DD150508A1

DD150508A1 - Verfahren und messgeraet zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten

Info

Publication number: DD150508A1
Application number: DD21784379A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Michael Jaenchen; Ingrid Seyer; Martina Siepe; Rudi Pittelkow
Original assignee: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Michael Jaenchen; Ingrid Seyer; Martina Siepe; Rudi Pittelkow; Semm Juergen; Wiegand Peter; Holesch Horst; Lange Gerald; Bertermann Karl; Kahrig Erwin; Mohr Peter; Walzel Gerd
Priority date: 1979-12-19
Filing date: 1979-12-19
Publication date: 1981-09-02
Also published as: DD150508B1

Abstract

Es besteht das Ziel, die Konzentration in mikrobiologischen und physiologischen Loesungen einfach und damit oekonomisch guenstig zu bestimmen. Die Erfindung loest die Aufgabe mit einem Meszgeraet auf der Basis einer Enzymelektrode, die in die geruehrte Meszzelle oder eine Durchfluszanordnung eingefuehrt ist, ohne selektive Membranen oder Differenzmessung, indem der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve nach Zugabe der Meszprobe als Meszsignal dient. Die Enzymelektrode besitzt vor der Indikatorelektrode eine Gelatineschicht von 5 bis 50 my Dicke, die 2 bis 100 Einheiten/cm&exp2! des Enzyms eingeschlossen sind. Zur Angleichung des kolloidosmotischen Drucks an die zu untersuchende Probe ist der Meszloesung ein Polymer zugesetzt. Die Meszzelle befindet sich zur Konstanthaltung der Temperatur an der Innenwand eines Badthermostaten, dessen Umwaelzpumpe zum Entleeren der Loesungen aus der Meszzelle verwendet wird.

Description

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Erfinder: Dr. F. Scheller D· Pfeiffer M. Jänohen I. Seyer M. Siepe R. Pittelkow

Verfahren und Meßgerät zur Konzentrationsbestimmung von S toffwechs eiprodukt en

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die"Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Meßgerät zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten in Fermentationslösungen sowie in verdünntem Serum, Plasma oder Vollblut,, Das Verfahren eignet sich für.die Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten, z. B. Glukose, im mikrobiologischen und im klinischen Labor,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Amperornetrische Enzymelektroden gewinnen wachsende Bedeutung für die Konzentrationsbestimmung im klinischen sowie mikrobiologischen Labor sowie im.Umweltschutz (D. Gray, M. Keyes, B. Watson; Analyt. Chem. 49, 1067 (1977)). Die Anwendbarkeit wird.durch Störungen, die von Bestandteilen der Meßprobenj ζ. Be des Blutes hervorgerufen werden, eingeschränkt: Lösungsbestandteile, die beim Potential der Indikatorreaktion (H₂0₂-Oxydation: + 600 mV; 0₂-Reduktion: - 600 mV) ebenfalls umgesetzt werden, führen zu einer fehlerhaften Vergrößerung des Meßwertes. Das gilt vor allem für die Messung des stationären Stroms oder auch für die kinetische Methode (G. Quilbault, Methods in Enzymology XLIV, 585 (1976)). Zur Ausschaltung dieser Störungen sind selektive Membranen geeignet, die nur das Substrat der Indikatorreaktion zur Elektrode gelangen lassen. Zum Beispiel wird durch eine spezielle "HoO^- ve Membran" die '.'Restreduktion¹¹ des Blutes ausgeschaltet (US Patent 3.979.274).

Der gleiche Effekt wird durch Og-permeable Membranen (z. B, Teflon oder Polyethylen),die z.-B« von Sauerstoffelektroden bekannt sind, erreicht» Dieses Prinzip ist nur bei der Messung des Op-Verbrauches möglich, es ergibt aber in Fermentationslösungen oder in venösem Blut zu hohe Meßwerte für die Konzentration des Stoffwechselproduktes, da sich die Erniedrigung der O₂-Konzentration in der Meßprobe zum Wert.des Op-Abfalls in der Enzymschicht vor der Elektrode addiert. Die Sättigung der Meßlösung durch Einleiten von Luft während der Messung löst dieses Problem nicht befriedigend, da die Reproduzierbarkeit schlecht und außerdem ein Zusatz von Antischaummittel notwendig ist. (P₀ Reitnauer, DDR Patent 127861)« Dagegen führt eine Differenzmessung mit je einer Enzym- und einer enzymfreien Elektrode (BRD Patent 1598285) zu reproduzierbaren und richtigen Ergebnissen sowohl bei der Op- als auch der HpO₂~Messung_e Allerdings erfordert diese Anordnung einen hohen apparativen und elektronischen Aufwand, da die zeitlichen Veränderungen beider Elektroden ständig abgeglichen werden müssen (S. Bessman et« al. Diabetes 25, 81 (1976)).

Eine weitere Störung (sowohl bei der Op- als auch der HpOp-Anzeige) zeigt sich in der Wechselwirkung der Messungen zwischen Meßprobe und proteinfreien Eichstandards. So erfolgt eine Erniedrigung um 10 - 20 % der Meßwerte für die Standards nach etwa 5-10 Blut- oder Serumproben, so daß.eine häufige Eichung notwendig ist (D₀ Thevenot et. al. Proc. 9th ISE-Meeting, Budapest, 1978). Es wurde bereits vorgeschlagen (F. Scheller et. al. DDR Patentschrift 131203), zur Verkürzung der Meßzeit bei der stationären Messung mit Enzymelektroden die Meßlösung stark zu rühren sowie die Indikatorelektrode fest gegen die Enzymschicht anzupressen,, Auch diese Maßnahmen reichen noch nicht aus, um den Einfluß von störenden Substanzen auf den Meßwert zu eliminieren, so daß zu hohe Y/erte erhalten werden.und außerdem auch noch Vergiftungserscheinungen auftreten«

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und ein Meßgerät zur Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten in physiologischen oder mikrobiologischen Lösungen zu entwickeln, das bei einfachem Aufbau die aufgezeigten Nachteile nicht-besitzt und damit breit anwendbar, ökonomisch günstig ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Meßgerät zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten zu entwickeln, das auf der Grundlage der Anzeige des maximalen Anstiegs der Strom-Zeit-Kurve (kinetisches Verfahren) einer Enzymelektrode ohne selektive Membranen oder Differenzmessung (zu einer enzymfreien Elektrode) in physiologischen oder mikrobiologischen Lösungen die schnelle und genaue Bestimmung der Konzentration von Stoffwechselprodukten ermöglichte Das erfindungsgemäße Verfahren und Meßgerät basiert auf.einer Enzymelektrode zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten. Sie besitzt eine Enzymschicht von 5-50 /Um Dicke, in.der 2-100 Einheiten des Enzyms in Gelatine eingebettet sind, unmittelbar vor der Indikatorelektrode. Als Enzyme dienen HgOg-erzeugende bzw. 0₂-verbrauchende Enzyme wie Glukose-oxydase, Urikase, Cholesterol-oxydase und Aminosäure-oxydase. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, ein zweites Enzym, das die Konzen~ tration des angezeigten Substrates verändert, zuzusetzen. In Betracht kommen beispielsweise Invertase, Hexokinase und Cholesterol-esterase.

Die Enzymelektrode ist in die gerührte Meßzelle oder eine Durchflußkammer eingeführt und wird auf ein konstantes Potential von + 600 mV bei der H₂o₂-Messung bzw. - 600 mV bei der O₂-Verbrauchsmessung gegenüber der Ag/AgCl-Bezugselektrode polarisiert. Der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve (bei konstantem Potential) nach Zugabe der Meßprobe.wird durch das elektronische Meßgerät ermittelt und angezeigt.

Der Meßwert stellt sich durch dieses Meßprinzip sowie die wendeten Membranen bereits ein, bevor störende Bestandteile die Indikatorelektrode erreichen»

Weiterhin wird der kolloidosmotische Druck der wäßrigen Eichstandards und der Spüllösung durch Zusatz eines Polymeren dem der Meßlösungen angeglichen, so daß sich die Quellung der Enzymschicht beim Messen und Spülen nicht veränderte Da'die Messung eine Temperierung der Meßlösung, der Zelle sowie der Elektrode erfordert, wird die Meßzelle direkt an der Innenwand eines Badthermostaten angebracht, wobei die Enzymelektrode durch eine Bohrung von außen horizontal in die Meßzelle eingeführt wird» Die horizontale Anordnung der Elektrode am Rande der zylindrischen Meßzelle sichert eine starke Konvektion bei Verwendung eines Magnetrührers_o Zur Verringerung der Einwirkdauer der Meßprobe auf die Enzymelektrode wird die Lösung unmittelbar nach Erreichen des Meßwertes aus der Meßzelle durch'eine Bohrung im Boden abgesaugt. Zur Erzeugung des Vakuums in einem Abfallgefäß wird zweckmäßig die Pumpe des Thermostaten verwendete

Ausfuhr ungsbeispiele

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden:

Beis_p_iel__l

Präparati^on^der Enzymmembran;

Zur Immobilisierung von lyophilisierter Uricase wird eine 5 %ige Gelatine-Wasser-Lösung hergestellte Dazu wird die Fotogelatine mit der Hälfte der Flüssigkeit 1 h bei Zimmertemperatur vorgequollen und anschließend nach Zugabe der restlichen Flüssigkeitsmenge bei 40⁰O ca. 1 h vollständig gelöst, wobei die Lösung in zeitlichen Abständen von 15 min durchgeschüttelt wird.

0,4 ml der fertigen Gelatinelösung werden mit 100 U Uricase

2 gut vermischt und anschließend auf 10 cm einer unsubstrier-

17 8 4 3

ten planen Filmunterlage ausgestrichen. Nach 12h Trocknungsdauer wird die Enzymmembran abgenommen und im Kühlschrank gelagert.

Meßlösungen

Zur Herstellung des Harnsäure-Einchstandards, der Spüllösung sowie zum Verdünnen der Blutproben wird folgende Grundlösung verwendet: 1 Liter enthält:

1,8 g KH₂PO₄; 9,6 g Ua₂HPO₄ · 2H₂O; 1,05 g Ia-Benzoat; 2,3 g KaCl; 0,3 g KaF; 1 g K₃C₂O₄ · H₂O; 2 g Dextran M 75 (pH 7,3).

Die Eichstandards werden durch Einwägen von wasserfreier Harnsäure hergestellte Die Blutproben v/erden wie folgt präpariert: 50 /Ul Blut werden in 450 ,ul der Grundlösung gegeben und kurz durchmischt„

Meßvorgang

Vor Beginn einer neuen Messung ist die Temperierung der Meßlösung zu sichern. Die Einbrenndauer des Gerätes beträgt etwa 20 Minuten nach dem Einschalten.

Die Meßzelle-wird mit etwa 2 ml Grundlösung gefüllt und wieder entleert«,

Danach erfolgt die exakte Vorgabe der Meßlösung (2 ml)₉ und nach der Einstellung des O-Wertes wird die Meßprobe (0,5 ml) zügig in die Meßzelle gegeben. Sofort nach Erreichen des Meßwertes, wird die Probe entfernt,und die Zelle kann gespült werden.

Am Anzeigegerät wird der Meßwert in mg/dl angezeigt. Bei der Eichung erfolgt über ein Potentiometer die Einstellung auf den deklarierten Wert.

Meßgerät

Ein rundes Membranstück von 3 mm Querschnitt wird zwischen einer Zelluloseacetat- (16 /um Dicke) und einer Polyethylenmembran auf der Stirnseite des Mantels einer üblichen O₀-

. ·- 6 - 2.

Stabmeßzelle gespannt. In den Elektrodenmantel werden 0,2 ml 0,1 M KCl gegeben und der Elektrodenkörper eingeführt, so daß durch eine Überwurfmutter die Pt-»Indikatorelektrode straff gegen die Membranen an der Stirnseite angepreßt wird«' Die präparierte Enzymelektrode wird in eine Bohrung der Meßzelle durch die Thermostatenwand eingeführt und mit einer zweiten Überwurfmutter straff gegen die Außenwand der Meßzelle gepreßt. Dabei befindet sich die Indikatorelektrode unmittelbar in ein'er durchgehenden Bohrung, so daß die.Membran mit der Lösung in der Meßzelle in Kontakt gelangen. An der Unterseite der Meßzelle ist in einem' angeschraubten Gehäuse ein Rührmotor mit Scheibenmagnet untergebracht, der mittels Rühr-flow die Strömung in der Meßzelle erzeugt.

Am Boden der Meßzelle ist eine Kanüle angebracht, die mit einem- dünnen.Schlauch mit einem Vakuumvorratsgefäß in Verbindung steht_β Diese Verbindung wird durch ein Magnetventil verschlossen, und das Vakuum wird durch die Saugpumpe des Thermostaten erzeugt. Die Temperatur im Thermostatbad wird auf 25⁰G eingeregelt«

Die Enzymelektrode ist an ein elektronisches Meßgerät angeschlossen, das die Indikatorelektrode auf -6OO mV gegenüber der Ag/AgCl-Elektrode polarisiert, die Strom-Zeit-Kurve differenziert sowie der maximale Wert den Anstieg digital anzeigt«,

Beispiel 2

Präparation der ^ Enzymmembran

200 ml 5 %ige Gelatinelösung, die als Weichmacher 0,01 % Propylenglykol enthält, wird wie.im Beispiel 1 beschrieben, vorgequollen und bei 40⁰C gelöst. Danach werden 250.000 U Glukose-oxidase zugegeben und die Lösung in den Trog einer Filmbeschichtungsmaschine gegeben. Als Unterlage wird ein geschlossenes Band von Azethylzellulose von I30 cm Länge und 20 cm Breite verwendete Dieses Band wird 6 mal durch Eintauchen in der Enzymlösung beschichtet, wobei die Dicke der. Ge-

- τ - 2

latineschicht etwa 40 /tun beträgt. Uach dem Trocknen im Kühlschrank wird die Enzymschicht von der Unterlage abgenommen und in kleine Blättchen geschnitten.

Meßgerät und Meßvorgang

Die Mikromeßkammer (VEB Metra Radebeul) wird wie folgt präpariert:

Über den Spannring wird eine Zelluloseazetatmembran (20 ,um) befestigt, darauf in der Mitte eine runde Scheibe der Enzymmembran von 3 mm 0 gelegt und darüber ein Dialyseschlauch von 16 /um Dicke gespannt. Der so präparierte Ring wird in die Öffnung der Meßzelle eingeführt.

Es wird 1 Tropfen 1 %iges 0,1 M KCl Gel auf die Zellulose«- azetatmembran gegeben und der Elektrodenkörper eingelegt und mit der Überwurfmutter gespannt.

Die Elektrode wird an das im Beispiel 1 beschriebene elektronische Meßgerät angeschlossen und die Polarität so gewählt, daß die Pt-Indikatorelektrode auf +600 mV Ag/AgCl gebracht wi r d (Hp C>2 -Me s s ung) ·

Die Mikromeßkammer wird auf 25⁰C temperiert und mit Silikonschläuchen über eine peristaltische Pumpe an einen automatischen Probenspeicher angeschlossen, in dem sich Blutproben (1 : 20'; verdünnt) befinden. Dabei beträgt die Spülzeit 20 und die Probenahmezeit 30 s. Eichung und Ablesung erfolgen analog zu Beispiel 1.

Claims

1, Verfahren und Meßgerät zur Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Enzymelektrode j bestehend aus einer Indikatorelektrode mit einem Enzym, das in eine Gelatineschicht eingebettet ist, in die Meßlösung, die zur Angleichung des kolloidosmotischen Drucks an die zu untersuchende Probe mit einem Polymeren, vorzugsweise Dextran versetzt ist, eingeführt und die Messung in der gerührten Meßzelle in an sich bekannter Weise oder in Durchflußanordnung durchgeführt wird, wobei .der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve nach Zugabe der zu untersuchenden Probe als Meßsignal dient.

Enzymelektrode nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelatineschicht eine Dicke von 5 bis 50 Ai aufweist und Zusätze, insbesondere Netzmittel, Weichmacher bzw.

Vernetzer enthält.

3. Enzymelektrode nach 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Enzyms in der Gelatineschicht 2 -

ρ
100 Einheiten pro cm beträgt.

4» Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Glukoseoxydase, Urikase, Cholesteroloxydase, Aminosäure-»·?;: oxydase ggf» unter Zusatz eines zweiten Enzyms eingesetzt wird»

5» Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Glukosebestimmung in ein Zehntel verdünntem Blut 2 g Dextran (MG 40000)/1 Meßlösung zugesetzt werden.

6. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet₉ daß die Meßzelle an der Innenwand eines Thermostaten angebracht ist und eine Umwälzpumpe zur Absaugung der Lösung aus der Zelle benutzt wird.