DD152142A1 - PROCESS FOR PREPARING ENZYME MIXTURES FOR SUGARING GRAINS - Google Patents

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DD152142A1 DD22267780A DD22267780A DD152142A1 DD 152142 A1 DD152142 A1 DD 152142A1 DD 22267780 A DD22267780 A DD 22267780A DD 22267780 A DD22267780 A DD 22267780A DD 152142 A1 DD152142 A1 DD 152142A1
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Rainer Borriss
Dieter Schmidt
Eberhardt Gorges
Heinz Ruttloff
Alfred Taeufel
Peter Lietz
Peter Steffen
Wolfgang Heinig
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Rainer Borriss
Dieter Schmidt
Eberhardt Gorges
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Alfred Taeufel
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur simultanen Herstellung von Enzymgemischen in Enzymkulturloesungen deren Zusammensetzung die technologische Verzuckerung von Getreidemaischen fuer die Herstellung von Gaerungsaethanol ermoeglicht. Ziel der Erfindung ist es, waehrend der gemeinsamen Kultivierung von Mikroorganismen einem Fermenter, die vorwiegend alpha-Amylase und Glucoamylase synthetisieren den erforderlichen Anteil von alpha-Amylase einzustellen, so dasz ein Einsatz des Praeparates in Brennereien ohne zusaetzliche Enzymdosierung moeglich wird. Das Enzymgemisch enthaelt neben Glucoamylase einen fuer die Verzuckerung von Getreidemaischen ausreichenden Anteil an alpha-Amylase durch Kultivierung eines Glucoamylasebildners, vorzugsweise eines Stammes der Gattung Endomycopsis und danach im gleichen Fermenter bei Zusatz unverkleisterter Staerke eines alpha-Amylasebildners, vorzugsweise eines Stammes der Gattung Aspergillus. Als N-Quelle werden neben Maisquellwasser gemahlene Oelfruechte oder Oelpreszkuchen und als C-Quelle wird Staerke in an sich bekannter Weise vor dem Autoklavieren zugefuegt. Das Verfahren kann in Brennereien angewendet werden.The invention relates to a process for the simultaneous preparation of enzyme mixtures in enzyme culture solutions whose composition allows the technological saccharification of cereal mash for the production of Gaerungsaethanol. The aim of the invention is to adjust during the common cultivation of microorganisms a fermenter, which synthesize mainly alpha-amylase and glucoamylase the required proportion of alpha-amylase, so dasz use of the preparation in distilleries without additional enzyme dosage is possible. In addition to glucoamylase, the enzyme mixture contains a proportion of alpha-amylase which is sufficient for the saccharification of grain mica by culturing a glucoamylase former, preferably a strain of the genus Endomycopsis and then in the same fermenter with the addition of uncorked starch of an alpha-amylase former, preferably a strain of the genus Aspergillus. In addition to corn steep liquor, ground oil or oil press cake is used as the N source and, as a C source, starch is added in a manner known per se prior to autoclaving. The process can be used in distilleries.

Description

222677222677

a) .^1ItβI11 ,der_ Erfindung; ' . a ). ^ 1 ItβI 11 , der_ invention; '.

Verfahren zur Herstellung von Enzymgemischen zur Verzuckerung von GetreidemaischeProcess for the preparation of enzyme mixtures for the saccharification of cereal mash

"b) Anwendungsgebiet der Erfindung"b) Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur simultanen Herstellung von Enzymgemischen in Enzymkulturlösungen deren Zusammensetzung die technologische Verzuckerung von Getreidemaische für die Herstellung von Gärungsäthanol ermöglicht,The invention relates to a process for the simultaneous preparation of enzyme mixtures in enzyme culture solutions whose composition enables the technological saccharification of cereal mash for the production of fermentation ethanol,

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen c) characteristics of be known technical solutions

Die Herstellung von Sohsprit bzv/. Rektifikat durch Verzuckerung von Getreidestärke mittels Brennereidarrmalz} Enzympräparaten oder Enzymkulturlösungen ist ein bekanntes und in der Produktion angewendetes Verfahren^ Die benötigten Hauptenzyme, 06-Amy läse und Glucoamylase werden dabei entweder in speziellen Enzymfabriken oder in den Brennereien selbst durch getrennte Kultivierung hergestellt. Dabei auftretende Nebenaktivitäten von Enzymen wie Zellulase-, Hemizellulase und Protease sind erwünscht und brauchen deshalb nicht abgetrennt zu werden.The production of sohsprit bzv /. Rectified by saccharification of cereal starch using distillate distillate } Enzyme preparations or enzyme culture solutions is a well-known and used in the production ^ The main enzymes required, 06-Amy läse and glucoamylase are produced either in special enzyme factories or in the distilleries themselves by separate cultivation. Occurring side activities of enzymes such as cellulase, hemicellulase and protease are desirable and therefore need not be separated.

Die erforderlichen Enzymmischungen für· die Verzuckerung der, Getreidemaische werden bisher so'hergestellt, daß in entsprechendem Verhältnis die Enzympräparate dosiert werdeiie Bei Enzymkulturlösurjgen, werden die benötigten Verhältnisse durch die Kultivierung von Enzymbildnern und die erforderliche Dosierung, der Enzymkulturlösungen in entsprechendem Verhältnis erreicht» In allen die sen.bekannten Pällen wird doppelterThe required enzyme mixtures for the saccharification of cereal mashes are so far prepared that the enzyme preparations are metered in a corresponding ratio. In the case of enzyme culture solutions, the required ratios are achieved by cultivating enzyme formers and the required dosage of enzyme culture solutions in a corresponding ratio the sen. known falls is doubled

... : _2_ 222 67 7...: _ 2 _ 222 67 7

!Ferment at ionsr aum, eine Zwischenlagerung von Kultur lösungen und ein nicht immer wirkungsvolles Enzymspektrura vorliegen. Bei der im WP C12d/213397 dargestellten Kerstel-" lung eines Enzympräparates, das durch die Kultivierung zweier Mikroorganismenstämme gewonnen wird, erhält man einen für die Verzuckerung von Getreidemaische zu geringen An— teilo6-Amylasej so daß auch in diesem Palle eine Zudosierung notwendig ist.! Fermentation ationrum, an intermediate storage of culture solutions and a not always effective enzyme spectrum. In the preparation of an enzyme preparation prepared in WP C12d / 213397, which is obtained by the cultivation of two microorganism strains, one obtains a low amount of 6-amylase for the saccharification of grain mashes, so that a metered addition is also necessary in this case.

^) Ziel der Erfindung^) Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, während der gemeinsamen Kultivierung von Mikroorganismen, die vorwiegendo6~Amyläse und Glucoamylase synthetisieren, den erforderlichen Anteilc^-Amyläseeinzustellen, so daß ein Einsatz des Präparates in Brennereien ohne zusätzliche Enzymdosierung möglich wird· und somit Enzymkosten verringert und eine gute Verzuckerung sowie Vergärung erreicht wirdoThe aim of the invention is to adjust the proportion of α-amylase required during the joint cultivation of microorganisms which synthesize predominantly α-amylase and glucoamylase, so that use of the preparation in distilleries is possible without additional enzyme dosage, thus reducing enzyme costs and good saccharification and fermentation is achieved

e) Parlegung^des Wesens der Erfindung e) it Parlegung ^ d W esens the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgemisches zu entwickeln, das ein für die Verzuckerung von Getreidemaische geeignetes Enzymspektrum aufweist» Das erfindungsgemäße Verfahren zur Her- · stellung des Enzymgemisches für diesen Zweck "besteht darin, daß in einem Fermenter das Kulturmedium, das.in bekannter V/eise als IT-Quelle neben Liaisquellwasser gemahlene Ölfrüchte oder Ülpresskuchen und als C-Quelle Stärke enthält, zuerst der Glucoarnylasebildner eingeimpft und nach Abschluß der log-Wachstumsphase der^-Amylasebildner in Verbindung mit der Zudosierung von unverkleisterter Stärke zugeführt . wird.The object of the invention is to develop a process for the preparation of an enzyme mixture which has an enzyme spectrum suitable for the saccharification of cereal mash. The process according to the invention for the preparation of the enzyme mixture for this purpose is that in a fermenter Culture medium, which in known manner as IT source contains liais spring water milled oil fruits or oil cake and starch as C source, first inoculated the glucoarnylase former and after completion of the log growth phase of the ^ -amylase former in connection with the addition of non-gelatinized starch is supplied.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Bnzymgemisch läßt sich vorteilhaft zur Verzuckerung von Getreidemaischen in der Brennerei einsetzen« Als Beispiel für einenoC—Amylasebildner sei der Stamm Aspergillus oryzae angeführt, als Glucoamylasebildiier der Stamm Endomycopsrs "bispora* Der letzte Stamm wird nach derThe Bnzymgemisch prepared by the process according to the invention can be used advantageously for saccharification of cereal mash in the distillery. "As an example of an oC-Amylasebildner the strain Aspergillus oryzae is given as Glucoamylasebildiier the strain Endomycopsrs" bispora * The last strain is after

_ 3 —_ 3 -

22 67722 677

DDR-Patentschrift 60536 charakterisiert. Alsoi, -Amylasebildner wird der Stamm Aspergillus oryzae 3? 15 (deponiert als Aspergillus oryzae i 911 in der Pilzsammlung der Friedrich-Schiller-Universität Y/eimar) und seine Mutanten verwendet ODDR patent 60536 characterizes. Also, the amylase-maker becomes the Aspergillus oryzae 3? 15 (deposited as Aspergillus oryzae i 911 in the mushroom collection of Friedrich Schiller University Y / eimar) and its mutants used O.

Die versetzte Beimpfung erfolgt wie in der DDR-Patentanmeldung "Verfahren zur Herstellung von Enzymen (W? C12d/ 213397) beschrieben wurde.The staggered inoculation is carried out as described in the GDR patent application "Process for the production of enzymes (W? C12d / 213397).

Ausführungsbeispiele Exemplary embodiments

Beispiel 1example 1

Mit 1 ml-einer Endomycopsis bispora-Vorkultur werden 100 ml Hauptkulturmedium (Grundmediumί 0,3 ί> (HH,)2ΗΡ0,, 0·,2 #With 1 ml of an endomycoplis bispora preculture, 100 ml of main culture medium (basal medium ί 0.3 ί> (HH,) 2 ΗΡ0 ,, 0 ·, 2 #

2PO4, 3 % MQW, 1 96 Stärke folgender Zusammensetzung: A) G-rundmedium + 2 % Rapsöl 2 PO 4 , 3 % MQW, 1 96 Starch of the following composition: A) G-round medium + 2% rapeseed oil

B) " -f- 4 % EapsmehlB) "-f- 4 % Eapsmehl

C) " + 4 fo Rapsmehl +C) "+ 4 fo rape flour +

2 % Rapsöl beimpft»2 % rapeseed oil inoculated »

Der pH-V/ert wurde auf 5,5 eingestellt und auf einem Schütteltisch (250 rpm) bei 30° C inkubiert. Nach 24 h wird zu den Endomycopsis-Kulturen jeweils 1 ml einer Aspergillus—oryzae-Yorkultur hinzugefügt.The pH was adjusted to 5.5 and incubated on a shaking table (250 rpm) at 30 ° C. After 24 hours, 1 ml of an Aspergillus oryzae Yorkultur is added to each of the endomycosis cultures.

Parallel zu diesen beimpften Kolben erfolgt zu den gleichen Hährbodenzusammensßtzungen, außer dem 1 ml-Aspergillus-ory-•zae-Vorkultur, eine Zugabe von 1 g unverkleisterter Stärke. Die Zultivierungsdauer beträgt 96 h.Parallel to these inoculated flasks, there is added to the same hatchery assays, except for the 1 ml Aspergillus oryzae preculture, an addition of 1 g of ungelkled starch. The culturing time is 96 h.

Folgende Ergebnisse werden erhaltendThe following results are obtained

Zuführung von 1% steriler unverkleisterter Stärke nach Beimpfung mit Asp. oryzaeDelivery of 1% sterile non-pasted starch after inoculation with Asp. Oryza e

Nährboden- Glucoamylase ct.- GIucοainylase ct^-Amylase Variante MSS GOD Amy läse MSS GOD ,_ Nutrient Glucoamylase ct.- glucoainylase ct ^ -amylase variant MSS GOD Amy läse MSS GOD , _

A 3oo E/ml 22o E/ml- 1 30E/ml 250S/ml 1803/ml 250E/ml B 32o E/ml 208 E/ml 300E/ml 380E/ml 200S/ml 460E/ml C' 34ü E/ml 24o E/ml 250E/ml 4003/ml 260E/ml · 320E/iü1A 3ooU / ml 22oU / ml- 1 30E / ml 250S / ml 1803 / ml 250E / ml B 32oU / ml 208E / ml 300E / ml 380E / ml 200S / ml 460E / ml C '34uU / ml 24oU / ml 250E / ml 4003 / ml 260E / ml · 320E / iü1

-4- 222677-4- 222677

Beispiel 2Example 2

Mit 100 ml einer Endomycopsis b'ispora - Vorkultur wurden 20 1 eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung 'beimpft:100 ml of an Endomycopsis b'ispora preculture were used to inoculate 20 l of a production medium of the following composition:

0,3 Io (NH4)2 HPO^, 0,2 % Na H2 PO^, 3'% Maisquellwasser, 1 <fo Rapsöl und 4 °b Rapsöl» Der pH-Wert wurde auf 5S5 eingestellt und Kultur in einem Glasfermenter (40, 1 Bruttovolumen) mit Rührung (100 U/min) und Zwangsbelüftung (0,6 vvm) bei 28 - 30° C fermentiert« Nach 24 h werden zu der Endomyeopsis-Kultur 100 ml einer Aspergillus oryzae-Vorkultur gegeben und gleichzeitig dem Medium 1 <fo unverkleisterte Stärke und 0,5 % Oa COo zugeführt*0.3 Io (NH 4) 2 HPO ^, 0.2% Na H 2 PO ^, 3 '% corn steep liquor, 1 <fo rapeseed oil and 4 ° b rapeseed oil "The pH was adjusted to 5 S 5 and culture a glass fermenter (40, 1 gross volume) with stirring (100 rev / min) and forced ventilation (0.6 vvm) fermented at 28 - 30 ° C. "After 24 h, 100 ml of Aspergillus oryzae preculture are added to the endomyeopsis culture and at the same time fed to the medium 1 < 0 unnorigued starch and 0.5 % Oa COo *

Nach einer !Fermentationszeit von 72 h werden im Kulturfiltrat 190 E/ml .Glucoamylase und 410 E/ml :>£·-Amy läse nachgewiesen. Nach Abtrennung der Biomasse wurden durch Eindampfung in Vakuum ein Konzentrat mit 3000 E/ml G-lucoamylase und 7000 B/ml a-Amylase. erhalten«After a fermentation time of 72 h, 190 U / ml of glucoamylase and 410 U / ml of oil are detected in the culture filtrate. After separation of the biomass by evaporation in vacuo, a concentrate with 3000 U / ml G-lucoamylase and 7000 B / ml of α-amylase. receive"

Beispiel 3Example 3

Ein Enzymkonzentrat, das aus KuIturfi3.trat, welches unter den in Beispiel 2 geschilderten Bedingungen hergestellt wurde, gewonnen werden konnte, enthielt 3000 E/ml Glucoamylase und' 7000 E/ml a-Amylasee Im Hochdruckdampfverfahren wurde dieses Probemuster unter Laborbedingungen getestet, Als Vergleichswert diente folgende EnzymdosierungίAn enzyme concentrate, which could be recovered from KuIturfi3.trat which was prepared under the conditions described in Example 2, containing 3000 U / ml of glucoamylase and '7000 U / ml of a-amylase e In the high pressure steam process of this test pattern has been tested under laboratory conditions, as Comparative value served the following enzyme dosageί

100 χ 10°/E Alpha-Amylase 80 χ der Pa0 Rapidase / t Stärke 20 χ 10 /E Glucoamylase AH 6 150 der Pa. Novo / t Stärke100 χ 10 ° / E alpha-amylase 80 χ the Pa 0 rapidase / t starch 20 χ 10 / E glucoamylase AH 6 150 the Pa. Novo / t strength

bei der die Alkoholausbeute 66,3 IW pro dt Stärke beträgt. Mit einer Enzymdosierung von 47 x 10 E<x-Amylase /t Stärke und 20 χ 106 E Glucoamylase/t Stärke (^ 6,7 1 Konzentrat / t Stärke) wurden höhere Ergebnisse als beim Vergleichswert (67,1 IW Alkoholausbeute pro t Stärke) und bei einer Enzymdosierung von 35 χ ΙΟ6 ε a-Amylase / t Stärke und 15 x 105E Glucoamylase/t Stärke ( ^ 51 Konzentrat / t Stärke) gleichten die Alkoholausbeute denen, die mit der Vergleichsdosierung erzielt wurden» . 'where the alcohol yield is 66.3 IW per dt starch. With an enzyme dosage of 47 x 10E <x-amylase / t starch and 20 χ 10 6 E glucoamylase / t starch (^ 6.7 1 concentrate / t starch) were higher results than the comparative value (67.1 IW alcohol yield per t Starch) and at an enzyme dosage of 35 χ ΙΟ 6 ε a-amylase / t starch and 15 x 10 5 E glucoamylase / t starch (^ 51 concentrate / t starch), the alcohol yield to those obtained with the comparison dosage ». '

Claims (2)

. _ 5- 222 677 Erf indungsanspruch, _ 5-222677 claim 1. Verfahren zur· simultanen Herstellung eines Bnzyragemisch.es "bestehend aus, G-lucoamyläse und einem für die Verzuckerung von Getreidemaischen ausreichenden Anteil an ^-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß hei der in "bekannter Weise durchgeführten Herstellung des Kulturmediums, welches als N-Quelle ·' neben Maisquellwasser gemahlene Ölfrüchte oder Ölpresskuchen, und als C-Quelle Stärke enthält und stufenweiser Beimpfung zuerst mit dem G-lucoamylasebildner, vorzugsweise eines Stammes der G-attung Endomycopsis, und nach Abschluß der log - Wachstumsphase mit dem (^ -Amylasebildner % vorzugsweise der Gattung Aspergillus, gleichzeitig im Verlauf der fermentation unverkleisterte Stärke dem. Kulturmedium zugeführt v/ird«1. A process for the simultaneous production of a Bnzyragemisch.es "consisting of, G-lucoamyläse and a sufficient for the saccharification of cereal malt portion of ^ -amylase, characterized in that the hot in the known manner carried out preparation of the culture medium, which as N -Source "oil spring or oil press cake milled in addition to corn steep liquor, and containing starch as a C source and gradual inoculation first with the G-lucoamylase former, preferably a strain of the genus Endomycopsis, and after completion of the log growth phase with the (^ -amylase former % preferably of the genus Aspergillus, at the same time in the course of the fermentation ungklleisterte strength supplied to the culture medium v / ird « 2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Verzuckerung von Getreidemaischen für die Brennerei eingesetzt wird«2 Method according to item 1, characterized in that it is used for the saccharification of cereal mash for the distillery «
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