DD204105A1 - Verfahren zum zuechten von bakterien - Google Patents

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Hermann Seim
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Abstract

Die Erfindung hat das Ziel, die Wachstumsrate der Bakterien zu steigern. Die Aufgabe besteht darin, zur Erzeugung von Biomasse Bakterienstaemme einzusetzen, die auf den Zusatz von chemischen Verbindungen mit verstaerktem Wachstum reagieren. Die Aufgabe wird durch den Einsatz von Staemmen wie Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida u.a. geloest, wobei als Wachstumsstimulantien quaternaere Ammoniumverbindungen wie Carnitin, Cholin o. dgl. eingesetzt werden.

Description

234317 7
Titel der Erfindung
Verfahren aim Züchten von Bakterien
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Bakterien, die als Biomasse von Bedeutung sind,
Charatsriatik der bekannten technischen Lösungen
ist bereits bekannt, Bakterien suchten und die Produkte der Züchtungsverfahren als Biomasse zn verwenden« So ist es weit verbreitet, als Kohlenstoffquelle für die Kultivierung von Bakterien .ethanol, Glucose, organische Säuren oder aliphatische Kohlenwasserstoffe einzusetzen* Um das Wachstum der Bakterien auf diesen Kohlenstoff- und Energiequellen zu beschleunigen, wird - da die Nährstoffansprüche der Mikroorganismen sehr komplex sind - im allgemeinen dem Kulturmedium Hefe-, Fleisch-, Malzextrakt,, Serum, Maisquellwasser oder andere, Wachstumsfaktoren enthaltende Verbindungen zugesetzt. Darüberhinaus ist bekannt, daß das Wachstum der Bakterien und/oder die Ausbeute an Biomasse außer durch verfahrenstechnische lösungen auch durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen beschleunigt bzw. erhöht werden kann« Dazu gehört z.B. die gesteuerte Zugabe von Hährsubstraten, die Ausbalancierung des Kohlenstoff/Stickstoffangebota, die Aufrechterhalten^ eines bestimmten pH-Wertes und/oder der Temperatur, der .Zusatz von Spurenelementen wie z.JB. Cu,. von Siliconöl entsprechender Viskosität o«dgl* Dia Mehrzahl
234 3 17 7
der Verfahren ist dabei auf ein bestimmtea Substrat and Jiikroorganismenspezies fixiert oder schlägt verfahrenstechnische lösungen vor, die sich darauf beziehen·
Bei den mit Hefezusatz arbeitenden Verfahren besteht in starkem laße die Gefahr der Verunreinigung der Bakterienkultur, da der Hefeextrakt BTähraedium für die Mehrzahl aller Mikroorganismen darstellt. Wünschenswert ist daher eine Methode zum Züchten von Bakterien, die den Hefeestraktzusatz vermeidet, ohne das Wachstum der Mikroorganismen dadurch zu vermindern·
A 3 1 7 7
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, die Waehstumsrate der Bakterien im Verlauf des Züchtungsprozesses zu steigern, die Ausbeute zu erhöhen und damit die Ökonomie der Herstellung verwertbarer Biomasse wesentlich zu verbessern.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Erfindung hat die Aufgabe, die Kultivierungsdauer der Bakterien zu vermindern, indem zur Erzeugung von Biomasse Bakterienstämme eingesetzt werden, die auf den Zusatz von chemischen Verbindungen mit verstärktem Wachstum reagieren. Ss soll dabei unerheblich sein, ob die Zusätze von den Bakterien als Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle bzw. Elektronen- oder Wasserstoffdonatoren mit verwendet werden.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß Bakterienstämme in einem rlüssigen Minimalmedium, flüssigen oder festen Komplerxmedium unter Verwendung von Acetat, Malat, Glucose, Pares, Mepasin o.dgl. als Kohlenstoffquelle und HH.C1 o. dgl. als Stickstoffquelle gezüchtet werden, wobei.erfindungsgemäß als wachstumsstimulierendes Mittel quaternäre Ammoniumverbindungen, insbesondere Cholin, Acetyleholin, D,Ii-,L(-) oder !>(+)-Carnitin, dessen Vorläufer wie z.B. Lysin, Abbauprodukte oder Derivate, eingesetzt werden.
Carnitin ist nicht nur Bestandteil tierischer Zellen bzw. Organe (Muskel, Leber), sondern kommt auch weitverbreitet in Mikroorganismen (ITeurospora, Streptokokken) vor« Die Holle des Carnitins im Stoffwechsel der Fettsäuren eukarynotischer Zellen bzw. Zeilkompartimente (Mitochondrien) iat in den letzten beiden Jahrzehnten intensiv untersucht worden. Trotz der Beschäftigung der Pachv/elt mit dem Carnitin und seiner Rolle im Stoffwechsel von Mikroorganismen iat es bisher nicht bekannt geworden, daß Carnitin
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selbst, Derivate davon oder Vorläufer von ihm auf das Wachstum von Bakterien einen merklichen Einfloß ausüben* Es ist zweifellos überraschend, daß Carnitin und seine Derivate auf Bakterienstämme wie z.B..
Acinetobaeter calcoaceticus 60,/V
Acinetobacter calcoaceticus GCM 2355 Acinetobacter calcoaceticus EB 104 Acinetobacter calcoaceticus CCM 5572 Acinetobacter calcoaceticus CCIlI 2376 Pseudomonas putida
Pseudomonas oleovorans
Salmonella typhisiurium LüL·
Proteus vulgaris
Sscherichia coli 044 K74
Acetobacter
Gluconobacter
Mischkulturen o«g. Bakterien
Mischkulturen anderer Art bei Anwesenheit ein oder
mehrerer Spezies o.g« Bakterien
wachstumsstimulierend wirken. Als Caraitinderivate sind insbesondere DL-Carnitin selbst, Acetylcamitin, Cholin, Acetylcholin, Betainhydrat, Lysin, ^-Butyrobetain, Grotonbetain als wirksam erkannt worden9 jedoch sind auch Salze des Carnitins and seiner Vorläufer wie Halogenide oder Hitrate, Sulfate and Phosphate einsetzbar.
Beispiele für verwendbare Carnitinderivate sind weiterhin solche Verbindungen, die zu Carnitin gespaltet werden können, wie kurzkettige oder langkettige Acylcarnitine,. wie Propionylcarnitin, Butyrylearnitin, Palmitoylcamitin und Stearoylcarnitin, sowie Alkylester, wie Methyl- und Athylester des'Carnitine« Beispiele für Derivate von Crotonobetain und Butyrobetain sind die entsprechenden Alkylester, wie der Methyl- und Athylester sowie Doppelester, wie z.B« Acetylcarnitinmethylester«
Im erfindungsgemäßen Verfahren können über das eingangs angegebene flüssige Minimalmedium hinaus Hährmedien mit beliebigen, durch Bakterien verwertbaren Kohlenstoffqaellen verwendet werden, Beispiele für diese Kohlenstoff quellen sind Zucker, wie Glucose, Rohrzucker oder Stärke, Alkohole, wie Ethanol oder Methanol, Carbonsäuren, wie Essigsäure oder fumarsäure, höhere Fettsäuren, wie Palmitinsäure, Stearinsäure oder Ölsäure, deren Ester, Öle und Pette, wie Sojabohnenöl oder Walöl, die diese fettsäuren enthalten, sowie Kohlenwasserstoffe, wie unverzweigte Paraffine, Kerosin oder Gssöl.
Das Mährmedium enthält ferner Stickstoffquellen wie Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumsulfat oder Ammonium-Chlorid, oder Harnstoff, ferner kann das iSährmedium anorganische Salze, wie Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Salze der Phosphorsäure, Zinksalze und Mangansalze, wie Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Zinksulfat oder Hangansulfat enthalten, ferner können dem iiähraediom Sparenmengen an Titaminen, wie Biotin oder Vitamin B-, Melassen und Maisquellwasser, die diese Vitamine enthalten, zugesetzt werden.
Die Züchtung kann auf festen oder flüssigen Ii ähr boden unter Verwendung üblicher i'ermenter und bei den üblichen 'Temperaturen durchgeführt werden* Züchtungsteaperaturen von 25 bis 400C sind besonders günstig. Der pH-Wert des Uährmediums beträgt bei Verwendung von Garbonsäuren oder höheren Fettsäuren vorzugsweise 6 bis 8 und bei Verwendung anderer Kohlenstoffquellen 4 bis 8« Bei Verwendung von Kohlenwasserstoffen oder Ölen und Petten als Kohlenstoffquelle kann eine grenzflächenaktive Verbindung, beispielsweise ein Fett säur«derivat, zugesetzt werden, um die Dispersion aes Substrats unter den Züchtungabedingungen su verbessern. Das erfindungsgesiäö verwendete Carnitin oder dessen Derivate bzw. Vorläufer werden des Nährmedium.in einer Konzentration von mindestens 10 ^ug/Iiter, berech-
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net als Carnitinchlorid, zugesetzt. Selbst in höfcs?en Konzentrationen hemmt das Carnitin oder dessen Derivate nicht das Wachstum der Bakterien, Allzu hohe Konzentrationen sind jedoch zu vermeiden. Die bevorzugte Konzentration liegt bei 10 /Ug bis 100 mg/Liter,
Die Erfindung soll nachstehend an 14 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden,
Beispiel 1
Es wird ein auf einen pH-Wert von 7,2 eingestelltes Minimalmedium verwendet, das aus 1,5 g HaH2PO4; 6,9 g K2HPO4; 0,2 g MgSO4 . 7 H2O; 750/üg ^eSO4 . 7H2O; 75 yag MaSO4 . 4 H2O; 75 /Ug ZnSO4 . 7 H2O; 15 /Ug CuSO4 . 5 H3O; 15 /Ug CoCl2 , 6 H2O und 15 /Ug H^BO3 in 1 Liter bidestilliertem Wasser hergestellt wird. Als einzige Kohlenstoffquelle dient Hesadecan (6 g/l); ST-Qüelle ist HH4Cl (3 g/l)» Dieses Grundinedium wird mit D,L-Carnitin in.den nachstehenden, in Tab, I angegebenen Mengen versetzt,
100 ml dieses Mediums werden in 500 ml fassende Schüttelkolben mit Einstiehen gegeben und mit 2,0 ml einer Kulturflüssigkeit (optische Dichte bei 600 nm etwa 1,5) von Acinetobacter calcoaceticus 69/Y beimpft. Die Kulturflüssigkeit wird durch Abschwemmen von 24h alten Sehrägagarröhrchen mit Minimalmedium gewonnen. Die Züchtung wird bei 300C unter Schütteln durchgeführt, Die Ergebnisse sind in Tabelle I. zusammengefaßt,
Tabelle I
D,L-Carnitin- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach ange-Kon2entration gebener Züchtungsdauer (h) (g/l) 16 18 21 22 23
0 60 140 290 540 930 0,1 190 460 2600 3800 6900 0,3 240 570 3600 5500 7200
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Beispiel 2
Beispiel 1 wird wiederholt, anstelle von Hesadecan werden 10 g/l Parez (Kohlenwasserstoffgemisch der Kettenlängen ^12~^2O^ a^"s e^nz^ee Wachst uinskohlenst off quelle verwendet< Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II
DjL-Carnitin- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach Konzentration angegebener Züchtungsdauer (h) (g/l) 16 19 24
0 920 1600 6100
0,1 1100 3700 6300
0,5 1400 3900 7500
Beispiel 3
Gemäß Beispiel 1 wird Acinetobacter calcoaceticüs CCH 2355 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt«
Tabelle III ebener Züchtungsdauer (h) 9,5 13
D,1-Carnitin 8 600 3900
Konzentration Bakterientrockengewicht (mg/1) nach 190 1380 5800
(g/i) angeg 460 1500 6400
0 6 520
0,1 40
0,3 80
90
Beispiel 4
Gemäß' Beispiel 1 werden Acinetobacter calcoaceticüs Ξ3 104, COM 5572 und CCM 237b gezüchtet. Die Ergebnisse sind in fabelie 17 zusammengefaßt.
« *> «* j ι / /
Bakterienstamm
Oamitin-Zusatz (g/1)
Tabelle IT
Bakterientroekengewicht (mg/1) nach.
angegebener Zuchtungsdauer (h)
β 8 10 11 12 13 14 21
Ac^calco- aceticus EB 104 0,5 120 500 250 700 110 520 4900 5100 360 1900 5700 5900 1300 1900
Ac,Galeo- aceticus GCM 5572 0,5 150 250 630 1400 2500 1150 2300 3900
Ac.ealco- aceticus GCM 2376 0,5
Beispiel 5
Gemäß Beispiel 1 wird Ac. calcoaceticus &3/Ί gezüchtet. Als-Kohlenwasserstoffquelle wird jedoch anstelle der n-Päraffine ffialat (20 g/l) eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle T zusammengefaßt.
Tabelle Y (mg/1) nach 8
D, L-G aasiitin iungsdatier (n) 780
Konzentrat ion BakterientroGkengewicht 1500
(g/l) angegebener Züehl 200
O 1,5 4 700
0,5 20 40
50 90
L O 4 J i /
Beispiel 6
Beispiel 1 wird wiederholt, außer i),L-Carnitin werden jedoch auch L-Acetyl-Camitin, Cholin vind Acetyl-Cholin eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt«
Zusatz
Tabelle VI
Bakterientrockengewichi; (mg/1) nach angegebener Züchtungsdauer (h) 7 8,5 12 13,5
270 570 2000 5600
Cholin (1 g/l) 200 560 2200 6000
Acetyl-Cholin (lg/1) 390 800 4900 10700
D,!-Carnitin (0,5g/D 330 780 5200 10800
L-Aeetyl-Carnitin 810 1500 10200 11500
(0,5 g/l)
Beispiel 7
Gemäß Beispiel 1 wird Ac, calcoaceticus SB 104 gezüchtet, außer D,L-Carnitin werden jedoch Acetyl-Carnitin, Cholin und Acetyl-Cholin eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VlI zusammengefaßt.
Tabelle VII
Zusatz Bakterientrockenge'wicht (mg/1) nach
angegebener Züchtungsdauer (h) 11 13
Cholin (o,5 g/l) Acetyl-Cholin (0,5g
/1)
DjL-Carnitin
(0,5 g/l) L-A cetyl-Carnitin
(0,5 g/l)
6200 7450 8600
7350 6500
6450 7900
9700
7700 6850
6900
8600
15000
8850 7400
17
Beispiel 8
Gemäß Beispiel 1 werden Ac· Galeoaceticus 69/V und SB 104 gezüchtet.. Anstelle von B,L-Caraitin wird Glycinbetain als Zusatz verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle Till zusammengefaßt.
labeile VIII
Bakterien- GIycinstamrn betain
Zusatz
(g/l) 3,5 7,5
Bakterientrockengewicht (mg/1) nach angegebener Züchtungsdauer
Ch) 8 10 11 12 13 14,5 21,5 24
Ac.Calco- o, 5 50 60 2500 4000 100 5000 20 6400 5100
aceticus 60 80 2700 4500 210 6700 950 8000 10500
69/T _
Ac.calco- o, 5 4S0O
aceticus 940©
SB 104
Beispiel 9
Gemäß Beispiel 1 wird Ac.calcoaceticus CGM 2355 gezüchtet, Anstelle von D,!-Carnitin werden jedoch Acetyl-Carnitin bzw. Glycinbetain als Zusätze verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle U. zusammengefaßt.
Zusatz (0,5 g/l)
Tabelle ΓΣ
Bakterientrockengewicht (mg/1) nach angegebener Züchtungsdauer (h) 6 8 9,5 13
— 40 190 600 3900
Acetyl-Carnitin 280 1430 3700 7000
Glycinbetain 90 520 1500 5800
Beispiel 10
Gemäß Beispiel 1 werden Pseudomonas putida und Pseudomonas oleovorans gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle dient jedoch Octan (20 g/l). Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle
Bakterienstamm
Carnitin-Zusatz
(g/l)
Bakterientrockengewicht (mg/1)
nach angegebener Züchtungsdauer (h)
13
15
18,5
23,5
Ps. 0 - 50 90 650 280
oleovorans ,5 100 180 970 850
Ps. 0 _ 20 110
putida ,5 380 720
Beispiel 11
Gezüchtet wird Salmonella typhlmuriom unter partiell anaeroben Bedingungen« Als Substrat dient Komplezmedium (Pankreatisches Pepton). Gezüchtet wird in 14ml-Ansätzen in Reagenzgläsern. Dem Medium werden !-Carnitin, Acetyl-L-Carnitin, γ - Butyrobetain, Crotonbetain oder Gholin (jeweils 5 g/l) zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengefaßt.
Zusatz (5 g/l)
Tabelle II
Bakterientrockengewicht (mg/1) nach angegebener Züchtungsdauer (h), 19 24 46
Cholin Crotonbetain
320 330 430
1V -Butyrobetain 380 L-Carnitin 630 Acetyl-L-Carnitin 590
360 380 490
440 690 610
380 480 560
610 890 800
I /
Beispiel 12
Gemäß Beispiel, 11 wird Proteus vulgaria gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle JII zusammengefaßt.
Tabelle III
Zusatz Bakterientrockengewicht (mg/1) nach
(5 g/l) angegebener Züchtungsdauer (h)
24 48
350 480 850 940 540 660
Beispiel 13
Gemäß Beispiel 11 wird Sscheriehia eoli gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII zusammengefaßt,
Tabelle Uli
Zusatz Bakterientrockengewieht (mg/1) nach (5 g/l) angegebener Züehtungsdauer (h)
24 48
230 240 400 250 400 480
290
Acetyl-L-Carnitin 310
Cholin
Grotonbetain
^ -Butyrobetain
L-Carnitin 360
'- 220
Gholin 220
Crotonbetain 380
^ -Butyrobetain 220
!-Carnitin 370
Acetyl-L-Carnitin 430
L J k J 1 / /
Beispiel 14
Gezüchtet wird Acinetobaeter oalcoaceticua IB 104 nach Beispiel 1 (0j6 % Cjg auf Minimalmedi tun) unter Zusatz von lysin
Die Ergebnisse sind in Tabelle HY zusammengefaßt.
Tabelle XIV
Lysinkonzentration Bakterientrockengewicht (mg/1) nach (g/l) angegebener Zuchtungsdauer .(h)
3,5 4,5 5,5 6,5 7,5
_ 120 600 1200 2900 6200
0,1 220 700 1600 4300 6200
0,5 290 780 1800 4700 6400

Claims (27)

  1. 234317 7
    Erfindungsanspruch
    1. Verfahren zum Züchten von Bakterien, in einem flüssigen Minimalmedium, rlüssigen oder festen Komplerraedium unter Verwendung von Acetat, Malat, Glucose, Pares:, Mepasin o.dgl« als Kohlenstoffquelle und NH.G1 o.dgl« als Sttökstoffquelle,
    dadurch gekennzeichnet, daß
    als waehstumsfördernder Zusatz quaternäre Ammoniumverbindungen, insbesondere Choiin, Acetylcholin, Lysin, D,L-, l(-) oder D(+)-Carnitin, dessen Vorläufer, Abbauprodukte und/oder Derivate eingesetzt werden«
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus 69 V gezüchtet wird,
  3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobaeter ealcoaceticus CCM 2355 gezüchtet wird«
  4. 4. Verfahren nach Punkt T, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus EB 104 gezüchtet wird« .
  5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus CCM 5572 gezüchtet wird«
    6« Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus GCM 2376 gezüchtet wird«
  6. 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas putida gezüchtet wird«
    8, Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas oleovorans gezüchtet wird«
    L J 4 ά 1 I I *
  7. 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet,..daß der Stamm Salmonella typhimurium LSp gezüchtet wird.
  8. 10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Proteus vulgaris gezüchtet wird.
  9. 11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Sscherichia coli 044 K74 gezüchtet wird.
  10. 12. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acetobacter gezüchtet wird«
  11. 13. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Giuconobaeter gezüchtet wird.
  12. 14. Verfahren nach Punkt 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Mischkulturen gezüchtet werden«
  13. 15. Verfahren nach Punkt 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Aeinetobacter calcoaceticus 69 V, GCM 23559 BB 104, CGM 5572, CCM 2376, Pseudomonas putida, Pseudo» monas oleovorans, Salmonella typhimurium LT^» Proteus vulgaris, üscherichia coli 044 K74, Acetobacter, Gluconobacter .jeder für sich oder in belieöiger Kombination miteinander anwesend sind bei der Züchtung beliebiger anderer Arten von Mischkulturen.
  14. 15. Verfahren nach Punkt 1 bis 15? dadurch gekennzeichnet, daß als Carnitinvorläufer Crotonbetain oder Butyrobetain •verwendet werden.
  15. 17. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carnitinderivate ein Acylcarnitin, Alkylcarnitin oder Acyl-Alkylcarnitin verwendet,
  16. 18. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylcarnitine solche mit Pettsaurere sten der Kettenlänge zwischen Cp und Cp^ wie 3,B, Acety!carnitin, Propionylcamitin, Butyry !carnitin, Pälini toy !carnitin
    oder Stearoylcarnitin verwendet. -
  17. 19. Verfahren nach Punkt 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylcarnitin Methyl- oder Xthylcarnitin verwendet.
  18. 20. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Crotonobetainderivat ein Alkylcrotonobetain verwendet .
  19. 21. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Älkylcrotonobetain Methyl- oder Äthylcronotobetain verwendet.
  20. 22. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Butyrobetainderivat ein Alkylbutyrobetain verwendet .
  21. 23. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylbutyrobetain Methyl- oder Athylbutyrobetain verwendet.
  22. 24. Verfahren nach Punkt 1 und 16-23, dadurch gekennzeichnet, daß man Hitrile und Amide der entsprechenden Betaine einsetzt.
  23. 25. Verfahren nach Punkt 1 some 9-11 und 14-24, dadurch gekennzeichnet, daß unter partiell anaeroben Bedingungen gezüchtet wird.
  24. 26. Verfahren nach Punkt 1 sowie 9-11 und 14-24, dadurch gekennzeichnet, daß mikroaerophil gezüchtet wird.
  25. 27. Verfahren nach Punkt 1 sowie 9-11 und 14-24, dadurch gekennzeichnet, daß anaerob gezüchtet wird.
  26. 28. Verfahren nach. Punkt 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstumsförderung in vivo stattfindet.
  27. 29. Verfahren nach Punkt 1-28, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumverbindungen standardisierten festen oder flüssigen Minimal- oder Komplex-?ertignährböden zur Bakterienkultivierung zugesetzt werden.
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