DD152690A3 - Verfahren zur reduzierung des nucleinsaeuregehaltes mikrobieller biomasse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung des Nucleinsaeuregehaltes von Bakterien- oder Hefezellen zwecks Einsatz in der menschlichen Ernaehrung. Ziel der Erfindung ist es, aus Mikroorganismen solche Proteinprodukte zu gewinnen, die auf Grund ihres geringen Nucleinsaeuregehaltes in der menschlichen Ernaehrung Anwendung finden koennen, wobei der durch die Herabsetzung des Nucleinsaeuregehaltes bewirkte Proteinverlust so gering sein soll,dass ein oekonomisch interessantes Verfahren resultiert. Erfindungsgemaess wird das dadurch erreicht, dass mechanisch aufgeschlossene Biomasse mit hoher Trockensubstanz-konzentration zwecks Herabsetzung der Proteaseaktivitaet thermisch denaturiert und auf den fuer d. Nucleasewirkung geeigneten pH-Wert eingestellt wird. Der Abbau der Nucleinsaeuren erfolgt durch Inkubation der Mikroorganismensuspension in Gegenwart einer geeigneten Kombination niedriger Konzentrationen von Salzen und oberflaechenaktiven Substanzen. Das Verfahren ist auf Hefen und Bakterien anwendbar. Als oberflaechenaktive Substanzen werden anionische Tenside eingesetzt. Salze anorganischer und organischer Saeuren sind in niedrigen Konzentrationen wirksam.

Description

Verfahren zur Reduzierung des Nucleinsäuregehaltes mikrobieller Biomasse

b) Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beduzierung des Nucleinsäuregehaltes von Bakterien- oder Hefezellen zwecks Einsatz in der menschlichen Ernährung.

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß der hohe Nucleinsäuregehalt von mikrobiellen Biomassen dem direkten Einsatz als Protein quelle in der menschlichen Ernährung entgegensteht. Die mit der täglichen Nahrung aufgenommene Nucleinsäuremenge soll 2 Gramm nicht übersteigen (J.C. EDOZIEN et al., Nature 228 (1970) 180). Beim Einsatz von unbehandelten Hefen ist dieser Wert mit der Aufnahme von ca. 10 g Protein bereits erreicht. Um eine Einschränkung der Proteinaufnahme zu vermeiden, müssen durch geeignete Maßnahmen Proteinprodukte aus Hefen mit einem Prot-ein-Nucleinsäure-Verhältnis von 40 - 80 gewonnen werden.

Pur die Herabsetzung des Nucleinsäuregehaltes mikrobieller Biomassen sind chemische und enzymatisch^ Methoden bekannt. Der Nachteil, der auf. alle Mikroorganismen anwendbaren chemischen Methoden besteht in der Gefahr einer tiefgreifenden Protein Schädigung. Bei hohen und tiefen pH-Werten und erhöhter Temperatur, die für einen mit vertretbarer Ge-

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schwindigkeit ablaufenden Nucleinsäureabbau erforderlich sind, treten hohe Proteinverluste durch Hydrolyse ein. ' Außerdem wird der ernährungsphysiologische Wert des Proteins durch teilweise Zerstörung von Aminosäuren und das Austreten toxikologisch bedenklicher Substanzen herabgesetzt.

Di© wesentlich schonenderen enzymatischen Methoden zum Nuc Ie in säure abb au sind bei Einsatz von EDzympräparaten ökonomisch zu aufwendig. Daher verdienen Verfahren unter Ausnutzung der zelleigenen Kucleasen der Mikroorganismen größte Aufmerksamkeit.

Die in den Ribosomen der Mikroorganismen lokalisierten Ribonucleasen sind in nativen Zellen gehemmt, können jedoch durch verschiedenartige chemische und physikalische Einwirkungen aktiviert werden, die mit einer Zerstörung der ribosonalen Struktur verbunden sind.

Bekannt ist die Aktivierung durch kurzzeitige Wärmeeinwirkung (Hitzeschock), die bei Candida lipolytica und Candida utilis erfolgreich zur Abtrennung der Nucleinsäuren eingesetzt wurde (S. OHTA et al., Appl. Microbiol. 22 (1971) 415). Diese Methode ist bei Saccharomyoes cerevisiae schwer realisierbar (W.eV TREFELIAN, J. Sc. Fd. Agric. 29 (1978) 141). Allgemeiner anwendbar scheint die Aktivierung der latenten Nucleasen durch mechanische Zerstörung der Zellen zu sein. Sowohl in aufgeschlossenen Suspensionen von Candida utilis als auch von Saccharomyces cerevisiae läßt sich eine starke Nucleaseaktivität nachweisen.

Allerdings sinkt die Aktivität der Ribonuclease durch ther-, mische Denaturierung und spezifische Inhibitoren während der Inkubation zum Zwecke der Nucleinsäureabtrennung relativ schnell ab, und ein weitgehender Nucleinsäureabbau wird nicht oder nur nach langen Reaktionszeiten erreicht.

Gleichzeitig anwesende zelleigeao Proteasen bewirken hohe Proteinverluste.

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Durch Zusatz von Salzen (NaCl, ECl, Na₂HPQ^ etc.) in Tnzentrationen von 3 bis 5 % konnte M. LINDBLOM (BiotecL 1. Bioeng♦ 16 (1974) 1123) die Inaktivierung der Nucleasc- vermeiden, wodurch ein sehr weitgehender Nuc Ie in säure abb ε.: bereits in der kurzen Reaktionszeit von 20 - 30 Minuten erreicht werden kann.

Kurze Reaktionszeiten bewirken geringe Proteinverluste.

Nachteilig ist der hohe Salzeinsatz, der trotz Verwendung hoher Hefetrockensubstanzkonzentrationen von 10 % der !!enge an gewinnbarem Proteinisolat gleichkommt oder sie sogar übersteigt. ·

In der DE-OS 2 504 512 wird ein Verfahren zur Gewinnung eines Proteinkonzentrates mit niedrigem Nucleinsäuregehalt aus einer Mikrobenzellmasse beschrieben, bei dem die aufgeschlossene Zellmasse in Gegenwart von 0,1 bis 20 Ge- ^, besonders 1 bis 3 Gewichts-^, Salz im Bereich

von 30 bis ?0 ⁰C und bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 inkubiert und das Proteinkonzentrat sodann abgetrennt wird. Nach diesem Verfahren führt ein 5 %iger Salzzusatz zu einem guten NS-Gehalt bei gutem Protein/NS-Verhältais. Bezüglich dieser beiden Kriterien ist bei ca. 3 % Salzsusatz die Grenze des ernährungsphysiologisch brauchbaren ProteiJQkonzentrats erreicht. Der Einsatz von 1 % Salz (Beispiel 3) liefert jedenfalls unbefriedigende Ergebnisse, die auch nicht der auf Seite 6, letzter Absatz der o. g. DE-OS angegebenen ENS-Verminderung von 75 % entsprechen. Unter diesem Gesichtspunkt ist die an gleicher Stelle erwähnte wesentliche Verminderung der Nucleinsäure bei Zusatz von 0,1 % Salz in keiner Weise belegt und auch nicht zu erwarten.

Es ist weiterhin bekannt (K. KHÄKO et al., J. Ferment. Technol. 48 (1970) 14)., daß die Behandlung nicht aufgeschlossener Zellen vod Candida utilis mit? oberflächenaktiven Substanzen (OAS) zur Ausschüttung (Exkretion) von Ilucleinsäu-

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reabbauprodukten führt. Im Widerspruch dazu beschreibt CG. KUHLAIID (J. Mol. Biol. 2 (1960) 83). eine vollständige Hem-• mung der ribosomalen Nuclease bei OAS-Konzentrationen oberhalb 0,1 %,.Möglicherweise verhalten sich die Nucleasesysteme der Mikroorganismen verschieden.

Durch eine alkalische Proteinextraktion aus aufgeschlossener Mikroorganismensuspension und Abtrennen der Zellwandreste zwecks Erhöhung der Proteinausbeute und -reinheit tritt eine starke Schädigung des Nucleasesystems auf, so daß nur noch bei stark verdünnten Suspensionen mit langen Beaktionszeiten ein weitgehender Nucleinsäureabbau erzielt werden kann (LHTOBLOM).

Die Nachteile der bekannten Verfahren zur Abtrennung von nucleinsäuren aus Mikroorganismen unter Ausnutzung zelleigener Nucleasen bestehen entweaer im Arbeiten mit stark verdünnten Hefesuspensionen bei langen Reaktionszeiten oder sehr hohen Salzeinsatzen.

Mit der nachstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Methode sind diese Nachteile behoben.

d) Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, aus Mikroorganismen Proteinprodukte in hoher Ausbeute mit so geringem Nucleinsäuregehalt zu gewinnen, daß ihr Einsatz für die menschliche Ernährung möglich wird.

©) Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Nucleinsäuren abbau in mikrobieller Biomasse mit zelleigenen Nucleasen so durchzuführen, daß trotz hohen Abbaugrades technisch vertretbare Proteinverluste auftreten.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß mechanisch aufgeschlossene MikrocrganisciensuspensioL mit einem Trockensubstanzgehalt von 3 bis 15 % nach einer kurzzeitigen Hitzebehandlung

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(30 bis 35 Sekunden bei 60 bis 80 ⁰C) zum Zwecke der Proteaseinaktivierung durch Zugabe von Alkalien auf eisen pH-Weit zwischen 5,5 und 8,0 eingestellt wird. Anschließend wild durch 20- bis 180 minütige Inkubation der Suspension bei Temperaturen von 45 bis 65 ⁰C ein weitgehender Abbau der zelleigenen Nucleinsäuren erzielt· Erfindungsgemäß wird die Inkubation Id Gegenwart von 0,01 bis 5 % einer anionischen oberflächenaktiven Substanz (OAS) und 0,1 bis 2,0 % Salz durchgeführt. Durch Zentrifugieren und Waschen können die Hucleinsaureabbauprodukte in bekannter Weise von der Biomasse abgetrennt werden, die den Hauptanteil des Proteins der eingesetzten Mikroorganismen enthält.

Um die günstige Wirkung der erfindungsgemäßen Kombination von Salz und OAS zu veranschaulichen, sei auf das Verhältnis Protein/Nucleinsäure von Produkten, die nur mit Hilfe einer Komponente erhalten wurden, hingewiesen.

3 % NaCl (DE-/S 2 5OA 512): Protein/HS 28 0,2 % SDS (eigene Ergebnisse): Protein/NS 26

Demgegenüber stehen bei der gemeinsamen Verwendung der Komponenten Werte von AO.

Bei Mikroorganismen mit geringer Protease- und gleichzeitig hoher Nucleaseaktivität kann der Thermoschock zur Proteaseinhibierung entfallen.

Wird der Abbau der Nucleinsäuren durch Inkubation aufgeschlossener Hefe suspension en in Gegenwart von 0,01 bis 0,2 % OAS und 0,1 bis 1 % Salz (NaCl, KCl, Na₂HPO₄ u. a.) vorgenommen, laßt sich aufgrund der dann zu beobachtenden Stabilität der Nuclease durch Verlängerung de* Beaktionszeit eine sehr weitgehende Eeduzierung des Nucleinsäuregehaltes erzielen (siehe Tabelle 1.und 2 und Beispiel 1).

f) Ausführungsbeispiele ·

Die beschriebene Erfindung soll durch folgende Beispiele erläutert werden:

1OO' sio

1C si hc de

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Beispiel 1 .

100 g einer 10 g Hefetrockensubstanz enthaltenden Suspension aufgeschlossener Stellhefe I werdec durch Zugabe von 0,1 N Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt und unter Zusatz von 0,5 g NaCl und 0,1 g Ifatriumdodecylsulfat 30 Minuten bei 55 ⁰C inkubiert.

Das durch Zentrifugieren und Waschen mit Y/asser erhaltene Sediment hat ein Trockengewicht von 5»95 g-

Proteingehalt: 60,8 %\ Nucleinsäuregehalt: 1,4 %\ Beinproteinausbeute: 86 %i Protein/Nucleinsäure-Verhältnis: 40:1

Beispiel 2

100 g eioer 10 g Hefetrockensubstanz enthaltenden Suspension mechanisch aufgeschlossener und denaturierter Stellhofe I werden unter Susatz von 0,5 g HaCl und 0,25 g ITadodecylsulfonat-1 30 Minuten bei 56 ⁰C inkubiert.

Nach dem Zentrifugieren und Waschen mit Wasser wird ein Sediment mit einem Trockengewicht von 5t^0 g erhalten.

TS-Ausbeute: 56 % .

Protein-Gehalt: 60,5 % NS-Gehalt: 1,3 %

Beinprotein-Ausbeute: 84 % Protein/NS-Verhältnis: 46 :1

Beispiel 3

100 g einer 10 $igen HTS-Suspension mechanisch aufgeschlossener und denaturierter Backhefe werden wie im Beispiel 2

mit 0,5 g NaCl und 0,30 g Na-3-äthoxy-n-dodecylsulfonat-i 30 Minuten bei 5⁸ °^c inkubiert, zentrifugiert und gewaschen.

TS-Ausbeute: 55,1 %

Protein-Gehalt: 59,8 % MS-Gehalt: 1,5 %

Reinprotoin-üusbeute: 73_t2 % Protein/NS-VerhältiDis: HO ι 1

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Tabelle 1 ·

Vergleich der Nucleaseaktivität von Suspensionen aufgeschlossener Backhefe (ca. 5 % Hefetrockensubstanz) mit verschiedenen Zusätzen

Nucleaseaktivität in % vor der nach der Zusatz Inkubation Inkubation

3 % NaCl 0,5 %

0,1 % SDS 83 50 \

0,1 % SDS + 0,5 %

100	100
60	60
83	50
100	100
65	35

Bestimmung der Nucleaseaktivität

Zu 1 ml Bibonucleinsäure enthaltenden Acetatpuffer (1,5 mg ENS pro 1 ml 0,2 N Acetatpuffer, pH 516) werden 5OyUl der aufgeschlossenen Hefesuspension gegeben. Die Inkubation erfolgt 15 Minuten bei 50 ⁰C. Die Reaktion wird durch Abkühlen der Proben und Zugabe von 1 ml Fällungsreagenz (0,4 % ₂ (OCOCHo)₂ i° 12 %ige* Perchlorsäure) beendet- Die Proben werden zentrifugiert und 1 ml des Überstandes mit 9 nil Wasser verdünnt.

Die Messung der Extinktion der verdünnten Proben erfolgt bei 260 nm gegen eine Blindprobe, die in gleicher Weise wie die Meßprobe behandelt wird, nur daß anstelle der ENS-LÖ-sung 1 ml Wasser eingesetzt wird.

Tabelle 2

Abtrennung der Nucleinsäuren durch Inkubation von Suspensionen mechanisch aufgeschlossener Hefen in Gegenwart von an ionischen Tensiden (Na-n-dodecylsulf at-1, Na-n-dodecylsulfonat-1 und Na-3-äthoxy-n-dodecylsulfonat-1) und Natriumchlorid

anion. WoCl

Teusid (55) (%)

te Hefe

Vorbehandle· moch.aufgeschl. Hefe

extrahierte Hofoinhnltontoffo Temp. Zeit {% d.einges.Menge) (⁰C) (min) NS Protein

SD3	o,	25	0,5	Stellhefe	I	35	sek,	70°C	7	,5 .	55	30	92	5	14	,β	I
	o,	25	0,5	tt			tt		7	,5	56	30	93	16	03
	o,	30	0,5	Backhefe				7	,5 ·	58	30	93,	21	I

Na-n-dodecylsulfonat-1 Na-3-ät?hoxy-n-dodecylsulfonat-1

Claims (2)

1. Verfahren zur Reduzierung des Nucleinsäuregehaltes bieller Biomasse durch mechanischen Aufschluß der Biomasse, thermische Denaturierung, Einstellung des pH-Westes auf 5,5 bis 8 durch Zugabe von Albalien, Zusatz von Salzen in Mengen von 0,1 bis 2,0 %_% Inkubation bei Temperaturen von 45 bis 65 ⁰C und Gewinnung des Proteinproduktes sowie der Nucleinsäureabbauprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation in Gegenwart von Salzen und 0,01 bis 5₉O % einer anionischen oberflächenaktiven Substanz durchgeführt wird. -

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Substanzen n-Alkylsulfate und n-Alkylsulfocate verwendet werden.