DD151963B1

DD151963B1 - Verfahren zur gewinnung von eiweissbiomasse

Info

Publication number: DD151963B1
Application number: DD21321479A
Authority: DD
Inventors: Lidija I Kozlova; Olga I Velikoslavinskaja; Radij V Katrusch; Valerija A Rjabchuk; Herbert Gentzsch; Gustav-Adolf Luebbert; Wolfgang Hieke; Joachim Bauch; Guenter Eidenreich
Original assignee: Petrolchemisches Kombinat; Wissenschaftliches Allunionsfo
Priority date: 1979-05-29
Filing date: 1979-05-29
Publication date: 1988-04-27
Also published as: DD151963A1

Description

Überraschend wurde gefunden, daß die Aufgabe so gelöst werden kann, daß im Rahmen der kontinuierlichen Kultvierung von Mikroorganismen, z. B. Hefe auf Nährmedien, eine Regulierung des Verhältnisses der Menge an Frischwasser und des rückzuführenden wäßrigen Mediums sowie das Verhältnis der Konzentration der n-Alkane und des Kaliumions in bestimmten Bereichen erfolgt. Die Regulierung muß so erfolgen, daß das Verhältnis der Menge an Frischwasser und an rückzuführendem wäßrigen Medium im Bereich 0,05-0,5:0,5-0,95 und das Verhältnis der Konzentration der n-Alkane C₈-C₁₈ und der des Kaliumions im Bereich 20-100:1 liegt.

Das Verfahren wird unter den Bedingungen der Rückführung des wäßrigen Mediums für das Abtrennen und Eindicken von Biomasse realisiert. Das rückzuführende wäßrige Medium, das unverbrauchte Nährelemente für die Mikroorganismen besitzt, wird für die Herstellung von Nährmedium verwendet. Dadurch wird der Verbrauch an Frischwasser, welches für den Prozeß der Kultivierung von Mikroorganismen gebraucht wird, und der Verbrauch an Elementen des Nährmediums erheblich reduziert.

Nach diesem Verfahren erreicht der Methioningehalt 3,3% des Gesamtgehaltes an Aminosäuren in der Biomasse. Der Eiweißgehalt in der Biomasse erreicht 65%.

Im einzelnen läuft das Verfahren zur Gewinnung von Biomasse mit erhöhtem Methioningehalt wie folgt ab:

Im Rahmen der Kultivierung von Mikroorganismen, vorzugsweise Hefe der Gattung Candida auf einem Nährmedium, werden als Kohlenstoffquelle n-Alkane mit einer Kettenlänge des Kohlenstoffs von C₈-C₃₆ oder eine Erdölfraktion, die bei 200-400⁰C siedet und n-Alkane C₈-C₃₅ besitzt, verwendet.

Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt in Fermentoren mit Rührern und Belüften des Mediums bei einer Konzentration des Kohlenwasserstoffs im Nährmedium von 2,5-5%, bezogen auf n-Alkane C₈-C₃₅. Das wäßrige Nährmedium enthält Stickstoff, Phosphor, Kalzium, Magnesium und andere Quellen für die mineralische Ernährung, die für das Wachstum oder Mikroorganismen notwendig sind. Die Konzentration der Quellen für die mineralische Ernährung im Nährmedium setzt sich aus deren Menge im rückzuführenden wäßrigen Medium und zusätzlich der Menge, die mit dem Frischwasser zugeführt wird, zusammen. Dabei wird die Gesamtkonzentration des Kaliumions im Nährmedium so beibehalten, daß sich das Verhältnis der Konzentration der n-Alkane C₈-C₁₈ und des Kaliumions im Bereich 20-100:1 befindet.

Im Prozeß der Kultivierung wird die Belüftungsintensität des Mediums bei 100-250m³/h, der pH-Wert des Mediums bei 3,5-5, die Temperatur des Mediums bei 30-42⁰C, die Verdünnungsgeschwindigkeit des Mediums bei 0,13-0,4 h~¹ beibehalten.

Die mikrobiologische Suspension, die aus dem Fermentor abläuft, wird durch bekannte Verfahren eingedickt, dabei wird das abgetrennte wäßrige Medium in den Fermentationsprozeß zurückgeführt und bei der Herstellung des Nährmediums verwendet.

Das wäßrige Medium, das sich beim Eindicken der Biomasse gebildet hat, enthält alle Elemente des Nährmediums, u.a. auch Kaliumionen. Die Kaliumkonzertration im Nährmedium hängt von der Art der Abtrennung ab. Bei der Abtrennung des wäßrigen Mediums ohne Erhitzen ist der Gehalt an Kalium gleich 50-250mg/l, beim Erhitzen bis zu 70-90⁰C wächst der Kaliumgehalt bis auf 800-1 300mg/l an.

Die Kaliumkonzentration wird im Nährmedium (Sk) so reguliert, daß sie in einem bestimmten Verhältnis zu der Konzentration im Nährmedium der n-Alkane C₈-Ci₈ (Sc^c₈). die zum Bestand der n-Alkane C₈-C₃₅ gehören, steht. Die fehlende Menge an Kalium im Nährmedium wird durch ein zusätzliches Einführen an Kaliumsalzlösung in das Frischwasser hinzugefügt. Der Überschuß an Kalium wird durch das Verdünnen des Nährmediums mit Frischwasser beseitigt. Dabei wird das Verhältnis von Frischwasser und des Rücklaufwassers im Prozeß der Kultivierung von Mikroorganismen im Bereich 0,05-0,5:0,5-0,95 reguliert.

Die Kohlenstoffquelle in Form der Kohlenwasserstoffe wird entweder unmittelbar in den Kultivierungsprozeß gegeben, oder sie wird vorher mit dem wäßrigen Nährmedium emulgiert. Die Kohlenwasserstoffe werden in den Fermentor oder in das Nährmedium so gegeben, daß sich die Konzentration der n-Alkane C₈-C₃₅ nicht verändert, vorzugsweise 2,5-5%. Dabei wird die Konzentration der n-Alkane C₈-C₁₈, die einen bestimmten Teil der Zusammensetzung der n-Alkane C₈-C₃B bilden, konstant gehalten. Nach der Konzentration der n-Alkane C₈-C₁₈ wird die Kaliumkonzentration im Nährmedium so geregelt, daß das Verhältnis S_Ce_c,₈:S_k = 20-100:1 und das Verhältnis der Menge an Frischwasser und des Rückführwassers sich im Bereich 0,05-0,5:0,5-0,95 befindet.

Die Durchführung des Kultivierungsprozesses der Mikroorganismen, vorzugsweise Hefe der Gattung Candida, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht in einem kontinuierlichen und nichtsterilen Prozeß eine Biomasse der Mikroorganismen mit einem Eiweißgehalt bis zu 65%, bei einem Methioningehalt bis zu 3,3% des Gesamtgehaltes an Aminosäure im Eiweiß, zu bekommen.

Nachdem bisher bekannten Verfahren erhält man in der Biomasse innerhalb von 15-18 Stunden des periodischen Kultivierens unter sterilen Bedingungen streng definierter Stämme der Hefe der Gattung Candida bis zu 2% Methionin. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man in der gleichen Kultivierungszeit um 7-10mal mehr Methionin.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgende Ausführungsbeispiele veranschaulicht:

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Die Hefe Candida guilliermondii wurde in einem Fermentor mit einem Arbeitsvolumen von 75t, ausgerüstet mit einem Rührer und einem kontinuierlichen Belüftungssystem, auf Erdölfraktionen, die im Bereich von 240-360⁰C sieden, kultiviert. Der Gehalt an n-Alkanen C₈-C₃₅ in der Kohlenwasserstofffraktion betrug 20%, davon entfallen 70% auf die n-Alkane C₈-Ci₈.

In den Fermentor wurden laufend 19t/h Nährmedium, das aus einem Kohlenwasserstoffgemisch und einer wäßrigen Lösung der Mineralsalze bestand, gegeben. Die Kohlenwasserstoffkonzentration im Nährmedium betrug 3%, bezogen auf die n-Alkane C₈-C₃₅ oder 2,1 %, bezogen auf die n-Alkane C₈-C₁₈.

Die wäßrige Lösung der Salze diente als Quelle des Stickstoffs, Phosphors, Kaliums, Magnesiums und der Spurenelemente. Das Verhältnis des Frischwassers und des Rücklaufwassers im Nährmedium betrug 0,35:0,65. Die Kaliumkonzentration betrug im Frischwasser 1 060mg/l, im rückführenden wäßrigen Medium 200 mg/1, die gesamte Kaliumionenkonzentration im Nährmedium 500mg/l.

Verhältnis der Konzentrationen Sc₈X^Si₁ = 42:1

Die übrigen Parameter der Kultivierung sind:

Geschwindigkeit des Verdünnen des Mediums 0,25 rT¹ Belüftungsintensität 10Om³A h, pH-Wert des Mediums 4—4,5, Temperatur des Mediums 32-34⁰C.

Die Suspension der Hefe wurde aus dem Fermentorzum Eindicken in das Aufrahmgefäß, wo bis zu 65% der wäßrigen Phase abgetrennt wurde, danach in die Separatoren, wo 15-20% der wäßrigen Phase abgetrennt wurden, geleitet. Rund 10% des wäßrigen Mediums, das in den Fermentorgegeben wurde, wurden von der Gesamtmenge durch die Verdampfung der Biomasse abgetrennt. Das wäßrige Medium, das in den Stadien des Eindickens der Biomasse abgetrennt wurde, wurde in den Kultivierungsprozeß der Hefe zurückgeführt.

Die bis zu 20-25% Trockensubstanz eingedickter Hefesuspension wurde in einem Zerstäubertrockner weitergetrocknet. Die so getrocknete Biomasse wurde auf Eiweißgehalt und Aminosäure untersucht.

Beispiel 2

"Die Hefe Candida maltosa wurde in einem Fermentor wie in Beispiel 1 kultiviert.

Es wurde eine Erdölfraktion des Siedebereiches 250-375T eingesetzt, die einen n-Alkangehalt (Gs-Сзв) von 14% aufwies, davon entfielen 67% auf C₈-C₁₈.

In den Fermentor wurden kontinuierlich 17t/h Nährmedium, davon 3t/h Erdölfraktion dosiert. Dfen-Alkankqnzentration im Medium (bezogen auf C₈-C₁₈) betrug damit 1,7%.

Die Menge an Rückführwasser in der Nährlösung betrug 12t/h, die Kaliumkonzentration in Frischwasser wurde auf 100mg/l eingestellt und im Rückführwasser lag sie bei 800mg/l. Demgemäß hatte die Gesamtnährlösung einen Kaliumgehalt von 700mg/l.

Das Verhältnis der Konzentrationen und der Mengen war wie folgt:

Sk = 24:1

Frischwasser: Rückführwasser = 0,14:0,86 Die übrigen Parameter der Kultivierung waren:

Verweilzeit des Mediums: 4,4h Belüftungsintensität: 90m³/t · h pH-Wert des Mediums: 4,0-4,2 Temperatur des Mediums: 32-34⁰C Während der Aufarbeitung wurden 60% der wäßrigen Phase im Aufrahmgefäß und 26% der wäßrigen Phase sowie das nicht verbrauchte Öl in Separatoren abgetrennt.

Beide Ströme wurden vollständig in den Fermentor zurückgeführt. Die im Zerstäubungstrockner gewonnene Trockenhefe wurde auf ihren Eiweißgehalt und ihre Aminosäurezusammensetzung untersucht.

Beispiel 3

In einem Rührfermentor mit einem Fassungsvermögen von 200kg wurde die Hefe Candida salmonicola kultiviert. Bei einer Verweilzeit von 4h wurden kontinuierlich 50kg Nährmedium mit einem Erdöldestillatanteil des Siedebereiches 250-360⁰C von 12,5kg/h dosiert. Der n-Alkangehalt im Destillat betrug 13% (C₈-C₃₆), wobei 65% auf C₈-C₁₈ entfielen. Der n-Alkangehalt im Medium lag damit bei 21 %.

Die Menge Rückführwasser betrug 26kg/h mit einer Kaliumkonzentration von 150mg/l. Der Kaliumgehalt im Frischwasser lag bei 1000mg/l, woraus ein Kaliumgehalt in der Gesamtnährlösung von 411 mg/1 resultierte.

Damit war das Verhältnis der Konzentrationen S_C8_g,₈:Sk = 51:1 und das Verhältnis der Mengen Frischwasser: Rückführwasser = 0,31:0,69 Die übrigen Parameter waren:

Belüftungsintensität: 120m³/t · h pH-Wert des Mediums: 4,1-4,3 Temperatur des Mediums: 33°C Während der Aufarbeitung wurden 69% der wäßrigen Phase in einem Aufrahmgefäß abgetrennt und vollständig in den Fermentor zurückgeführt.

In handelsüblichen Kleinseparatoren wurde das nicht verbrauchte Destillat sowie die Wasserphase soweit abgetrennt, daß eine Suspension mit 20% Trockenhefe erhalten wurde. In einem Laborsprühtrockner wurde das Hefepulver gewonnen und analytisch untersucht.

Die Ergebnisse der Beispiele 1-3 sind in der folgenden Tabelle dargestellt und zwei bekannten Verfahren A und B gegenübergestellt. Dabei betrifft A die periodische Kultivierung nach dem japanischen Patent 43876 und B die kontinuierliche Hefekultivierung ohne erfindungsgemäße Lösung.

Tabelle

	Beispiel 1	Beispiel 2	Beispiels	Bekannte techn. A	Lösungen B
Verhältnis der Frisch-u.Rückführ- wassermenge	0,35:0,65	0,14:0,86	0,31:0,69	1:0	1:0
Verhältnis der Konzentration im Medium C₈-Ci₈*	42:1	24:1	51:1	12:1	16:1
Produzierte Bio masse in 24h jet Fermentorinhalt (kg)	96	84	86	29	87
Eiweißgehalt der Biomasse (%)	63,7	62,8	64,1	57,5	53,2
Methioningehalt pro Gesamtgehaltan Aminosäuren (%)	3,0	3,3	3,4	1,4	1,5
Produziertes Methionin in24h jet Fermentorinhalt (kg)	1,84	1,75	1,87	0,24	0,69

Claims

Verfahren zur Gewinnung von Eiweißbiomasse, angereichert mit Methionin durch Kultivierung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen, die n-Älkane C₈-C₃₅ enthalten, bei Anwesenheit der notwendigen Nährstoffquellen und unter Bedingungen der Belüftung mit nachfolgender Abtrennung der Biomasse, Kohlenwasserstoffe und des wäßrigen Mediums, Rückführung des wäßrigen Mediums in den Kultivierungsprozeß, gekennzeichnet dadurch, daß zur Erhöhung des Methioningehaltes im Eiweiß das Verhältnis der Konzentrationen der n-Alkane C₈-C₁₈ und des Kaliums im Bereich 20-100:1 und das Verhältnis der Menge an Frischwasser und des rückzuführenden wäßrigen Mediums im Bereich 0,05-0,5:0,5-0,95 reguliert wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Eiweißbiomasse der Mikroorganismen, die durch die essentielle Aminosäure Methionin angereichert ist. Es handelt sich um eine kontinuierliche Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere durch Hefe auf Kohlenwasserstoffen, die die n-Alkane C₈-C₃₅ enthalten, bei Vorhandensein der erforderlichen Quellen an Nähr- und Spurenelementen unter den Bedingungen der Belüftung. Die aus dem Fermentor austretende Biomassesuspension wird in 3 Phasen unterschieden: die wäßrige Phase, die Kohlenwasserstoffphase und die Biomasse. Die die Biomasse enthaltende Phase wird einer weiteren Behandlung nach bekannten Verfahren unterzogen. Die Anwendung der Erfindung ist in der mikrobiologischen Industrie möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hefeeiweiß, das auf Kohlenwasserstoffen gezüchtet wurde, beinhaltet alle nicht substituierbaren Aminosäuren und ist hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung dem Eiweiß des Hühnereies gleichwertig. Jedoch ist der Gehalt der nichtsubstituierbaren Aminosäure Methionin im Hefeeiweiß um vier- bis fünfmal niedriger als im Eiweiß eines Hühnereies (Grisdew, L.G. u.a. 1974, Izvestja TSCHA, Ausgabe
2, Seite86, russ.).

Zur Erhöhung des Nährwertes des Hefeeiweißes, das als Futter für landwirtschaftliche Nutzwerte verwendet wird, ist es erforderlich, zusätzlich in das Futter Methionin zu geben. Es gibt nur wenige bekannte Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Methionin. Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung eines mit Methionin angereicherten Eiweißpräparates durch die Kultivierung eines bestimmten Stammes von Bakterien der Gattung Micobacterium auf Kohlenwasserstoffen (UdSSR-Urheberschein Nr. 199.796,1973, Kl. C12 K —1/06). Weiterhin ist ein Verfahren zur Gewinnung von wasserlöslichem Methionin durch Kultivierung eines bestimmten Bakterienstammes der Art Brevibacterium auf Glukose bekannt (Japanische Patenanmeldung Nr.6753,1976, Kl.36 [2] D251).

Bei den bekannten Verfahren werden bestimmte Stämme von Bakterien, die durch ein periodisches Verfahren unter sterilen Bedingungen gezüchtet werden, verwendet. Außerdem ist die Abtrennung der Bakterien aus der Kulturflüssigkeit technisch sehr kompliziert, und es existieren auch keine Apparate in industriellem Maßstab für die Abtrennung der Bakterien von der Kulturflüssigkeit.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse durch Kultivierung bestimmter Stämme von Hefen der Gattung Candida, die äthioninbeständig sind, auf Nährmedien, welche eine begrenzte enge Fraktion der n-Alkane Ci₃-C₁₈ enthalten. Bei der periodischen Kultivierung der Hefe Candida petrophyllum. Stamm Nr.401, Candida tropicalis Nr. 505 und IFO0589, Candida rugosa Nr. 603 und IFO 0750 unter sterilen Bedingungen auf Nährmedien bei Vorhandenseineines Biostimulators — Maisextrakt — speichert die Hefe in 15-18 Stunden in der Biomasse 1,32-1,96% Methionin. Dieses Verfahren kann als Prototyp angesehen werden (Japanisches Patent Nr. 43.876,1973, Kl. 36 [2] D 251). Als Mangel dieses Verfahrens ist die Züchtung der Hefe unter sterilen Bedingungen durch ein periodisches Verfahren bei Verwendung streng bestimmter Stämme der Hefe der Gattung Candida und der engen Fraktion der gereinigten n-Alkane mit einem Kettenlängenbereich von C₁₃-C₁₈ zu nennen.

Ziel der Erfindung

Das 7iel der Erfindung ist die Erhöhung des Methioningehaltes in der Eiweißbiomasse unter unsterilen Bedingungen.

Dalegung des Wesens der Erfindung

Die technische Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahrensparameter aufzufinden, die die Gewinnung einer Biomasse mit erhöhtem Gehalt an Methionin unabhängig von sterilen Bedingungen und unter Berücksichtigung eines wesentlich breiteren C-Bereiches der n-Alkane ermöglichen.