DD150508B1 - Verfahren und enzymelektrode zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Enzymelektrode zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten in Fermentationslösungen sowie in verdünntem Serum, Plasma oder Vollblut. Das Verfahren eignet sich für die Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten, z. B. Glukose, im mikrobiologischen und im klinischen Labor.
Amperometrische Enzymelektroden gewinnen wachsende Bedeutung für die Konzentrationsbestimmung im klinischen sowie mikrobiologischen Labor sowie im Umweltschutz (D. Gray, M.Keyes, B. Watson; Analyt.Chem.49,1067 [1977]). Die Anwendbarkeit wird durch Störungen, die von Bestandteilen der Meßproben, z. B. des Blutes hervorgerufen werden, eingeschränkt: Lösungsbestandteile, die beim Potential der Indikatorreaktion (H2Or-Oxydation: + 60OmV; 02-Reduktion: — 60OmV) ebenfalls umgesetzt werden, führen zu einer fehlerhaften Vergrößerung des Meßwertes. Das gilt vor allem für die Messung des stationären Stromsoderauch für die kinetische Methode (G.Guilbault, Methods in Enzymology XLIV, 585 [1976]). Zur Ausschaltung dieser Störungen sind selektive Membranen geeignet, die nur das Substrat der Indikatorreaktion zur Elektrode gelangen lassen. Zum Beispiel wird durch eine spezielle „H2O2-selektive Membran" die „Restreduktion" des Blutes ausgeschaltet <US Patent 3.979.274).
Der gleiche Effekt wird durch O2-permeable Membranen (z. B. Teflon oder Polyethylen), die z. B. von Sauerstoffelektroden bekannt sind, erreicht. Dieses Prinzip ist nur bei der Messung des Cb-Verbrauches möglich, es ergibt aber in Fermentationslösungen oder in venösem Blut zu hohe Meßwerte für die Konzentration des Stoffwechselproduktes, da sich die Erniedrigung der 02-Konzentration in der Meßprobe zum Wert des O2-Abfalls in der Enzymschicht vor der Elektrode addiert. Die Sättigung der Meßlösung durch Einleiten von Luft während der Messung löst dieses Problem nicht befriedigend, da die Reproduzierbarkeit schlecht und außerdem ein Zusatz von Antischaummittel notwendig ist. (P.Reitnauer, DDR Patent 127861). Dagegen führt eine Differenzmessung mit je einer Enzym- und einer enzymfreien Elektrode (BRD Patent 1598285) zu reproduzierbaren und richtigen Ergebnissen sowohl bei der O2- als auch der H2O2-Messung. Allerdings erfordert diese Anordnung einen hohen apparativen und elektronischen Aufwand, da die zeitlichen Veränderungen beider Elektroden ständig abgeglichen werden müssen (S.Bessman et. al. Diabetes 25,81 [1976]).
Eine weitere Störung (sowohl bei der O2- als auch der H2O2-Anzeige) zeigt sich in der Wechselwirkung der Messungen zwischen Meßprobe und proteinfreien Eichstandards. So erfolgt eine Erniedrigung um 10-20% der Meßwerte für die Standards nach etwa 5-10 Blut-oder Serumproben, so daß eine häufige Eichung notwendig ist (D.Thevenot et. al.Proc.9th ISE-Meeting, Budapest, 1978). Es wurde bereits vorgeschlagen (F. Scheller et. al. DDR Patentschrift 131203), zur Verkürzung der Meßzeit bei der stationären Messung mit Enzymelektroden die Meßlösung stark zu rühren sowie die Indikatorelekffode fest gegen die Enzymschicht anzupressen. Auch diese Maßnahmen reichen noch nicht aus, um den Einfluß von störenden Substanzen auf den Meßwert zu eliminieren, so daß zu hohe Werte erhalten werden und außerdem auch noch Vergiftungserscheinungen auftreten.
Für die kovalente Fixierung von Enzymen an Membranmaterial z.B. Kollagen sind hochaktive gereinigte Enzyme (mindestens 50U/mg) erforderlich, und die Fixierungsausbeute beträgt nur bis zu 30% (Thevenotet al.Anal.Chem.51, 96,1979). Dagegen sind der Geleinschluß oder die Vernetzung mit bifunktionellen Reagenzien, z. B. Glutaraldehyd, auch zur Herstellung von Enzymmembranen aus weniger aktivem Ausgangsmaterial (etwa 1 U/mg) geeignet. Ein entscheidender Nachteil der Enzym-Immobilisierung durch Geleinschluß z. B. in Polyacrylamid oder Stärke liegt darin, daß die Enzymmembranen feucht gelagert werden müssen, da das Austrocknen zum Verlust der Membranstruktur führt. Damit ist ein praktischer Einsatz solcher Membranen auf die Eigenpräparation beschränkt. Beim Vernetzen von Enzymen treten ebenfalls meist hohe Aktivitätsverluste auf. Weiterhin ist die mechanische Stabilität solcher Immobilisate so gering, daß ein zusätzlicher Träger z. B. Filterpapier oder Seide (DD 131 203) erforderlich sind. Durch diese zusätzlichen Träger wird aber die Ansprechzeit verlängert und die Empfindlichkeit der Enzymelektrode gesenkt.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, bei der Bestimmung von Stoffwechselprodukten mit einer Enzymelektrode eine schnellere Einstellung des Meßwertes und eine höhere Funktionsstabilität der Elektrode zu erreichen. Weiterhin soll die Wirkung von Störsubstanzen und die Wechselwirkung zwischen Meßprobe und Eichstandard ausgeschaltet werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Angleichen der osmotischen Eigei schäften verschiedener Meßlösungen und eine wirkungsvolle, d. h. eine die Aktivität des Enzyms weitgehendst erhaltene Immobilisierung auf der Enzymelektrode zu erreichen.
Die Lösung der Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß den proteinarmen bzw. proteinfreien Meßlösungen, wie Standardlösungen, Spüllösungen, Vorlagelösungen, eine wasserlösliche polymere Verbindung zugesetzt wird und die Enzymelektrode an ihrem elektronenleitenden Teil (Indikatorelektrode) eine enzymenthaltende Gelatineschicht aufweist, die auf einer Membran aufgebracht bzw. zwischen zwei Membranen eingeschlossen ist. Die Schicht ist 5-50μιη dick und enthält 2-100 Einheiten des Enzyms. Die Schicht und die Membran sind unmittelbar vor dem elektronenleitenden Teil der Elektrode (Indikatorelektrode) angeordnet. Gegebenenfalls enthält die Gelatineschicht Zusätze, wie Netzmittel, Weichmacher bzw.
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Vernetzer, mit deren Hilfe das Beschichtungsverhalten und die mechanische Festigkeit der Schicht auf der Membran variiert werden können.
Als Enzyme dienen H2O2-erzeugende bzw. (^-verbrauchende Enzyme wie Glukose-oxydase, Urikase, Cholesterol-oxydase und Aminosäure-oxydase. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, ein zweites Enzym, das die Konzentration des angezeigten Substrates verändert, zuzusetzen. In Betracht kommen beispielsweise Invertase, Hexokinase und Cholesterol-esterase.
Die Enzymelektrode ist in die gerührte Meßzelle oder eine Durchflußzelle eingeführt und wird auf ein konstantes Potential von + 60OmV bei der H2O2-Messung bzw. - 600 mV bei der O2-Verbrauchsmessung gegenüber der Ag/AgCI-Bezugselektrode polarisiert. Der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve (bei konstantem Potential) nach Zugabe der Meßprobe wird durch das elektronische Meßgerät ermittelt und angezeigt.
Der Meßwert stellt sich durch dieses Meßprinzip und die erfindungsgemäße Elektrode bereits ein, bevor störende Bestandteile die Indikatorelektrode erreichen.
Weiterhin wird der kolloidosmotische Druck der wäßrigen Eichstandards und der Spüllösung durch Zusatz eines Polymeren dem der Meßlösungen angeglichen, so daß sich die Quellung der Enzymschicht beim Messen und Spülen nicht verändert. Ein geeignetes Polymer ist z. B. Dextran. Da die Messung eine Temperierung der Meßlösung, der Zelle sowie der Elektrode erfordert, wird die Meßzelle direkt an der Innenwand eines Badthermostaten angebracht, wobei die Enzymelektrode durch eine Bohrung von außen horizontal in die Meßzelle eingeführt wird. Die horizontale Anordnung der Elektrode am Rande der zylindrischen Meßzelle sichert eine starke Konvektion bei Verwendung eines Magnetrührers. Zur Verringerung der Einwirkdauer der Meßprobe auf die Enzymelektrode wird die Lösung unmittelbar nach Erreichen des Meßwertes aus der Meßzelle durch eine Bohrung im Boden abgesaugt. Zur Erzeugung des Vakuums in einem Abfallgefäß wird zweckmäßig die Pumpe des Thermostaten verwendet.
Die erfindungsgemäße Enzymelektrode mit dem dazugehörigen Bestimmungsverfahren für Stoffwechselprodukte zeichnet sich durch eine schnelle Einstellung des Meßwertes und eine höhere Funktionsstabilität aus. Die Wirkung von Störsubstanzen und die Wechselwirkung zwischen Meßprobe und Eichstandard wird ausgeschaltet. Der Einschluß der Enzyme in Gelatine erlaubt eine trockene Lagerung. Die Immobilisierungsausbeute liegt aufgrund der „schonenden" Bedingungen bei 95%. Mit der in den Beispielen beschriebenen Begußtechnik können sehr dünne Enzymschichten mit geringem Diffusionswiderstand hergestellt werden.
Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden:
Zur Immobilisierung von lyophilisierter Uricase wird eine 5%ige Gelatine-Wasser-Lösung hergestellt. Dazu wird die Fotogelatine mit der Hälfte der Flüssigkeit 1 h bei Zimmertemperatur vorgequollen und anschließend nach Zugabe der restlichen Flüssigkeitsmenge bei 4O0C ca. 1 h vollständig gelöst, wobei die Lösung in zeitlichen Abständen von 15 min durchgeschüttelt wird. 0,4ml der fertigen Gelatinelösung werden mit 100U Uricase gut vermischt und anschließend auf 10cm2 einer unsubstrierten planen Filmunterlage ausgestrichen. Nach 12h Trocknungsdauer wird die Enzymmembran abgenommen und im Kühlschrank gelagert.
Zur Herstellung des Harnsäure-Eichstandards, der Spüllösung sowie zum Verdünnen der Blutproben wird folgende Grundlösung verwendet:
1 Liter enthält:
1,8g KH2PO4; 9,6g Na2HPO4 · 2H2O; 1,05g Na-Benzoat; 2,3g NaCI; 0,3g NaF; 1 g K2C2O4 · H2O; 2g Dextran M 75 (pH 7,3).
Die Eichstandards werden durch Einwägen von wasserfreier Harnsäure hergestellt. Die Blutproben werden wie folgt präpariert:
50μΙ Blut werden in 450 μ.Ι der Grundlösung gegeben und kurz durchmischt.
Vor Beginn einer neuen Messung ist die Temperierung der Meßlösung zu sichern. Die Einbrenndauer des Gerätes beträgt etwa 20 Minuten nach dem Einschalten.
Die Meßzelle wird mit etwa 2 ml Grundlösung gefüllt und wieder entleert.
Danach erfolgt die exakte Vorgabe der Meßlösung (2ml), und nach der Einstellung des O-Wertes wird die Meßprobe (0,5ml) zügig in die Meßzelle gegeben. Sofort nach Erreichen des Meßwertes wird die Probe entfernt, und die Zelle kann gespült werden.
Am Anzeigegerät wird der Meßwert in mg/dl angezeigt. Bei der Eichung erfolgt über ein Potentiometer die Einstellung auf den deklarierten Wert.
Meßgerät
Ein rundes Membranstück von 3mm Querschnitt wird zwischen einer Zelluloseacetat- (16/xm Dicke) und einer Polyethylenmembran auf der Stirnseite des Mantels einer üblichen O2-Stabmeßzelle gespannten den Elektrodenmantel werden 0,2 ml 0,1 M KCI gegeben und der Elektrodenkörper eingeführt, so daß durch eine Überwurfmutter die Pt-Indikatorelektrode straff gegen die Membranen an der Stirnseite angepreßt wird. Die präparierte Enzymelektrode wird in eine Bohrung der Meßzelle durch die Thermostatenwand eingeführt und mit einer zweiten Überwurfmutter straff gegen die Außenwand der Meßzelle gepreßt. Dabei befindet sich die Indikatorelektroc s unmittelbar in einer durchgehenden Bohrung, so daß die Membran mit der Lösung in der Meßzelle in Kontakt gelangen. An der Unterseite der Meßzelle ist in einem angeschraubten Gehäuse ein Rührmotor mit Scheibenmagnet untergebracht, der mittels Rühr-flow die Strömung in der Meßzelle erzeugt. Am Boden der Meßzelle ist eine Kanüle angebracht, die mit einem dünnen Schlauch mit einem Vakuumvorratsgefäß in Verbindung steht. Diese Verbindung wird durch ein Magnetventil verschlossen, und das Vakuum wird durch die Saugpumpe des Thermostaten erzeugt. Die Temperatur im Thermostatbad wird auf 25°C eingeregelt.
Die Enzymelektrode ist an ein elektronisches Meßgerät angeschlossen, das die Indikatorelekrode auf —60OmV gegenüber der Ag/AgCI-€lektrode polarisiert, die Strom-Zeit-Kurve differenziert sowie der maximale Wert den Anstieg digital anzeigt.
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200 ml 5%ige Gelatinelösung, die als Weichmacher 0,01 % Propylenglykol enthält, wird wie im Beispiel 1 beschrieben, vorgequollen und bei 40°C gelöst. Danach werden 250000 U Glukose-oxidase zugegeben und die Lösung in den Trog einer Filmbeschichtungsmaschine gegeben. Als Unterlage wird ein geschlossenes Band von Azethylzeltulose von 130cm Länge und 20cm Breite verwendet. Dieses Band wird 6mal durch Eintauchen in der Enzymlösung beschichtet, wobei die Dicke der Gelatineschicht etwa 40μπΊ beträgt. Nach dem Trocknen im Kühlschrank wird die Enzymschicht von der Unterlage abgenommen und in kleine Blättchen geschnitten.
Die Mikromeßkammer (VEB Metra Radebeul) wird wie folgt präpariert:
Über den Spannring wird eine Zelluloseazetatmembran (20,um) befestigt, darauf in der Mitte eine runde Scheibe der
Enzymmembran von 3 mm 0 gelegt und darüber ein Dialyseschlauch von 16μνη Dicke gespannt. Der so präparierte Ring wird in die Öffnung der Meßzelle eingeführt.
Es wird 1 Tropfen 1%iges0,1 M KCI Gel auf die Zelluloseazetatmembran gegeben und der Elektrodenkörper eingelegt und mit der Überwurfmutter gespannt.
Die Elektrode wird an das im Beispiel 1 beschriebene elektronische Meßgerät angeschlossen und die Polarität so gewählt, daß diePt-lndikatorelektrodeauf+60OmV Ag/AgCI gebracht wird (H2O2-Messung).
Die Mikromeßkammer wird auf 25°C temperiert und mit Silikonschläuchen über eine peristaltische Pumpe an einen
automatischen Probenspeicher angeschlossen, in dem sich Blutproben (1:20 verdünnt) befinden. Dabei beträgt die Spülzeit 20 und die Probenahemzeit 30s. Eichung und Ablesung erfolgen analog zu Beispiel 1.
Claims (4)
1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten durch Bestimmung des maximalen Anstieges der Strom-Zeit-Kurve, gekennzeichnet dadurch, daß den proteinarmen bzw. proteinfreien Meßlösungen eine wasserlösliche polymere Verbindung zugesetzt wird.
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Erfindungsanspruch:
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als wasserlösliche polymere Verbindung insbesondere Dextran zugesetzt wird.
3. Enzymelektrode zur Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten, bestehend aus einem elektronenleitenden Teil und enzymtragenden Membranen, gegebenenfalls Netzmittel, Weichmacher bzw. Vernetzer enthaltend, gekennzeichnet dadurch, daß der elektronenleitende Teil eine enzymenthaltende Gelatineschicht aufweist, die auf einer Membran
* aufgebracht bzw. zwischen zwei Membranen eingeschlossen ist.
4. Enzymelektrode nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Gelatineschicht eine Dicke von 5-50μπη aufweist.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21784379A DD150508B1 (de) | 1979-12-19 | 1979-12-19 | Verfahren und enzymelektrode zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21784379A DD150508B1 (de) | 1979-12-19 | 1979-12-19 | Verfahren und enzymelektrode zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD150508A1 DD150508A1 (de) | 1981-09-02 |
| DD150508B1 true DD150508B1 (de) | 1986-03-26 |
Family
ID=5521774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD21784379A DD150508B1 (de) | 1979-12-19 | 1979-12-19 | Verfahren und enzymelektrode zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD150508B1 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0308330A1 (de) * | 1987-09-17 | 1989-03-22 | Elf Sanofi | Proteine, Enzyme oder Mikroorganismen, die in einem Träger aus Gelatine immobilisiert sind, der mit einem oxidierten Polysaccharid vernetzt ist |
-
1979
- 1979-12-19 DD DD21784379A patent/DD150508B1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD150508A1 (de) | 1981-09-02 |
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