DD149875A3 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung eines gemisches von zitronensaeure und isozitronensaeure - Google Patents

Abstract

Patentansprüche: 1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Gemisches von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Hefen auf verschiedenen Kohlenstoffquellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährlösung in der Wachstumsphase gerade soviel einer Stickstoffquelle zugesetzt wird, dass man eine Biomassekonzentration 5 bis 15 g/l erhält, und dass in der anschließenden Produktionsphase in an sich bekannte Bedingungen für eine Zitronensäureakkumulation (saurer pH, Abfangen der Säure, Vorhandensein von Effektoren, gute Belüftung u.dgl.) eingehalten werden. 2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass beide Phasen, die Wachstums- und die Produktionsphase, als räumlich voneinander getrennte Prozessstufen durchgeführt werden.

Description

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Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Zitronen- und Isozitronensäure durch Hefen iait Kohlenstoffquellen wie n-Alkane, Zucker oder kurzkettige aliphatisch^ sauerstoffhaltige Verbindungen.

Die Akkumulation der Zitronensäuren durch Hefen erfolgt "bekanntermaßen nach Abschluß der ϊ/achstuinsphase, was sich durch eine maximale Hefebiomassekonzentration und Erschöpfung der Stickstoffquelle anzeigt. Allgemein wird so verfahren, daß .ein Zitronensäurenbildender Stamm, meist der Gattung Candida zugehörig, in einer Impfkultur herausgezogen wird und mit dieser eine Fermentationslösung beimpft wird, die neben üblichen IJährsalzen und evtl. Supplinen. eine geeignete Kohlenstoffquelle in Konzentrationen enthält, die der zu erzielenden Menge des Zitronensäurengemisches entspricht und zur Abstumpfung der Säuren meist Kalziumkarbonat enthält. Zahlreiche Erfindungen berücksichtigen die Beeinflußbarkeit der' an der Synthese beteiligten Enzyme durch bestimmte chemische Agenzien und beschreiben den Zusatz von Schwermetallionen und anderer Effektoren, wodurch die Säurenausscheidung erhöht oder aber die Bildung der Zitronensäure auf Kosten der Isozitronensäure gefördert wird. ' Ton den Hefen der Gattung Candida werden besonders Stämme der Art Candida lipolytica als besonders leistungsfähig beschrieben. Auch die Züchtung von Hochleistungsstämmen durch Mutation ist bekannt. Auch werden Arten, wie Candida zeylanoides angeführt, die sich besonders für eine Zitronensäurenproduktion eignen sollen. Die Mengen der ausgeschiedenen Säuren werden sehr unterschiedlich angegeben..Sie können im günstigsten'Falle bei 200 g/l Zitronen- plus Isozitronensäuren liegen, obwohl Angarte η zwischen 50 bis 100 g/l am häufigsten sind. .

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Ein Nachteil der bekennten Verfahren besteht darin, daß allgemein eine hohe Biomassekonzentration angestrebt ist, was jedoch nicht in jedem Fall erwünscht ist, weil eine hohe Biomassekonzentration einen entsprechend hohen Aufwand an Ausgangsprodukten, an Rühr-und Belüftungsenergie sowie a.j3 Reinigungsoperationen erforderte

Zweck der Erfindung ist die Herstellung eines Gemisches von Zitronensäure und Isozitronensäure in hoher Ausbeute mit verringertem Einsatz an Ausgangsaaterialieη·

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Mengenverhältnisse der Nährstoffe zu modifizieren.

Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung des Zitronensäuregeiaisches derart, daß die eigentliche Produktionsphase unter .Limitation durch die Stickstoffquelle durchgeführt wird» Das bedeutet, daß man dem Medium gerade soviel einer Stickstoff— quelle zufügt, wie für eine ungestörte Vermehrung der Hefe— bioffiasse zu einer für die nachfolgend hohe Zitroneη säurebildung optimalen Menge nötig ist. Überraschenderweise liegt diese Menge bei niedrigen Konzentrationswerten β Bei Werten zwischen 5 und 7 g Hefetrockensubstanz γ/ird bereits das Maximum der Zitronensäurenakkumulation erreicht, welches über einen weiten Bereich bis etwa 15 g/l, beibehalten wirdo

Im einzelnen wird »vie folgt gearbeitet: Hefe vorzugsweise der Gattung Candida wird unter aseptischen und aeroben Bedingungen in einem Medium angezüchtet, daß gerade soviel einer Stickstoffquelle enthält, um eine Biomasse-¹ menge zwischen 5.bis 15 g/l (als Trockensubstanz) zu bilden» Als Anhaltswert für die Bemessung der Menge der Stickstoffquelle - meist ein Ammoniumsalz — dient die Beziehung.:

angestrebte Menge Biomasse

N-Quelle (auf N berechnet) in g/l = in g/1

12,5

wobei von einem Eiweißgehalt der Hefe von 50 % ausgegangen wird.

Die übrigen Bestandteile des Mediums - LiLneralsalze und \ abhängig von der Bedürftigkeit de-s Hefestammes auch Supp— ι line (wie z»B. Hefeautolysat) werden nach bekannter Bej Ziehung auf die Menge der vorgelegten Stickstoffquelle , abgestellt. Die Kohlenstoffquelle und das Kalziurakarbo- : nat (als eine andere Substanz zum Abfangen der Säuren) : können, bereits zu Beginn der Kultivierung in voller.Höhe oder aber der Teil, der ausschließlich zur Zitronensäure- ; synthese diont, nach Abschluß der V/achstumsphase zugesetzt werden. Die Menge des ICalziumkarbonats ist zweckmäßigerweise so zu bemessen, daß der pH-V7ert erst gegen Ende des Prozesses kleiner als 3 wird· Nach Abschluß der Wachstumsphase wird der Prozeß unter aeroben und aseptischen Bedingungen für etwa 3-5 Tage fortgesetzt.

Es ist durchaus im Sinne der Erfindung, wenn der für eine Zi-. troneηSäurenproduktion vorgesehene Hefestamm in einer gesonderten Vermehrungsstufe kultiviert wird und die eigentliche Zitronensäuresynthese in einer zweiten oder in mehreren Stufen erfolgt, wobei die einzelnen Stufen räumlich getrennt, in eigenen Fermentoren durchgeführt werden können*

Eine erfindungsgemäße Trennung in mindestens zwei Phasen erlaubt den Zusatz solcher Substanzen zur Phase der Zitronen— ' Säurenausscheidung, welche diese beeinflussen oder den Anteil der Isozitronensäure zugunsten des Anteils der Zitronensäure verringern und umgekehrt. Solche Substanzen sind z. B. Eisen-, Blei-, Zink- und Manganionen, Fluoracetat oder -zitrat, ; Methanol sowie bestimmte Vitamine wie Thiamin oder vitaminhaltige Substrate, wie Hefeautolysat· *

Folgende Beispiele verdeutlichen das erfindungsgemäße Verfah- ; ren: :

'. Beispiel Λ . ·

In einem Hührfermentor von 1 1 Volumen werden 550 ml einer "Nährlösung folgender Zusammensetzung sterilisiert:

" 0,4 i> NH₄Cl

0,1 % KH₂PO_{4 :} ·; ν- 0,05 ίο MgSO₄ ...7 H₂O

0,5 %. Hefe extrakt (70 #)

0,5 % CaCO₃

20 ml Para,ffinöl-(η-Paraffine ^c-jo~

Der Fermentor wird danach mit 40 ml einer gut gev/achsenen, 18 Stunden alten Schüttelkultur von Candida lipolytica "beimpft. Die Nährlösung der Schiittelkultur hatte die gleiche Zusammensetzung wie oben abgegeben* Es wird mit 50 l/h Luft belüftet und die Temperatur auf 30 + 10 ⁰C gehalten* Nach 40 h ist die Biomassesynthese be endet, die Ferrnentationslösung enthält 1,5 % Hefetrocken-

Die Fermentationslösung wird unter aseptischen Bedingungen Id einen sterilisierten Fermentor vom gleichen Typ wie oben überführt, in dem über eine Regeleinrichtung ein pH—,.'ert νου 4,5 bis 5 mit Hilfe von ständig aufgeschlämmter 10 %iger Kalkmilch konstant gehalten wird. Außerdem wird mit 60 1-Laft/h belüftet. Nach 10 Stunden wird aseptisch 100 ml Paraffiaöl (η-Paraffine C,q - C₂q) zugegeben» Nach weiteren 80-Stunden ist die Fermentation' beendet· Das "Volumen der Fermentation slösung beträgt 305 ml«

Die Ausbeute beträgt - auf das Ausgangsvolumen von 600 ml "berechnet - 31 g/l Zitronen- und 60 g/l Isozitronensäure·

Beispiel 2 .

1 1 einer Nährlösung, die mit Leitungswasser aufgefüllt wird, eathält

1,5 ml Paraffinöl (n~?araffine C^₀- C₂₀)

0,6 g N (als NH.Cl)

0,5 g KH₂PO₄

0,2 g MgSO₄ · 7 H₂O

0,02 g CaCl₂

2,5 g Hefeextrakt (70 % Trockensubstanz)

Je 100 ml dieses Mediums werden in-zehn 500 ml Schüttelkolben gefüllt, sterilisiert und mit 10 ml einer Impflösung von Candida lipolytioa beimpft· Es wurde 30 Stunden bei 30 C geschüttelt.

β

Danach beträgt der η-Gehalt der Fermentationslösung Ό,Ό08 g/l und die/Biomassekonzentration 7,5 g/l· Zu jedem Kolben werden aseptisch zugegeben 8 g CaCO-, 15 ml Paraffinöl und die Kolben werden 4 Tage bei 30 ⁰C geschüttelt. Die Ausbeute beträgt 50 g/l Zitronen- und 55 g/l Isozitronensäure·

Beispiel 3Γ. . . . '." :\'.':"' ' .Λ-. . -" '' .'. .'. . Es werden das gleiche Medium und die gleiche Verfahrensdurchführüng wie bei Beispiel 2 benutzt» lediglich wird das Paraffinöl durch Zucker (20 g/l Glukose für die Wachstuinsphase und 50 g/l für die Produktionsphase) ersetzt· Die Ausbeute an Zitronensäure (Isozitronensäure wurde nicht bestimmt).beträgt 35 g/l· .: ; . , ;

Beispiel 4' /^r -.' '' - ·

0,8 . g/l . N (als

20 ν ^ml " ^v η-Paraffine (

.0,5 g £H2^P04

0,2 g MgSO_A « .7 H₂O

H-

0,02 g . CuSO₄

_: 0,01 g ' ZnCl₂

0,02 ' g CoSO₄ · 7 H₂O ,

0,02 g MnSO₄ · 4 H₂O

" 0,02 g CaCl₂

werden mit Leitungswasser auf 1· 1 aufgefüllt, je 100 ml in "zehü ; Schürt elkolber¹)' von 500 ml; Volumen: gefüllt, sterilisiert, mit 10 ml einer Impflösung von Candida guilliermondii beimpft und 40 Stunden bei "'30 ⁰C geschüttelt. Danach beträgt der N- ,. Gehalt der Feriiientationslösung 0,02 g/l und die Biomassekon— zeniration 10/g/l.. Zu -jedem. Schüttelkoroeü v/er^en unter aseptischen Bedingungen 1' ml einer .10 ?iigen Hefeautolysatlösung und 5g CaCOo zugegeben. ,

Ss v/ird 4 2c>ge bei 30 ⁰C geschüttelt. Die Ausbeute beträgt 10 g/l Zitronen- und 25 g/l IsiDzitron en säure.

Claims (2)

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Patent an spr iiche; ~~~" _._...-— .._:... -

1· Verfahren zur mikroMellen Herstellung eines Gemisches. von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Hefen auf verschiedenen Kohlenstoffquellen, dadurch gekennzeichnet, daß'der Nährlösung in der Wachstumsphase gerade soviel einer Stickstoffquelle augesetzt wird, daß man eine Biomassekonzentration .5.'."bis 15 g/l erhält, und daß in der anschließenden Produktionsphase in an sich "bekannte' Bedingungen für eine Zitronen säure akkumulation (saurer pH, Abfangen der Säure, Vorhandensein von Effektoren} gute Belüftung u.dgl.) eingehalten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß "beide Phasen, die Y/achstuius- und die Produktionsphase_s als räumlich voneinander getrennte Prozeßstufen durchgeführt werden.