DD155176A5 - Verfahren zur herstellung von derivaten cyclischer peptidkerne - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten cyclischer Peptidkerne. Es handelt sich um neue semisynthetische, stark antifungal wirksame Verbindungen, die man durch enzymatische Deacylierung eines entsprechenden cyclischen Peptidantibiotikums herstellt. Beispielsweise wird der A-42355-Antibiotikumkomplex hergestellt und abgetrennt. In den Rahmen der Erfindung faellt auch die Herstellung des Antibiotikums S31794/F-1 durch submerse Zuechtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095 oder die Herstellung von Derivaten des A-30912 D oder A-30912 H Kerns, um einige Beispiele zu nennen.

Description

22 6 030 -*-

Aktenzeichen: X-5595A-P

Anmelder:

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V. St. A.

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung von Derivaten cyclischer

Peptidkerne

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer semisynthetischer antifungal wirksamer Verbindungen, die man durch Acylierung cyclischer Peptidkerne erhält, welche durch enzymatische Deacylierung eines entsprechenden cyclischen Peptidantibiotikums hergestellt werden.

Charakteristik der bekannten - technischen Lösungen:

Das oben erwähnte cyclische Peptidantibiotikum ist eine antifungal wirksame Verbindung der allgemeinen Formel I

- 2 - 22 6 03 0

H₃ ^H?J

/ \ Hs*

>/ *H I H—*r~-»»estf>!-R

0=*_N H GH H \ X.

_h. . .-_M

12 3 4

worin R₇ R , R , R und R die später angegebenen Bedeutungen haben.

Werden im folgenden Formeln für cyclische Peptide, wie die obige Formel I, angegeben, dann ist dabei vorausgesetzt, daß die Aminosäuren in L-Konfiguration vorliegen.

Die Faktoren A, B, D und H de-..- Antibiotikums A-30912 sind cyclische Peptidantibiotika der obigen allgemeinen Formel I, worin R für Linoleyl /eis,eis CH₃(CH₂)₄-CH=CHCH₂CH=CH-(CH₂)_?- CO₁₁/ steht.

A-30912 Faktor A hat die Struktur der Formel I, worin R¹, R^J

4 2

und R insgesamt OH bedeuten und R für H steht.

- 3 - 2 2 6 0 3 0

A-30912 Faktor B hat die Struktur der Formel I, worin R und

2 3 4

R jeweils H sind und R sowie R jeweils OH bedeuten.

A-30912 Faktor D hat die Struktur der Formel I, worin R , R ,

3 4

R und R insgesamt H sind.

A-30912 Faktor H hat die Struktur der Formel I, worin R und R beide OH sind, R für H steht und R³ für CH₃O steht.

Das Antibiotikum S 31794/F-1 ist ein antifungal wirksames cyclisches Peptid der Formel I, worin R Myris.toyl bedeutet, R¹, R und R für OH stehen und R² für -CO-NH« steht.

Jeder Faktor ist aus dem A-30912-Komplex isoliert, der die anderen Faktoren enthält, welche willkürlich als Faktoren B, C, D, E, F und G bezeichnet werden. Der A-3 0912-Komplex und . die einzelnen Faktoren A'bis G gehen aus US-PS 4 024 245 hervor. Das Antibiotikum A-30912 Faktor A ist identisch mit dem Antobiotikum A-22802, das in US-PS 4 024 246 beschrieben ist. Der Faktor A ist ferner auch identisch mit dem Antibiotikum Echinocandin B (siehe HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974) und CH-PS 568 386) und dem Antibiotikum SL 7810/F (siehe Tetrahedron Letters 4147 (1976) und BE-PS 834 289).

Das Antibiotikum A-30912 Faktor A wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, (c) Aspergillus nidulans var.echinulatus A-32204, NRRL. 3860, (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 oder (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Auch der Faktor B hat sich als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum'Echinocandin C /siehe HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979_)_/ und dem Antibiotikum SL 7810/F-II /siehe BE-PS 834 289/. Das Antibiotikum A-30912 Faktor B wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von meh-

- 4 - 22 6 03 0

reren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL .8113, (b) Aspergillus nidulans var. echinu- latus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 oder (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Weiter hat sich auch der Faktor D als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum Echinocandin D _/siehe KeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979]_/ und dem Antibiotikum SL 7810/F-III (siehe BE-PS 834 289). Das Antibiotikum A-30912 Faktor D wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (siehe BE-PS 834 289) oder (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Der Faktor H ist ein später aufgefundener antibiotisch wirksamer Faktor von A-30912 und geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Karl H. Michel mit dem Titel "ANTIBIOTIC A-30912 FACTOR H", Serial No. 117 739 vom 1. Februar 1980 hervor, bei der es sich um eine continuation-in-part-Anmeldung mit der Serial No. 46,875 vom 8. Juni 1979 (zwischenzeitlich fallengelassen) handelt, und die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit in die vorliegende Anmeldung eingeführt. . .

Das Antibiotikum A-30912 Faktor H wird hergestellt durch Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 oder (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Eine Subkultur von A· nidulans var. roseus ist in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 11440

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für die Öffentlichkeit zugänglich ist. Verwendet man einen Stamm von A. nidulans var. roseus NRRL 11440 zur Erzeugung irgendeines der Faktoren von A-30912, dann erhält man einen Komplex an Faktoren, der vorliegend einfach als A-42355 Antibiotikum-Komplex bezeichnet wird. Das. Antibiotikum A-30912 Faktor A ist der überwiegende Faktor des A-42355 Antibiotikum-Komplexes, während die Faktoren B, D und H die in geringerer Menge vorhandenen Faktoren sind. Die später, folgenden Herstellungsbeispiele 2 bis 7 erläutern die Herstellung des A-42355 Komplexes und die Isolierung . und Reinigung der ein- ' zelnen A-30912 Faktoren aus diesem Komplex.

Im Antibiotikummolekül der allgemeinen Formel I ist die Linoleylseitenkette (R) an der OC-Aminogruppe des Ornithinrests gebunden. Überraschenderweise wurde dabei gefunden, daß sich die Linoleylseitenkette vom Kern enzymatisch abspalten läßt, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird. Das für diese Deacylierungsreaktion verwendete Enzym wird durch einen Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise durch den Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder eine Variante hiervon, gebildet. Zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung gibt man den jeweiligen Faktor des Antibiotikums A-30912 zu einer Kultur des Mikroorganismus und bebrütet die Kultur mit dem Substrat solange, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierbei erhaltene cyclische Kern wird in bekannter Weise von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Im Gegensatz zu den Faktoren A, B, D und H des Antibiotikums A-30912 ist der cyclische Kern, der keine Linoleylseitenkette mehr enthält, praktisch nicht antifungal wirksam.

In DE-OS 26 28 965 und US-PS 4 173 629 wird das Antibiotikum S31794/F-1 beschrieben, welches durch Acrophialophora

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iimonispora nov. spec. Dreyfuss et Müller NRRL 8095 gebildet wird. Dieses Antibiotikum S31794/F-1 weist folgende charakteristische Eigenschaften auf: Schmelzpunkt 178 bis 180⁰C (Zersetzung) (amorph) oder 181 bis 183°C (Zersetzung) (kristallin), /o^/p°=-24° (C=O,5, CH₃OH) oder +37° (c=0,5, Pyridin) (kristallin), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 194 nm

(eÜ^% = 807), 225 nm (Schulter) e]^% = 132), 276 nm 1cm 1cm

(e'^% - 12,8), 284 nm (Schulter) e}^% = 10,5); ¹³C-NMR-Spektrum ι cm ι cm

in Deuteromethanol (190 mg in 1,5 ml Deuteromethanol, Tetramethylsilan als interner Standard) mit folgenden Eigenschaften (kristallin):

	Ppm	EEHl
176,2	75,5	51,2
175,0	74,0	39,7
173,7	71 ,0	38,8
172,6	70,5	36,6
172,0	69,7	34,8
171,8	68,0	32,8
171,7	62,2	30,6
168,6	58,3	26,7
157,7	57,0	23,5
132,5	56,2	19,7
129,0	55,4	14,3
115,9	52,9	11,1
76,6

und (nach Trocknung des kristallinen Materials über eine Zeitdauer von 2 Stunden in einem Hochvakuum bei 100⁰C etwa folgende Elementaranalyse: 55,5-56,5 % Kohlenstoff, 7,5-7,7 % Wasserstoff, 10,5-10,8 % Stickstoff und 25,5-26,0 % Sauerstoff, ist löslich in Methanol, Ethanol, Pyridin, Dimethylsulfoxid,

"J _

A O ti

U o U

'schwachlöslich in Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Diethylether, Benzol und Hexan, und ist antifungal wirksam, und zwar insbesondere gegenüber Candida albicans.

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird hergestellt durch submerse aerobe Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095, wie dies aus den später folgenden Herstellungsbeispielen 8 und 9 hervorgeht. Auch dieser Mikroorganismus ist in der Kulturensamrnlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der er unter der Nummer NRRL 8.095 für die Öffentlichkeit zugänglich ist.

Das Antibiotikum S31794/F-1 ist antifungal wirksam, und zwar insbesondere gegenüber Stämmen von Candida, wie Candida albicans. Herstellung und Isolierung dieses Antibiotikums können durch Bioautographie unter Verwendung einer Spezies von Candida, wie Candida albicans, überwacht werden.

Im Molekül des Antibiotikums &31794/F-1 der Formel l_f worin R , R und R insgesamt OH sind und R für -CO-NH₂ steht, ist die Myristoylseitenkette (R) an die o^-Aminogruppe des Dxhydroxyornxthinrestes des cyclischen Peptidkerns gebunden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß diese Myristoylseitenkette vom Kern enzymatisch abgespalten werden kann, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird. Das zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung verwendete Enzym wird von einem Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise dem Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder einer Varianten hiervon, gebildet. Zur Durchführung dieser Deacylierung gibt man das Antibiotikum S31794/F-1 zu einer Kultur des Mi-kroorganis-

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mus und läßt die Kultur solange auf das Substrat einwirken, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierdurch erhaltene cyclische. Kern wird von der Fermentationsbrühe in bekannter Weise abgetrennt. Im Gegensatz zu dem Antibiotikum S31794/F-1 weist der cyclische Kern, der keine Myristoylseitenkette mehr enthält, praktisch keine antifungale Wirksamkeit auf.

Die durch die oben beschriebenen enzymatischen Deacylierungen der Antibiotika der allgemeinen Formel I erhaltenen cyclischen Peptidkerne entsprechen folgender allgemeiner Formel II

CH₃ ^H0

II

2 2 6 0 3

.Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin

13 4 2

R , R und R insgesamt OH bedeuten und R für H steht,

stellt den Kern von A-30912 Faktor A dar und wird der Einfachheit halber im folgenden als A-30912A Kern bezeichnet. Der A-30912A Kern hat eine empirische Formel von C-^H₅₁-N-O₁₅ und ein Molekulargewicht von 797,83.

1 Die Verbindung aus der allgemeinen Formel II, worin R und

2 " 3 4

R - jeweils H bedeuten und R sowie R beide OH sind, ist der Kern von A-30912 Faktor B und wird im folgenden als A-30912B Kern bezeichnet. Der A-30912B Kern hat die empirische Formel C-.Hc-N-O.. und weist ein Molekulargewicht von 781,81 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R¹, R ,R und R jeweils H sind, ist der Kern von A-30912 Faktor D und wird der Einfachheit halber im folgenden als A-30912D Kern bezeichnet. Der A-30912D Kern hat eine empirische Formel von C₃₄H₅₁N₇O₁„ und weist ein Molekulargewicht von 749,83 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R¹ und R⁴ jeweils OH sind, R² für H steht und R³ für CH₃O-steht, ist der Kern von A-3 0912 Faktor H und wird im folgenden einfach als A-30912H Kern bezeichnet.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R¹, R und R jeweils OH sind und R für -CO-NH₂ steht, ist der Kern des Antibiotikums S31794/F-1 und wird einfach als S31794/F-1 Kern bezeichnet. Der S31794/F-1 Kern hat eine

empirische Formel von ^C35^Hc₂ ^N8^Oi6 ^{und we}^-^{st e}^-ⁿ Molekulargewicht von 840,87 auf.

Durch Abspaltung der Seitenkettengruppe erhält man, eine .freie primäre oC-Aminogruppe im Ornithinrest des cyclischen Peptids,

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Die dabei erhaltenen Kerne können dabei selbstverständlich entweder die Form eines freien Amins oder eines Säureadditionssalzes haben. Es kann sich dabei um irgendwelche geeigneten Säureadditionssalze handeln, wobei die Säureadditionssalze nicht toxischer und pharmazeutisch unbedenklicher Säuren jedoch bevorzugt sind.

Das Verfahren zur Herstellung des jeweiligen Kerns aus dem entsprechenden Antibiotikum durch Fermentation unter Verwendurig von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Bernard J. Abbott und David S. Fukuda mit dem Titel "A PROCESS FOR THE PREPARATION OF CYCLIC PEPTIDE NUCLEI" und mit dem internen Aktenzeichen X-5399A hervor, und die Offenbarung dieser Anmeldung wird hierdurch vorliegend eingeführt.

Kulturen typischer Spezies von Actinoplanaceae sind in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory hinterlegt worden und bilden einen Teil der dortigen Sammlung, von der sie unter "den im folgenden angegebenen Nummern für die Öffentlichkeit zugänglich sind.

Actinoplanes utahensis . NRRL 12052 Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp. . NRRL 12065' Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit irgendeines bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der erfindungsgemäßen Deacylierung wird durch folgendes Verfahren ermittelt. Ein geeignetes Wachstumsmedium wird mit dem Mikroorganismus beimpft. Die Kultur wird dann zwei oder drei Tage bei etwa 28⁰C auf einem Rotations-

2 2 6 0 3

schüttler bebrütet. Sodann versetzt man die Kultur mit einem der Substratantibiotika. Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird auf etwa pH 6,5 gehalten. Die Kultur wird bezüglich ihrer Aktivität unter Verwendung von Candida albicans durch Bioautographie überwacht. Eine Abnahme der antibiotischen Wirksamkeit ist ein Zeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacylierung geeignete jeweilige Enzym bildet. Diese Tatsache muß jedoch-sichtbar gemacht werden, wozu man sich folgender Methoden bedienen kann: (1) Analyse durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bezüglich der Gegenwart des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer entsprechenden Seitenkette, beispielsweise Linoleyl, Stearoyl, Palmitoyl oder Myristoyl, zur Wiederherstellung der ursprünglichen Wirksamkeit.

Es ist bekannt, daß andere antibiotisch wirksame Substanzen den gleichen Kern enthalten wie das Antibiotikum A-30912 Faktor A.Diese Antibiotika unterscheiden sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor A darin, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I andere Acylgruppen enthalten. Beispiele für solche Antibiotika sind (a) Tetrahydro-A-30912 Faktor A (Tetrahydro-SL 7810/F, Tetrahydroechinocandin B gemäß BE-PS 834 289 und HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974)), das der allgemeinen Formel I entspricht, falls R Stearoyl ist, oder (b) Aculaecin A, das ein Bestandteil des Aculaecin-Komplexes ist (hergestellt durch Fermentation mittels Aspergillus aculeatus NRRL 8075) gemäß ÜS-PS 3 978 210. Wie aus der BE-PS 859 067 hervorgeht, enthält das Aculaecin A eine Palmxtoylsextenkette anstelle von Linoleyl. Tetrahydro-A-309 12 Faktor A läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor A herstellen durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck. Sowohl Tetrahydro-A-30912 Faktor A als auch Aculaecin A können als Substrate für die enzyrnatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.

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Es ist weiter bekannt, daß auch eine andere antibiotische Substanz den gleichen Kern wie das Antibiotikum A-30912 Faktor B enthält; Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor B lediglich darin, daß sie anstelle der Lxnoleylgruppe (.R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und bei ihr handelt es sich um Tetrahydro-A-3 0912 Faktor B (Tetrahydro-SL 7810/F-II, Tetrahydroechinocandin C) gemäß HeIv. Ghim. Act'a 62, 1252 (1979). Tetrahydro-A-30912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I, falls R für Stearoyl steht. Tetrahydro-A-30912 Faktor B läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor B durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-30912 Faktor B kann als Träger anstelle des Antibiotikums A-30912 Faktor B für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Ferner ist bekannt, daß auch eine weitere antibiotische Substanz den gleichen Kern enthält wie das Antibiotikum A-30912 Faktor D. Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor D dadurch, daß sie anstelle der Lxnoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und hierbei handelt es sich um Tetrahydro-A-30912 Faktor D (Tetrahydro-SL 7810/F-III, Tetrahydroechinocandin D) gemäß HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979). Tetrahydro-A~30912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I, falls R für Stearoyl steht. Tetrahydro-A-30912 Faktor D läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor D durch .katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-3 0912 kann als Substrat anstelle des Antibiotikums .A-30912. Faktor D für die enzymatische Deacylierung nach dem vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

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Beim Antibiotikum A-30912 Faktor H ist die im Dihydroxyornithinrest des Peptidkerns vorhandene 5-Hydroxylgruppe methyliert, während beim Antibiotikum A-30912 Faktor A diese 5-Hydroxylgruppe unsubstituiert ist. Der Faktor H läßt sich demnach synthetisieren, indem man den Faktor A in für die Herstellung eines aliphatischen Ethers aus einem Alkohol üblicherweise methyliert. Der Faktor A kann selbstverständlich auch mit anderen niederen Alkylgruppen alkyliert werden, wodurch man zu Alkyloxyhomoiogen des Moleküls des Faktors H gelangt. Die Alkyloxyhomologen des Faktors H, die sich synthetisch aus dem Faktor A herstellen lassen, sind als Homologe des Antibiotikums A-30912 Faktor H bekannt. Die Verbindung aus der obigen all-

14 2

gemeinen Formel II, worin R und R jeweils OH sind, R für H steht und R für C_n-C, Alkyloxy steht, werden vorlieqend als A-30912H Kerne bezeichnet.

Die Linoleylseitenkette von A-30912 Faktor H oder von Homologen von A-30912 Faktor H können selbstverständlich in üblicher Weise hydriert werden, wodurch man zu Tetrahydro-A-30912 Faktor H oder dem entsprechenden Tetrahydroderivat der Alkyloxyhomologen (R=Stearoyl) gelangt. Wahlweise kann man die Tetrahydroderivate auch herstellen, indem man zuerst das Antibiotikum A-30912 Faktor A zu Tetrahydro-A-30912 Faktor A hydriert und daraus dann das jeweils gewünschte Alkyloxyderivat bildet.

Die Antibiotika A-30912 Faktor H, Tetrahydro-A-30912 Faktor H, Cp-C_fi Alkyloxyhomologe des Faktors H oder Tel;vahydroderivate von C₂-C₆ Alkyloxyhomologendes Faktors H lassen sich selbstverständlich ebenfalls als Substrate für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren einsetzen.

- 14 - 22 6 03

Aufgabe der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate von cyclischen Peptidkernen zu schaffen, die sich durch eine besondere Wirksamkeit, vor allem eine besondere antifungale Wirksamkeit, auszeichnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die' obige Aufgabe wird erfindungsgemäß nun dadurch gelöst, daß man cyclische Peptidkerne der oben erwähnten allgemeinen Formel II einfach acyliert und hierdurch in Derivate cyclischer Peptidkerne der folgenden allgemeinen Formel III überführt .

γμ HO ff R^a R*

ι. y\y *"\ η

H I H—a ..iiiisgsNj-

H.. \—/ S=O

R²H₂C H ^__{H H N},

> N

R¹^ ·.„. ^{H φ} :t I

—β··OH

III

- is.- 22 6 03 O '

1 2 3

worin R für H oder OH steht, wobei R für H steht und R

4 1

sowie R jeweils H oder jeweils OH sind, falls R für H steht,

2 3

oder wobei R für H steht, R für OH oder C₁ -C-. Alkoxy steht

4 2 ⁶ 3

und R für OH steht oder R ·für -CO-NH₂ steht und R sowie

R⁴ jeweils für OH stehen, falls R¹ für OH steht, 0

Γ Il C

R N-Alkanoylaminoacyl der allgemeinen Formel -W-C-R bedeutet,

worin W zweiwertiges Aminoacyl der folgenden allgemeinen Formeln ist: ·

(a) -C-A-NH-,

worin A für C-C₁₀ Alkylen oder C₅-C, Cycloalkylen steht, OR⁷

(b) -C-CH-NH-,

worin R Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl ist, deren Benzolring durch Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C Alkyl, Hydroxy, C₁-C, Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C^. Alkylcarbamyl substituiert ist,

-jf—NH-

worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C-C^ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkoxy, Mercapto, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C- Alkylcarbamyl bedeutet,

.,1

-L/V¹

«-NH- oder -u

- ie - 22 6 03 0

worin X Chlor, Brom oder Iod ist,

-f

HjIH

oder -C- f j| oder

<^f> K /—Λ

a s

worin B einen zweiwertigen Rest der allgemeinen Formeln -(CH₂) -, worin'η eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 ist, -CH=CH-, -CH=CH-CH₂- oder

O -CNHCH₂- darstellt, und

R⁶ für C₁-C₁₇ Alkyl oder C₃-C₁₇ Alkenyl steht.

Unter Alkylen, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio oder Alkenyl werden sowohl gerade als auch verzweigte- Kohlenwasserstoffketten verstanden. Unter Alkyl wird ein einwertiger gesättigter Kohlenwasserstoffrest verstanden. Unter Alkenyl wird ein einwertiger gesättigter Kohlenwasserstoffrest verstanden, der eine, zwei oder drei Doppelbindungen enthält, die eis- oder trans-Konfiguration haben können.Unter' Alkylen wird ein zweiwertiger gesättigter Kohlenwasserstoffrest verstanden. Unter Cycloalkylen ist ein zweiwertiger cyclischer gesättigter KohlenwasserstofSrest zu verstehen.

2 2 8 0 3 0

Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte C₁-C- Alkylenreste sind folgende:

R⁸

-CH₂-, -CH-, worin R für C. -C. Alkyl steht, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, t-Butyl, Isobutyl oder 1-Methylpropyl, -(CH₀) -, worin m für eine Zahl von 2 bis TO steht, und CH₃-(CH₂) -CH-(CH₂) -, worin ρ eine Zahl von 1 bis 8 bedeutet und q für 0 bis 7 steht, mit der Maßgabe, daß die Summe aus η + m nicht größer als 8 sein darf.

Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte C₁-C₁₇ Alkylgruppen sind folgende:

(a) CH₃-,

(b) -(CH₀) CH-, worin η für 1 bis 16 steht, und

£* Xl O• <r^H3

(c) -(CH₀) CH(CH,,) CH..,, worin r und s unabhängig voneinander Zahlen von O bis 14 bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Summe aus r + s nicht größer als 14 sein darf.

Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte C₀-C₁₇ Alkenylreste sind folgende:

(a) -(CH₀) -CH=CH-(CH ) -CH.,, worin t und u unabhängig voneinander für 0 bis 14 stehen, mit der Maßgabe, daß die Summe aus t + u nicht größer als 14 sein darf, und

(b) -(CH₀) -CH=CH-(CH ) -CH=CH-(CH ) -CH , worin ν und ζ unabhängig voneinander für 0 bis 11 stehen und y eine Zahl von 1 bis 12 bedeutet, mit der Maßgabe, daß die Summe aus ν + y + ζ nicht größer als 11 sein darf.

22 6 03 0

•Besonders bevorzugte C.-C _ Alkylgruppen sind folgende:

^CH3~ CH₃

H, (CR-)r~ CH₃(CH₂)₈-CH₃ (CH₂) ₁₀-

CH₃

CH₃(CH₂)₁₄-

CH₃(CH₂)₁₆-

Besonders bevorzugte C₃-C₁₇ Alkenylgruppen sind folgende: cis-CH-, (CH₀) ,CH=CH(CH₀)_-

t£ans_-CH₃ (CH₂) ₅CH=CH (

CiS-CH₃(CH₂)_1QCH=CH(CH₂)₄-trans-CH,(CH₀), CH=CH(CH₀),-CXS-CH-. (CH₀ ) -C-H=CH (CK₀ ) _-

trans-CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)_-

cis-CH-, (CH„) _CCH=CH (CH₀) _Q-

trans-CH₀ (CK₀) ,-CH=CH(CK₀) _Q-

eis, cis-CH,(CH₀).CH=CHCH₀CH=CH(Ch₀)_-

trans, trans-CH-, (CH₀) CH=CHCH₀CH=CH (CH₀) _-

eis,eis,CiS-CH₀CH₀CH=CHCK_nCH=CHCH₀CH=CH-(CH₀)_-,

_ ₁₉ _ 22 6 03 0

Bedeutet der Substituent W einen zweiwertigen Rest der allgemeinen Formel

-b—\- -jj—nh-

Il

dann können die -C-Funktion und die -NH-Funktion am Benzolring selbstverständlich in ortho-, meta-, oder para-Konfiguration zueinander orientiert sein. Der Substituent X kann sich an irgendeiner-Stelle des Benzolrings befinden. Vorzugsweise steht der Substituent X für Wasserstoff und sind die O

-C- und -NH-Funktionen in para-Konfiguration orientiert.

Unter substituiertem Phenyl und substiuiertem Benzyl wird gemäß der Definition des Substituenten R in der allgemeinen Formel III eine Substitution einer Gruppe an irgendeiner verfügbaren Stellung des Benzolrings verstanden, so daß dieser Substiuent in ortho-, meta- oder para-Konfiguration vorhanden

7 sein kann. Unter C₁-C, Alkyl gemäß R oder gemäß X in der allgemeinen Formel III werden Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isppropyl verstanden.

Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines cyclischen Peptidkerns der allgemeinen Formel III

22 6 030

CH₃ ^H0

III

1 2

worin R für H oder OH steht, wobei R für H steht und R

4 1

sowie R jeweils H oder jeweils OH sind, falls R für H steht,

2 3

oder wobei R für H steht, R für OH oder C₁-C, Alkoxy steht

4 2 ' ⁶ 3

und R für OH steht oder R für -CO-NH₀ steht und R sowie

4 1

R jeweils für OH stehen, falls R für OH steht, 0

r "Pi

R N-Alkanoylaminoacyl der allgemeinen Formel -W-C-R bedeutet,

worin W zweiwertiges Aminoacyl der folgenden allgemeinen Formeln ist: O

(a) -C-A-NH-,

worin A für C₁-C _ Alkylen oder C^-C, Cycloalkylen steht, OR⁷

(b) -C-CH-NH-,

worin R Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl ist, deren Benzolring durch Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oderC.-C- Alkylcarbamyi substituiert ist,

22 6 030

(C) If /\

-§— NH-

worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C- Alkyl, Hydroxy, C₁-C- Alkoxy, Mercapto, C₁-C- Alkylthio, Carbamyl oder C,-C^ Alkylcarbamyl bedeutet,

.£—s^x e-NH- oder -c—ν β

i. ,1! *. .U-NH-

S./ S/

worin X Chlor, Brom oder Iod ist,

-NH

ΝΗ-β. β oder β © oder

i/

^ N-NH

worin B einen zweiwertigen Rest der allgemeinen Formeln -(CH-) -, worin η eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 ist, -CH=CH-, -CH=CH-CH₂- oder

2 2 6 0 3 0

-CNHCH₂- darstellt, und

R für C₁-C₁₇ Alkyl oder C₃-C₁₇ Alkenyl steht.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III hemmen das Wachs-' tum pathogener Pilze, wie sich anhand üblicher biologischer Testverfahren zeigen läßt. Diese Verbindungen eignen sich daher zur Bekämpfung des Wachstums von Pilzen auf entsprechenden Flächen (als Antiseptikum) oder zur Behandlung von durch Pilze hervorgerufenen Infektionen. Die antifungale Wirksamkeit dieser Verbindungen ist gegenüber Candida albicans in vitro durch die sogenannte Agar-Scheibendiffusionsmethode und die sogenannte Agar-Verdünnungsmethode bestimmt worden und in vivo durch Untersuchungen von mit C. albicans infizierten Mäusen ermittelt worden. Die vorliegenden Verbindungen eignen sich daher insbesondere zur Behandlung von Infektionen, die durch Stämme von C. albicans (Cahdidosis) verursacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel III haben sich im Agar-Scheibendiffusionsversuch ferner auch als wirksam erwiesen gegenüber Trichophyton mentagrophytes, nämlich einem dermatophytischen Organismus. Ferner haben sich diese Verbindungen in vitro bei Agar-Scheibendiffusionsversuchen als wirksam erwiesen gegenüber Saccharomyces pastorianus und Neurospora crassa. Bestimmte der vorliegenden Verbindungen (Beispiel 40, Tabelle VIII) ergeben bei oraler Verabreichung an Mäuse stark erhöhte Blutspiegel. Verabreicht

13 4

man die Verbindung der Formel III, worin R , R und R jeweils

2 5

OH bedeuten, R für H steht und R für n-Dodecanoyl-p-aminobenzoyl steht, in einer Dosis von 100 mg/kg täglich über eine Zeitdauer von 5 Tagen intravenös an Hunde, dann lassen sich keinerlei Anzeichen einer Toxizität feststellen, obwohl die SGPT-Spiegel erhöht sind.

- 23 - 2 2 6 0 3 0

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden hergestellt, indem man den entsprechenden Kern an der oO-Aminogruppe von Ornithin mit der jeweiligen N-Alkanoylaminoacyl- oder N-Alkenoylaminoacylseitenkette in zur Bildung einer Amidbindung üblicher Weise acyliert. Diese Acylierung läßt sich im allgemeinen erreichen, indem man den Kern mit einem aktivierten Derivat der Säure (Formel IV), die der gewünschten Acylseitenkettengruppe entspricht, umsetzt, nämlich mit einer Verbindung der Formel IV

HO-W-C-R⁶

IV

worin W und R die bereits oben angegebenen Bedeutungen haben;

Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels gegenüber einer Kupplung mit der primären Aminogruppe reaktionsfähig macht, so daß die Amidobindung entsteht, die die Acylseitenkette mit dem Kern verbindet. Beispiele für geeignet aktivierte Derivate dieser Art, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden für ihren Einsatz als Acylierungsmittel für primäre Amine sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte hierzu geeignete aktivierte Derivate sind: (a) Säurehalogenide, wie Säurechloride, (b) Säureanhydride, wie Alkoxyameisensäureanhydrid oder Aryloxyameisensäureanhydrid, oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5-Trichlorphenylester, N-Hydroxybenztriazolester oder N-Hydroxysuccinimidester. Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der'Carboxylfunktion gehören eine Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyl-· diimid, wie Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid oder Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid, wodurch man zu einem reaktionsfähigen Zwischenprodukt gelangt, das infolge Instabilität nicht iso-

2 2 6 0 3 0

liert wird. Die Umsetzung mit dem primären Amin wird hierbei im Reaktionsgemisch durchgeführt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden vorzugsweise nach der Methode unter Verwendung eines aktiven Esters hergestellt. Als Acylierungsmittel am meisten bevorzugt wird hierzu der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten N-Alkanoylaminosäure oder N-Alkenoylaminosäure (Formel IV). Zu diesem Zweck setzt man einen Überschuß des aktiven Esters mit dem Kern bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel um, wie Dimethylformamid (DMF). Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, wobei jedoch Umsetzungszeiten von etwa 15 bis 18 Stunden bevorzugt sind. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand gereinigt, beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase und eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/ Volumen) als Lösungsmittelsystem.

Die 2,4,5-Trichlorphenylester der N-Alkanoylaminosäuren oder N-Alkenoylaminosäuren lassen sich herstellen, indem man einfach die gewünschte Aminosäure (Formel IV) mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie N,N'-Di-^ cyclohexylcarbodiimid, behandelt. Andere zur Herstellung von Aminosäureestern geeignete Methoden sind dem Fachmann geläufig.

Die N-Alkanoylaminosäuren oder N-Akenoylaminosäuren sind entweder bekannte Verbindungen oder können durch Acylierung der entsprechenden Aminosäure mit der jeweiligen Alkanoyl- oder Alkenoylgruppe in üblicher Weise erzeugt werden, wie dies bereits oben kurz beschrieben wurde. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der N-Alkanoylaminosäuren besteht in einer Behandlung der entsprechenden Aminosäure mit einem Alkansäurechlorid in Pyridin. Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendeten Alkansäuren oder Alkensäuren,

-•25 - 22 6 03 0

die aktivierten Derivate hiervon und die Aminosäuren sind entweder bekannte Verbindungen oder können durch bekannte Verfahren oder durch Abwandlung bekannter Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig sind. Enthält eine bestimmte Aminosäure eine andere acylierbare funktioneile Gruppe als die Aminogruppe, dann muß eine solche Gruppe selbstverständlich geschützt werden, bevor man die Aminosäure mit dem zur Einführung der Alkanoyl- oder Alkenoylgruppe verwendeten Reagens umsetzt. Zu diesem Zweck lassen sich alle bekannten Schutzgruppen verwenden, wie sie bereits zum Schutz einer funktioneilen Seitenkettengruppe bei Peptidsynthesen eingesetzt werden. Gruppen dieser Art sind somit wohlbekannt, und die Auswahl der jeweils besonders geeigneten Schutzgruppe und die Methode ihrer Einführung kann dem Fachmann überlassen werden. Es wird in diesem Zusammenhang lediglich beispielsweise hingewiesen auf "Protective Groups In Organic Chemistry", M. McOmie, Verlag Plenum Press, New York, 19 73.

c-

Besimmte Aminosäuren, die zur Synthese der vorliegenden Verbindungen verwendet werden, können selbstverständlich in optisch aktiven Formen vorkommen, so daß sich sowohl die natürliche Konfiguration (L-Konfiguration) als auch die nicht natürliche Konfiguration (D-Konfiguration) hiervon als Ausgangsmaterialien verwenden lassen und zu erfindungsgemäßen Produkten führen. Bei systemischer Anwendung kann die Dosis der jeweils zu verabreichenden Verbindung aus der allgemeinen Formel III schwanken in Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Verbindung, der Stärke und Art der Infektion und dem physikalischen Zustand des jeweiligen Empfängers. Bei einer entsprechenden Therapie sollte man mit niedrigen Dosen beginnen und die Dosis dann bis zur Erzielung der gewünschten antifungalen Wirkung dann erhöhen. Die vorliegenden Verbindungen lassen sich intravenös oder intramuskulär durch Injektion in Form einer steril.en wässrigen Lösung oder

- 26 - 22 6 03

Suspension verabreichen,, die gewunschtenfalls verschiedene herkömmliche pharmazeutisch unbedenkliche Konservierungsmittel f Puffermittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel enthalten kann. Zur Herstellung isotonischer Lösungen können auch andere Zusätze verwendet werden, wie Kochsalz oder Glucose. Das jeweils anzuwendende Mengenverhältnis und die jeweilige Art solcher Zusätze sind dem Fachmann geläufig.

Bestimmte Verbindungen aus der allgemeinen Formel III ergeben nach oraler Verabreichung stark erhöhte Blutspiegel (Beispiel 40, Tabelle VIII) und können systemisch oral verabreicht werden. Zur oralen Anwendung können diese Verbindungen in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Hilfsstoffen in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulvern eingesetzt werden. Art und Menge, in der solche Träger oder Hilfsstoffe zur Anwendung gelangen, sind dem Fachmann bekannt.

Zur Behandlung vaginaler candida-Infektionen können die Verbindungen der allgemeinen Formel III in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsmitteln verwendet werden, wie sie für intravaginale Anwendungen üblich sind. Auch solche intravaginal verabreichbare Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.

- 27 - 2 2 6 O 3 O

Herstellungsbeispiel 1 Fermentation Von Äctinoplanes utahensis NRRL 12052

Es wird eine Stammkultur von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 hergestellt und auf einer Agar-Schräge gehalten. Das zur BiI-. dung der Schräge verwendete Medium wird aus folgenden Medien ausgewählt.

MEDIUM A	Bestandteile	q.s	Mengen
Babyhafermehl		60,0 g
Hefe	2,5 g
K2HPO4	1,0 g
Czapek-Mineralgrundmischung*	5,0 ml
Agar	25,0 g
Deionisiertes Wasser	. auf 1 Liter

Der pH-Wert vor der Behandlung im Autoklav beträgt etwa 5,9. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt. Nach der Behandlung im Autoklav liegt der pH-Wert bei etwa 6,7,

* Die Czapek-Mineralgrundmischung weist folgende Zusammensetzung auf

Bestandteile Mengen

FeSO."7H₂O (gelöst in 2 ml

konz. HCl) 2 g

KCl . 100 g

MgSO₄-7H₂O 100 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

22 6 03 0

MEDIUM B

5,0	g	g	g
0,5	g	ml
3,0	g	g
0,5	g	1 Liter
12,5	g
5,0	g
5,0	g
2,5	g
0,25
UO
2,0
20,0
auf

Bestandteile Mengen

Kartoffeldextrin

Hefeextrakt

Enzymhydrolysat von Casein* Rinderextrakt

Dextrose

Maisstärke

Fleischpepton

Portweinmelasse

MgSO₄-7H₂O

CaCO₃

Czapek-Mineralgrundmischung Agar

Deionisiertes Wasser q.s,

* N-Z-AmineA von Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Die Schräge wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 beimpft und die beimpfte Schräge bei 3O⁰C etwa 8 bis 10 Tage bebrütet. Mit etwa der Hälfte des Schrägenwachstums beimpft man dann ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung

Bestandteile Mengen

Babyhafermehl 20,0 g

Saccharose 20,0 g

Hefe 2,5 g

Getrocknete Destillationsschlempe* 5,0 g

K₂HPO₄ . 1,0 g

Czapek-Mineralgrundmischung 5,0 ml Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

22 6Ό30

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 6,8.

* National Destillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N.Y.

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben bei 30⁰C etwa 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler bebrütet, der unter einer Geschwindigkeit von 250 Upm und unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser rotiert.

Das so erhaltene bebrütete vegetative Medium läßt sich direkt zur Beimpfung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwenden. Wahlweise und vorzugsweise wird dieses vegetative Medium jedoch bis zu einem späteren Gebrauch aufgehoben, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für eine derartige Lagerung wird.die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen hergestellt:

In jede Ampulle gibt man 2 ml des bebrüteten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung (siehe W. A. Dailey und C. E. Higgens "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen", Cryobiol TO, 364 bis 367 (1973). Die so hergestellten Suspensionen werden dann in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine aufbewahrte Suspension (1 ml.) des obigen vegetativen Mediums verwendet man dann zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe (das die oben bereits beschriebene Zusammensetzung hat). Das beimpfte vegetative Medium der ersten Stufe wird dann wie oben beschrieben bebrütet.

-30-22OÜOU

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zu 400 ml eines vegetativen Nährmediums der zweiten Stufe verwendet, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das vegetative Medium der ersten Stufe» Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25°C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser mit 250 Upm rotiert.

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 Liter eines sterilen Produktionsmediums mit einer der folgenden Zusammensetzungen:

MEDIUM I Bestandteile

Erdnußmehl Lösliches Fleischpepton Saccharose KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄'7H₂O

Leitungswasser q.s

Der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6,9 nach Sterilisation durch Behandlung im Autoklav bei. 121⁰C über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei einem Druck von etwa 1,1 "bis 1,3 bar.

Mengen	(g/l)
10,0
5,0
20,0
0,5
1,2
0,25
auf 1	Liter

MEDIUM II

22 6 03 0

Bestandteile Mengen (g/l)

Saccharose 30,0

Pepton 5,0

K₃HPO₄ 1,0

KCl 0,5

MgSO₄-7H₂O . 0,5

FeSO₄'7H₂O 0,002

Dexonisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert wird mit Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 7,0.

	MEDIUM III	Mengen (g/l)
Bestandteile		20,0
Glucose		3,0
NH. Cl		2,0
Na2SO4		0,019
ZnCl2		0,304
MgCl2-OH2O		0,063
FeCl3-GH2O		0,035
MnCl2-4H2O		0,005
CuCl2-2H0		6,0
CaCO3		0,67
KH2PO4*		σ.s. auf 1 Lite
Leitungswasser -

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen

zugesetzt

Der pH-Wert am Ende beträgt etwa 6,6.

22 6 030

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank bei einer Temperatur von etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 42 Stunden fermentieren. Hierbei wird das Fermentationsmedium mit herkömmlichen Rührern unter einer Geschwindigkeit von etwa 200 Upm gerührt und mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts .an gelöstem Sauerstoff von über 30 % der Luftsättigung bei atmosphärischem Druck belüftet.

Herstellungsbeispiel 2 Herstellung des A-42355 Antibiotikum-Komplexes A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 wird auf einer Agar-Schräge aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt und gehalten.

Bestandteile Mengen

Glucose Hefeextrakt CaCO₃

Pflanzensaft* Agar**

Deionisiertes Wasser q.s,

(anfänglicher pH=6,1)

* V-8 Juice, Campbell Soup Co., Camden, N.J. **.Meer Corp.

Die Schräge wird mit Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 beimpft, und die beimpfte Schräge wird etwa 7 Tage bei 25⁰C bebrütet. Die reife Kultur wird mit Wasser bedeckt Und

5	g	1 Liter
2	g
3	g
200	ml
20	g
auf

-33- 226030

mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen abgekratzt. Die so erhaltene Suspension wird mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser aufgenommen.

Ein ml der so erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 55 ml vegetativen Mediums in einem 250-ml-Kolben verwendet. Das vegetative Medium hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Saccharose Portweinmelasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymhydrolysat von Casein* Leitungswasser

(anfänglicher pH = 6,5 bis 6,-7)

* N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Das inokulierte vegetative Medium wird bei 25°C 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 250 Upm inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit in einer Mischvorrichtung (Waring) homogenisiert und dann die übrigen 24 Stunden inkubiert. Stattdessen kann man das inokulierte vegetative Medium aber auch 48 Stunden inkubieren und anschließend 15 Minuten bei geringer Geschwindigkeit homogenisieren.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann zum Beimpfen von Schüttelkolbenfermentationskulturmedium oder zum Inokulieren eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann man es auch für eine spätere Verwendung aufheben, indem man es in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff

25	g
36	g
6	g
10	g
2	g
10	g
1100	ml

22 6 03 0

hält. Für eine derartige Aufbewahrung wird die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen zubereitet.

Die.vegetativen Kulturen werden mit gleichen Volumina einer Suspendierlösung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

Bestandteile Mengen

Glycerin 20 ml

Lactose 10 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 100 ml

Die Suspensionen werden auf kleine sterile Schraubverschlußhülsen (4 ml pro Hülse) verteilt. Die so erhaltenen Hülsen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine in dieser Weise zubereitete und aufbewahrte Suspension läßt sich dann zum Inokulieren von Agar-Schrägen oder flüssigen Saat-Medien verwenden. Die Schrägen werden bei 25⁰C im Licht 7 Tage inkubiert.

B. Tankfermentation

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum verwendet man 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zum Inokulieren von 4 00 ml eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von etwa 5 cm bei 250 Upm rotiert.

22 6 03 0

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 1 steriles Produktionsmedium mit einer der folgenden zusammensetzungen:

. MEDIUM IV Bestandteile Mengen

ZnSO₄-7H₂O

Lösliches Fleischpepton* Sojabohnenmehl Tapiocadextrin** Portweinrnelasse Enzymhydrolysat von Casein*** Na₃HPO₄

MgSO₄·7H₂O

FeSO₄'7H₂O

Baumwollsaatöl Antischaummittel**** Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,8 bis 7,0)

* O.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

** "Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

**.* N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J- **** P2000, Dow Corning, Midland, Michigan

0,00455	g/i
30,5	g/i
15,5	g/i
2,0	g/i
10,5	g/i
' 8,5	g/i
4,5	g/i
5,5	g/i
0,1	g/i
40,0	ml
1,0	ml
1000,0	ml

22 6 03

MEDIUM V

Bestandteile	Mengen
Glucose	2,5 %
Stärke	1,0 %
Lösliches Fleischpepton*	1,0 %
Portweinmelasse	1,0 %
CaCO-	0,2 %
MgSO4'7H2O	0,05 %
Enzymhydrolysat von Casein**	0,4 %
Antischaummittel***	0,02 %
Leitungswasser	q.s. auf Volumen

* O.M. Peptone ** N-Z-AmineA *** Antifoam "A"

Dow Corning

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man iri einem Fermentationstank von 165 1 Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 25⁰C etwa 7 Tage fermentieren. Das Fermentationsmedium wird dabei mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von über etwa 50 % der Luftsättigung belüftet.

C. Vegetatives Medium der dritten Stufe

Immer dann, wenn die Fermentation in größeren Tanks als für 100 1 Fermentationen durchgeführt· wird, ist zu empfehlen, daß zum Beimpfen größerer Tanks eine vegetative Kultur der dritten Stufe verwendet wird. Ein bevorzugtes vegetatives Medium der dritten Stufe hat folgende Zusammensetzung:

25	g
25	g
6	g
10	g
.10	g
2	g
1000	ml

- 37 - 226030

Bestandteile Mengen

Saccharose Rohrzuckermelasse Maisquellwasser Enzymhydrolysat von Casein* Malzextrakt

^K2^HPO4

Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,1) *N-Z-Case

Herstellungsbeispiel 3

Abtrennung des A-423 55 Antibiotikum-Komplexes

Die nach dem im Beispiel 22 beschrieben Verfahren unter Verwendung des Produktionsmediums V erhaltene Gesamtfermentationsmaische (4127 1), wird eine Stunde gründlich mit Methanol (4280 1) verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe auf Basis von Diatomeenerde (Hyflo Supercel von Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird mittels 5 normaler Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter Vakuum auf ein Volumen von 20 1 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird zu 200 1 Diethylether gegeben, wodurch der A-42355 Komplex ausfällt. Durch Abfiltrieren des angefallenen Niederschlags gelangt man zu 2775 g des A-42355 Komplexes in Form eines grauweißen Pulvers.

_ 38 . 226030

Isolierung und Identifizierung der Faktoren von A-30912

Herstellun g s beispiel 4 Isolierung von A-30912 Faktor A

Zu diesem Zweck löst man zuerst 1 g des in den Herstellungsbeispielen 2 und 3 beschrieben A-42355 Antibiotikum-Komplexes in 7 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Die erhaltene Lösung wird filtriert und auf eine 35 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm (Michel-Miller Hihgh Performance Low Pressure (HPLPLC) Chromatography Column, Ace Glass Incorporated, Vineland, N.J. 08360) aufgegeben, die man über eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems mit dem gemäß Herstellungsbeispiel 10 hergestellten LP-l/C_i8~Siliciagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) füllt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlämmfüllverfahren in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) bepackt. Das Lösungsmittel wird mittels einer F.M.I.-Pumpe mit ventilloser Kolbenauslegung (maximale Strömungsgeschwindigkeit 19,5 ml/min) durch die-Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 9 ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar bewegt, wobei man jede Minute eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

- 39 - 2 2 6 0 3 0

Herstellung s beispiel 5 Isolierung von Ä-3Ö912 Faktor B

Zur Auftrennung von A-423 55 Komplex geht man wie im Herstellungsbeispiel 3 beschrieben vor, mit der Ausnahme, daß man die konzentrierten .Chloroformextrakte (285 1) über eine Silicagelsäule (150 1 Grace-Silicagel, Sorte 62) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 l/min chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform (200 1) gewaschen, mit Acetonitril (500 1) eluiert und dann kontinuierlich mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/min eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 aufgefangen und einzeln bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit analysiert. Hierzu verwendet man Papierscheiben auf Agar-Platten, die mit Candida albicans beimpft sind. Die Fraktionen 77 bis 103 (1365 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt.Die konzentrierte Lösung (4,5 1) enthält einen Niederschlag, durch dessen Abfiltrieren man zu 119 g A-4 2355 Komplex mit angereichertem Faktor B gelangt. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird wieder, in einem entsprechenden Volumen Methanol gelöst. Die Methanollösung wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der den Faktor B enthaltende Komplex des Antibiotikums ausfällt. Dieser Niederschlag wird ebenfalls abfiltriert und getrocknet, wodurch man weitere 24 g A-42355 Komplex mit angereichertem Faktor B in Form eines grauen Pulvers erhält.

Der in obiger Weise hergestellte A-42355 Komplex mit angereichertem Faktor B (1,0 g) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe über ein Ventilsystem ' auf eine Silicagelsäule (Länge 33 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule wird über eine Schlaufe mit einem Ventilsystem mit LP-IZC_1fi-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron), hergestellt nach dem Herstellungsbeispiel

22 6 03 0

10,in einer Mischung aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Zum Füllen der Säule wird das im Herstellungsbeispiel 11 beschriebene Aufschlämmfüllverfahren verwendet. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt. Jede Minute wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 15 verfolgt. Die Fraktionen 102 bis 110 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Ql eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und die Lösung wird lyophilisiert, wodurch man zu 22 mg A-30912 Faktor B gelangt.

Herstellungsbeispiel 6 Isolierung von A-30912 Faktor D

Konzentrierte Chloroformextrakte von zwei nach dem Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen Fermentationsversuchen (3800 1 und 4007 1) werden vereinigt und auf einer Silicagelsäule (Grace/ Sorte 62) chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform gewaschen und dann.zuerst mit Acetonitril und anschließend mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 gesammelt und bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit durch Verwendung von Papierscheiben auf mit Candida albicans angeimpftem Agar analysiert. Die aktiven Fraktionen (850 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt. Die eingeengte Lösung (0,7 1) wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex ausfällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch man 32 g des an Faktor D angereicherten A-42355 KompLexes in Form eines grauen Pulvers erhält.

2 2 6 0 3

Der obige, an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex (1,0 g) wird in 5 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Länge 30 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule ist mit LP-l/C. o-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) gefüllt, das nach dem Herstellungsbeispiel 10 hergestellt worden ist. Zum Füllen der Säule bedient man sich des beim Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlämmfüllverfahrens unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min unter einem Druck von etwa 3,1 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenführung durch die Säule geführt. Alle 2 Minuten wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model UA-5) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt. Die Fraktionen 96 bis 108 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Dieses Öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren der Lösung gelangt man zu 89 mg A-3 0912 Faktor D.

Herstellungsbeispiel 7 Isolierung von A-30912 Faktor H

Der nach den Herstellungsbeispielen 2 und 3 erhaltene A-42355 Antibiotikum-Komplex (5,0 g) wird in 35 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1.) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Glassäule mit 42 cm Länge und 3,7 cm Innendurchmesser (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Verfahren

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mit LP-IZC₁o-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Die Herstellung des verwendeten Silicagel-Umkehrphasenharzes ist im Herstellungsbeispiel 10 beschrieben. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 13 ml/min unter einem Druck von etwa 8,4 bar mit einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt, wobei man alle 2 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm nach der im Herstellungsbeispiel 19, Abschnitt C, beschriebenen Methode überwacht. Die Fraktionen 112 bis 132 werden mit den Fraktionen 106 bis 117 aus einer zweiten ähnlichen Reinigung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 173 mg rohem A-30912 Faktor H.

Das rohe A-30912 Faktor H (150 mg) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und wie oben beschrieben in eine Glassäule mit einer Länge von 3 2 cm und einem Innendurchmesser von 2,0 cm eingeführt. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 mm/min unter einem Druck von etwa 5,6 bar durch die Säule geführt, wobei man alle 3 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 17 und 18 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 29 mg A-30912 Faktor H.

Indentifizierung der Faktoren von A-30912

Die einzelnen Faktoren von A-30912 lassen sich durch Dünnschichtchromatographie (TLC) identifizieren. Die dabei für die Faktoren A bis G des Antibiotikums A-30912 unter Verwendung von Silicagel ·

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(Merck, Darmstadt) in einem Lösungsmittelsystem aus Benzol und Methanol (7:3) und durch Bioautographie mit Candida albicans erhaltenen R -Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

Tabelle	VII
A-3 0912 Faktoren	R^-Werte
A	II 0,35
B	0,45
C	0,54 .
D	0,59
E	0,27
F	0,18
G	0,13

Die ungefähren R -Werte der Faktoren A, B, C, D und H von A-30912 in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, die man durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel (Merck-Darmstadt, Silicagel-Platten Nr. 60, 20x20 cm) und Bioautographie mit Candida albicans erhält, können der folgenden Tabelle VIII entnommen werden.

Tabelle VIII A-3O912 Faktoren

Faktor A Faktor B Faktor C Faktor D Faktor H

R_f-Werte - Lösungsmittelsysteme

a b 0,28 0,14 0,39 0,21

0,28 0,43

0,42 0,47·

0,51 0,58

0,57 0,61

0,42 0,27 0,36 0,53

0,46 0,31 0,50 0,38

Lösungsmittelsysteme:

a: EthylacetatrMethanol (3:2)

b: Ethylacetat:Methanol (7:3)

c: Acetonitril:Wasser (95:5)

d: Ethylacetat:EthanolEssigsäure (40:60:0,25)

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Die Faktoren A, B, D und H von A-30912 lassen sich ferner auch durch analytische Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie unter folgenden Bedingungen identifizieren.

Säule: Packung:

Lösungsmittel: Probenvolumen: Probengröße: Säulentemperatur:

Strömungsgeschwindigkeit:

Druck: Detektor:

Pumpe: Injektion:

Glas, 0,8 χ 15,0 cm Nucleosil 10-C₁₈ (Machery-Nagel

and Company),

nach dem im Beispiel 8 beschriebenen

Aufschlämmungsverfahren abgepackt Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1) 8 mcl 8 meg Umgebung

1,8 ml/min etwa 14 bar

UV bei 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor) LDC Duplex-Minipumpe Schlaufeninjektion

Die unter diesen Bedingungen ermittelten ungefähren Verweilzeiten für die Faktoren A, B, D und H von A-30912 gehen aus folgender Tabelle IX hervor:

	Tabelle IX
A-30912 Faktoren	Verweilzeit
	(Sekunden)
A .B H D	792 870 990 1140

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Herstellungsbeispiel 8

Herstellung von Antibiotikum S31794/F-1

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird durch submerse Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095 unter Rühren, Schütteln und/oder Belüften bei einem pH-Wert von 3 bis 8, vorzugsweise einem pH-Wert von 5 bis 7, und bei einer Temperatur von 15 .bis 3O⁰C/ vorzugsweise einer Temperatur von 18 bis 27⁰C₇ über eine Zeitdauer von 48 bis 360 Stunden, vorzugsweise eine Zeitdauer von 120 bis 288 Stunden, hergestellt.

Zur Isolierung des Antibiotikums S31794/F-1 wird die Kulturbrühe (90 1) mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Isopropanol (4:1, 90 1) behandelt und das Ganze dann 30 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und unter Vakuum bei etwa 40⁰C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit einer 10-fachen Menge Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (95:5 bis 60:40) chromatographiert. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und mit einer 100-fachen Menge Silicagel (Sephadex LH-20) mit Methanol chromatographiert. Die aus der Sephadex-Säule kommenden Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und erneut mit einer 100-fachen Menge Silicagel (0,05 bis 0,2 mm) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform, Methanol und Wasser (71:25:4) chromatographiert. Die eluierten Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu rohem Antibiotikum S31794/F-1 gelangt. Dieses Produkt wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und mit Diethylether ausgefällt, wodurch man S31794/F-1 in Form eines weißen amorphen Pulvers erhält, das nach Trocknen unter Hochvakuum bei 25 bis 30⁰C bei 178 bis 180⁰C unter Zersetzung schmilzt. Durch Umkristallisation aus einer 10-fachen Menge eines Gemisches aus Ethylacetat, Methanol und Wasser (80:12:8) gelangt man zu kristallinem S31794/F-1, das nach Trocknen unter

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Hochvakuum bei 20⁰C bei 181 bis 183°C unter Zersetzung schmilzt.

Hers te llungsbeispiel 9 Isolierung des Antibiotikums S31794/F-1

Das gemäß Herstellungsbeispiel 8 nach Chromatographie über Sephadex erhaltene rohe Antibiotikum S31794/F-1 wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems mit LP-1/C.o-Silicagel-ümkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) (hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 10) in einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser (71:25:4) gefüllt. Zur Förderung des Lösungsmittels durch die Säule wird eine F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung verwendet. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 22 -verfolgt. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man das Antibiotikum S31794/F-1 erhält. Bei einer entsprechenden dünnschichtchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von Silicagel (Merck, 0,25 mm) ergeben sich für dieses Antibiotikum S31974/F-1 folgende R_f-Werte.

Lösungsmittelsystem R^-Werte

Chloroform!Methanol:Wasser (71:25:4) 0,17

Chloroform:Methanol:konz. Essigsäure" (70:29:1) 0,19 Chloroform:Methanol (2:1) 0,27

Das Antibiotikum S31794/F-1 läßt sich ferner auch durch Ioddampf erkennen.

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Herstellungsbeispiel 10 Herstellung von Silicagel/C. o-Umkehrphaseriharz

Stufe 1: Hydrolyse

Man gibt LP-1 Silicagel (1000 g von Quantum Corp., jetzt Whatman) zu einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure (1650 ml) und konzentrierter Salpetersäure (1650 ml) in einem 5-1-Rundkolben und schüttelt das Ganze solange, bis es sauber suspendiert ist. Sodann erhitzt man das Gemisch über Nacht (16 Stunden) auf einem Dampfbad, wobei man auf den Kolben einen mit Wasser gekühlten Kühler aufsetzt.

Anschließend wird das Gemisch in einem Eisbad abgekühlt und vorsichtig unter Verwendung einer Sinterglasnutsche filtriert. Das Silicagel wird solange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis sein pH-Wert neutral ist. Sodann wird das Silicagel mit Aceton (4 1) gewaschen und unter Vakuum bei 100⁰C zwei Tage getrocknet. ♦

Stufe 2: Erste Silylierung

Das nach Stufe 1 erhaltene trockne Silicagel wird in einen Rundkolben übertragen und in Toluol (3,5 1) suspendiert. Der Kolben wird zwei Stunden auf einem Dampfbad erhitzt, um das noch vorhandene restliche Wasser azeotrop .zu entfernen. Sodann versetzt man das Ganze mit Octadecyltrichlorsilan (321 ml, Aldrich Chemical Company) und rührt das Reaktionsgemisch über Nacht (16 Stunden) unter langsamem mechanischem Rühren bei etwa 60⁰C. Es ist darauf zu achten, daß der Rührer nicht bis zum Boden des Kolbens reicht, damit die Silicagelteilchen nicht gemahlen werden.

22 6 03

Im Anschluß daran läßt man das Gemisch abkühlen. Sodann wird das silanierte Silicagel gesammelt, mit Toluol (3 1) und Aceton (3 1) gewaschen und anschließend über Nacht (16 bis 20 Stunden) an der Luft getrocknet. Das getrocknete Silicagel wird in 3,5 1 eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (1:1) in einem 5-1-Kolben suspendiert, worauf man das Ganze vorsichtig 2 Stunden bei Raumtemperatur rührt, filtriert, mit Aceton (3 1) wäscht und über Nacht an der Luft trocknet.

Stufe 3: zweite Silylierung

Das Verfahren der obigen ersten Silyiierung wird unter Verwendung von 200 ml Octadecyltrichlorsilan wiederholt. Die Suspension wird 2 Stunden unter vorsichtigem Rühren bei 6 0°C unter Rückfluß gehalten. Das hierdurch erhaltene Produkt wird abfiltriert, mit Toluol (3 1) und Methanol (6 1) gewaschen und dann unter Vakuum bei 50⁰C über Nacht (16 bis 20 Stunden) getrocknet.

Herstellungsbeispiel 11

Aufschlämmfüllverfahren für Michel-Miller-Säulen Allgemeine Angaben

Dieses Verfahren wird zum Füllen entsprechender Säulen mit Silicagel-Cjo-Umkehrphasenharz verwendet, wie es beispielsweise nach der Methode des Herstellungsbeispiels 10 gebildet wird.

Für diese Aufschlämmfülltechnik sind im allgemeinen Drücke von weniger als etwa 14 bar und Fließgeschwindigkeiten von 5 bis 40 ml/min erforderlich. Im einzelnen richten sich diese Werte nach dem Säulenvolumen und den Säulen."abmessungen. Der Druck beim Füllen soll um etwa 2 bis 3,5 he höher sein als der bei der--Trennung angewandte Druck. Dadu,ch wird sicher-

-so- 226030

gestellt, daß während der Trennung keine weitere Kompression des Adsorbens erfolgt.

Eine plötzliche Erniedrigung des Drucks kann die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial verursachen, was ein wirksames Arbeiten der Säule stark beeinträchtigen würde. Nach Abstellen der Pumpe muß daher für ein langsames Abfallen des Drucks auf den Wert Null gesorgt werden.

Die verwendeten Säulen (Ace Glass Cat. No. unbepackt) haben etwa folgende Volumina: No. 5795-04=12 ml, No. 5795-10=110 ml, No. 5795-16=300 ml, No. 5795-24=635 ml und No. 5796-34= 34 ml.

Die zum Füllen einer Glassäule erforderliche Zeit liegt je nach Säulenabmessung und Geschicklichkeit zwischen Minuten und mehreren Stunden..

Stufen

1. Die Glassäule wird über eine Kupplung mit einer Vorratssäule verbunden (das Volumen der Vorratssäule soll doppelt so groß sein wie das der Säule). Beide Säulen werden mit der Vorratssäule oben in senkrechte Stellung gebracht.

2. Das Füllmaterial ist abgewogen (etwa 100 g für eine Säule von etwa 200 ml) . " _...

3. Das Füllmaterial wird mit fünf Volumina Lösungsmittel, und zwar einem Gemisch aus 70 bis 80 %.Methanol und 20 bis 30 % Wasser, versetzt.

4. Es wird gut geschüttelt, bis alle Teilchen befeuchtet · sind, worauf man das Ganze über Nacht oder langer stehenläßt, damit eine vollständige Tränkung der Teilchen durch Lösungsmittel gewährleistet ist. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen.

- si - 22 6 03 0

5. Das Harz wird mit zur Füllung der Vorratssäule ausreichendem Lösungsmittel aufgeschlämmt und dann schnell in diese gegossen. Die Säule muß dabei mit dem gleichen Lösungsmittel vorgefüllt sein, und die Vorratssäule soll vor dem Eingießen der Aufschlämmung mit Lösungsmittel teilweise gefüllt sein. Die Verwendung größerer Aufschlämmungsvolumina kann gleichfalls zu guten Ergebnissen führen, erfordert jedoch (a) einen größeren Vorratsraum oder (b) mehrere Vorratsraumfüllungen während des EinfüllVorgangs.

6. Die Vorratssäule wird mit dem Tetrafluorethylenstopfen unterhalb der Säule verschlossen (vgl. Fig. 1 von US-PS 4 131 547, Stopfen Nr. .3), worauf man die Pumpe anschließt und sofort mit dem Pumpen von Lösungsmittel durch das System bei einer Höchstfließgeschwindigkeit von 20 ml/min, wenn eine Ace Cat. No. 13265-25-Pumpe oder ein ähnliches Lösungsmittelabgabesystem verwendet wird.

7. Die obige Arbeitsweise wird solange fortgesetzt, bis die Säule vollständig mit Adsorbens gefüllt ist. Der Druck soll die Höchsttoleranz der Säule während dieses Vorgangs nicht übersteigen (etwa 14 bar für große Säulen und etwa 21 bar für Analysensäulen). In den meisten Fällen genügen Drücke von weniger als etwa 14 bar.

8. Wenn der Druck Höchstwerte übersteigt, dann wird die Fließgeschwindigkeit herabgesetzt, so daß der Druck abfällt.

9. Nach Füllung der Säule mit dem Adsorbens wird die Pumpe abgestellt, der Druck auf Null fallengelassen und die Verbindung zur Vorratssäule gelöst. Die Vorratssäule wird durch eine Vorsäule ersetzt, die mit Lösungsmittel.und einer kleinen Menge Adsorbens gefüllt wird, wonach bis zur vollständigen Füllung der Säule mit Höchstdruck gepumpt wird. Bezüglich weiterer Hinweise wird auf die allgemeine Verfahrensbeschreibung verwiesen.

2 2 6 0 3 0

Nach dem Abstellen der Pumpe muß dafür gesorgt werden, daß der Druck immer langsam abfällt, wodurch die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial vermieden wird.

10. Nach Aufheben des Druckes wird die Verbindung zur Vorsäule sorgfältig gelöst. Einige mm (2 bis 4 mm) der Füllung werden mit einem kleinen Spatel vom oberen Ende der Säule entfernt. Auf das obere Ende der Säule werden ein oder zwei Filter gelegt, die gelinde auf das Füllmaterial aufgedrückt werden, worauf man den Tetrafluorethylenstopfen bis zum festen Verschluß auf die Säule aufbringt. Die Säule wird mit der Pumpe verbunden, worauf Druck angelegt wird (gewöhnlich weniger als etwa 14 bar) und durch die Glaswandung am oberen Ende der Säule beobachtet wird, ob sich das Harz noch weiter zusammenpackt. Sollte sich das Füllmaterial noch weiter absetzen (was bei größeren Säulen der Fall sein kann), dann erscheint ein kleiner Leerraum oder eine Kanalbildung, und in diesem Fall sollte die Stufe 9 wiederholt werden.

Herstellungsbeispiel 12 Herstellung von A-30912A Kern A. Deacylierung von Antobiotikum A-30912 Faktor A

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wird eine Fermentation unter Verwendung von A. utahensis durchgeführt, wobei man das Schrägenmedium A und das Produktionsmedium I verwendet, und das Produktionsmedium etwa 42 Stunden inkubiert. Das Fermentationsmedium versetzt man mit A-30912 Faktor A (340 g Rohsubstrat, das etwa 19,7 g A-30912 Faktor A enthält, und zwar gelöst in 1,5 1 Ethanol). Die Deacylierung von A-30912 Faktor A wird durch einen entsprechenden Versuch unter Verwendung von Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch ein Verschwinden der Aktivität gegenüber C. albicans

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äußert.

B. Isolierung von A-30912A Kern

Die gemäß obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe (100 I)₇ welche etwa 20 g A-30912 Faktor A enthält, wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene klare Filtrat (etwa 93 1) führt man mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min durch eine Säule, die 4,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche Filterbrühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) (35 1) mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 300 ml/min eluiert.

Die Eluierung wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Von jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans. Zeigt die unbahandelte Teilmenge keine Wirksamkeit, während die acylierte Teilmenge wirksam ist, dann enthält diese Fraktion A-30912A Kern. Das den A-30912A Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt, und durch Lyophilisieren dieses Konzentrats gelangt man zu etwa 97 g rohem Kern.

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C. Reinigung von A-30912A Kern durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie · '

Der nach obiger Stufe C erhaltene A-30912A Kern (25 g) wird in 300 ml eines Gemisches aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1 ) gelöst. Die Lösung wird mittels einer 4 1 fassenden Säule aus rostfreiem Stahl (8 cm χ 80 cm) chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (^obin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird unter einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 6 0 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model.] UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISO Typ 6) bei 280 nm verfolgt. Jede Minute werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 500 ml aufgefangen.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912A Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zu 2,6 g des gewünschten Kerns gelangt. Bis zur vollständigen chromatographischen Trennung ist eine Lösungsmittelmenge von 7 bis 8 1 erforderlich.

D. Eigenschaften vom A-30912A Kern

(a) Empirische Formel: C, ,H ..N₇O₁₅.

(b) Molekulargewicht: 797,83.

(c) Weißer amorpher Feststoff, der in Wasser, Dimethylformamid, Dirnethylsulfoxid und Methanol löslich ist,

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sich in Chloroform, Toluol und Diethylether jedoch nicht löst.

(d) IR-Absorptionsspektrum ' (KBr-Scheiben) mit folgenden Absorptionsmaxima:

,3340 breit (OH, H-gebunden); 2970, 2930 und 2890 (CH-Streckung, aliphatische CH_ , CH , CH Gruppen) 1660 und 1625 (mehrere Carbonyle C=O) ; 1510-1550; 1 430-1 450 (CH Bewe-• gung); 1310-1340; 1230-1260; 1080; 835, 650 breit und 550 breit cm

(e) Die elektrometrische Titration in 66%-igem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 7,35 (anfänglicher

pH-Viert = 7,32) .

(f) Bei der Hochdruckflüssigchromatographie beträgt die Verweilzeit (K') 11,52 Minuten, und zwar unter folgenden Bedingungen:

Säule: 4 χ 300 mm Packung: Silicagel/C. _ft

Lösungsmittel: Ammoniumacetat Acetonitril:Wasser (1:2:97)

Strömungsgeschwindigkeit: 3 ml/min Druck: 175 bar

Detektor: UV-Licht mit veränderlicher Wellenlänge von

230 nm Sensitivität: 0 bis 0,4 A.ELF.S.

Herstellungsbeispiel 13

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912A Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 12 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912A verwendet.

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Hers te llungsbeispiel 14

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912A Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 12 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Aculeacin A verwendet.

Herstellungsbeispiel 15 Herstellung von A-30912B Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor B

Unter Anwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man A. utahensis, und zwar unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur.versetzt man das Fermentationsmedium mit A-30912 Faktor B in Form einer Lösung in einer geringen Menge Methanol.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor B wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

B. Isolierung von A-30912B Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der hierbei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch .vorhandene restliche Fermentationsbrühe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser

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wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem· Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält diese Fraktion A-30912B Kern. Das den A-3 0912B Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912B Kern durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie ;

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912B Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 4 0 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird beim Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model'UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mittels einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) überwacht.

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Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912B Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912B Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 16

Zur Herstellung und Reinigung A-30912B Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 15 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912B verwendet.

Herstellungsbeispiel 17 Herstellung von A-30912D Kern

A, Deacylierung von A-30912 Faktor D

Unter Verwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man A. utahensis mit einem Produktionsmedium I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung von A-30912 Faktor D in einer kleinen Menge Methanol.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor D wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden der Aktivität äußert.

B. Isolierung von A-30912D Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der hierbei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu

22 6 030

acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch vorhandene restliche Fermentationsbrühe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und' Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-30912D Kern. Das den A-30912D Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912D Kern durch Umkehrphasen-Flüssig-

keitschromatographie '

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912D Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, so daß sich eine Fließgeschwindi-gkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit .einer optischen

- 60 - 22 6 03 0

Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden diejenigen Fraktionen vereinigt, die den A-30912D Kern enthalten, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912D Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 18

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912D Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 17 beschrieben vor, wobei man als

Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912D verwendet.

Herstellungsbeispiel 19 Herstellung von A-30912H Kern A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor H

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach 48-stündiger Bebrütung der Kultur löst man A-30912 Faktor H in einer geringen Menge Methanol und gibt die Lösung zum Fermentationsmedium.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor H wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

- ei - 22 6 03 0

B. Isolierung von A-30912H Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat leitet man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der dabei anfallende Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Sodann wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion werden zwei Teilmengen entnommen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-30912H Kern. Das den A-30912H Kern enthaltende Eluat wird auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912H Kern durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene .rohe A-30912H Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lesung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160.Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck

.„. 226030

von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Herstellungsbeispiel 20

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912H Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 19 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-3 0912H verwendet.

Herstellungsbeispiel 21 Herstellung von S31794/F-1 Kern A. Deacylierung von Antibiotikum S3179 4/F-1

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediums . I . Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung des Antibiotikums S31794/F-1 in einer kleinen Menge Methanol.

Die Deacylierung von S31794/F-1 wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zu Beendigung der Deacylierung laufen, was sich anhand eines Verschwindens der Aktivität äußert.

- 63 - 2 2 6 0 3 0

B. Isolierung von S31794/F-1 Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das angefallene klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION hochporöses Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der dabei anfallende Abstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das anfallende Waschwasser wird verworfen. Die Säule wird hierauf mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion werden zwei Teilmengen entnommen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält die jeweilige Fraktion S31794/F-1 Kern. Das den S31794/F-1 Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum gewünschten rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von S31794/F-1 Kern durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie

Der nach obigem Abschnitt B erhaltene rohe S31794/F-1 Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer

22 6 03 0

Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Υνόη, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird.bei einem Druck von 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5₇ Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die den S31794/F-1 Kern enthaltenden Fraktionen vereinigt, unter Vakuum eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum reinen S31794/F-1 Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 22 Herstellung von Tetrahydro-A-30912A

A-30912 Faktor A wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor A mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912A.

Herstellungsbeispiel 23 Herstellung von Tetrahydro-A-30912B

A-30912 Fakor B wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol -zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man "dann A-30912 Faktor B mittels Wasserstoff-unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden)- Das Reäktionsgemisch wird

-es- 226030

filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und .durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912B.

Herstellungsbeispiel 24 Herstellung von Tetrahydro-A-30912D

A-30912 Faktor D wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor D mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912D.

Herstellungsbeispiel 25 Herstellung von Tetrahydro-Ä-30912H

A-30912 Faktor H wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Plätindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor H mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912H.

- 66 - 22 6 03 0

Hersteilungsbeispiele 26-55

Die später folgende Tabelle I zeigt die Herstellung verschiedener N-Alkanoy!aminosäuren. Die aus dieser Tabelle I hervorgehenden Verbindungen werden nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt:

Man gibt das jeweilige Alkansäurechlorid tropfenweise zu einer Lösung der entsprechenden Aminosäure in Pyridin, und zwar unter einem Molverhältnis von etwa 1:1. Es wird mit einer solchen Pyridinmenge gearbeitet, daß sich darin eine 0,1- bis 0,2-molare Konzentration der Reaktionsteilnehmer ergibt. Die erhaltene Lösung wird etwa 3 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann in ein großes Volumen Wasser gegossen. Das aus der Lösung ausfallende Produkt wird abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert.

Tabelle I

• Herstellung von N-Alkanoylaminosäuren Alkansäurechlorid Aminosäure N-Al kanoyl aminosäure

Beispiel

Nr. Formel . Gewicht Formel Gewicht Formel Gewicht

27 ClI₃(CH₂) _1OCOC1 3.00 g NII₂CH(CH₂C₆H₅)CO₂H 2.0 g CH₃(CH₂)^CONHCH(C₅H₅)CO₂H 2.5 g

28 CIu(CHJ₁^COCI 234 mg NH₀(CH)₇CO₀H 482 mg CH₀(CH ) CONH(CH ),CO H 598 mg

29 CH₃(CH₂)_1OCOC1 21.85 g. NH^CIip^CO,,!! . 20.1 mg CH₃(CH₂)_1QCONH(CH₂)_1QCO₂H 19.97 g

.β—

30 CH₀(CHJ_1nCOCl 11.09 g- NH -·( >-C0aH 6.2 g. CH (CH ) CONH-·^ e-CC-aH 6.0 g

31 CH,(CH₉),-COCl 2.19 g NH -·( )· 1.37 g CH (CH ) CONH-»( )· 3.19 g.

cn "COsH

32 CH₃(CH₂) ₁₀COC1 437 mg NH₃-^ )»-C0aH 306 mg CH₃(CH₂)₁₍₎CONH-*_N _ ,·

670 mg

^X0H

»ς-CI

33 CH₃(CH₂)₁₀COC1 2.17 g NH^V )· 2.06 g CH₃(CHJ₁₀CONH-^ __/ 3.58 g. ^

Tabelle I (Forts.)

	Alkansäurechlorid	Herstellung von	Formel	N-Alkanoyiaminosäuren	Gewicht
	Formel Gewicht	Aminosäure	' 5—V~.	N-Alkanoyiaminosäure
Beispiel Nr.		Gewicht Formel
	. , ΛΛ m .m 1J-
'V PP-,

34 CH-(CHJ_1nCOCl 2.17 g NH-/ )«-CO₂H 3.89 g CH(CH)_1nCONH-O^ ^0-CO₂H 5.23 g

^/ I

35 -CH-(CHJ_1nCOCl 2.17 g. NH V )o 1.51g CH (CH₂)_χ CONH-o^ )· 3.04 g

β CO2H

Jf ^^—/-o-u 1 ei r. · r-u /Ou N ρλμιι—·' ι

36 CH-(CHJ_1nCOCl 2.17 g NH -< >-CO₂H 1.51 g · CH (CHJ CONH-·^ «

>-COsH 2.87

CH/

37 CH₃(CH₂) ₁₀COC1 2.17 g NH^ ^o 1.67 g CH₃ (CH₂) ^CONH-o^ ^ f 3.34 g

CO2H

38 CH₃(CH₂J₁₀COCl 21.85g NH_g-o^ ^0-CHaCOaH 15.1 g CH₃(CH₂)_1QCONH-·^ ^ ^o-CHsCOaH 33.3g

39 CH,(CHJ_1nCOCl 2.19 g NH -/ VcH=CH-COnH 1.6 g CH (CH₂) CONH-o^ ^0-CH=CH-CO₂H 2.76 g

Beispiel

Alkansäurechlorid

Tabelle I (Forts.)

Herstellung von N-Alkanoylaminosäuren Aminosäure N-Alkanoylamiη ο s au re

Formel

Gewicht Formel Gewicht Formel

Gewicht

CH₃(CH₂) ₁₀COC1 21.85 g NH

S-CONHCHsCO₂H 19.4 g CHa(CHa) ιoCONH-βζ ^•-CONHCHaCOaH 37.6 g

HOaQ

CIL(ClL)_1nCOCl 8.52 g NH -β. ,

^{J z ιυ} N—β

CH₃(CIl₂)₅COC1 14.85 g 5.4 g. CHa(CHa)ioCONH-·^ S

20.1 g· CH₃(CH₂)₅CONH(CH₂)

43 CH COCl 785 mg NH -<^ ^»-COaH 1.37 g CH₃CONH-*^

a ο

7.6 g 31.3 g

1.56 g ' σι

^—β_χ CH₃(CH₂)^COCl 1.49 g NH -·ζ ^e-CO₂H CiL (CH₀) _QCOC1 1.91 g NH -/ CH₃(CH₂)₁₂COC1 2.46g ^ΝΗ ₃~·\ /»-COaH

_/»—&_x

CIl(CIL)₁₇COCI 2.74 g NH -V S-COsH ^{3 2 lH 3} \=.^/

1.37 g CHa(CHa)sCONH-·

*—^#

*—*

1.37 g CH₃(CHs)aCONH-·^ ^«-

Λ β

1.37 g CH₃(CH₂)I₂CONH-*^ ^

1.37 g CHs(CHs)14CONH-*

2.25 g.

2.52 g

2.84 g

3.16 g

Alkansäurechlorid

Tabelle I (Forts.)

Herstellung von N-Alkanoylaminosäuren Aminosäure

N-Alkanoylami ndosäure

IJ^PI·¹ Fonnel

Gewicht Formel

Gewicht Formel

Gewifcht

CH₃(CH₂)gCOCl 3.42 g

< VcOaH

NHa

3.43 g

NHCO(CH ) CH

6

6 3

3.20 g

49 CH₃(CH₂)_1QCOC1

4.6Og. e^:

β=©

NHs

3.43 g Nfic0(CH ) CH s 10 3

2.89 g

.·—e

50 CH₃(CH₂)gCOCl 3.42 g

NHa

CH₃(CH₂)₁₀coci

4.6Og

NHa

53 .. CH₃(CIIp₁₀COCl 4.6Og

3.43 g

3.43 g

CH₃(CH₂)₆COC1 3.42 g NHa-·^ ^e-COaH 3.43 g

3.43 g

Cl-/

NHCO(CH ") CH a β 3

β—β

e-COsH

NlHCO(CH ) CH 3

CH (CH ) CONH-»f

2 6 \

CH (CH ) CONH-/ a 10 \

*—*

(CH ) a 10

3.19 g

4.26 g

6.23 g

Alkansäurechlorid

Tabelle I (Forts.) Herstellung von N-Akanoylaminosäuren

Aminosäure N-Alkanoylaminosäure

Beispiel _p , Nr.· Ι?ΙίΒϋ

Gewicht Formel

^Cl

54 CH₃(CH₂)₆COC1 3.42 g. «^ )·

-COaH

—If

^cl

55 CH-(CH₀^COCl 4.01 g < .

-CO2H

Gewicht Formel

6.18 g

-COsH

^xci

4.12 g Ni-ICO(CH ) CH

6 3

Cl

Nf-ICO(CH ) CH

8 3

Gewicht

,4.26 g

3.638 g

Cl

*—*

56 CH₃(CH₂)₁₂COC1 5.18 g

NH2 Cl

V-.

4.12 g. NHCO(CH ) CH

12

4.187 g

- 72 - 2 2 6 0 3 0

Herstellungsbeispiele 56-85

Die folgende Tabelle II zeigt die Herstellung der darin angegebenen verschiedenen 2,4,5-Trichlorphenylester aus den darin angeführten N-Alkanoylaminosäuren. Die Verbindungen gemäß Tabelle II werden nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt.

Man löst die jeweilige N-Alkanoylaminosäure (1MoI), 2,4,5-Trichlorphenol (1,1 Mol) und Dicyclohexylcarbodiimid (1 Mol) in Methylenchlorid, Ether oder Tetrahydrofuran. Die Lösung wird etwa 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und das dabei erhaltene Produkt entweder aus Acetonitril-Wasser oder Diethylether-Petrolether umkristallisiert.

^Ο ß Ti'* τ ß ε2'9 H⁸OO-*' \-HNOD^0T (²HD) ^eHD V9

CO %-Λ

CD · ^Ne==e^/

CM ß 02*2 ß 89*ε ·^ ^-HNOD⁰¹(²HD)^eHD ε9

CM Ho'*"*

ß εθ*Τ ß"¹ 0L9 Η²ΟΟ-β_χ /»-HNOD^0T (²HD) ^EHD 29

H³OO_x ___β

^ ß erz ß 61* ε ·_χ ^e-HNOD^{0 Τ} (²HD) ^eiID T9

ßui OT^ ^ßui 8ε9 H³OO-O^ \-ΗΝ03°^τ (²HD) ^£HD

U3}sa [Äuaqdjo moui-g" f ζ

üb auoLM3F) auriBsouiitm

i't'Z UOA

, ß 20* τ ß ε8*ε H²OD^0T(²HD)HNOD^0i:(²HD)^eHD 69

ßui 9S6 ßui 869 H²OD^ (²HD) HNOD⁰¹" (²HD) ^£HD 89

ßui 009 ßui εεε h²od(⁹h⁹d²hd)hdhnod^01: (²HD)^iD z.g

Tabelle II (Forts.)

Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenylestern

N₁AIkanoylaminosäure _{Gewicht an erhaltBBem}

Bai spiel Nr. Formel . Gewicht 2,4,5-Trichl orphenylester

65 CH (CH ) CONH-< > 3.04 g 4.7 g

β—©.

66 CH (CH ) CONH-eC ^e-COaH 2.87 g 4.45 g.

^{3 z 10} N/

(C ) ^{3 z 10}

CH₃CHe- β

67 CH (CH ). CONH-®^ )» 3.34 g 3.86 g

COsH

68 CH (CH ) CONH-eC ^©-CHaCOsH 3.33g 2.6g

3 2 10 \—t^y

69 CH (CH ) CONH-V ^e-CH=CH-COsH 2.76g. '2.14g

3 2 IO \ *

70 CH (CH ) CONH-/ ^e-CONHCHsCOzH 3.76 g 1.0g

^{3 3 1O} \=e^/

HOsC-o==®.

71 CH (CH ) CONH-/ > 3.28 g 4.4 g

3 2 10 \/

Beispiel Nr.

73

74 75

Tabelle II (Forts.)

Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenylestern N-Alkanoylaminosäure

Formel

CH

CU CONH-/ S-COeH ³ \==S

.9 ^#V

CH (CH ) -CONH-/ N-COsH

3 2 6 \—9

.β

CH (CH ) CONH-/ S-COeH

Gewicht Gewicht an erhaltenem 2,4,5-Trichlorphenylester

4.8 g	1.68 g
895 mg	1.48 g
1.245 g	1.59 g
2.52 g	2.97 g

β—

76

77

78

_/β—·_χ

CH (CH ) CONH-/ S-CO2H ^{3 3 12} β=β

¹²

CH (CH ) CONH-/ S-COeH'-

3 2 14 \ /

β—_β

NHCO(CH ) CH

2 6

2.84 g

3.16 g

2.08 g 2.44 g

1.33 g

2.436 g

(700 mg nach b'mkristallisation)

Beispiel Nr. 79

Tabelle II(Forts.) Herstellung von 2,4 „5-Trich"! orphenyl estern

N-AIkanoylaminosäure Formel

NHC

CO(ChI ) CH

2 1O Gewicht

2.65 g

Gewicht an erhaltenem 2,4,5-Tirchlorphenylester

2.373 g

80

O B

9-CO2H 2.68 g

1.619 g

81

NHCO(CH ) CH

2 6

β ©

Ni

NHCO(CH ) CH

2 10

,Cl 3.19 g.

1.605 g

82

83

CH (CH ) CONH-/ N-CO₂H ^{3 2 6} \=·^/

CH (CH ) CONH-©^ \-C0aH ^{3 2 1}° «==·

2.38 g 2.83 g.

1.716 g

1.575 g

Tabelle II (Forts.) Herstellung von 2,4,5-Tr.ichl orphenyl estern

_{Gewicht an erhaltenem}

Beispiel Nr. Formel Gewicht 2,4,5-Tirchlorphenylester

^Clv-.

e( )»-CO₂H 4.19 g 2.02 g NHCO(CH ) CH

Pl 2 6 3

»^^e~*%-C0 H 2.88 g 3.507 g

^XCI NHCO(CH ) CH

8 3 A——Q

. e( Vc02H 3.33 g 1.897 g

/ ^XCI NHCO(CH ) CH

1 !3 3

cn ο ω ο

- ⁷⁸ - 2 2 6 0 3 0

Beispiele 1-30

Die folgende Tabelle III zeigt die Herstellung entsprechender Derivate von A-30912A Kern aus den darin angegebenen N-Alkanoylaminosäure-2,4,5-trichlorphenylestern. Die darin genannten Verbindungen werden nach folgendem allgemeinen Verfahren herge- · stellt.

Eine Lösung von A-30912A Kern in Dimethylformamid (DMF) wird mit dem 2,4 ,5-Trichlorphenylester der jeweiligen N-Alkanoylaminosäure versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit Ethylether und mit Methylenchlorid gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer Silicagelsäule (Woelm, Korngröße 0,1 bis 0,2 mm) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluiermittel chromatographiert. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zu einem produkthaltigen Rückstand gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie wie folgt analysieren:

Das Material wird in einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:1:2, Volumen/Volumen) (1 mg/ml) gelöst und die Lösung in eine etwa 30 cm lange Säule mit einem Durchmesser von etwa 6,5 mm aus rostfreiem Stahl gegeben, die mit C „-Mikro-Bondapak-Harz (Waters Associates, Inc., MiIford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/ Volumen) eluiert. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa

-79- 226030

105 bar mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von 5 mm/min durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom UV-Detektor bei 230 nrh verfolgt.

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

22 6 03 0

CVJ

CD CO

(Λ

co CU-σ

ω +j to

•ι—

χω •σ ω

ε:

.·ϊ—

to

•—«—«ax

g-..ρ.

Tabelle III (Forts.)

Beispiel ₅-^^

Nr. R in Formel V

ι-2 3

CH₃ (ClI₂) _Ί qCONHCH(CH₂C₆H₅)CO- 31

CIl₃ (CH₂

β—©

CHa(CHa)1oCONH-

CHa(CHs)ioC

9.

CHs(CHs)1oCONH-

St=Z-Q

CHa(CH₂)ioCONH-β^

^X0H β—β-CI

β ==&

CH₃(CHs)loCONH-e^

Beispiel	er "Gewicht(mg)	Kern von A-30912A (mg)	Produkt (mg)	1148(M"1" H	HPLC Retention (cm)
31	141	250	158	1101(M+ H	—
32	795	250	132	1185(M+ H	—
33	462	400	327	1121(M+ H	1.23
34	515	400	247	1120(M+ H	—
35	515	400	302	1137(M+ H	—
36	515	400	354	1197(M+ H	1.33
37	570	400	196		1.65
	- 22)
L 22)
r 23)
κ 23)
r 22)
V 23)
ν 30)

38

400

291

1.20

Tabelle III (Forts.)

Beispiel

Produkt

Nr. R⁵ in'Formel V

CH₃(CHs)

14

O ^·

Kern von

Ester A-30912A

Beispiel Gewicht(mg) (mg)

TCO-

10 Cl-Is(CHa) loCONH-·^

O

©—~β

11 CHa(CHe)

CHa' CHaCb®—β.

β—β.

12 CHa(CHs)loCONH-«/ ^e-CHsCO- 42

13 CHa(CHs) ioCONH-·^ N-CH=QH 43

N-CH=C

c-

-CONHCH₂ 44 O-

512 512 530

497 535

400 400 400

400 400

540 . 400

Produkt (mg)

182

166 120

452

453

HPLC

Retention (cm)

1135(M + 23)

1143(M^T + 31) 1.43

1151(M + 23)

1135(M⁺ + 23) 1.32

1148(M + 24) 1.40

1170(M + 25) 1.40

Tabelle III (Forts.)

Beispiel j

'ir. . R in Formel V

Kern von

Ester A-30912A

Beispiel . Gewicht(mg) (mg)

CHa(CHa)loCONH-e

45

492

400 Produkt (mg)

277

HPLC

Retention (cm)

CHa(CHs)eCONH(CHa)IO-CO-

' CHaCONH-o^ S-CO-

46

47

493 360

400 400 273 213

1115(M⁺ + 23) 0.95^s

980(M + 22) 1.75

CH₃(CHa)₅-CONH-/ ^e-CO-. 48

9==β

CHs (CHa)₀CONH-B_x' S-CC- ' 49

430

500

400

400 218

162

1O93(M + 23) 0.90

,φ—©

CHa(CHa)ιsCONH-·^ /»-CO-

9e

β—β

50

21. CHa(CHa) 14CONH-«_X S-CO- 51

52

527

555

477

400

400

400 234

350

176

1149(M+ 4	2.	35	ro ro
1177(M+ H	3.	23	cn O
			ω
			O
1099(M+ H	O.	7
- 23)
- 23)
- 23)

NHCO(CH ) CH

6

Tabelle III (Forts.)

Beispiel

Produkt

Nr. R in'Formel V Kern von

Ester A-30912A Produkt Beispiel Gewicht(mg) (mg) (mg)

HPLC

Retention (cm)

23

24

NHCO(CH ) CH

^ S 1O

ο—©.

53 533 400

54 477 400

127 1155(M +23)

319 1099(M⁺ +23)

25

26

27

NHCO(CH ) CH

2 6

NHCO(CH ) CH

2 IO

55 533 400

.Cl

CH (CH ) CONH-< >-C0-

3 2 6 N S

β Θ.

CH (CH ) CONH-φ^ N-CO-

3 2 10 \ /

Cl.

56 477 400

57 533 400

214 1155(M + 23)

290

325

1.0

3.4

28

>-co-

58 512 400

\l

nAco(ch ) cn

se 324

1.3

Tabelle III (Forts.)

Beispiel ^Pg^odukt

Nr. R in Formel V

29

^C1

Ester Beispiel

Kern von A-30912A Gewicht(mg) (mg)

59

540

400

Produkt (mg)

281

M⁺

HPLC

Retention (cm)

1162(M +23)

NHCO(CH ) CH

2 8

₀ ο

30

NHCO(CH ) CH

2 12

60

596

400

269

1217(M + 23)	7.7	CD cn ι
		IO K)
		O ω ο

- 86 - 2 2 6 0 3 0

Beispiele 31-40

Die Beispiele 31 bis 40 zeigen die Herstellung von Verbindungen aus der allgemeinen Formel III in größerem Maßstab. Die nach den im folgenden näher beschriebenen Verfahren hergestellten Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel III, worin R für N- (n-Dodecanoyl) -p-aminobenzoy.l steht.

Beispiel 31 A. Herstellung von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure

Man gibt n-Dodecanoylchlorid (8,74 g, 40 mMol) tropfenweise zu einer Lösung von p-Aminobenzoesäure (5,5 g, 40 mMol) in Pyridin (100 ml ) .Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden gerührt und dann in Wasser (3 1) gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (11,01 g) gelangt.

B. Herstellung des 2 - 4,5-Trichlorphenylesters von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure

Man löst N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (11,01 g, 34,5 mMol), 2,4,5-Trichlorphenol (7,5 g, 38 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (6,94 g, 34,5 mMol) in Methylenchlorid (250 ml). Das .Reaktionsgemisch wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der dabei erhaltene Rückstand aus Acetonitril/Wasser umkristallisiert, wodurch man den 2,4,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (12,84 g) erhält.

- 87 - 2 2 6 0 3 0

C. Acylierung von A-30912A Kern

Den A-3d912A Kern (8,16 g, 10,2 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (4,72 g, 10,2 mMol) löst man in Dimethylformamid (100 ml). Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel . wird unter Vakuum entfernt, und der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in Methanol (50 ml) gelöst und durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigchromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) unter Verwendung einei Prep Pak-500/C.jO Säule (Waters Associates, Inc.) als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch mit einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) bei einem Druck von etwa 35 bar eluiert. Die Fraktionen v/erden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagelplatten und von einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem analysiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man das N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivat von A-30912A Kern (3,5 g) erhält.

Beispiel 32 Acylierung von A-30912B Kern

Man löst A-30912B Kern (10,2 mMol) und den 2 ,4 ,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (hergestellt gemäß Beispiel 31, Stufen A und B) (10,2 mMol) in Dimethylformamid (100 ml). Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der durch anschließendes Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether gewaschen« Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in Methanol (50 ml)

- 88 - 22 6 03 O

gelöst und durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigchromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Massachusetts) unter Verwendung einer Prep Pak-500/C.g Säule (Waters Associates, Inc.) als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch mit einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) bei einem Druck von etwa 35 bar gereinigt. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagelplatten und eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volurnen) als Lösungsmittelsystem analysiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderviat von A-30912B Kern gelangt.

Beispiel 33

Nach dem in Beispiel 32 beschriebenen Verfahren werden unter Vornahme geringer Änderungen weitere Derivate des A-30912B Kerns synthetisiert. Zu diesem Zweck ersetzt, man das jeweilige Acylchlorid und die jeweilige Aminosäure bei der Stufe A, verwendet bei der Stufe B die entsprechende N-Alkanoylaminosäure . (und Tetrahydrofuran als Lösungsmittel für. N-Alkanoylirionochloraminobenzoesäure) und arbeitet mit dem jeweiligen 2,4,5-Trichlorphenylester, wodurch man zu den folgenden Derivaten des A-30912B Kerns gelangt.

- 89 - 2 2 6 0 3 0

N-Alkanoylaminosäurederivate des Kerns von A-30912B

VI

R⁵

CH-. (CH₀) , _nCONHCH (CH-C.H,.) CO-CH₃(CH₂)₁₀CONH(CH₂)₄"CO-(CH₃(CH₂)₁₀CONH(CH₂)₁₀~CO-

CH₃(CH₂)

co-

.·—»ν

V N-CO-.=.

OH

_/· βς-C I

CH₃(CH₂)1OC0NH-©/ N

c/ \q~

CHs(CHs)1oCONH-e^

CHs(CHs)

CO-

e—©

O/ N-CO-.=©

CHs

CHs CKs--©.

CHs(CHs) ioCONH~«/ _)© .=.

CO-

CHs(CHs) ioCONH-s/ N

CHs (CHs) 1 oCONH-<^ N

- 91 - 22 6 03 0

CH₃(CH₂)ιoCONH-e^ ^e-CONHCHa ·=» ι

COCO-

CH₃(CHa) ιoCONH-e^ /·

CH₃(CHs)sCONH(CHa)10-CO-

/*—^β\

CHsCONH-«/ /»-

·=9

/·—β

CH₃(CHa)₅-CCNH-O^ ^e-

β—β

CH₃(CHa)aCONH-®^

CH₃(CHs) ιsCONH-«/

CH₃ (CHa) 14CQNH-«f %-CO-

NHO

/•-CO-

CO(CH ) CH

2 6 ₃

- 92 -	22	30
NHCO(CH ) CH 2Ί0 3
Cl- *C ,©—CO—
NHCO(CH ) CH 2 6 3
.· β. C1_@( yCo-
NHCO(CH ) CH 210 3
re 0

CH (CH ) CONH-©^ S-CO-

3 2 6

.9—©.

CH (CH ) CONH-©^ S-CO-^{2 10} \^/

^I>-v

>-co-

NHCO(CH ) CH

2 6 3

NHCO(CH )' CH

2 3

CL

NHCO(CH ) CH

2 13

-93- 226030'

Beispiel 34 Acylierung von A-30912D Kern

Man löst A-30912D Kern 10,2 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (hergestellt nach Beispiel 31, Stufe A und B) (10,2 mMol) in Dimethylformamid (100 ml). Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der erhaltene Rückstand zweimal mit Diethylether gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in Methanol (50 ml) gelöst und durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Massachusetts) unter Verwendung einer Prep Pak-500/ C18 Säule (Waters Associates, Inc.) als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) bei einem Druck von etwa 35 bar eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographxsch unter Verwendung von Siiicagelplatten und eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem analysiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoyIderivat des A-30912D Kerns gelangt.

Beispiel 35

Das in Beispiel 34 beschriebene Verfahren wird zur Herstellung weiterer Derivate des A-30912D Kerns wiederholt. Zu diesem Zweck verwendet man bei der Stufe A das jeweilige Acylchlorid und die entsprechende Aminosäure, arbeitet bei der Stufe B mit der jeweiligen N-Alkanoylaminosäure (und Tetrahydrofuran als Lösungsmittel für N-Alkanoylmonochloraminobenzoesäure) und ersetzt den beim Beispiel 34 verwendeten

- 94 - 22 6 03 O

2,4,5-Trichlorphenylester in entsprechender Weise, wodurch man zu den aus der folgenden Aufstellung hervorgehenden Derivaten von A-30912D Kern gelangt, worin R die im Beispiel 32 angegebene Bedeutung hat.

N~Alkanoylaminosäurederiväte des Kerns von A-3 0912D

CH₃ ^H0

HgEf.

VII

Beispiel 36 Acylierung von A-30912H Kern

Man löst A-30912H Kern (10,2 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (hergestellt nach Beispiel 31, Stufen" A und B) (10,2 mMol) in Dimethylfbrinamid (100 ml). Die Lösung wird "T5 Stunden bei

- 95 - 2 2 6 0 3 0

Raumtemperatur gerührt. Der durch anschließendes Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethyl-ether gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in Methanol (50 ml) gelöst und durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Massachusetts) unter Verwendung einer Prep Pak-500/C18 Säule (Waters Associates, Inc.) als •stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch mit einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10,^Volumen/Volumen) bei einem·Druck von etwa 35 bar eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagelplatten und eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem analysiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man das N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoy!derivat des A-30912H Kerns erhält.

Beispiel 37

Nach dem in Beispiel 36 beschriebenen Verfahren v/erden unter Vornahme geringer Änderungen weitere Derivate des A-30912H Kerns synthetisiert. Durch Verwendung entsprechender Acylchloride und Aminosäuren in Stufe A, Einsatz entsprechender N-Alkanoylaminosäuren (und von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel für N-Alkanoylmonochloraminobenzoesäure) in Stufe B und Ersatz des jeweiligen 2,4,5-Trichlorphenylesters in Beispiel 3 6 gelangt man zu den folgenden Derivaten des A-30912H Kerns, worin R die gleiche Bedeutung wie bei Beispiel 32 hat.

-96- 226030

N-Alkanoylaminosäurederivate des Kerns von Ä-30912H

/ S 0=

0=< H . OH

VIII

Beispiel 38

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung des N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivats des Kerns von A-30912H aus dem Kern von A-30912A. Der A-30912A Kern wird nach dem im Beispiel 36 beschriebenen Verfahren mit 2,4,5-Trichlorphenyl N(-n-dodecanoyl)-p-aminobenzoat behandelt. Das hierdurch erhaltene Derivat methyliert man dann durch Behandlung einer Probe hiervon (20 mg)

22 6 03 0

mit 3 % HCl-Methanol (0,06 ml) in Dimethylformamid. Die Lösung wird 16 Stunden gerührt, und durch anschließendes Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck gelangt man zu einem Rückstand. Der Rückstand wird durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Silicagel/C.o~H^arz gereinigt.

Beispie 139 Acylierung von S31794/F-1 Kern

Man löst den S31794/F-1 Kern (10,2 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoesäure (hergestellt gemäß Beispiel 31, Stufen A und B) (10,2 mMol) in Dimethylformamid (100 ml). Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der durch Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in Methanol (50 ml) gelöst und durch Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Massachusetts) unter Verwendung einer Prep Pak-500/C18 Säule (Waters Associates, Inc.) als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird isokratisch mit einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) bei einem Druck von etwa 35 bar eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagelplatten und einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (25:65:10, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem analysiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum N- (n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivat'des S31794/F-1 Kerns gelangt.

- 98 - 22 6 03 0

Beispiel 40

Nach dem in Beispiel 39 beschriebenen Verfahren v/erden unter Vornahme geringer Änderungen weitere Derivate des S31794/F-1 Kerns synthetisiert. Hierdurch gelangt man unter Einsatz entsprechender Acylchlorideund Aminosäuren bei Stufe A, Verwendung einer entsprechenden N-Alkanoylaminosäure (und von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel für N-Alkaonylmonochloraminobenzoesäure) bei Stufe B und Ersatz des entsprechenden 2,4,5-Trichlorphenylesters bei Beispiel 39 zu folgenden Derivaten des S31794/F-1 Kerns, worin R die gleiche Bedeutung wie bei Beispiel 32 hat.

N-Alkanoylaminosäurederivate des Kerns von S3179 4/F-1

0H

IX

_₉₉_ 22603ο

Beispiel 41

Die antifungale Wirksamkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel III läßt sich durch übliche Scheibendiffusionstests und Agar-Verdünnungstests in·vitro und durch übliche Untersuchungen an Mäusen in vivo ermitteln, die gegenüber einer systemischen Pilzinfektion wirksam sind. Die bei dieser Ermittlung der antifungalen Wirksamkeit für typische Verbindung gen aus der allgemeinen Formel V (Beispiele 1 bis 30) erhaltenen Ergebnisse gehen aus den später folgenden Tabellen IV, V, VI und VII hervor.

Die Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse einer Untersuchung der Verbindungen der Beispiele 61 bis 81 durch die sogenannte Agar-Scheiben-Diffusionsmethode in vitro. In der Tabelle IV ist die ermittelte Wirksamkeit durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten Hemmzone des Mikroorganismus angegeben, die von der jeweils untersuchten Verbindung gebildet wird. In Tabelle V ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz (ug/ Scheibe) angegeben, die zur Hemmung·des Wachstums des jeweiligen Testorganismus erforderlich ist. Aus der Tabelle VI gehen die Ergebnisse der Untersuchung des N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivats von A-30912A Kern (Formel III, worin R für N- (Dodecanoyl)-p-aminobenzoyl steht) in vitro gegenüber fünf Stämmen von Candida albicans durch die Agar-Verdünnungsmethode hervor. In dieser Tabelle VI ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz (μΐη/ml) angegeben, die für eine Hemmung des jeweiligen Testorganismus erforderlich ist.

Aus Tabelle VII gehen die Ergebnisse entsprechender in-vivo™ Untersuchungen zur Ermittlung der Wirksamkeit der Verbindungen der Beispiele 61 bis 81, 86 und 88 gegenüber einer durch

-•ίοο.- 22 6 03 0

Candida albicans Ä-26 an Mäusen verursachten Infektion hervor, wobei die Wirksamkeit in Form der ED,-_n-Werte angegeben ist, worunter die Dosis in mg/kg verstanden wird, die zur Heilung von 50 % der Versuchstiere benötigt wird. Wurden keine ED_[-_n~Werte ermittelt, dann ist als Wirksamkeit jeweils die niedrigste Dosis angeführt, bei der sich eine beachtliche antifungale Wirkung feststellen läßt. Für die entsprechenden Untersuchungen werden Gruppen aus männlichen weißen Mäusen (die pathogen frei sind) mit einem Gewicht von 18 bis 20 g verwendet, welche man intravenös mit Candida albicans A-26 infiziert. Die Tiere werden 24 Stunden vor- der Infizierung über eine Zeitdauer von 8 Minuten mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von etwa 50 Röntgen pro Minute (Gesamtdosis 400 Röntgen) behandelt, um auf diese Weise eine Immunreaktion gegenüber dem infizierenden Mikroorganismus herabzusetzen. Jeweils 0, 4 und 24 Stunden nach erfolgter Infektion gibt man jeder Gruppe an Mäusen sucutanabgestufte Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung in Form einer Suspension in 33 % Polyethylenglykol-Wasser. Man ermittelt den Tag, an dem die jeweiligen Tiere verendet sind. Nach dem sogenannten Student-T-Test bestimmt man durch Vergleich des jeweiligen mittleren Todestages zwischen jeder Gruppe an infizierten behandelten Mäusen bei der jeweiligen Dosierungshöhe und an 10 infizierten unbehandelten Tieren, ob es durch die jeweilige Behandlung zu einer wesentlichen Verlängerung der Überlebenszeit gekommen ist.

Aus der später folgenden Tabelle VIII gehen die Ergebnisse der Bestimmung der Absorption entsprechender Verbindungen nach oraler Verabreichung hervor. Hierzu gibt man Mäusen über eine Magensonde eine Dosis von 416 mg/kg des jeweiligen Wirkstoffes in-Form einer Suspension in 33 % Polyethylenglykol 400-Wasser. In bestimmten Zeitabständen werden vom Orbitalsinus Blutproben entnommen und in folgender weise

-ιοί - 22 6 03 0

bezüglich einer antibiotischen Wirksamkeit ausgewertet:

Eine 7 mm große Scheibe, die 20 μΐ Gesamtblut enthält, wird auf Agar gelegt, der mit Aspergillus montevidensis A35137 angeimpft ist. Nach 40-stündiger Inkubation bei 30⁰C vergleicht man die Hemmzonen der Blutproben mit einem aus dem jeweiligen Wirkstoff erhaltenen Standard und ermittelt die in den Blutproben enthaltenden Wirkstoffmengen.

Tabelle IV

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest __Verbindung Größe der Hemmzone (

l\i_r 5 Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida

' . R von.Formel V pastorianus X-52 Crassa 846 mentagrophytes A-23 albicans Λ-26

1 CH '(CIO_1nCONHCH(CH₀C-IL)-CO- 18 42* 55* 25

2 CH₃(CH₂)_1QCONH(CH₂)₄-CO- 15· 27* 60* 25

3 CH (CH ) CONH(CII ) -CO- 15 28* 55* 24

^{J l 1U l XU} 18 35 63* 25

.15 28 56 24

_/ö—ο_χ

4 CHo(CHa) ioCONH-·^ V-CO- 21 33* 55* 23 '

®==® 17 35* 56* 19 ο

/·—O_x ·. ^

5 CH₃(CHs) loCONH-e^ ^e 17 — —20 '

CO-

6 CH3(CHa) ioCONH-»C \-CQ- 18 — — 23 .»

\=t ^⁰

OH . · N5

7 CHa(CHs) ioCONH-·^ ^e 19 35* 44* 27 O

Cl CO- _o

Tabelle IV (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest / χ Verbindung Größe der Hemmzone (mm Γ '

μ D^ c π Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida J^J K von Formal V pastorianus X-52 Crassa 846 mentagrophytes A-23 albicans A-26

8 CHs(CHa)loCONH-«/ ' ^e-CO- 17 30* 60 25

I—·=·

9 CH₃(CHa)loCONH-e' ^* 17 30* — 16

10 CHa(CHa)ioCONH-ef ^X*-C0- 19 25* 45* 26 -

β—β , co

CH₃ .

CHaCb«—·.

11 CH₃(CHa)ioCONH-*^ ^* 10 32* 50* 20

*~\o- to

12 CHa(CHs)loCONH-e^ ^e-CH₂-CO- 20 30* 55* .19 ^

•~. O

13 CH₃(CHa) loCONH-e^ ^e-CH=CH-CC- 17 29* 24* 60* CjU

Tabelle IV (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest Verbindung Größe der Hemmzone

Beispiel ^ Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida

^Nr· R von Formel V pastorianus X-52 Crassa 846 mentagrophytes A-23 albicans A-26

14 CH₃(CH₃) ioCONH-·^ ^e-CONHCH₂- 13 28* — 15

0-

15 CH₃(CH₂)ioCONH-«( /β 14 30* 54* 24

16 CH₃(CH₂)SCONH(CH₂)10-CO- — 20* 35*

17 CHaCONH-·^ /«-CO- 17 24* 51*

18 CH₃(CH₂) öCONH-β^ ^e-CO- 20 25 14

19 CH₃(CH₂) aCONH-/ %-CO 17 30*

20^l CH₃(CH₂) I₂CONH-*^ ^e-CO- 17 — — 22

10	104
24	1
	!O
45*	K)
	σ)
24	σ ω
	ο

Tabelle IV (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest Verbindung Größe der Hemmzone

_{Nr R}5 _von p_orme-| _v Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida

pastorianus X-52 Crassa 846 mentagrophytes A-23 albicans A-26

CHa(CHs) 14CONH-*^ ^e-CO- 24 — — 25

Die Verbindungen werden in Form einer Suspension in Methanol untersucht. Die Verbindungen

werden in einer Konzentration von 1 mg/ml untersucht, indem man eine 7 mm große Scheibe

in die Suspension taacht und diese Scheibe dann auf die Agar-Oberflache gibt.

Inkubation: 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37°C. ο

'* Meßbare Hemmzone, bei der der Organismus um die Scheibe herumgewachsen ist,

Tabelle V

Antifungaie Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest Verbindung Minimale Hemmkonzentration (pg/Scheibe)*

Beispiel ₅

|\jr. R von Formel V . Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

1 CHs(CHa)1OCONHCH(CHsC₆Hs)-CO- 0.625 <O.O39

2 CHs(CHa)IOCONH(CHs)₄-CO- 1.25 O..O78

3 CHa(CHs)ioC0NH(CHa)1O-C0- ' 2.5 0.156

1.25 0.156

4 CHs(CHa)ioC0NH-®f ^&-00- 0.625 <0.039

β=· 1.25 0.678 _

5. CHs(CHa)ιoCONH-e^ ^« 5.0 <0.039 . '

6 CHs(CHa)ioCONH-©^ /•-CO- 1.25 <0.039

^X0H (J)

⁷ CHs(Ca) ₁₀CONH-<^e~^#>^CI °·^{625 <0}'°³⁹ S

/·—\ ·

Cl CO-

Tabelle V (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest Verbindung Minimale Hemmkonzentration (yg/Scheibe)*

Beispiel

[\]_Γί

R von Formel V Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

8 CHs(CHb)IoCONH-/ S-CO-1.25'

0.078

9 CHs(CHs) loCONH-©

CO- >20

<0.039

10 CHa(CHa) loCONH-/ N-CO-

99

CHa

11 CHs(CHa)lüCONH-®

o-20

<0.039

,1» W.

12 CHs(CHs)loCONH-·^ ^e-CHa-CO-2.5

0.078

Tabelle V (Forts.)

Beispiel

13

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusionstest Verbindung Minimale Hemmkonzentration (pg/Scheibe)*

5 R von Formel V

/*—*\ .CHs(CH₂) ι oCONH-·' N-CH=CH-CO-

e==o Candida alblcans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

1.25 <0.039

14 CH₃(CH₂) loCONH-·^ N-CONHCH₂-CO-10

0.078

16 17

18

CHa(CH₂) ioCONH-<

H (

- ο

Ν—

CHa(CH₂)BCONH(CHs)Io-CO-

CH₃(CH₂)e

*—^β

9

19 CH₃(CH₂)aCONH-*^ ^e-CO-2.5

>20;80 >20;40

>20;160 0.625

0.078

0.625 0.312

1.25

σ> ο ω ο

Tabelle V (Forts.)

Antdfungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben-Diffusicnstest

Verbindung Minimale Hemnikonzentration (uq/Scheibe)*

Beispiel ₅

Nr. R in Formel V Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

_/a—®_N

20 CHs(CHa)IaCONH-Q^ ^e-CO- 1.25 <Q.O39

_/β ©_x

21 CH₃(CHs)14CÖNH-©^ /«»-CO- 0.312 <O.O39

©=9

* Die Verbindungen sind in 0,01-molarer Natriumboratlösung suspendiert, die einen pH- ι

Wert von 7,5 hat. Die Verbindungen.werden in einer Menge von 20 pg/Scheibe als höchster Konzentration und unter Zweifachverdünnungen bis zum Erreichen der jeweiligen Endpunkte untersucht. Inkubation: 24 Stunden bei 30⁰G.

** Meßbare Hemmzone, bei der der Organismus um die Scheibe herumgewachsen ist. ^

ο

- ¹¹° - 22 6 03 0

Tabelle VI

In-vitro-Wirksamkeit des N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivats (Beispiel 4) und des N-(n-Dodecanoyl)-5-amino-npentanoylderivats (Beispiel 2) von A-30912A Kern gegenüber fünf Stämmen von Candida albicans nach dem Agar-Verdünnungsversuch.

Minimale Hemmkonzentration {[ig /ml)

Verbindung A26

Beispiel 4 0,312 0,625 Beispiel 2 1 ,25

SBH	,6	16	SBH	,6	.31	SBH 28	,625	SBH 29
0	,5	25	0	,5	25	0	,5	o,
2		2		2	2,
,625
,5

	Tabelle VII	Candida albicans	A-26 bei Mäusen*
	Therapeutische Wirksamkeit gegenüber	Λ* 5Q (mg/kg)	Niedrigste wirk same Dosis(mg/kg)
	Verbindung	>40	>40
Beispiel Nr.	R von Formel V ED	22	20
1	CHa(CHa)ιoCONHCH(CHaCeHs)-CC-	>40	>40
2	CHa(CHa)ioCONH(CHa)4-CO-	15 15	10 <5
3	CHa(CIb) 1OCONH(CHa) ι o-CO-
4	©—β. CHo(CHs)ιοΟΟΝΗτβζ ^e-CO- β==β

.β—β. ι

^ ^· >Α0 >Α0 . —

CO- '

CH3(GHs) ioCONH-·^ ^a-CO- >40 · 40

OH _Μ

/«»--e^C I . . Ν3

CHo(CHs) ioCONH-·^ ^© 14 ¹⁰ CJ)

ci^/==\o- ο

Tabelle VII (Forts.)

Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26 bei Mäusen* Verbindung

** Niedrigste wirk-

Beispiel Nr. R⁵ von Formel V ^ED50 ⁽ⁱⁿ8^/kg> samejosis(mg/kg)

i-₉ —_#^ 8 CHa(CH2)ioCONH-<^ ^e-CO- >40 40

a η

% >40

10 CHs(CHs)loCONH-·^ ^«-CO- . >40 >40

β==β ro

CH₃ '

CH₃Cb*-·.

11 CH₃(CHs)ioCONH-©( ;· >40 >40

co- J₀

_/e—β_χ

12 CH₃(CHs) 1OC0NH-/ ^e-CHs-CO- >40 40 ⁰^

13 CH₃(CHs) ioCONH-·^ S-CH=CH-CO- 24 20 Q

Tabelle VII (Forts.)

Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26 bei Mäusen*

verbindung ... , . . . ,

^a ** Niedrigste vnrk-

Beispiel Nr. R^von Formel V ED₅₀ (mg/kg) same Dosis(mg/kg)

©—_β 14 ' CHa(CHs)ioCONH-·^ /•-CONHCHa-CC- >4O >4O .

β==β

15 CHa(CHa) ioCONH-·^ J* >AO >4O

16 CHiS(CHa) sCONH(CHs)IO-CC- >40 >40

17 CHsCONH-«^ ^e-CO- >40 >40

18 CH3(CHa)5C0NH-·^ /»-CC- >40 >40 K)

19 CH₃(CH₂)SCONH-*^ ^e-CO- 26 5

·=· OO

Tabelle VII (Forts.) Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26 bei Mäusen*

Verbindung ^ Niedrigste wirk-

Beispiel Nr. R von Formel V ^ED ₅₀ (^ms/^k8) same Dosis(mg/kg)

20 CHa(CHs)12CONH-S^ ./O-CO- 11 2.5

21 CH₃ (CH2) 14CONH-*^ N-CO- 7 5

26 CH₃(CHs)₆CONH-O^ N»-C0- 29 10 . '

28 CHa(CHs) eCONH-·^ % >40 20

ei^{7 x}co-

* Dosierungsschema: 40, 20, 15 und 10 mg/kg. Die entsprechenden Dosen werden 0, 4 und N3

24 Stunden nach erfolgter Injektion in Form einer Suspension des jeweiligen Wirk- ^v fO

stoffes in,30 % PEG-H₂O verabreicht. Jede Wirkstoffdosis wird jeweils einer Gruppe· ^ aus 6 Mäusen gegeben. Die Kontroll gruppe (unbehandelte Tiere) besteht jeweils aus

.10 Mäusen. O

** Gemessen anhand der Zunahme der Überlebenszeit der behandelten Tiere gegenüber q

den Kontrollen und berechnet nach der Methode von Reed V. Mueuch, American J. Hygiene 493 (1938).

Tabelle VIII

- Blutspiegel nach Verabreichung an Mäuse Verbindung

Beispiel Nr. R von Formel V . Blutspiegel* (pg/ml)

1 CHa(CHa)IoCONHCH(CHaCeHe)-CO- O

2 CHa(CKe)IoCONH(CHs)4-C0- O

3 CH₃(CHS)IOCONH(CHs)IO-CO- 0.40(0)

4 CH₃(CHs)-IoCONH-*^ ^e-CO- 0.83

/^β—®λ cn

5 CH₃(CHs)loCONH-·^ ^e O ι

•=\

CO-

6 CH₃(CHe) 1 oCONH-/ V-CO- O Ν3

·=· JO

7 CHs(CHa)ioCONH-e( )β 0.53 O

\=.ico- ω

Tabelle VIII (Forts.)

	Verbindung'	Blutspiegel	nach	Verabreichung an Mäuse
Beispiel Nr.	R5 von	Formel V		Blutspiegel'
8 9	CHs(CHs)IoCONH-O^ ^< /=. CH3(CHs)1oCONH-«/ \	i-CO- »	O. O
* (Mg/ml)
,34

10 CHs(CHs) loCONH-e; V-CO- O ^

/ I

CH₃CH₃O₇O-Ov 11 CHa(CHs) loCONH-ö^ N>

Λ /Κ.

β=*

β—<r

eC ^e-CHs-CO- 034 CT)

12 CHs(CHs) ioCONH-eC ^e-CHs-CO- 0.34

13 . CH₃(CHs) ioCONH-β^ ^e-CH=CH-CO- 1.31

Tabelle VIII (Forts.) Blutspiegel nach Verabreichung an Mäuse Verbindung

Beispiel Nr. R⁵ von Formel V Blutspiegel* (ug/ml)

14 CHa(CHa) ioCONH-·^ ^-CONHCHa-CO- 0.64

15 · CHa(CHa)loCONH-·^ )· O

16 CH₃(CHs)OCONH(CHa)Io-CO- O _,

17 CHaCONH-βζ ^e-CO- O

18 CHa (CHa) eCONH-«f N-CC- — jsj

' . cn

19 CHa(CHs)aCONH-ef ^©-CC- — °

_/9 s^ O

20 CHa(CHs)isCONH-e^ /«-CC- 6.5

Tabelle VIII (Forts.)

Blutspiegel nach Verabreichung an Mäuse Verbindung

Beispiel Nr. R von Formel V Blutspiegel* (pg/ml)

«j—_β

21 CH3(CHs) nCONH-«^ N-CO- 36

4 Stunden nach Verabreichung des Wirkstoffes in einer Dosis von 416 mg/kg mittels einer Magensonde in Form einer Suspension des jeweiligen Wirkstoffes in 33 % PEG 400-l-LO. Zur Bestimmung wird Aspergillus montevidensis ' A-35137 verwendet. ^

Claims (9)

1. Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines cyclischen Peptidkerns der allgemeinen. Formel III

   R¹ OH II .· I i„.

   0 Η' - ^0Η

   H III

   1 2 3

   worin R für H oder OH steht, wobei R für H steht und R

   4 1

   sowie R jeweils H oder jeweils OH sind, falls R für H steht,

   2 3

   oder wobei R für H steht, R für OH oder C₁-C, Alkoxy steht

   4 2 ' ⁶ 3

   und R für OH steht oder R für -CO-NH₀ steht und R sowie

   4 1

   R jeweils für OH stehen, falls R für OH steht, O

   5 " ß

   R N-Alkanoylaminoacyl der allgemeinen Formel -W-C-R

   bedeutet,

   worin W zweiwertiges Aminoacyl der folgenden allgemeinen

   Formeln ist:

   0
   (a) -C-A-NH-,

   worin A für C.-Cj₀ Alkylen oder C₅-C₆ Cycloalkylen steht,

   -120- 226030

   OR⁷

   (b) -C-CH-NH-, · ·

   worin R Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl ist, deren Benzolring durch Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C- Alkylcarbamyl substituiert ist,

   t Λ

   worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃ Alkyl Hydroxy, C₁-C₃ Alkoxy, Mercapto, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C. Alkylcarbamyl bedeutet,

   Y¹ T

   I oder I I! _MU

   Y Y

   worin X Chlor, Brom oder Iod ist,

   . -NH.

   H oder I Il oder

   worin B einen zweiwertigen Rest der allgemeinen, Formeln -(CH„) -, worin η eine ganze Zahl von 1 bis einschließlieh 3 ist, -CH=CH-, -rCH=CH-CH₂- oder

   2 2 6 0 3 0

   -CNHCH₂- darstellt, und

   R. für C₁-C₁₇ Alkyl oder CrC- Alkenyl steht, dadurch gekennzeichnet, daß man einen cyclischen Peptidkern der allgemeinen Formel II

   CH₃ : ,,ff R³. .R⁴

   «^H

   R²-CH

   ^H\ .·^Η

   ν -·> y

   •·0Η

   II

   12 3 4

   worin R , R , R und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer N-Alkanoylaminosäure acyliert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für N-Alkanoylaminoacyl steht, das von der entsprechenden

   "6
   Säure der Formel -W-C-R abgeleitet wird,

   - 122 - 2 2 6 0 3 0

   worin W zweiwertiges Aminoacyl der folgenden allgemeinen Formeln ist:
   0

   (a) -C-A-NH-,

   worin A für C₁-C₁₀ Alkylen oder C₅-C- Cycloalkylen steht, O R⁷

   (b) -C-CH-NH-,

   worin R Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl oder substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl ist, deren Benzolring durch Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C-. Alkylcarbamyl substituiert ist,

   id ' -e—j--|-NH-

   worin X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C- Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkoxy, Mercapto, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C- Alkylcarbamyl bedeutet,

   II

   * / ^oder \ /

   I- · I-

   worin X Chlor, Brom oder iod ist.

   - 123 - 22 6 03 0

   NH

   ii T ft

   -NH-*. · oder ·κ ,· oder

   -C-B-/ N-NH-

   worin B einen zweiwertigen Rest der allgemeinen Formeln -(CH₂) -, worin η eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 1st, -CH=CH-, -CH=CH-CH₂- oder

   O
   -CNHCH₂- darstellt, und

   R für C^-C₁₇ Alkyl oder C₃-C₁₇ Alkenyl steht, dadurch gekennzeichnet, daß man einen cyclischen Peptidkern der allgemeinen Formel II

   * ' l'i ti —. .1 I H 1*1 If

   R²-CH_ -»—τ«

   Ο-·' Η ^0=β *^N

   ,1

   ••oh ^H S .,'I

   R'

   " H" β 4··0Η

   - 124 - 22 6 03 0

   mit einer N-Alkanoylaminosäure acyliert.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R 0 0

   für -C-A-NH-CR⁶ steht, worin A für C₁-C_1n Alkylen steht und

   6 I ι υ

   R geradkettiges C₁-C₁-, Alkyl ist.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß

   R für N- (n-DodecanoyD-5-amino-n-pentanoyl, N-(n-Dodecanoyl) 11-amino-n-hendecanoyl oder N-(n-Heptanoyl)-11-amino-nhendecanoyl steht.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ für

   steht, worin X Wasserstoff ist und R geradkettiges C..-C..., Alkyl bedeutet.
6. 6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß R für N- (n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoyl,· N-(n-Dodecanoyl)-m-aminobenzoyl, N-(Acetyl)-p-aminobenzoyl, N-(n-Heptanoyl)-p-aminofcenzoyl, N- (n-Decanoyl) -p-aminobenzoyl, N-.(n-Tetradecanoyl)-p-aminobenzoyl oder N-(n-Hexadecanoyl)-p-aminobenzoyl steht»
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für '

   -NH-CR⁶

   - 125 - 22 6 03

   steht, worin X Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C- Alkyl, Hydroxy, C₁-CL Alkoxy, Mercapto, C₁-C- Alkylthio, Carbamyl oder C,-C_ Alkylcarbamyl ist und R geradkettiges C₁-C- Alkyl bedeutet.
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß R

   für N- (n-Dodecanoyl) ^-amino^-hydroxybenzoyl, N- (n-Dodecanoyl) 3-amino-4-methylbenzoyl, N-(n-Dodecanoyl)^-amino-S-methylbenzoyl oder N- (n-Dodecanoyl) -3-amino-4~irLethoxybenzoyl steht.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R

   für N-(n-Dodecanoyl)-3-amino-2,5-dichlorbenzoyl, N-(n-Dodecanoyl) 4~amino-3,5-diiodbenzoyl, N-(n-Dodecanoyl)-p-aminophenyiacetyl, N-(n-Dodecanoyl)-p-aminocinnarnoyl, N-(n-Dodecanoyl)-p-aminohippuryl, N-(n-Dodecanoyl)-2-aminonicotinyl oder N-(n-Dodecanoyl)-phenylalanyl steht.