werden von der festen Phase, die das unlösliche CoA-SPC enthält,abgetrennt. Das CoA-SPC wird durch Kontakt dieser festen Phase mit der flüssigen Phase löslich gemacht, die ursprünglich beim Auftauen der Hefe gebildet wurde. Das löslich gemachte CoA-SPC wird dann abgetrennt. Das in dieser Weise hergestellte CoA-SPC enthält v/eit weniger zusätzliche proteinartige Materialien als herkömmlich hergestelltes CoA-SPC.

Gemäß einer anderen Ausführungsart der Erfindung werden die niedermolekularen Komponenten der vom Auftauen der Bäckerhefe herstammenden flüssigen Phase von den Komponenten dieser Phase mit höherem Molekulargewicht getrennt. Diese niedermolekularen Komponenten werden dann zum Löslichmachen des in der festen Phase enthaltenen CoA-SPC verwendet, nachdem sie.zur Entfernung anderer unlöslicher proteinartiger Materialien behandelt worden ist.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die niedermolekulare Zellkomponente von Bäckerhefe, welche CoA-SPC löslich macht und t-Faktor genannt wird.

Die niedermolekulare Komponente der Bäckerhefe, welche das in den Bäckerhefezellen befindliche CoA-SPC löslich macht und im nachfolgenden als "t-Faktor" bezeich-

net wird, kann nach irgendeiner der herkömmlichen Verfahrensweisen erhalten werden, die zur Lysis von Bäckerhefezellen bestimmt sind oder nach Verfahrensweisen, die Zellmaterialien aus Hefezellen extrahieren, wie Schallbehandlung, Homogenisierung, Flügelpresse . (French Press), lytische Enzyme mit nachfolgendem osmotisehen Schock sowie auch Siedebehandlung der Hefe in Wasser.

Handelsüblich erhältliche Federal Brand, Budweiser, Fleischmann und Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Shizuoka (Japan) Hefen wurden mit Erfolg angewandt.

j > Vorzugsweise wird der t-Faktor entweder (1) durch

Einfrieren der Hefe in einer Äther-COp Mischung, wie es von Morrison u.a. in der US-Patentanmeldung, Serial Number 727 633 für die Herstellung von CoA-SPC angegeben wird oder (2) durch Einfrieren von vorzugsweise zerbrökkelter Bäckerhefe in flüssigem Np zum Einfrieren der Zellen und nachfolgendes Auftauen erhalten.

Bei beiden Techniken (1) oder (2) müssen die festen und flüssigen Phasen getrennt werden, wenn gereinigter CoA-SPC Bäckerhefeextrakt gewünscht wird. Wenn kein gereinigtes Produkt gewünscht wird, kann das aufgetaute Material der Technik (2) direkt zu der bei der Technik (i) erhaltenen festen Portion zugesetzt werden. Die aufgetaute Mischung der Technik (1) kann direkt zur Gewinnung von verunreinigtem CoA-SPC Bäckerhefeextrakt verarbeitet werden, was jedoch nicht bevorzugt wird.

Wenn die Technik (1) angewandt wird und auch ein CoA-SPC Bäckerhefeextrakt gewonnen werden soll, muß die Trenntechnik zur Absonderung des t-Faktors,der in der flüssigen Phase ist, von der festen Phase geeignet sein, welche das unlösliche CoA-SPC und andere unlösliche pro-

teinartige Materialien enthält, um eine CoA-SPC enthaltende Phase zu erzeugen, die im wesentlichen frei vom t-Faktor ist. Zu geeigneten Trenntechniken gehören Zentrifugieren, Ultrafiltrationj Säulenchromatographie und dergleichen. Nach Wunsch, kann die aufgetaute Hefeprobe einer ersten Trennung zur Entfernung von intakten Hefezellen durch eine geeignete Technik unterworfen v/erden, wozu Dekantieren, Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit und dergleichen gehören. Die bevorzugte Trenntechnik umfaßt ein relativ hochtouriges Zentrifugieren» vorzugsweise mit minimal 4000 bis 5000 g, vorzugsweise zumindest 10 Ö00 g und insbesondere etwa 105 000 g oder mehr. Es .sollte ausreichend lange zentrifugiert werden, um die notwendige Trennung zu erreichen. Bei höheren Zentrifugiergeschwindigkeiten ist diese Zeit natürlich geringer als bei niedrigeren Zentrifugierbedingungen. Die Zeit kann von 10 Minuten bis 2 Stunden reichen, wobei- natürlich längere Zentrifugierdauern angewandt werden können, Jedoch keinen Vorteil bieten. Allgemein reicht ein Zentrifugieren für etwa 1 Stunde'aus. Wenn kein CoA-SPC Bäckerhefeextrakt erzeugt v/erden soll oder keine Herstellung des Extrakts in hoher Reinheit gewünscht wird, ist es nicht notwendig, eine CoA-SPC enthaltende Phase herzustellen, die wesentlich frei vom t-Faktor ist. In diesem Falle können so weniger intensive Trenntechniken angewandt werden.

Die überstehende Fraktion vom Zentrifugieren kann, wie sie ist, als Quelle für den t-Faktor zum Loslichinachen des CoA-SPC dienen. Vorzugsweise wird jedoch der t-Faktor vor der Verwendung weiter gereinigt. Die zusätzliche Reinigung kann eine Denaturierung mit nachfolgendem Dekantieren und zusätzlichem Zentrifugieren umfassen. Die Denaturierung wird vorzugsweise durch Aufheizen der den t-Faktor enthaltenden überstehenden Fraktion auf eine aus-

reichende Temperatur zur Denaturierung der wärmedenaturierbaren Komponenten der Fraktion erreicht. Temperatur und Zeitdauer der Denaturierung sind nicht kritisch, wobei höhere Temperaturen kürzere Heizzeiten zulassen. Eine typische Denaturierung wird bei 50 bis 100⁰C für Zeiten von 3 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Temperaturen von etwa 8O⁰C für Zeitdauern von etwa 5 Minuten ergeben zufriedenstellende Resultate. Nach Wunsch, kann die den t-Faktor enthaltende denaturierte überstehende Flüssigkeit zentrifugiert und dann gesammelt werden. Die Zentrifugiergeschwindigkeit ist nicht kritisch und kann von 5 000 g bis 105 000 g reichen, wobei sich ein Zentrifugieren bei 105 000 g oder darüber als zufriedenstellend erwiesen hat. Die Zentrifugierdauer ist nicht kritisch und kann von 10 Minuten bis 2 Stunden reichen. Zentrifugierdauern von etwa 1 Stunde haben sich als zufriedenstellend erwiesen. Die resultierende überstehende Flüssigkeit enthält einen t-Faktor, der wesentlich frei von wärmedenaturierbaren Proteinen ist.'

Nach Wunsch, kann die überstehende Fraktion weiteren Behandlungen zur Steigerung der Reinheit des t-Faktors unterworfen werden. Zu solchen Behandlungen können Filtrieren und Ultrafiltration, Dialyse, Papier- oder Säulenchromatographie, Ausfällung oder irgendeine Kombination derselben gehören, zur Erzielung einer Fraktion,die praktisch frei von Material mit einem Molekulargewicht über 25 000 ist und vorzugsweise im wesentlichen frei von.Material mit einem Molekulargewicht über 1000, insbesondere im wesentlichen frei von Material mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 und weniger als 400, Der t-Faktor selbst hat ein Molekulargewicht von weniger als 1000. Bezüglich der Ultrafiltration erweist sich das Molekulargewicht als geringer als 500. Gemäß einer Sephadex-Chromatographie liegt das Molekulargewicht

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zwischen 400 und 1000. Die Diskrepanz resultiert wahrscheinlich daher, daß de benitzte Ultrafiltrationsmembran eine höhere Molekulargewichtsausschlußgrenze als 500 hatte.

Es wurde gefunden, daß die Membran CoA mit einem Molekulargewicht von etwa 800 mit gleicher Geschwindigkeit durchläßt wie eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 500 oder weniger. Demgemäß liegt das Molekulargewicht des t-Faktors sehr wahrscheinlich zwischen 400 und 1000.

Wenn diese Technik zur Gewinnung des t-Faktors angewandt wird, ist es möglich, das von der einleitenden Trennung der flüssigen und festen Phase der aufgetauten Hefe aufgesammelte feste Material zur Gewinnung von CoA-SPC zu behandeln. Diese Gewinnung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Die zweite Verfahrensweise zur Erzielung des t-Faktors umfaßt ein Einfrieren, der Hefe auf tiefe Temperaturen wie durch Einbringen der Bäckerhefe (vorzugsweise in zerkrümmelter Form) in flüssigen Stickstoff zum Einfrieren der Zellen. Die Eintauchdauer in flüssigen Stickstoff ist nicht kritisch,solange sie zum Einfrieren der Zellen ausreicht. Sie kann von 5 Minuten bis zu einer Stunde reichen, obgleich längere Zeiten angewandt werden können, die jedoch keinen Vorteil bringen. Kürzere Zeiten können vorgesehen werden, wenn die Zellen gefroren sind.

Die gefrorenen Zellen werden nachfolgend aufgetaut. Die aufgetaute Mischung enthält "aufgelöste" Zellen, intakte Zellen und lösliche Zellkomponenten von beiden. Die festen und flüssigen Fraktionen werden voneinander getrennt, da der t-Faktor prinzipiell in der flüssigen Phase vorhanden ist, wobei herkömmliche Techniken wie

Zentrifugieren, Filtrieren, Dialyse und dergleichen angewandt werden. Vorzugsweise wird die Trennung durch Zentrifugieren mit ausreichender Geschwindigkeit und Zeitdauer zur Erzielung der Trennung erreicht. Die .Zentrifugierteschwindigkeit liegt vorzugsweise' bei zumindest 4 000 g, insbesondere bei zumindest 10 000 g und ganz besonders bei etwa 105 000 g. Die Zentrifugierdauer hängt von der Intensität ab. Generell wird zumindest 10 Minuten lang zentrifugiert, vorzugsweise zumindest 30 Minuten lang₀ Ein einstündiges Zentrifugieren mit 105 000 g hat sich als zufriedenstellend erwiesen, obgleich längere oder kürzere Zeitdauern vorgesehen werden können.

Die so gesammelte flüssige Fraktion kann direkt als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC in den Hefezellen dienen« Vorzugsweise wird jedoch die den t-Faktor enthaltende überstehende Fraktion v/eiteren Reinigungen wie Denaturieren, Dialyse, Filtrieren, Ultrafiltration, Ausfällung und Chromatographie unterworfen. Kombinationen dieser Reinigungsverfahren können ebenfalls angewandt werden. Die Reinigung muß derart durchgeführt werden, daß die die niedermolekularen Bestandteile enthaltende Fraktion zurückgehalten bzw. aufbewahrt wird, da sich der t-Faktor als vergleichsweise niedermolekular erweist mit einem Molekulargewicht von wahrscheinlich 1000 oder darunter.

Die bevorzugte Reinigungsweise umfaßt als erstes eine Denaturierung der denaturierbaren Proteine in der t-faktorhaltlgen überstehenden Flüssigkeit, Die Denaturierung erfolgt ganz besonders durch Aufheizen auf eine Temperatur und für eine Zeitdauer, die ausreichen, die . wärmedenaturierbaren Proteine zu denaturieren_β Allgemein können Temperaturen von 50 bis 10O⁰C, vorzugsweise 75 bis 85⁰C vorgesehen werden. Die Zeitdauer, für welche die Mi-

schung aufgeheizt wird, hängt von der Temperatur ab, sie reicht jedoch allgemein von J5 Minuten bis 24 Stunden. Die Heizdauer wird derart gewählt, daß die gewünschte Denaturierung erzielt wird. Bei Temperaturen von etwa 8O⁰C haben sich Heizbehandlungszeiten von 5 bis 10 Minuten als zufriedenstellend erwiesen. Die resultierende Mischung kann als t-Faktorquelle zum Löslichmachen des CoA-SPC dienen. Vorzugsweise wird die Mischung jedoch zur Entfernung der denaturierten Proteine behandelt.

Die denaturierten Proteine können durch Anwendung herkömmlicher Techniken wie Zentrifugieren, Filtrieren, Dialyse und dergleichen entfernt werden. Ein Zentrifugieren wird wegen seiner Einfachheit bevorzugt. Die anwendbare Zentrifugierbehandlung entspricht der zuvor.zur Trennung der flüssigen und festen Phasen angewandten. Ein Zentrifugieren mit etwa 105 000 g für etwa 30 Minuten hat sich als zufriedenstellend erwiesen.

Die resultierende überstehende Flüssigkeit kann direkt als die t-Faktorquelle für die CoA-SPC Auflösung angewandt werden. Vorzugsweise werden jedoch irgendwelche hochmolekularen Komponenten entfernt, bevor die überstehende Flüssigkeit als t-Faktorquelle benutzt wird. Vorzugsweise werden solche Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 25 000 entfernt und insbesondere solche mit einem Molekulargewicht über etwa 1 000. Das heißt, die Fraktionen mit Komponenten mit Molekularge- wichten von gleich oder weniger als 25 000, vorzugsweise etwa 1 000 oder*weniger und insbesondere mit einem Molekulargewicht von 400 bis 1 000 werden als Quelle für den t-Faktor benutzt. Solche Fraktionen können unter Anwendung herkömmlicher Techniken wie Filtrieren, Dialyse, Ultrafiltration,· Chromatographie, Ausscheidung und Kombinationen derselben erhalten werden. Die genaue Verfahrensweise ist nicht kritisch.

Eine typische Verfahrensweise könnte eine Dialyse gegen verminderten Druck unter Anwendung einer Membran umfassen, die die meisten Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 15 000 bis 20.000 zurückhält. Der verminderte Druck ist nicht kritisch und kann von 12 bis 700 Torr reichen. Die t-Faktoraktivität findet sich im Dialysat. Alternativ kann die überstehende Flüssigkeit unter Anwendung eines Mediums filtriert v/erden, welches Materialien mit einem Molekulargewicht von 25 000 oder mehr zurückhält. Der t-Faktor findet sich im Filtrat. Das Diaiysat oder das Filtrat können .direkt als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC dienen.

Vorzugsweise wird das Dialysat oder Filtrat einer Ultrafiltration und Chromatographie unterworfen, um Materialien mit einem Molekulargewicht von mehr als 1 000 oder weniger als 400 abzutrennen. Das Filtrat wird darm als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC angewandt. Durch Anwendung der beschriebenen Techniken ist es möglich, einen t-Faktor von gewünschter Reinheit zu erzielen. Nach einer simplen Denaturierung durch Aufwärmen der t-faktorhaltigen überstehenden Flüssigkeit, wie weiter oben beschrieben, wird eine 1,5-fache Reinigung erzielt. Ein Filtrieren zur Entfernung der Fraktion mit einem Molekulargewicht über 25 000 vom denaturierten Material führt zu einem t-Faktor mit einer etwa 3-fachen Reinheit. Nichtgereinigter t-Faktor kann zum Löslichmachen des CoA-SPC .von den Hefezellen dienen, jedoch wird ein t-Faktor mit zumindest 1,5-facher Reinheit bevorzugt und insbesondere wird ein t-Faktor mit einer zumindest 3-fachen Reinigung angewandt. Es ist möglich, einen t-Faktor mit einer bis zu 900-fachen Reinheit,nach Wunsch, herzustellen, der zum Löslichmachen von CoA-SPC dienen kann. Ein t-Faktor mit einer ^kO- bis 625-fachen Reinheit

karm ohne weiteres erhalten werden. Ein t-Faktor mit so hoher Reinheit ist jedoch für die Herstellung von CoA-SPC von hoher Reinheit gemäß der Erfindung nicht erforderlich. "

Die t-Faktorreinheit wird wie folgt berechnet:

Gesamtfeststoffgewicht in der zur Erzielung von 1 ml gereinigtem t-Fakt.or ausreichenden rohen überstehenden Flüssigkeit

Reinigungs- . __

faktor ~

Gesamtfeststoffgewicht in 1 ml aufgesammeltem gereinigten t-Faktor

Der CoA-SPC Bäckerhefeextrakt wird durch Einfrieren der Bäckerhefe in einer COp-Äther Mischung, wie bei Morrison u.a. beschrieben oder in einer Flüssigstickstoff-Äther Mischung hergestellt. Bei diesen Verfahrensweisen können andere organische Lösungsmittel,-welche CoA-SPC nicht inaktivieren, angewandt v/erden. Vorzugsweise sind diese Lösungsmittel leicht ^von den "lysierten" Zellen nach dem Auftauen entfernbar. Geeignete Lösungsmittel,zu denen Aceton, Toluol, Chloroform, Butanol und dergleichen gehören, können an Stelle von Äther benutzt v/erden. Die Temperaturen, denen die Hefe ausgesetzt wird, sind solche, bei denen Hefe gefriert und vorzugsweise liegt die Temperatur der Mischung bei -70 bis -195⁰C, insbesondere -72 bis -77⁰C. Die Zeitdauer, für welche die Hefe diesen Temperaturen ausgesetzt wird, hängt von der Temperatur und der Hefemenge ab. Die Zeitdauer muß nur zum Einfrieren der Hefezellen ausreichen, wobei längere Perioden,nach Wunschj angewandt werden können. Die gefrorene Hefe wird _r dann aufgetaut. Wenn eine Äthermischung zum Einfrieren der Hefe benutzt wurde, wird der restliche Äther entfernt. Das unlösliche CoA-SPC iot in der festen'Phase enthalten.

während der t-»Faktor in der flüssigen Phase enthalten ist« Die beiden Phasen werden unter solchen Bedingungen abgesondert, daß die feste Phase wesentlich frei von t-Faktor ist. Geeignete Trenntechniken sind solche, wie sie weiter oben zur Herstellung des t-Faktors nach der Technik (1) angegeben wurden.

Das aufgesammelte Zellmaterial enthält nicht nur unlösliches CoA-SPC,sondern auch andere unlösliche proteinartige Materialien sowie andere Verunreinigungen. Da die Anwesenheit des t-Faktors zum Löslichmachen des CoA-SPC₅ jedoch nicht der anderen unlöslichen proteinartigen Materialien notwendig ist, besteht die Möglichkeit zu einer selektiven Auflösung dieser anderen unlöslichen proteinartigen Komponenten der Hefe. Dieses Löslichmachen kann durch simples Rühren, Rühren in einem wässrigen Medium und dergleichen durchgeführt werden. Geschv/indigkeit und Ausmaß des Löslichmachens können durch die Zugabe von Salzen wie von Chloriden, Nitraten, Acetat und dergleichen erhöht werden. Vorzugsweise wird ein Chlcridionen enthaltendes wässriges Medium angewandt. Der kationische Anteil des Salzes könnte durch irgendein Kation gebildet werden, das die CoA-SPC Aktivität inhibiert. So sollten die Salze von Quecksilber, Blei, Zink, Eisen und Lithium vermieden werden. Andere Salze können jedoch angewandt werden. Salze von Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium und Mangan wurden mit Erfolg benutzt. Insbesondere können KCi, NaAc, Tris-puffer und dergleichen angewandt werden. Durch geeignete Auswahl der Rührzeit und Anionenkonzentration kann die Entfernung von soviel oder sowenig von diesen anderen proteinartigen Materialien,wie erwünscht sein mag,erreicht werden« Allgemein haben sich Konzentrationen an Anionen und vorzugsweise Chloridionen von 0,01 bis 2,0 N.als zufriedenstellend erwiesen, und bevorzugt werden Konzentrationen von 0,026 bis 1,0 N und ins-

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besondere 0,47 bis 0,73 N. Höhere Anionenkonzentrationen können vorgesehen werden, jedoch bieten sie keinen besonderen Vorteil. Unabhängig von der lonenkonzentration geht aktives CoA-SPC in Abwesenheit von t-Faktor nicht in Lösung.

Der pH-Wert des Mediums während der Auflösung dieser anderen unlöslichen proteinartigen Materialien ist nicht kritisch und kann im sauren, basischen oder neutralen pH-Bereich liegen. Bevorzugte pH-Bereiche liegen bei 5,0 bis 8 und insbesondere 5,6 bis 5,9. i >

j

Der pH-Wert kann durch Zugabe von praktisch irgendeinem Säure- oder Basenpuffer wie Tris-acetat und NaAc (Acetat) aufrechterhalten werden.

Das so löslich gemachte proteinartige Material wird vom Zellmaterial, welches das unlösliche. CoA-SFC enthält, durch herkömmliche Techniken wie Zentrifugieren mit 10 000 bis 105 000 g für 30 Minuten und Dekantieren der das zusätzliche Protein enthaltenden überstehenden Flüssigkeit, Filtrieren und dergleichen abgetrennt.

Das gewonnene Zellmaterial kann nach Wunsch mit Wasser gewaschen werden, um irgendwelche Restverunreinigungen oder löslichen proteinartigen Materialien,die durch das Trennverfahren nicht eliminiert wurden, abzutrennen. Das gewaschene Zellmaterial wird dann in ein wässriges Medium eingeführt, das Chlorid- oder Nitrationen enthält. Die Chlorid- oder Nitrationenquelle ist nicht kritisch und umfaßt solche Materialien, wie sie weiter oben erwähnt wurden. Die Konzentration an Chloridoder Nitrationen beeinflußt die Geschwindigkeit, mit welcher der t-Faktor das CoA-SPC löslich macht. Demgemäß ist es erwünscht, daß eine minimale Chlorid- oder Nitrationenkonzentration von 0,02 N vorhanden ist. Geringere

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Konzentrationen werden zwar eine Durchführung gestatten, jedoch wird die Auflösungsrate niedrig sein. Die maximale Chlorid- oder Nitrationenkonzentration liegt bei et-. wa 2 N (75 mg/ml). Da das CoA-SPC oder die t-Faktorquelle oder beide wahrscheinlich einige' endogene Chloridionen enthalten werden, ist es nicht wesentlich, daß Chloridoder Nitrationen zum;wässrigen Medium zugesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Chloridionenkonzentration auf zumindest 0,40 N eingestellt oder es werden ausreichend Nitrationen zur Erzielung dieser Konzentration zugegeben, um eine zufriedenstellende Auflösungsrate zu erreichen. Besonders bevorzugt werden Chlorid- oder Nitrationenkonzontrationsbereiche von 0,4-7 bis 0,73 N.

Der pH-Wert des wässrigen Mediums während der Auflösung des CoA-SPC ist nicht kritisch. Vorzugsweise reicht der pH-Wert von 5 bis 8, insbesondere von 5 bis und ganz besonders von 5,6 bis 5,9. Der pH-Wert kann durch Zugabe von geeigneten Säuren, Basen oder Puffern wie Natriumacetat und Tris-acetat eingestellt werden. Der pH-Wert muß jedoch nicht eingestellt werden,und man kann allein Wasser beim Löslichinachen anwenden.

Die Menge des t-Faktors oder t-faktorhaltigen Extrakts, die zugesetzt wirdjist nicht kritisch. Die Geschwindigkeit, mit der das CoA-SPC löslich gemacht wird, ist jedoch eine Funktion der Menge des vorhandenen t-Faktors. Die zum Löslichmachen des CoA-SPC angewandte t-Faktormenge kann diejenige sein, die während der einleitenden Verarbeitung der Bäckerhefe gewonnen wurde. Der t-Faktor kann in Form der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt werden, die ursprünglich von dem aufgetauten Zellmaterial abgesondert wurde. Die Gesamtmenge dieser überstehenden Flüssigkeit kann hinzugegeben werden oder auch nur eine Fraktion derselben wie 1/8, 1/4, 1/2, 3/4

etc.. Zur Gewinnung von CoA-SPC mit einer hohen Reinheit wird die Anwendung einer t-faktorhaltigen Mischung bevorzugt, die durch irgendeine der weiter oben beschriebenen Verfahrensweisen gereinigt wurde.

Der t-Faktor kann vom löslich gemachten CoA-SPC durch Dialyse oder Filtrieren durch eine Membran, welche Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 zurückhält, wiedergewonnen werden. Das Filtrat oder Dia-Iysat kann dann zur Erzielung von gereinigtem t-Faktor durch Anwendung der weiter oben beschriebenen Verfahrensweisen behandelt werden. Nach Yfunsch, kann gereinigter t-Faktor direkt durch Dialyse oder Filtrieren durch eine Membran erzielt werden, welche solche Komponenten zurückhält, die ein Molekulargewicht von mehr als 1 000 aufweisen. Durch Rückgewinnung und Wiederverwendung des t-Faktors ist es möglich, gröi3ere t-Faktormengen zum Löslichinachen von CoA-SPC anzuwenden,als in der ursprünglichen Probe vorhanden sind, aus der das CoA-SPC gewonnen wird. " So kann der t-Faktor von so vielen Hefeproben, wie man wünscht, zurückgehalten und zum Löslichraachen von CoA-SPC aus irgendeiner Hefemenge benutzt werden. Diese Verfahrensweise stellt eine wirtschaftliche Technik zur Erhöhung der Lösungsrate dar. Der zum Löslichir.achen des CoA-SPC angewandte t-Faktor kann derjenige sein, der durch die weiter oben beschriebene Verfahrensweise (2) erhalten wurde.

Der gemäfi dieser bevorzugten Verfahrensweise erzeugte CoA-SPC Bäckerhefeextrakt ist wesentlich frei von pro-teolytischen Enzymen. Die Gegenwart von proteolytischen Enzymen in nach älteren Verfahren hergestellten CoA-SPC Bäckerhefeextrakten führt zu Produkten mit unbefriedigenden Lagerungseigenschaften. Der CoA-SPC Bäckerhefeextrakt gemäß der Erfindung verliert wegen seines verminderten Gehalts an proteolytischen Enzymen bei Gefriertrocknen

-SLO- Berlin,d.19.2.1979

AP C12D/296

und Lagerung wesentlich weniger Aktivität als der bekannte Extrakt· Der erfindungsgemäße Extrakt zeigt auch überlegene Lagerungseigenschaften bei Aufbewahrung im gefrorenen Zustand bei -20 ⁰C

Außerdem erfordert der erfindungsgemäße CoA-SPG Bäckerhefeextrakt weniger ATP Substrat zur Bildung des beim Krebsnach-. weisverfahren gemäß der US~Patentanmeldung_f Serial-Number 727 633 vom 29«,9«1976 angewandten Bindungsproteins· Im übrigen hat der erfindungsgemäße CoA-SPG Bäckerhefeextrakt eina verbesserte CoA-SPC Aktivität pro mg Protein im Vergleich zu dem bislang verfügbaren Extrakt«, CoA-SPC Bäckerhefe extrakt hat ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und wird durch seine Wechselwirkung mit den Substraten L-Cystein, D-Pantothensäure und /JTP gekennzeichnet«, Er wird auch charakterisiert durch seine Wechselvrirkuag mit L-Cystein, D-Pantothensäure und AS)P zur Gewinnung von Bindungsprotein, das zu Komplexbildung mit Blutserumprotein befähigt ist, wie es in der US-Patentanmeldung Serial Number 727 633 vom 29.9*1976 beschrieben wird«,

^S£äfeSiB.-sSMi§£^i ...

Die vorstehend allgemein beschriebene Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele besser verständlich werden, die lediglich zur Erläuterung angegeben werden und beliebigen Abwandlungen zugänglich sind»

.1

Prüfung der CoA-SPG Aktivität!

Die CoA-SPC'Aktivität wurde durch Verwendung von L-Cystein, D-Pantothensäure oder AODP mit radioaktiver Markierung ermittelt«, Eine typische Reaktionsmischung ent-

-abA,70 mM Dinatrium-ATP, 0,5 ml Puffer A (mit 0,10 M Tris-acetat; pH 7,2; 0,02 M Magnesiumacetat; 0,05 M KCl); 0,50 mM Calciumsalz von D-Pantothensäure; 0,50 mM |_ sl-L-Cystein (18 000 Ipm); 0,05 ml der zu prüfenden überstehenden Fraktion und Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 ml. Reaktionsmischungen ohne ATP dienten zur Bestimmung des Nullwerts der Aktivität.

•Die Reaktionsmischung enthaltende Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 36⁰C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2, ml 10/oiger TCA und 5 Minuten Aufheizen der Röhrchen in einem siedenden Wasserbad beendet. Die Röhrchen wurden abgekühlt und die CoA-SPC enthaltenden .denaturierten Proteinausscheidungen wurden durch Filtrieren gesammelt unter Verwendung eines Millipore Filtergeräts und von Whatman No. 3 MM Papierscheiben. Die auf den Filtern gesammelten Ausscheidungen wurden 4mal mit je etwa 2 ml Wasser gewaschen. Die Scheiben wurden getrocknet und dann in Szintillationsampullen überführt; die vorhandene Radioaktivität wurde in einem Nuclear Chicago Flüssigszintillationszähler unter Anwendung der von Hoskinson und Khorana in J. Bio!. Chem. 2^0 (1965) Seiten 2129-35 beschriebenen Szintillationsflüssigkeit ermittelt.

Prüfung der t-Faktoraktivität:

Das angewandte Prüfverfahren zum Nachweis der Anwesenheit von t-Faktor war wie folgt:

Die auf ihre t-Faktpraktivität zu prüfende Fraktion "wurde 17 Stunden bei 4⁰C mit vom rohen Hefezellysat durch eine Stunde Zentrifugieren mit 105 000 g gewonnenem, gewaschenem Bodensatzmaterial gerührt und außerdem mit KCl für eine Endkonzentration von 5 mg/ml versetzt. Anschlies-

send an die Rührstufe.wurde die Mischung mit 105 000 g eine Stunde lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, wie oben beschrieben,auf ihre CoA-SPC Aktivität hin geprüft. Für Kontrollproben-wurde Bodensatzmaterial 17 Stunden lang mit 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2 mit einem' Gehalt von 5 mg/ml KCl und mit der überstehenden Fraktion von 105 000 g bei Abwesenheit von exogenem KCl gerührt.

Herstellung des t-Faktors^

Etwa 454 g·frische Bäckerhefe wurden in einen geeigneten Behälter mit 0,7 kg wasserfreiem Athyläther zerkrürnmeli. Zum Einfrieren der Hefe wurden 3 kg Trockeneis zugesetzt. Die gefrorene Hefe wurde für 7 Stunden auf 23 bis 24°C aufgetaut. Restlicher Äther und CO₂ wurden von dem aufgetauten Hefezellysat durch Unterdruck,v/ie früher bei Morrison u.a. beschrieben,entfernt.

Das Hefezellysat wurde in drei gleiche Teile unterteilt und gemäß der folgenden Verfahrensweisen behandelt: Ein Drittel des Lysats verblieb als rohes Lysat (Verfahren I); das zweite Drittel Lysat wurde (Verfahrensweise II) mit 105 000 g eine Stunde lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt; der dritte Teil des Hefezellysats wurde (Verfahrensweise III) mit 1 000 g 10 Minuten lang bei 4⁰C zentrifugiert, um intakte Hefezellen zu entfernen. Die Zellen wurden verworfen und die verbleibende Suspension 20 Minuten lang bei 4⁰C mit 105 000 g zentrifugiert. Sowohl der Bodensatz als auch die überstehende Fraktion wurden gesammelt« Letztere wurde 5 Minuten lang auf 80⁰C erhitzt, 1 Stunde lang mit 105 000 g zentrifugiert und durch ein Käsetuch dekantiert und aufgesammelt. Der Bodensatz wurde zum Auswaschen des Materials erneut 2mal in 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2

suspendiert und nachfolgend eine Stunde lang mit 105 000g zentrifugiert. Eine Portion des gewaschenen Bodensatzmaterials wurde (Verfahrensweise lila) erneut in der aufgeheizten überstehenden Fraktion von 105 000 g wie bei der Verfahrensweise III suspendiert. Eine weitere Portion des gewaschenen Bodensatzmaterials wurde (Verfahrensweise HIb) in 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2 suspendiert. Eine Endkonzentration von näherungsweise 5 mg exogenem KCl pro ml wurde zu den Proben der Verfahrensweisen I, II, IHa und IHb zugesetzt, wonach ein mechanisches Rühren aufgenommen und 17 Stunden lang bei 4⁰C fortgesetzt wurde.

Anschließend an den 17stUndigen Rührvorgang, durch den CoA-SPC allmählich in Lösung geht, wurden die Mischungen der Verfahrensweisen I, II, IHa und IHb eine Stunde lang mit 105 000 g zentrifugiert und Bodensatz und überstehende Fraktion abgesondert. Jede überstehende Fraktion wurde bezüglich der CoA-SPC Aktivität unter Verwendung von L-Cystein, D-Pantothensäure oder ATP als radioaktives Spurenelement getestet.

Die Proben der Verfahrensweise I und Verfahrensweise HIa enthielten eine CoA-SPC Aktivität, wie durch das Ausmaß an meßbarer Radioaktivität in den TCA Ausscheidungen oder Niederschlägen ermittelt wurde. Die Proben der Verfahrensweise IHb (die gewaschenen Bodensatz gemischt mit 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2 enthielt) und gemäß Verfahrensweise II waren frei von CoA-SPC Aktivität. Mithin scheint eine Komponente (s) in.der überstehenden Fraktion zum Löslichrnachen von CoA-SPC erforderlich zu sein.

Dieses Ergebnis läßt zwei vital wichtige Eigenschaften von CoA-SPC erkennen: (1) CoA-SPC scheint an außer-

ordentlich schwere, unlösliche Hefezellkomponenten bzw. eine solche Komponente gebunden zu sein und bleibt in diesem Zustand, wenn nicht Bedingungen, wie sie für die Verfahrensweise I und die Verfahrensweise IHa beschrieben wurden, auftreten; (2) Eine lösliche Komponente der Hefezelle ist für die Freigabe oder das Löslichmachen von CoA-SPC wesentlich. Da diese lösliche Zellkomponente nicht identifiziert worden ist, wurde sie absichtlich t-Faktor genannt.

g Bäckerhefe wurde zum Einfrieren der Zellen in flüssigen Stickstoff gekrümmelt. Die gefrorenen Zellen wurden dann aufgetaut - die aufgetaute Mischung enthielt löslich gemachte Zellen, intakte Zellen und lösliche Zeilkomponenten von beiden. Diese Mischung wurde 1.Stunde lang bei 4⁰C mit 105 000 g zentrifugiert. Die flüssige ,Fraktion wurde in ein anderes Gefäß dekantiert und 1Ό Minuten lang auf 80⁰C erhitzt zur Entfernung wärmedenaturierbarer Proteine aus der Mischung. Nach der Heizbehand-. lung wurde die Mischung erneut 30 Minuten lang mit 105 000g zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde unter Anwendung von No. 8 Schlauch gegen verminder- ' ten Druck von 700 bis 12 Torr dialysiert. Die gesamte nachweisbare t~Faktoraktivität war im Dialysat anwesend. Bei einigen Präparationen wurde ein zur Dialyse alternativer Schritt angewandt. Die aufgeheizte überstehende Fraktion wurde filtriert (eher als dialysiert),und zwar durch Amicon Centriflo Filterkegel (CF25), die Materialien mit einem Molekulargewicht von 25 000 oder mehr zurückhalten. In diesem Falle erscheint der t-Faktor im Filtrat. Das t-faktorhaltige Dialysat oder Filtrat wurde zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsschritten unterworfen. Bei

der ersten Ultrafiltration wurde ein Amicon UM-2 Filter (1 000 M Retention) angewandt. Bei der zweiten Ultrafiltration wurde das t-faktorhaltige UM-2 'Filtrat durch eine Amicon UM-05 Membran (500 M Retention) geschickt. Der t-Faktor war im UM-05 Filtrat anwesend. In Anbetracht der Ultrafiltrationsschritte scheint der t-Faktor ein Molekulargewicht von 500 oder weniger zu haben, jedoch ist es bekannt, daß gewisse Verbindungen wie CoA mit einem Molekulargewicht von 800 durch dieses Filter hindurchgehen. Die Säulenchromatographie besagt, daß der t-Faktor ein Molekulargewicht zwischen 400 und 1 000 hat.

Die CoA-SPC Aktivität wurde vor dem Löslichmachen nicht aufgezeigt; die Ermittlung der t-Faktoraktivität ' basiert daher gemäß indirekter Prüfung auf der Anwesenheit von CoA-SPC Aktivität nach dem Löslichmachen. Das Ausmaß der nach 17 Stunden Rühren vorhandenen CoA-SPC Aktivität scheint in direkter Beziehung zur in der. geprüften Fraktion anwesenden t-Faktorkonzentration zu stehen.

Beispiel 3 Trypsin- und Proteasebehandluns; des t-Faktors:

Die offensichtliche CoA-SPC Lösefähigkeit des t-Faktors läßt t-Faktorfunktionen als proteolytisches Enzym erscheinen.Eine Portion des Amicon UM-5 Filtrats wurde in 4 ml aliquoten Teilen gefriergetrocknet. Ein aliquoter Teil des Filtrats wurde in 10 ml 0,13 M Ammoniumbicarbonatlösung aufgelöst und mit 100 pg Trypsin (Worthington, 2 χ kristallisiert) versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1N NH^OH auf 8,0 eingestellt. Eine Kontrollprobe wurde in ähnlicher Weise hergestellt, nur daß das Trypsin 'durch 2 Minuten Sieden vor seiner Zugabe zum ge-

η α C

friergetrockneten UM-05 Filtrat inaktiviert wurde. Zwei v/eitere aliquote Teile wurden einer Zersetzung durch Protease (Sigma, St£e_£_₁__g_rJ^scjJS; wiedergereinigter Typ VI) .ausgesetzt. Zu einem aliquoten Teil des gefriergetrockneten Filtrats, gelöst in 10 ml 0,13 M Ammoniumbicarbonatlösung,wurden 100/Jg Protease zugesetzt und der pH-Wert mit 1N HCl auf 7,2 eingestellt. Eine Kontrolle für Protease wurde in identischer Weise hergestellt, nur daß das Enzym vor seiner Zugabe zum gefriergetrockneten UM-05 Filtrat 2 Minuten zum Sieden erhitzt wurde. Alle vier Proben wurden 6 Stunden lang bei 36⁰C inkubiert und der pH-Wert überwacht. Anschließend an die Inkubationszeit wurden die enzymatischen Reaktionen durch 3 Minuten Sieden been'det. Denaturierte proteolytische Enzyme wurden durch Zentrifugieren entfernt und die überstehenden Flüssigkeiten bei 4⁰C gegen verminderten Druck durch No. 8 Schlauch dialysiert. Die Dialysate wurden bis zur Trockne gefriergetrocknet und in 4 ml HpO aufgelöst. Der pH-Wert wurde bei Bedarf mit 1N HCl auf 5,8 eingestellt,. Kaliumchlorid wurde für eine Endkonzentration von 5 mg/ml zugesetzt und die Dialysate wurden mit gewaschenem Bodensatzmaterial vermischt,* das von der COp-Ather Präparationsmethode erhalten worden war. Eine Prüfung der CoA-SPC Aktivität ergab, daß Trypsin- und Proteasekontrollen eine Aktivität aufwiesen. Zusätzlich hatten die Reaktionsmischungen, bei denen Trypsin und Protease nicht inaktiviert worden waren, den gleichen Pegel an CoA-SPC Aktivität. Diese Ergebnisse sprechen in hohem Maße dafür» daß der t-Faktor keine Peptidbindungen enthält.

Wärmebehandlung des t-Faktors:

Das UM-05 Filtrat wurde auch bez üglich der Wärmestabilität überprüft. Tabelle 1 zeigt, daß weniger als eine 10^ige Abnahme der t-Faktoraktivitat nach 24 Stunden

20 6 24 5

Erwärmen auf 80 C beobachtet wurde. Mithin scheint der t-Faktor unter diesen Bedingungen stabil zu sein, insbesondere da der nachweisbare Verlust an t-Faktoraktivi-. tat während der ersten 10 Minuten Heizbehandlung auftritt. Irgendwelche beobachteten Verluste der t-Faktoraktivität scheinen auf spezifische Eigenheiten der Verfahrensweise zurückzugehen.

Benötigung von KCl oder Chloridionen:

Exogene Chlorid- oder Nitrationen und t-Faktor scheinen für ein maximales Inlösunggehen von CoA-SPC wesentlich zu sein (Tabelle i). Wegen der Anwesenheit von endogenen Chloridionen in den t-faktorhaltigen Fraktionen wurde eine gewisse CoA-SPC Aktivität ohne die Zugabe von Chlorid zum Rührkolben nachgewiesen. KCl in HpO oder in 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2 in Abwesenheit von t-Faktor setzt dagegen kein CoA-SPC frei. Es wird angenommen, daß. der t-Faktor für die Freigabe von CoA-SPC spezifisch notwendig ist, jedoch ist die anschließend an das Rühren von Bodensatzmaterial mit t-Faktor und KCl in der überstehenden Fraktion anwesende Proteinmenge größer als die Proteinmenge, die auf CoA-SPC allein zurückgehen könnte. Das heißt, es wird auch zusätzliches Protein löslich gemacht. Es ist bekannt, daß viel des zusätzlichen löslich gemachten Proteins auf mechanisches Rühren und Salzkonzentra- —~ tion zurückgeht.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, scheint gerade das Chlorid- oder Nitration für das Inlösunggehen von CoA-SPC wesentlich zu sein und nicht das Kation. Mono- und Dichloridsalze mit äquivalenten Chloridionenkonzentrationen erwiesen sich als gleich gut für das Löslichmachen von CoA-SPC. Die Zugabe von Salzen, welche kein Chlorid oder Nitrat enthalten (wie z.B. ICAc, NaAc, Na^SO^), er-

höhen das Niveau der CoA-SPC Aktivität nicht über das für endogenes Chlorid angegebene. Mithin scheinen die geprüften Salze, die keine Chlorid- oder Nitrationen enthalten, keine Funktion bezüglich der Auflösung von CoA-SPC zu besitzen. Die Chlorid- oder Nitrationen können, in irgendeiner herkömmlichen Form zugesetzt werden, wie in Form von Salz. Allerdings scheinen Kationen wie Li, Hg, Pb, Zn und Fe die katalytisch^ Aktivität von CoA-SPC zu inhibieren. Kationen wie K, Na, I¹In, Mg und Ca haben sich insgesamt als geeignet erwiesen.

Bei weiteren Untersuchungen wurden Versuche mit (j⁵ Cl]-NaCl durchgeführt, um festzustellen, ob das Chloridion seine Wirkung durch Bindung an CoA-SPC, schwere Komponenten des Hefezellysats oder den t-Faktor ausübt. Die Ergebnisse dieser Versuche geben keinen Hinweis für eine Cl~-Bindung an irgendeine dieser Fraktionen. Das heißt, falls eine ^^DCl""-Bindung stattfindet, wird die Bindung zwischen Cl und seinen BindungsZentren während der Gewinnung bzw. Isolierung von CoA-SPC, anderen Zellkomponenten oder des t-Faktors für die Untersuchung aufgebrochen.

20S245

TABELLE I

Einfluß unterschiedlicher Salze auf das Inlösunggehen

von CoA-SPC-

zugesetzte Komponenten 1	Salz	CoA-SPC Aktivität η»μ Mol
t-Faktor	KCl KCl² NaCl MgCl₂ CaCl₂ 1-InCl₂ LiCl³ KC₂H₃O₂ NaC₂H₃O₂ KJ Na₂SO₄ KNO₃ CaCl₂	5,2 19,8 0,5 18,2 19,3 25,0 . 29,3 0,3 . 7,6 4,9 3,1 5,2 18,9 0,1 0,2
♦'

(4·) bedeutet zugesetzten t-Faktor; (-) besagt, daß entweder der t-Faktor oder das Salz von der Mischung weggelassen wurde.

Die mittlere endogene Cl" Konzentration (von verschiedenen Hefeansätzen) lag bei 0,92 mg/ml der überstehenden Fraktion des Zellysats bei 105 000 g. Die zugesetzten 5 mg/ml exogenes .KCl sind auf das gesamte Hefezellvolumen bezogen. Dies entspricht 25 mg/ml exogenem KCl für die überstehende Fraktion bei 105.000 g. Andere geprüfte Salze wurden näherungsweise auf die KCl Konzentration eingestellt,

KCl in Abwesenheit des t-Faktors wurde in 4 ml Wasser . gelöst und dann mit dem Bodensatzmaterial gemischt, wie es bei.der "Prüfung der t-Faktoraktivität" beschrieben ist.

•^Anionen die mit Kationen wie Li, Hg, Pb, Zn, Fe assoziiert sind, scheinen die katalytische Aktivität von CoA-SPC zu inhibieren.

Darüber hinaus scheint der t-Faktor seine Wirkung nicht durch Bildung einer stabilen Bindung mit CoA-SPC oder anderen Zellkomponenten auszuüben, da der t-Faktor nach dem Inlösunggehen von CoA-SPC mehrere Male durch Dialyse rückgewonnen und ohne offensichtlichen Aktivitätsverlust wieder verwendet werden kann.

Bäckerhefezellen enthalten proteolytische Enzyme und andere Enzyme, die für CoA-SPC, sein Substrat oder Produkt, das heißt, das Bindungsprotein schädlich sein können. Das CoA-SPC,wie es gemäß der US-Patentanmeldung Serial No. 727 633 vom 29. September 1976 erhalten wird, enthält wesentliche Mengen von diesen Enzymen und nachweisbare Konzentrationen an Protease A» B und C. Die maximale Reinheit,die mit dem iii der US-Patentanmeldung

20 6 24 5

beschriebenen Verfahren erzielt v/erden kann, ist etwa 36-fach. Das CoA-SPC gemäß der Erfindung wird zumindest 45-fach gereinigt und im allgemeinen zumindest. 50fach. Reinheiten von 50-fach sind ohne weiteres' erhältlich und ergeben ein CoA-SPC,das frei von nachweisbaren Konzentrationen an Protease A, B und C ist. Ferner werden die meisten der anderen proteolytischen und hydrolytischen Enzyme - unabhängig davon, ob sie in Vakuolen oder in periplasmischen Räumen löslich sind - durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise zur Erzielung von CoA-SPC entfernt. Der CoA-SPC Bäckerhefeextrakt gemäß der Erfindung' kann somit als frei von nachweisbaren Konzentrationen an Proteasen A, B und C charakterisiert werden.

Die Reinheit des CoA-SPC wird wie folgt berechnet:

Zählwert pro min pro mg gereinigtes Lösungsprotein ·

Reinheits- _

zahl

Zählwert pro" min pro mg rohes Lösungsprotein

wobei der Zählwert pro min pro mg Proteinlösung,wie in Beispiel 1 beschrieben,ermittelt wird, und zwar gemäß:

Zählwert/min/ml Lösung

Zählwert/min/mg Lösungs- ~

protein _{mg Protein} / _ml Lösung

Nach YJunsch, kann der t-Faktor in einer sehr hoch gereinigten Form hergestellt werden, so daß er im wesentlichen frei von allen proteinartigen Materialien ist. Folglich wurden alle nachweisbaren proteolytischen und anderen Enzyme im löslichen Anteil des Zellysats, aus dem der t-Faktor gereinigt wurde, entfernt. Zusätzlich werden durch die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen

vom t-Faktor das endogene Substrat D-Pantothensäure und L-Cystein ebenso wie alle anderen löslichen Komponenten mit einem Molekulargev/icht über 1 000 und weniger als '400 abgetrennt.

Das Auswaschen des Feststoffs, der sich durch Lysis der Hefezellen mit nachfolgender Salzextraktion, wie weiter oben beschrieben, ergibt, entfernt die nichtgesuchten und unerwünschten proteinartigen Materialien, so daß CoA-SPC von hoher Reinheit, wie weiter oben diskutiert wurde, erhalten wird. Dieses hochreine CoA-SPC hat sich als gefriertrocknungs- und lagerungsstabil sowie als stabil b|ei einer Lagerung in Lösungen bei -20 C erwiesen. Nach einer Aufbewahrungsdauer von h Monaten hat die Aktivität des CoA-SPC sich nicht von ihrem ursprünglichen Niveau nach unten entfernt. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber dem in der US-Patentanmeldung Serial No. 727 633 beschriebenen CoA-SPC dar. Das gemäß dieser US-Patentanmeldung hergestellte CoA-SPC verliert 25 bis 100 % der Aktivität nach einer Lagerung über eine ähnliche Zeitdauer von etwa 4. Monaten.

Claims

AP C 12 Ό/206 245' 53 771 18

Erfindungsanspruch

1, Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen, gekennzeichnet durch einen CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, der im wesentliehen ifj'rei von proteolytischen Enzymen ist und Substratmengen für diesen Extrakt, die bezüglich einer Wechselwirkung mit dem Extrakt unter Bildung eines Bindungsproteins wirksam sind, das sich an Protein im Blutserum des Menschen unter Bildung eines Serumprotein/Bindungsprotein-Komplexes anlagert. . . '

2, Reagenz nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Substrate durch ATP oder ein Salz derselben, D—Pantotensäure oder ein Salz derselben bzw. L-Cytein oder ein Salz desselben gebildet werden.

3ö Reagenz nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch«, daß der pH-Wert bei 6,2 bis 7,6 liegt·

4. Reagenz nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß zumindest eines der Substrate radioaktiv markiert ist.

5· Reagenz nach Punkt 4, gekennzeichnet durch eine zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes wirksame Menge eines Puffers«

S₀ Reagenz nach Punkt 5, gekennzeichnet durch 0,01 bis 10 mM ATP oder ATP-SaIs; 0,01 bis 1,0 mM »-Pantothensäure

— 2 —

AP'C 12 D/206 53 771 18

oder D-Pantothensäuresalz und OjOI bis 0,6 mML-Cystein- oder 1-Cysteinsalze.

7, Reagenz nach Punkt 6, gekennzeichnet durch 0,01 bis 0,1 ml des Extraktes und bis zu 0,8 ml des besagten Puffers pro ml Reagenz. :

8* Reagenz nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß das radioaktive Substrat durch {. Sj- oder J. C-UJ-3 >Cystein oderf. CJ -D-Pantothensäure gebildet wird.

9« Reagenz zum Machweis von Krebs bei Menschen, gekennzeichnet durch 0,04 bis 0,06 ml CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, der im wesentlichen frei von proteolytiscxien Enzymen ist; 1,5 bis 5 mM ATP oder ATP-SaIz; 0,5 bis 0,6 mM D-Pantothensäure oder -Salz; 0,05 bis 0,15 mM L~Cystein oder L-Cysteinsalz; und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den ρH-Wert des Reagenz im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, pro 1 ml lösung, während der Rest durch destilliertes Wasser gebildet wird; wobei das L-Cystein in der [_ SJ —oder L C-UJ -radioaktiven Form oder besagte D-Pantothensäure in der[_ Cj-radioaktiven Form vorliegen.
10. Reagenz nach Punkt 9_} gekennzeichnet dadurch, daß ATP als Dinatriumsalz und D—Pantothensäure als Hemicalciumsalz anwesend sind und der Puffer 0,002 bis 250 mM Tris-acetat; 0,01 bis 50 mM Magnesiumacetat und 0,001 bis 250 mM KCI auf v/eist«