DE69026953T2

DE69026953T2 - Pilzzellwandmaterial mit flockungseigenschaften und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE69026953T2
Application number: DE69026953T
Authority: DE
Inventors: Lars Edebo; Xiangpeng Li
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-08
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2010-10-09
Also published as: EP0494950B1; SE465678B; ATE137800T1; ES2089034T3; SE8903368D0; JPH05500901A; JP3083554B2; DK0494950T3; EP0494950A1; SE8903368L; DE69026953D1; WO1991005869A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Pilzzellwandmaterial mit einem positiven Zeta-Potential bei pH 7, ein Verfahren zur Herstellung des Pilzzellwandmaterials sowie dessen Verwendung.
Chitosan wird als Flockungsmittel insbesondere bei der Abwasserbehandlung verwendet, da es Aminogruppen enthält. Nachdem die meisten biologischen Moleküle und Zellen negativ geladen sind, ist Abwassermaterial, welches organische Materialien wie Proteine, Nukleinsäuren, Bakterien, Fettsäuren, Cellulosefasern enthält, mit positiv geladenem Chitosan ausgeflockt worden, um das Abwasser zu klären.
Im allgemeinen wurde Chitosan aus Meeresabfallresten hergestellt, z.B. Schalen von Krabben, Shrimps, Hummern und Krill. Zuerst wurde das Chitin (Polyacetylglucosamin) aus den Schalen durch Säure extrahiert, dann durch konzentrierte alkalische Lösung bei hoher Temperatur hydrolysiert, um Chitosan, ein alkaliunlösliches und säurelösliches Polymer, zu produzieren. Chitosan wurde gewöhnlich in saurer Lösung extrahiert und solubilisiert. Nach der Filtration wurde die Flüssigkeit durch Alkali neutralisiert, so daß das Chitosan ausfiel und gewonnen wurde.
Das Myzel von Zygomyceten und einigen Ascomyceten enthält ebenfalls Chitin oder Chitosan. Chitosan-Glucan-Komplexe wurden aus dem Myzel von Mucor rouxii und Aspergillus niger extrahiert durch 40% Natriumhydroxid bei 128ºC für 4 Stunden. Der Chitosan-Glucan- Komplex war ein Essigsäure-lösliches weißes Pulver mit Aminogruppen, die durch das IR-Spektrum nachgewiesen wurden, und mit positiven Ladungen, wie eine Kolloidtitration zeigte (Muzzarelli, Ricardo, Deutsche Offenlegungsschrift 2 923 802, 1979). Ferner wurde berichtet, daß Pilz-Chitosan aus Absidia coerulea hergestellt worden war. Das Myzel von Absidia coerulea wurde durch einstündiges Kochen mit 2% Natriumhydroxid deproteiniert. Dann wurde das Chitosan aus dem deproteinierten Myzel durch 2% Essigsäure extrahiert und solubilisiert, das in Essigsäure unlösliche Material jedoch verworfen (W.I. McGahren, etc., Process Biochemistry, 19, 88-90, 1984). Schließlich offenbaren die Publikation J. Gen. Microbiol. 44, 1966, 329-341 und Chemical Abstracts 66, 9, 3367, Abstract-Nr. 35614 ein Hexosamin-Produkt, das aus einer Kulturbrühe erhalten wurde und durch eine Anzahl von Schritten, welche die Lösung von Zwischenprodukten in sauren Medien beinhalteten, hergestellt wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß Pilzzellmaterial, das sowohl in saurem als auch alkalischem Milieu wasserunlöslich ist und bei einem pH-Wert von 7 ein positives Zeta- Potential aufweist, in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Hexosaminen im Zellwandmaterial ausgezeichnete ausflockende und immobilisierende Eigenschaften aufweist. Die Zeta-Potentiale wurden bei Zellwandmaterialien mit einer Teilchengröße von weniger als 20 µm in einem Malvern-Zetasizer bestimmt. Falls das Zellmaterial der Erfindung nicht im Zustand kleiner Teilchen vorliegt, muß das Material zerteilt werden, bevor das Zeta-Potential bestimmt werden kann. Es hat immer noch die schwammige Pilzstruktur und enthält große Mengen an Glucosamin-Einheiten. Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Das Flockungsvermögen des Zellwandmaterials, z.B. für Proteine wie Rinderserumalbumin und für Nukleinsäuren wie Ribonukleinsäure, ist wesentlich höher als das Flockungsvermögen von Chitosan. Das Zellwandmaterial kann leicht durch Zugabe von Essigsäure zu den Flöckchen der Zellwand und des Proteins regeneriert werden. Wenn der pH der ausgeflockten Flüssigkeit durch Essigsäure herabgesetzt wird, verschwinden die Flöckchen und das Protein löst sich in Wasser. Das Zellwandmaterial kann durch Filtration oder Zentrifugation rückgewonnen werden.
Das erfindungsgemäße Pilzzellwandmaterial kann als selektives Flockungsmittel, Träger und/oder Ionenaustauscher bei Verfahren zur Gewinnung oder Entfernung negativ geladener Produkte wie chemische Verbindungen, Polymere, z.B. Proteine wie Enzyme und Hormone sowie Nukleinsäuren, aus Fluiden auf Wasserbasis eingesetzt werden. Ferner können Abwässer wie Abwasser aus Schlachthäusern, Hefe- und Margarinefabriken, der Fischkonserven-Industrie und Zellstoff- und Papierindustrie durch Verwendung des Zellwandmaterials als Flockungsmittel vorteilhaft geklärt werden.
Das Pilzzellwandmaterial ist auch ein ausgezeichneter biologischer Träger zur Immobilisierung von mikrobiellen Zellen und Enzymen. Die Bindungskräfte sind oft so stark, daß die immobilisierten Zellen und Enzyme in einer Wasserlösung hoher Ionenstärke, in saurer und alkalischer Wasserlösung ebenso wie in wäßrigen Lösungen, die heftigem Rühren unterworfen werden, stabil sind. Die Zellen können aus der Gruppe aus Bakterien, Hefen, Pilzmyzelien, Pflanzenzellen und Tierzellen ausgewählt sein, und die Enzyme aus der Gruppe aus Amylase, Katalase, Cellulase, Desoxyribonuklease, Beta-Galactosidase, Beta-Glucanase, Glucoseoxidase, Glucoseisomerase, Lipase, Lysozym, Papain, Penicillinacylase, Pepsin, Protease, Ribonuklease, Trypsin, Urease und irgendwelchen Enzymen, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen.
Zellen und Enzyme mit isoelektrischen Punkten bei sauren pH-Werten können auf dem Zellwandmaterial bei pH-Werten um und unterhalb von 7 immobilisiert werden. In einigen Fällen sind die gebildeten Flöckchen so stabil, daß die Verwendung von Vernetzungsmitteln nicht erforderlich ist. In einigen Fällen, z.B. wenn die Zellen und Enzyme isoelektrische Punkte bei neutralen oder alkalischen pH-Werten aufweisen, könnten keine Flöckchen gebildet werden oder die gebildeten Flöckchen könnten in einer Lösung hoher Ionenstärke oder bei heftigem Rühren nicht ausreichend stabil sein. In diesen Fällen können bifunktionelle Reagenzien wie Dialdehyde und Diisocyanate zur Vernetzung auf übliche Weise eingesetzt werden. Unabhängig davon, ob die Immobilisierung mit oder ohne Vernetzungsmittel erreicht wird, zeigten die gemäß der vorliegenden Erfindung immobilisierten Enzyme außerordentliche Enzymaktivität und Beladung.
Das erfindungsgemäße Pilzzellwandmaterial wird aus einem Pilz, der Chitin oder Chitosan enthält, durch ein Verfahren hergestellt, worin der Pilz Extraktionen zur Entfernung von Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren und Chitosan unterworfen wird. Der Pilz wird normalerweise auch physisch zerteilt, um die Extraktion zu erleichtern. Gemäß einem geeigneten Verfahren wird das Myzel
a) physikalisch zerteilt ünd/oder durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel von Lipiden befreit;
b) von Proteinen und Nukleinsäure durch Behandlung mit Alkali oder Enzym befreit und, falls dies gewünscht wird, mit einer Säure behandelt, um Chitosan zu entfernen.
Im Verfahren der Erfindung können beliebige Pilze, deren Zellwände Chitin oder Chitosan enthalten, verwendet werden. Beispiele geeigneter Pilze sind der Stamm Zygomycota mit den Gattungen Absidia, Mucor und Rhizopus, sowie der Stamm Dikaryomycota mit den Gattungen Aspergillus, Fusarium und Penicillum. Diese Pilze können in einem flüssigen Medium in Kultur gezüchtet werden, das beispielsweise eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und Vitamine enthält. Beispiele anderer Stickstoffquellen sind anorganische Quellen wie (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, NH&sub4;Cl, NH&sub4;NO&sub3; oder organische Quellen wie Harnstoff, Pepton, Sojabohnenprotein und Maiseinweichwasser. Hefeextrakt kann als Vitaminergänzung zugegeben werden. Eine geeignete Kohlenstoffquelle sind Kohlenhydrate wie Glucose, Lactose, Maltose, Sucrose, Stärke und Molassen. Die Kulturbedingungen sind nicht kritisch, es könnten aber übliche Verfahren angewendet werden.
Der physikalische Zerteilungsschritt kann nach jedem üblichen Verfahren durchgeführt werden, z.B. Ultraschallbehandlung, Mahlen in einer Mühle, Sand-Schwingung und Hochgeschwindigkeitsscherung, die Zerteilung wird jedoch vorzugsweise durch Gefrierpressen durchgeführt. Die zerteilten Zellwände weisen vorzugsweise eine Teilchengröße von weniger als 20 µm auf. Nach der Zerteilung kann das intrazelluläre protoplasmatische Material mit Wasser ausgewaschen werden.
Die zerteilten Zellwände werden vorzugsweise einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Hexan, Chloroform, Aceton und Benzol unterworfen, um Lipide zu entfernen. Unter den Lösungsmitteln ist Ethanol das bevorzugte.
Dann werden die von Lipiden befreiten Zellwände mit Alkali oder Enzymen behandelt, um Protein und Nukleinsäure zu entfernen. Geeignete Alkalilösungen sind wäßrige Lösungen von KOH, NaOH, Ca(OH)&sub2; und NH&sub4;OH. Das Enzym Proteinase könnte zur Entfernung von Protein und das Enzym Nuklease zur Entfernung von Nukleinsäure eingesetzt werden. Die Konzentration des Alkali hängt von dem eingesetzten Pilzstamm ab. Vorzugsweise beträgt er 0,2 N-2, 0 N NaOH für Zygomyceten und etwa 8 N für Ascomyceten. Werden die Zellwände keiner physischen Zerteilung unterworfen oder nur einer sanften Zerteilung, die in einer durchschnittlichen Teilchengröße von mehr als 20 µm resultiert, sollte die Behandlung mit Alkali unter Verwendung einer relativ starken Alkalilösung, z.B. 1,0 N NaOH oder höher für Zygomyceten, durchgeführt werden.
Die Entfernung von Chitosan aus den von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäure befreiten Zellwänden ist ein optionaler, aber bevorzugter Schritt im Verfahren der Herstellung des Zellwandmaterials. Durch Säurebehandlung wird freies Chitosan gelöst und aus den Zellwänden entfernt. Die bevorzugte Säure ist Essigsäure, es können jedoch andere Säuren wie verdünnte Salzsäure und Ameisensäure ebenfalls eingesetzt werden. Entferntes Chitosan kann durch Einstellen des pH-Werts auf 9,0 ausgefällt werden.
Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Zellwandmaterial enthält Hexosamine und weist ein positives Zeta-Potential bei sauren und neutralen pH-Werten auf und vorzugsweise beträgt das Zeta- Potential mehr als 20 mV bei pH 6.
Bei pH 7 sind die physisch zerteilten Zellwände ebenso wie die von Lipiden befreiten Zellwände in Wasser negativ geladen. Jedoch weist das zerteilte Zellwandmaterial nach einer Alkali-Extraktion ebenso wie nach der nachfolgenden Essigsäure-Extraktion ein positives Zeta- Potential (positive Ladung) auf. Normalerweise besitzt die zerteilte Zellwand der Erfindung eine durchschnittliche Teilchengröße von weniger als 20 µm.
Das Zellwandmaterial der Erfindung weist ein ausgezeichnetes Vermögen zur Ausflockung von Rinderserumalbumin (BSA) bei einem pH zwischen 4 und 7 und von Hefe-RNA bei einem pH zwischen 3,5 und 6,2 auf. Abwässer aus Schlachthäusern und Hefe-, Margarine- und Fischkonservenfabriken kann leicht durch das Zellwandmaterial bei pH 6 geklärt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

BEISPIEL 1

Fünf verschiedene Zygomycetes-Stämme und zwei verschiedene Ascomycetes-Stämme gemäß Tabelle 1 unten wurden in einem Medium, das Glucose, Hefeextrakt und Mineralsalze enthält, in Kultur gezüchtet. Nach der Züchtung wurde das Myzel auf einem Nylonnetz ausfiltriert und in einer X-Presse zerteilt. Das zerteilte Myzel wurde mit Wasser gewaschen und dann mit heißem Ethanol, zweimal mit heißer 1 N NaOH für Zygomyceten und 8 N NaOH für Ascomyceten, zweimal mit heißem Wasser und schließlich mit 0,2 N Essigsäure extrahiert, wobei jedem Extraktionsschritt eine Filtration folgte. Der Hexosamin-Gehalt, wie nachgewiesen durch ein modifiziertes Elson-Morgan-Verfahren (George C. Chen etc., Appl. Envir. Microbiol. 46 13-16, 1983), und die Zeta- Potentiale (Malvern Zetasizer II, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire WR14 1AQ, England) der erhaltenen Zellwandmaterialien sind in Tabelle 2 unten ebenso wie die Ausbeuten an Zellwandmaterial und Chitosan dargestellt. Das meiste Zellwandmaterial besaß eine Teilchengröße von 5-10 µm. TABELLE 1 Absidia coerulea IMI 38500 Mucor sp. (Chinesisches Isolat) Mucor rouxii ATCC 24905 Rhizopus oligosporus MUCL 18813 Rhizopus oryzae CBS 112.07 Aspergillus niger CCUG sp. Fusanum poae CCUG 22425 ATCC = American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Julianalaan 67a, 2628 BC Delft, Niederlande. CCUG = Culture Collection, University of Göteborg, Guldhedsgatan 10, S-413 46 Göteborg, Schweden. IMI = Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. MUCL = Mycotheque de l Université Catholique de Louvain, Place Croix du Sud 3 Bte 8, 1348 Lourain-la-Neuve, Belgien. TABELLE 2 Stamm (siehe Tabelle 1) Ausbeute an Zellwandmaterial, Gew.-% Ausbeute an Chitosan, Gew.-% Hexosamin im Zellwandmaterial, Gew.-% Zeta-Potential, mV Isoelektrischer Punkt
Als Vergleich wurde rohes Zellwandmaterial aus den Stämmen B und E durch Zerteilung und sorgfältiges Waschen der zerteilten Zellwände in Wasser hergestellt. Ein Teil des zerteilten Zellwandmaterials wurde mit heißem Ethanol extrahiert, um eine Befreiung von Lipiden zu erzielen. Die Zeta-Potentiale sowohl des von Lipiden befreiten Zellwandmaterials als auch des rohen Zellwandmaterials wurden gemessen. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. TABELLE 3 Zeta-Potential, mV Stamm B Stamm E rohe Zellwand von Lipiden befreite Zellwand
Aus dem voranstehenden ist ersichtlich, daß die rohen Zellwandmaterialien bei einem pH-Wert oberhalb von 4 negative Zeta- Potentiale aufweisen, während die gemäß der Erfindung hergestellten Zellwandmaterialien positiv geladen sind.
Es wurde auch ein weiterer Vergleichstest durchgeführt, bei dem das Myzel gemäß W.I. McGahren, etc., Process Biochemistry, 19, 88-90, 1984 behandelt wurde. Nach der Zerteilung in einem Waring-Blendor wurde das Zeta-Potential gemessen und bei pH 7,0 als negativ befunden.

BEISPIEL 2

3,6 mg Trockengewicht an Zellwandmaterial von Beispiel 1 und 1 ml Rinderserumalbumin BSA (6 mg/ml) wurden in ein 10 ml-Reagenzglas pipettiert. Wasser wurde in einer solchen Menge zugegeben, daß nach Einstellung des pHs auf einen pH-Wert von 6,0 das Suspensionsvolumen 6 ml betrug. Die BSA-Endkonzentration betrug 1 mg/ml und das Zellmaterial betrug 600 ppm. Wurden die positiv geladenen Zellwandmaterialien der Tests von Beispiel 1 mit BSA gemischt, trat sofort Ausflocken und Aggregation auf. Es fand kein(e) Ausflocken oder Aggregation statt, wenn das negativ geladene rohe Zellwandmaterial und das von Lipiden befreite Zellwandmaterial aus dem Vergleich in Beispiel 1 statt des positiv geladenen Zellwandmaterials eingesetzt wurde. Es wurden auch Vergleichsteste mit Chitosan durchgeführt. Das Flockungsvermögen wurde durch UV-Extinktion bei 278 nm bestimmt und wie folgt berechnet:
Flockungsvermögen (%) = 100 - O.D. (Überstand)/O.D. (BSA-Kontrolle) × 100
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. TABELLE 4 Pilz BSA-Flockungsvermögen % Chitosan3/ Chitosan4/ 1/ Die Buchstaben A-G beziehen sich auf Tabelle 1. 2/ Penicillium frequentans CCUG sp. 3/ Maximalvermögen bei einer Konzentration von 50 - 100 ppm. 4/ Maximalvermögen bei einer Konzentration von etwa 300 ppm.
Aus den Tests ist ersichtlich, daß die Zellwandmaterialien der Erfindung ausgezeichnete BSA-Flockungsvermögen aufweisen und diesbezüglich Chitosan überlegen sind.

BEISPIEL 3

Rhizopus oryzae CBS 112.07 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 in Kultur gezüchtet und geerntet. Das Myzel wurde gewaschen und direkt 3 Stunden lang mit heißem Ethanol extrahiert. Nach dem Trocknen wurde von Lipiden befreites Myzel erhalten und 15 g davon mit NaOH und Essigsäure weitgehend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, die Konzentration der NaOH betrug jedoch jedoch 0,2 N. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das mit Alkali behandelte Myzel in 0,2 N Essigsäure suspendiert und unter hohen Scherkräften (Ultraturrax; Janke & Kunkel, Staufen, Westdeutschland) 1 Minute lang zerteilt, was 300 ml mit 4,12 mg/ml Bioflockungsmittel ergab. Nach Zentrifugation und pH-Einstellung auf 9,0 der wäßrigen Flüssigkeitsphase wurde Chitosan mit einer Ausbeute von 7,65 Gew.-% erhalten. Die Ausbeute an Zellwandmaterial gemäß der Erfindung betrug 6,77 Gew.-%. Die Ausflockung von BSA wurde wie in Beispiel 2 mit verschiedenen Konzentrationen an Zellwand-Bioflockungsmittel aus Rhizopus oryzae CBS 112.07 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5 Zellwandmaterial, ppm BSA-Ausflockung

BEISPIEL 4

Ribonukleinsäure (RNA) -Lösung (Reinheit 78%, 0,5 mg/ml in 0,05% NH&sub4;OH und 10% NaCl) aus Hefe in einer Menge von 1 ml wurde zusammen mit 2,75 ml Zellwandmaterial (1,6 mg/ml), das aus Rhizopus oryzae CBS 112.07 wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, und 0,1 ml 2 N Essigsäure in Reagenzgläser gegeben. Die pH-Werte der Mischungen wurden durch Zugabe von 0,1 N NaOH eingestellt. Das Flockungsvermögen wurde bestimmt. RNA wurde durch UV-Extinktion bei 260 nm nach Hydrolyse mit 0,5 N Perchlorsäure bei 70ºC nachgewiesen (S. Ohla et al., Applied Microbiology 22, S. 415-421, 1971). Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. TABELLE 8 RNA-Ausflockung, %
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das Zellwandmaterial ein ausgezeichnetes Flockungsvermögen für RNA aufwies. Im Vergleich dazu flockte Chitosan RNA in breiten Konzentrationsbereichen bei den obigen pH-Werten nicht aus.

BEISPIEL 5

Die Ausflockung von BSA mit Zellwand-Bioflockungsmittel wurde wie in Beispiel 2 bei pH 6,0 durchgeführt. Die Zellwand-Bioflockungsmittel der Mucor sp. (Chinesisches Isolat) und Rhizopus oryzae CBS 112.07 wurden dreimal wie folgt regeneriert. Die BSA-Bioflockungsmittel-Flöckchen wurden zentrifugiert und in 5 ml 0,2 N HAc resuspendiert, 20 Minuten lang heftig gerührt, bei 4000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert und in 5 ml 0,2 N HAC resuspendiert und erneut 1 Minute lang gerührt. Nach einer Zentrifugation wurde das Sediment zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen und schließlich 15 Minuten lang bei 4000 UpM zentrifugiert. Das regenerierte Zellwand- Bioflockungsmittel wurde erneut zur Ausflockung von BSA eingesetzt. TABELLE 9 Regeneration des Zellwand-Bioflockungsmittels Flockungsbedingungen: BSA 1 mg/ml, Zellwand- Bioflockungsmittel 1,2 mg/ml, pH 6,0 Zellwand-Bioflockungsmittel Verwendungszeit BSA-Ausflockung % Mucor sp. (Chinesisches Isolat) Rhizopus oryzae CBS 112.07
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das Flockungsvermögen durch die Regeneration nicht negativ beeinflußt wurde.

BEISPIEL 6

Abwasser aus einer Hefefabrik, einer Margarinefabrik, einem Schlachthaus und einer Fischkonservenfabrik wurden durch Zellwand- Bioflockungsmittel geklärt. Die Zellwand-Bioflockungsmittel- Suspensionen von Rhizopus oryzae CBS 112.07 oder Mucor sp. (Chinesisches Isolat) wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Flockungsmittel-Suspensionen wurden zu 50 ml-Wasserproben im Verlauf von 20 Sekunden unter hoher Rührgeschwindigkeit bis zu einem Endvolumen von 60 ml (100 ml für das Wasser aus der Fischkonservenfabrik) zugegeben. Der pH wurde auf 6,0-6,2 mit NaOH oder HCl eingestellt und die Proben langsam 2 Minuten lang gerührt. Man ließ die Proben 75 Minuten lang (180 Minuten für das Wasser der Fischkonservenfabrik) absetzen, wonach die oberen 25 ml mit einer Pipette für Trübungsmessungen abgesaugt wurden. Die Ergebnisse der Abwasserklärung, gezeigt als Resttrübung, sind in der Tabelle unten angegeben. TABELLE 10 Flockungsmittel Trübung Resttrübung (FTU) Abwasser von (FTU) Kontrolle Mucor sp., mg/ml Rhizopus oryzae mg/l Hefefabrik Margarinefabrik Schlachthaus Fisch-Eindosung * nicht gemessen

BEISPIEL 7

0,25 ml Penicillin V-Acylase (78 E/ml, 5,0 E/mg Protein), 1,55 ml Zellwandmaterial mit 5,0 mg/ml (Rhizopus oryzae, CBS 112.07, gemäß Beispiel 1 hergestellt) und 1 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 (KPB), wurden in ein 10 ml-Reagenzglas pipettiert, wonach verschiedene Mengen an 2,5% Glutaraldehyd und schließlich destilliertes Wasser zugegeben wurden, um ein Gesamtvolumen von 5,0 ml zu ergeben. Die Glutaraldehyd-Endkonzentration variierte von 0,04% bis 0,16%. Alle Mischungen wurden über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Die immobilisierte Penicillin V-Acylase wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Sediment wurde zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser, einmal mit 2 ml 3M NaCl, und zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser nacheinander gewaschen und schließlich in destilliertem Wasser auf 5,0 ml suspendiert, sorgfältig gemischt und die Aktivität der immobilisierten Penicillin V-Acylase wie folgt bestimmt:
Enzym, etwa 5 E von 1 ml immobilisierter Enzymsuspension, 20 ml destilliertes Wasser und 2,0 ml 50 mM KPB, pH 7,5 wurden gemischt und heftig bei 28ºC gerührt und dann 20 ml 4% Kalium-Penicillin V (Lösung in destilliertem Wasser) zugegeben. Der pH wurde erneut auf 7,5 durch Filtration mit 10 mM NaOH nach 10 Minuten eingestellt. Eine Einheit Penicillin V-Acylase ist definiert als die Produktion von 1 µM 6-Aminopenicillansäure in 1 Minute. Der Einfluß der Konzentration von Glutaraldehyd auf die Aktivität von immobilisierter Penicillin V-Acylase ist in Tabelle 11 gezeigt und das Verhältnis zwischen Enzym und Zellwand in Tabelle 12. TABELLE 11 Glutaraldehyd % immobilisierte Aktivität E/g trockene Zellwand immobilisierte Penicillin V-Acylase % TABELLE 12 Das Verfahren war dasselbe wie das für die in Tabelle 11 gezeigten Tests verwendete, es wurden jedoch verschiedene Volumina an Zellwandsuspension bei 10 mg/ml und Glutaraldehyd in einer Menge, die eine Konzentration von 0,1 Gew.-% ergab, eingesetzt. Acylase/Zellwand (w/w) immobilisierte Aktivität (E/G trockene Zellwand) immobilisierte Penicillin V-Acylase (%)

BEISPIEL 8

1,0 g gepreßter Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, mit 25% Trockengewicht wurde in 100 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 6,0 suspendiert. 2 ml der Hefesuspension und Zellwandmaterial (hergestellt gemäß Beispiel 1, Rhizopus oryzae CBS 112.07 5,0 mg/ml) wurden in ein 10 ml-Reagenzglas in solchen Mengen einpipettiert, daß die in Tabelle 13 angegebenen Verhältnisse erreicht wurden. Das Verhältnis (w/w) trockener gepreßter Hefe zu Zellwandmaterial wurde von 0,5 bis 3,0 gehalten. 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,0 wurde auf 5,0 ml zugegeben und die Suspensionen sorgfältig gemischt. Die Ausflockung geschah sofort. Unter dem Mikroskop bestanden die Flöckchen aus Hefezellen, die mit Zellwandmaterial gemischt waren. Die gesamte 5,0 ml-Suspension wurde durch ein Filterpapier filtriert und die Trübung des Filtrats bei 500 nm bestimmt. Die Immobilisierung der Hefezellen wurde wie folgt berechnet:
Immobilisierung (%) = 100 (1-ODFiltrat/ODKontrolle)
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: TABELLE 13 gepreßte Hefe/Zellwand (w/w) Immobilisierung von Hefezellen %
Die mit dem Zellwandmaterial immobilisierten Hefezellen waren bei heftigem Rühren, in Wasserlösungen mit hoher Ionenstärke und sauren oder alkalischen Wasserlösungen stabil, z.B. bei heftigem Rühren mit 500 UpM, in destilliertem Wasser, 2% NaCl, 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,0, 1% NH&sub4;OH, 0,1 N HAc, 0,1 M H&sub3;PO&sub4;, 0,1 M HCl bei Raumtemperatur. Die immobilisierten Hefezellen könnten mit Druckfiltration, Vakuumfiltration oder Zentrifugation behandelt werden. Im Vergleich dazu war die Ausflockung von Hefezellen mit Chitosan weder in 2% NaCl- Lösung noch in destilliertem Wasser stabil.

BEISPIEL 9

Pseudomonas putida EP 12690 von CCUG wurde in Fleischextrakt-Medium in Kultur gezüchtet, durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit Wasser gewaschen und in Wasser bei einem Trockengewicht von 10,8 mg/ml suspendiert. 0,5 ml der Bakteriensuspension und Zellwandmaterial (hergestellt gemäß Beispiel 1, Rhizopus oryzae CBS 112.07) wurden in ein 10 ml-Reagenzglas in solchen Mengen pipettiert, daß die in Tabelle 14 angegebenen Gewichtsverhältnisse erhalten wurden, und Wasser wurde auf 5,0 ml zugegeben und das Immobilisierungsverfahren und die Bestimmung der Immobilisierung wie für immobilisierte Hefezellen in Beispiel 1 durchgeführt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: TABELLE 14 Bakterien/Zellwand (w/w) Immobilisierung von Bakterienzellen %
Die Zellwand-Präparation und Pseudomonas putida sind beide als Trockengewicht angegeben. Die Flöckchen von Pseudomonas putida und Zellwänden waren so stabil wie diejenigen von Bäckerhefe bei einem Hochgeschwindigkeitsrühren mit 500 UpM, Filtrations- und Zentrifugationsverfahren, in destilliertem Wasser, 2% NaCl, 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,0, 1% NH&sub4;OH, 0,1 N HAc, 0,1 M H&sub3;PO&sub4; und 0,1 N HCl.
Die Beladungskapazität zur Immobilisierung von mikrobiellen Zellen an Zellwandmaterial war hoch, 1,0 - 2,0 g Hefezellen oder 0,9 - 1,35 g Bakterienzellen pro g Zellwandmaterial (Trockengewicht). Es ist ersichtlich, daß das Zellwandmaterial dieser Erfindung aufgrund der hohen Beladung und Stabilität sogar in stark sauren und alkalischen Wasserlösungen eine gute Matrix zur Immobilisierung mikrobieller Zellen darstellt.

BEISPIEL 10

Bohnen("jack bean")-Urease, 75 E/mg (Sigma Chemical Co.), wurde in 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei 1 mg/ml gelöst. 4 ml der Urease- Lösung und 4 mg/ml Zellwandmaterial (gemäß Beispiel 1 hergestellt, Absidia coerulea IMI 38500) wurden in ein 10 ml-Reagenzglas in solchen Mengen pipettiert, daß die in Tabelle 15 angegebenen Gewichtsverhältnisse erreicht wurden, 5 Minuten lang langsam gerührt und dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die Zellwände mit gebundener Urease wurde durch Zentrifugation gewonnen. Die Urease- Aktivität des Überstands wurde bestimmt und als nicht-immobilisierte Urease betrachtet. Der Niederschlag wurde mit 5 ml destilliertem Wasser, 5 ml 3 N NaCl, 5,0 ml destilliertem Wasser × 2 und 5 ml 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,0 nacheinander gewaschen und schließlich in 4,0 ml 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert, sorgfältig gemischt und als immobilisierte Urease-Präparation eingesetzt. Die Aktivitäten der Überstände als freie (nicht-immobilisierte) Urease und immobilisierte Urease wurden nachgewiesen wie im Worthington Enzyme Manual, S. 144, Worthington Biochemical Co., Freehold, New Jersey, USA, 1972, angegeben. Eine Einheit Urease-Aktivität wurde definiert als Freisetzung von einem Mikromol Ammoniak pro Minute bei pH 7,0 und 25ºC. Die freie Urease im Überstand betrug 0,9 - 3,4%. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. TABELLE 15 Urease/Zellwand (w/w) Immobilisierte Urease % Immobilisierte Aktivität E/g trockene Zellwand
Immobilisierte Urease ist als % der anfänglichen Urease-Aktivität vor der Immobilisierung angegeben.
Die Stabilität der Zellwand-immobilisierten Urease bei 4ºC und Raumtemperatur ist in Tabelle 16 dargestellt. TABELLE 16 Tag Aktivität % Raumtemperatur
Die Enzymaktivität der immobilisierten Urease war unter Bedingungen heftigen Rührens stabil. Die Ureasebeladung von 37800 E/g (trockene Zellwand) war viel höher als diejenige der hydrophilen synthetischen porösen Polymer-Perlen mit 416 E/g (trockener Träger) (Mauz, Otto, etc., Deutsche Offenl. DE 3 714 276, 1988) und diejenige eines synthetischen Kationenaustauschharzes mit 340 E/g (trockenes Harz) (H.J. Moynihan, etc., Biotechnology and Bioengineering 34:951-963, 1989). Die Halbwertszeiten der Enzymaktivität von Zellwandimmobilisierter Urease betrugen mehr als 27 Tage sowohl bei 4ºC als auch bei Raumtemperatur.

BEISPIEL 11

Glucoseoxidase, 59,4 E/mg, wurde in destilliertem Wasser bei 2 mg/ml gelöst. 4 ml der Glucoseoxidase-Lösung, 1,6 ml Zellwandmaterial (5,0 mg/ml Rhizopus oryzae CBS 112.07 gemäß Beispiel 1), 2,4 ml destilliertes Wasser und 0,32 ml 5% Glutaraldehyd wurden in ein 10 ml- Reagenzglas pipettiert, gemischt und dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die Glucoseoxidase wurde unter Verwendung der bifunktionellen Verbindung Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel an das Zellwandmaterial fixiert. Die Zellwand-immobilisierte Glucoseoxidase wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde mit 10 ml destilliertem Wasser × 2, 10 ml 0,25 M KCl, 10 ml destilliertem Wasser × 2, nacheinander gewaschen und schließlich in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert. Diese 200 ml-Suspension wurde unter hoher Scherkraft 1 Minute lang homogenisiert und die immobilisierte Glucoseoxidase bestimmt (Worthington Enzyme Manual, S. 19, Worthington Biochemical Co., Freehold, New Jersey, USA, 1972). Eine Einheit Glucoseoxidase-Aktivität wurde als diejenige Menge definiert, welche 1 Mikromol H&sub2;O&sub2; pro Minute bei 25ºC freisetzt.
Die Beladung immobilisierter Glucoseoxidase betrug 26800 E/g (trockene Zellwand), was weit hoher ist als diejenige der synthetischen Polyacrylamid-Perlen von 100 E/g (trockener Träger) (B. Szajäni, etc., Applied Biochemistry and Biotechnology 14:37-47, 1987). Die immobilisierte Glucoseoxidase zeigte 45,1% der Aktivität im Vergleich mit der ursprünglichen Glucoseoxidase-Lösung vor der Immobilisierung.

BEISPIEL 12

100 ml Zellwandmaterial (6,0 mg/ml Absidia coerulea IMI 38500 gemäß Beispiel 1), 20 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6 und 5,0 ml 25% Glutaraldehyd wurden in einem 200 ml-Becherglas gemischt, 5 Minuten lang langsam gerührt und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Glutaraldehyd-aktivierte Zellwandmaterial wurde durch Vakuumfiltration in einem gesinterten Glastrichter gewonnen und mit 100 ml destilliertem Wasser fünfmal, 50 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6, gewaschen und schließlich in 60 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6, suspendiert. 300 ml rohes Papain mit 1,5 E/mg wurden in 27 ml einer Lösung von destilliertem Wasser, die 0,05 M Cystein, 5×10&supmin;³M EDTA und 1×10&supmin;&sup6;M Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Die Papain-Lösung und das aktivierte Zellwandmaterial wurden gemischt und dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Das Zellwand-immobilisierte Papain wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit 50 ml destilliertem Wasser × 2, 50 ml 1 N NaCl × 2, und 50 ml destilliertem Wasser × 2 nacheinander gewaschen und in destilliertem Wasser suspendiert, um zusammen ein Endgewicht von 20 g zu ergeben.
Die Aktivität des immobilisierten Papains wurde bestimmt (Worthington Enzyme Manual, S. 134, Worthington Biochemical Co., Freehold, New Jersey, USA, 1972). Eine Einheit der Papain-Aktivität wurde definiert als Hydrolysierung eines Mikromols Benzoylargininethylester pro Minute bei 25ºC.
Die Beladung an immobilisiertem Papain betrug 370 E/g (trockene Zellwand) oder 49% der Aktivität im Vergleich zu dem ursprünglichen rohen Papain vor der Immobilisierung, was höher ist als diejenige von p-Benzochinon-aktivierter Cellulose mit 72,4 E/g (trockener Träger), die von A. Telefoncu, etc., Biotechnology and Bioengineering 23:1689-1674, 1981, angegeben wurde.

Claims

1. Pilzzellwandmaterial, das in saurem und alkalischem Milieu wasserunlöslich ist, dadurch gekennzeichnet, daß es Hexosamin enthält und bei einem pH-Wert von 7 ein positives Zeta-Potential aufweist, wenn es auf eine Teilchengröße von weniger als 20 µm zerteilt ist, wobei das Pilzzellmaterial aus einem Pilz, der Chitin oder Chitosan enthält, erhältlich ist durch

a) physikalische Zerteilung und/oder Entfernung von Lipiden mit einem organischen Lösungsmittel und

b) Entfernung von Proteinen und Nukleinsäure durch Alkalibehandlung und/oder Behandlung mit einem Enzym.

2. Pilzzellwandmaterial nach Anspruch 1, worin der Gehalt an Hexosamin mindestens 5 Gewichtsprozent beträgt.

3. Pilzzellwandmaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zellwandmaterial aus einem Pilz stammt, der aus der Ordnung Zygomycota oder der Ordnung Dikaryomycota ausgewählt ist.

4. Pilzzellwandmaterial nach Anspruch 3, wobei das Material aus einem Myzel stammt.

5. Pilzzellwandmaterial nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, wobei das Material bei pH 6 ein Zeta-Potential von mindestens 20 mV aufweist, wenn es auf eine Teilchengröße von weniger als 20 µm zerteilt ist.

6. Pilzzellwandmaterial nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, wobei das Material eine durchschnittliche Teilchengröße vonweniger als 20 µm aufweist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Pilzzellwandmaterials nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material aus einem Pilz, der Chitin oder Chitosan enthält, erhalten wird durch

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Pilz in Schritt a) physikalisch auf eine Teilchengröße von weniger als 20 µm zerteilt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin das deproteinierte Zellwandmaterial zur Entfernung von Chitosan mit Säuren extrahiert wird.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7-9, worin der Pilz aus der Ordnung Zygomycota oder der Ordnung Dikaryomycota ausgewählt ist.

11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7-10, worin das Zellwandmaterial aus einem Myzel erhalten wird.

12. Verwendung des Zellwandmaterials nach irgendeinem der Ansprüche 1-6 in einem Verfahren zur Gewinnung oder Entfernung von negativ geladenen Produkten aus Medien auf Wasserbasis.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin eine Zelle oder eine biologisch aktive Verbindung auf dem Zellwandmaterial immobilisiert ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die Zelle zu der aus Bakterien, Hefen, Pilzmyzelien und Pflanzen- und Tierzellen bestehenden Gruppe gehört.

15. Verwendung nach Anspruch 13, worin die Verbindung ein Enzym ist, das zu der aus Amylase, Katalase, Cellulase, Desoxyribonuklease, β-Galactosidase, β-Glucanase, Glukoseoxidase, Glukoseisomerase, Lipase, Lysozym, Papain, Penicillinacylase, Pepsin, Protease, Ribonuklease, Trypsin, Urease und irgendwelchen Enzymen, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen, bestehenden Gruppe gehört.

16. Verwendung nach den Ansprüchen 13-15, worin die Immobilisierung ohne die Anwesenheit eines Vernetzungsmittels durchgeführt wird.

17. Verwendung nach den Ansprüchen 13-15, worin die Immobilisierung in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels durchgeführt wird.