DD150199A1

DD150199A1 - Verfahren zur herstellung von neuen peptidwirkstoffen

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Publication number: DD150199A1
Application number: DD80220769A
Authority: DD
Inventors: Klaus Neubert; Burkhard Mehlis; Bianka Hartrodt; Hans-Dieter Jakubke; Peter Oehme; Jutta Bergmann
Original assignee: Klaus Neubert; Burkhard Mehlis; Bianka Hartrodt; Jakubke Hans Dieter; Peter Oehme; Jutta Bergmann
Priority date: 1980-04-30
Filing date: 1980-04-30
Publication date: 1981-08-19

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen, die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekuel enthalten. Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von biologisch aktiven Wirkstoffen mit verbesserten Eigenschaften, insbesondere einer Wirkungsverstaerkung, Erhoehung der Stabilitaet, Verbesserung der Transporteigenschaften sowie einer Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften. Die Aufgabe, solche Wirkstoffe zu entwickeln, wurde dadurch geloest, dasz Peptidwirkstoffe bzw. biologisch aktive Analoga, darunter verkuerzte oder modifizierte Teilsequenzen, durch Saeureamidbindungen - entweder ueber freie Alpha-oder Omega-Amino- bzw.Carboxylgruppen oder ueber Brueckenreagenzien - kovalent an cyclische Peptide gebunden werden. Die Erfindung ist von Bedeutung fuer die pharmazeutische Industrie, die klinische Pharmakologie und Diagnostik.

Description

Ve r fan r en zu r Hers te 11 u nc;. yo_n_ji eii e η Pep ti dwi rk st ο f_uf e η ^

Anwendungsgebiet dor Erf.in..du_Tng

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen , die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekül enthaltene Durch die erfindungsgemäße Bindung von linearen Peptidwirkstoffen bzw«, biologisch aktiven Wirkstoff analoga , darunter verkürzten oder modifizierten Teilsequenzen (im folgenden auch als Wirkstoff bezeichnet), an cyclische Peptidstrukturen werden Wirkstoff-Cyclopcptid-Konjugate mit potentieller Wirkungsverstärkung, einschließlich einer prologierten bzw. differenzierten biologischen Aktivität, erhalten, die durch Substitution an bestimmten funktionellen Gruppierungen über ein weites Spektrum modifiziert werfen können Die Erfindung ist von Bedeutung für die pharmazeutische Industrie, die klinische Pharmakologie und Diagnostik.

Es ist eine große Zahl von Verfahren zur Knüpfung von Peptidbindungen bekannt. Auch sind Verfahren beschrieben, die zur Cyclisierung linearer Peptide führen (vgl. E. Wünsch, Synthese von Peptiden - Houben - Weyl Bd. 15/1 und II, Methoden öer organischen Chemie, Ed» E* Müller, Georg Thiems Verlag Stuttgart , 1974).

Obwohl eine Verankerung von Wirkstoffen, darunter pharmakologischer und agrochemischer Art, an polymere Träger vor allem

mit immunologischer Aufgabenstellung und zur Depotwirkung, seit längerem bekannt ist (G.E. Allan et al., Nature ,234^ 349 (1971); H .G. ßatz et al., Angew. Chem. 84, 1189 (1972); K. Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 3516 (1976), ist eine kovalente Fixierung von Peptidwirkstoffen an cyclische Peptidstrukturen mit der Zielstellung einer Wirkungsverstärkung bisher in der Literatur nicht beschrieben worden.

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von Peptidwirkstoffen bzw. biologisch aktiven Wirkstoffanaloga mit verbesserten Eigenschaften, insbesondere einer Wirkungsverstärkung, Erhöhung der Stabilität, Verbesserung der Transporteigenschaften sowie einer Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften.

Darlequna des Wesens der Erfinduna

mn »Μ ιι —ιιιιιιιιΛ ι ι ι ιΐ mi* V.i.ninn ι ιι.ιι» .μ »μ .im t.mmimimi... ιι ι im μπιιμ ι ι mi ιι n 11. ιιι ι Πιι'ι

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Peptidwirkstoffe bzvj. biologisch aktive Wirkstoffanaloga zu entwickeln, die folgende Vorteile aufweisen:

a) Potentielle Wirkungsverstärkung des betreffenden Wirkstoffes, einschließlich prolongierter bzw. differenzierter biologischer Wirkungen infolge Änderung der Molekülparameter, besonders dor Hydrophobie der Molekülstruktur

b) Potentielle Verbesserung der Transporteigenschaften des betreffenden Wirkstoffes

c) Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften des betreffenden Wirkstoffes durch entsprechende Substitution an geeigneten funktioneilen Gruppen

der Peptidketten, die die Lipophilie der Molekülstruktur und andere physiko-chemische Parameter gezielt verändern

d) Erhöhung der Stabilität des betreffenden Wirkstoffes gegenüber enzymatischem Abbau»

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Peptidwirkstoffe bzw

biologisch aktive Analoga, darunter verkürzte oder modifizierte Teilsequenzen, durch Säureamidbindungen - entweder über freie c£ - oder έ^-Amino- bzw. Carboxylgruppen oder über Brückenreagenzien - kovalent an cyclische Peptide gebunden werden

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellten Verbindungen sind durch die allgemeinen Formeln I bis IV

L_x. (X)_n- _YJ

- -w

Z -(X)_nTT] III

Z - (X)_n - Y - W^;. IV

gekennzeichnet, worin

W - für die Aminosäuresequenz eines Wirkstoffes X - für einen beliebigen Aminosäurerest

Y - für Asp, GIu (Verbindungstyp I bis III), Lys, Orn, Dab (Verbindungstyp I, III, IV) (Abkürzungen für Aminosäuren und Peptidderivate vgl. IUPAC-

IUB Commission on Biochemical Nomenclature - 0. Biol. Chem. 247, 977 (1972)

Z- im Falle von Y «= GIu, Asp, Lys, Om, Dab für Lys, Om und Dab (Verbindungstyp III) und im Falle von Y ·= Orn, Lys, Dab für GIu und Asp (Verbindungstyp IV)

stehen und

η - die Bedeutung O, 1, 2, 3, 4, 8, 10 besitzt.

Die lineare Vorstufe der gewünschten cyclischen Peptidstruktur mit selektiv geschützter Seitenkettenfunktion (Verbindungstyp I und III) bzw. mit selektiv geschützter C-terminaler Carboxylgruppe an Y (Verbindungstyp II und IV) wird nach den bekannten Verfahren der Peptidchemie aufgebaut (vgl. E* Yi/ünsch, s.o.), danach in eine für die beabsichtigte Cyclisierungsstrategie

DCCI-Verfahren mit Zusatzkomponenten (A) Mischanhydrid-Methode (B) - Azidverfahren (C)

Aktivesteraminolyse (D)

erforderliche Struktur der allgemeinen Formeln V bis VIII RRS ι * ι

H₂N - X - (X)_n - Y - T (V)

RRT • · I

H₂N - X .- (X)_n -Y-S (VI)

H₀N R S. I : l

S-Z- (X)_n - Y - T (VII)

- 5 - d ZX T R NH₀

1:1

S-Z- (X)_n - Y - S (VIII)₁

worin X₁ Y, Z und η wie zuvor definiert" sind und R, S_t T folgende Bedeutungen besitzen:

R - in Abhängigkeit der Synthesestrategie eventuell erforderlicher Seitenkettenschutz bei trifunktionellen Aminosäuren

S - entsprechend der Festlegung für Y und Z eine ei— oder to -Amino- bzw. °6 - oder Co -Carboxylschutzgruppe

T - OH (Cyclisierungsvariante A bzw. B) NH-NH„ (Cyclisierungsvariante C) , Überführung ins Azid aktivierter Ester (Cyclisierungsvariante D)

überführt und nach einer der genannten Strategien der Ring-ίchlußreaktion unterworfen. Man erhält nach Reinigung an Ionenaustauschern und Sephadex-Gelfiltration als Zwischenproduktedie cyclischen Peptide der allgemeinen Formeln ,IX bis XII

(IX)

• 11 ι

RRS

U ~ (X)_n - Y - S (X)

I f

1 η

R R

S-Z- (X)_n - Y-J (XI)

j I

RS

S-Z- (X)_n - Y - S (XII) ,

R .

worin X, Y, Z, R₁ S und η die oben genannte Bedeutung haben.

Nach selektiver Freisetzung der Seitenkettenfunktion an Y wird an das cyclische Peptid der vorgesehene lineare Peptidwirkstoff kovalent gebunden. Dabei können auch verkürzte oder modifizierte Teilsequenzen des linearen Peptidv/irkstoffs eingesetzt werden. Man verwendet Sequenzen, die für die kovalente Bindung geeignete teilgeschützte Strukturen besitzen und knüpft die Bindung über eine freie N-terminale Amino- bzw« C-terrainale Carboxylgruppe bzw. eine freie ζύ -Amino- oder Carboxylfunktion in der Seitenkette oder über sogenannte Brückenreagenzien, wie Dicarbonsäuren bzw. Alkyldiamine unterschiedlicher Kettenlänge, nach den üblichen Methoden der Peptidchemie*

Anschließend werden die verbliebenen Schutzgruppen unter den in der Peptidchemie üblichen Bedingungen durch Acidolyse, Hydrogenolyse, alkalische Hydrolyse oder Hydrazinolyse entsprechend der Zielstellung vollständig oder teilweise entfernt. Nach Reinigung, vorzugsvjeise durch Säulenchromatographie an Kieselgel bzw. Sephadex wird das gewünschte Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugat der allgemeinen Formeln I bis IV erhalten. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen weisen eine erhöhte bzw. prolongierte oder differenzierte biologische Aktivität auf «

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es.werden folgende Abkürzungen verwendet:

— 7 —

Aminosäuresymbole entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 0. Biol. Chem« 247, 977 (1972)

AcOH Essigsäure

Boc tert .-Butyloxycarbonyl

DC Dünnschichtchromatogramm, -chromato

graphisch

DCCI N ,N'.-Dicyclohexylcarbodiimid _f

DHF Dimethylformamid

HE Essigsäureethylester

Fp Schmelzpunkt

i. Vak. , im Vakuum

fiin* Minuten

OBut terto Butylester

OMe Methylester

OPfp Pentafluorphenylester

RT Raumtemperatur

TFA ' Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

Z Benzyloxycarbonyl

Folgende Laufmittelsysteme (in Volumenanteilen) zur Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Fertigplatten (Silufol UV 254, CSSR) wurden verwendet :

BAW 2-Butanol-Ameisensäure-Wasser 80+20+20

BEW I-Butanol-Essigsäure-Wasser 75 + 13,5 + 11,5

CM Chloroform-Methanol 90+10

EPEW Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser 10 + 10 + 10 +

Bei den Aminosäureanalysen stellt die mit *) gekennzeichnete Aminosäure den Bezugsviert dar.

Beispiel I

Kovalente Bindung von Substanz P (7-11) ~ Pentapeptid an cyclo (Glu-Pro)

cyclo (GIu - Pro)

^x I—phe - Phe - GIy - Leu - Met - NH₂

I» 1. cyclo (GIu - Pro)

OH

Von 4,5 g (10 mMol) Z-Glu(OBut)-Pro~OMe in Methanol wird mit Pd/Kohle (10%) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe bei 30⁰C hydrogenolytisch entfernt. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat i· Vak. auf ca. 30 ml eingeengt. Nach Zugabe einiger Tropfen 32%-iger Ammoniaklösung wird der Ansatz 24 h bei ca. 45 C stehen gelassen, anschließend i. Vak eingeengt, mit Ether verrührt, abfiltriert und der erhaltene Rückstand zur Entfernung der tert. Butylestergruppe mit 20 ml Trifluoressigsäure bei RT behandelt. Nach 45 Min. wird das Spaltreagenz i. Vak. abgezogen und der ölige Rückstand mit Ether digeriert, abgesaugt, mit Ether gewaschen und über getrocknet«,

Ausbeute: 0,85 g (38 % d. Th., über 3 Stufen) Fp: 173 - 175⁰C

DC: einheitlich in BEW, CM, EPEW

₄ (226,33) Ber· C 53,09 H 6,24 N 12,38 ' Gef. C 52,89 H 6,58 N 12,70

I. 2« H- Phe - Phe - GIy- Leu - Met - NH_£ . HCl

Der Aufbau des Pentapeptids erfolgte ausgehend von 3,0 g (10 EiMoI) H-Lou-Mot-NHg.HCl -(H.-D. Dakubke, Ch. Kleßen, K. Neubert; 3. prakt. Chem. ,319,, 640 (1977) durch schrittweise Anknüpfung der entsprechenden tert .«Butyloxycarbonylamino~ säure-pentafluorphenylester (13 mMol) in DMF (K. Neubert, B. Hartrodt, S. Koch, M. Bienert, E. Klauschenz, H.-D. Dakubke; Die Pharmazie, im Druck). Zur Deblockierung der N^-Aminoschutzgruppen diente jeweils 1,1 η HCl/AcOH - 30 Min. bei RT.

Ausbeute: 5,2 g (80 % d. Th.) Fp : Zers . ab 140⁰C

: - 77,6 ^w (c-1,

DC: einheitlich in BEW, EPEW

I. 3. cyclo (GIu - Pro)

- Phe - GIy » Leu - Met -

a) Koyalente Bindung nach der Mischanhydrid-Tec^hnik.

0,4 g (1,77 mMol) cyclo (GIu - Pro) werden in 20 ml THF/DMF (4:1) gelöst und nach Abkühlen auf -15°C mit 0,22 ml (1,77 mMol) N-Ethylmorpholin versetzt* Unter Rühren gibt man 0,23 ml (1,77 mMol) Chloraneisensäureisobutylester zur Lösung« Nach 8 Min. fügt man 0,13 ml (1,42 mMol) N-Ethylmorpholin und sofort danach 0,92 g (1,42 mMol) H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NHg.HCl in 10 ml

THF hinzu. Man rührt 2 h bei -15°C und 12 h bei RT. Danach wird das Lösungsmittel i. Vak. abgezogen, der Rückstand mit Wasser ausgerührt, abgesaugt und auf öer Fritte nacheinander mit 5%iger KHSO^-Lösung, V/asser, gesättigter NaHCOg-Lösung und Wasser gewaschen und i. Vak«über PoOc- getrocknet» Anschließend wird

- 10 -

das Rohprodukt jeweils 2 mal mit 25 ml Methanol und Ether extrahiert und aus Essigsäure/Ether umgefällt.

Ausbeute: 0,44 g (38 % d. Th.) Fp: 172,5 - 173,5⁰C Md^2; ~ 43,2° (c-1, AcOH) DC: einheitlich in CM, EPEW

Aminosäuren-Analyse: GIu Pro Phe GIy Leu Met

Ber· 112 11 1 Gef. 0,89 0,92 2,04 1,00 1,00 0,87

Bi o-lοqische^Testu^a : Kontraktion am isolierten Meerscbwein

chen-Ileum

Relative Aktivität: 27 % (Substanz P £ 100 %) Vergleichswert für Substanz P (7~11)-Pentapeptid : 1,4 %

b) j^ya^njtLg__j^

Zu einer auf -5 C gekühlten Lösung von 0,3 g (1,33 mMol) cyclo(Glu-Pro) , 0,84 g (1,3 mMol) H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NI-^.HCl, 0,17 ml (1,3 .mMol) N-Ethylmorpholin und.0,2 g (1,46 mMol) N-Hydroxybenzotriazol in 8 ml DMF gibt man O,3 g (1,46 mMol) DCCI in 2 ml DMF hinzu und läßt den Ansatz 0,5 h bei -5⁰C, 2 h bei O⁰C und 12 h bei RT rühren. Nach Zugabe einiger Tropfen AcOH wird die Reaktionsmischung auf O⁰C abgekühlt, der sich gebildete Dicyclohexylharnstoff abgetrennt, i. Vak. eingeengt und das Rohprodukt durch Zugabe von 5%iger KHSO.-Lösung ausgefällt. Der Feststoff wird wie unter a) beschrieben aufgearbeitet.

Ausbeute: 0,35 g (33 %.d.Th.) Fp: 172.- 174 ⁰C

ψ ι - .43,0° (C-I, AcOH) einheitlich in CMj EPEW _ΛΛ

- αϊ - *

Seispiel II

Kovalente Bindung von Substanz P (6-ll)~Hexapeptid an cyclo (Glu-Pro)

cyclo (Glu-Pro)

- Phe - Phe - GIy - Leu - Met - NH₂

0,23 g (1 mMol) cyclo(Glu-Pro) werden unter Rühren in 12 ml THF/DMF (3:1) gelöst und bei -15⁰C mit 0,13 ml (1 mMol) N-Ethylmorpholin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt. Nach 8 Min« gibt man 0,1 ml (0,8 mMol) N-Ethylmorpholin und sofort danach 0,62 g (0,8 mMol) H-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met, -ΝΗ₂·Η0ί (erhalten nach 1.2. durch Umsetzung von H~Phe-Phe-Gly-Leu~Met-NH₂ mit Boc-Gln-QPfp und anschließende Deblockierung mit 1,1 η HCl/AcOH ~ 10 Min. bei 1O⁰G, ümkristallisiert aus Methanol/EE; Fp: 228 - 233⁰C,

p: - 43,0 ° (c~0,5;DMF) in 10 ml DMF) hinzu. Der Ansatz wird 2 h bei -15°C und 12 h bei RT gerührt und wie unter 1.3.a) beschrieben aufgearbeitet.

Ausbeute: 0,32 g (42 % d. Th.) Fp: 209 - 210,5⁰C

²: ~ 56,3 ° (c-0,5; AcOH) DC: einheitlich in CM, EPEW

Aminosäuren-Analyse: GIu Pro Phe GIy Leu Met

Bar .2 1 2 11 1 Gef_s 2,00 0,91 2,07 1,00 1,00 0,85

S^SiSEä^EilS-Xf-äiidilS-i Kontraktion am isolierten Meerschvieinchen·

Ileum

Relative Aktivität: 227 % (Substanz P £> 100 %) Vergleichswert für Substanz P (6->ll)~Hexapeptid : 50 %

Claims

Erfindungs ansp ruch

1, Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen, die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekül enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugate der allgemeinen Formeln I bis IV

L_x _ _(X)_n _ yJ L_x _ _(x)n „ _Y

II

III IV

worin

Vi - für die Atainosäurefrequenz eines Wirkstoffes X - für einen beliebigen Aminosäurerest

Y - für Asp, GIu (Verbindungstyp I bis III), Lys , Orn, Dab (Verbindungstyp I, III, IV)

Z - im Falle von Y« GIu, Asp, Lys, Orn, Dab für Lys, Orn und Dab (Verbindungstyp III) und im Falle von Y» Orn, Lys, Dab für GIu und Asp (Verbindungstyp IV)

stehen und

η - die Bedeutung O, 1, 2, 3, 4, 8, 10 besitzt, aus cyclischen Peptiden der allgemeinen Formeln IX bis XII, die durch Ringschluß linearer Strukturen der allgemeinen Formeln V bis VIII entstehen

RRS RRT

X-(X)_n-Y-T H₂M-X-(X)_n-Y-S

V VI

~ 2

NH^ R

S- Z - (X)_n- Y-T

VII

R NH₀

:1

S-Z- (X)_n - Y - S

VIII

- γ - S

S_ y _

XI

„., γ !

R S

S-Z- (X)_n - Y - S

XII,

worin X, Y, Z und η wie zuvor definiert sind und

fi-~ in Abhängigkeit der Synthesestrategie eventuell erforderlicher Seitenkettenschutz bei trifunktionallen Aminosäuren

S - entsprechend der Festlegung für Y und Z eine dL - oder 0 -Amino- bzw. o£- oder fo -Carboxylschutzgruppe

T - OH, NH - NH₀, aktivierter Ester

bedeuten,

und linearen Peptidvjirkstoffen bzw. biologisch aktiven Analoga, darunter verkürzten oder modifizierten Teilsequenzen, durch kovalente Verknüpfung gewonnen werden*

2* Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclischen Peptide mit in Abhängigkeit von äer Aminosäuresequenz und unter Berücksichtigung essentieller Strukturelemente partialgeschützten Peptidwirks.toffen bzw. biologisch aktiven Analoga, darunter verkürzten oder modifizier·

- 3

-IB-

ten Teilsequenzen, über eine .freie N-terminale Amino- bzw* C-terminale Carboxylgruppe bzw. eine freie CO -Amino- oder Carboxylfunktion in der Seitenkette oder über Brük- kenreagenzien, wie Dicarbonsäuren oder Alkyldiamine, über Säureamidbindungen verknüpft, anschließend die verbliebenen Schutzgruppen vollständig oder partiell entfernt werden und nach Reinigung die Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugate erhalten werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclischen Peptide der allgemeinen Formeln IX bis XII durch Ringschluß der linearen Strukturen V bis VIII gebildet werden, wobei als Cyclisierungsstrategie das DCCI-Verfahren mit Zusatzkomponenten oder die Mischanhydrid-Methode gewählt werden, wenn T für OH steht, das Azidverfahren gewählt wird, wenn T für NH - NH₂ steht und die Aktivesteraminolyse gewählt wird, wenn T für aktivierter Ester steht.