DD155431A5 - Verfahren zur herstellung von fruktose und fruktosesirup - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fruktose und Fruktosesirup.Ziel d. Erfindg. ist d. Verbesserung der enzymischen Isomerisation von Glukose.Erfindungsgemaess wird Glukose mit einem Isomeraseenzym in Kontakt gebracht,welches Mikroorganismen des Geschlechts Agrobakterium enthaelt,die durch die Symbole NRRL 11291 und NRRL B11394 gekennzeichnet sind.
Description
2 1 9 Ö 8 ^ - ^ " Berlin, den 5. 7» 1980
AP C 13 K/ 219 084 56 958 18
Verfahren zur Herstellung von Fruktose und Fruktosesirup
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung von Fruktose und Sirup von Fruktose und Glukose durch die Verwendung eines isomerisierenden Enzyms, wie es von Mikroorganismen des Agrobakteriengeschlechts erhal~ ten wird, und auf die Mittelt die zur Durchführung des Ver fahrens notwendig sind«
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Für die enzymische Isomerisation von Glukose in Fruktoae wird die Glukose-=Isomerase (D-Xylose-Ketol-Isomerase EC 5·3·1«5·) einer Glukoselösung zugesetzt, z« B0 Korn (Mais) Sirup, und die Reaktionsbedingungen werden so geregelt, daß ein Bruchteil der Glukose als Funktion der Konstante des. Gleichgewichts, die bei 60 0C 1,08 beträgt, in Fruktose umgewandelt vvirdo
Eine Anzahl vorheriger Entdeckungen beschreiben enzymische Verfahren für die Umwandlung von Glukose in Sirup, der durch die Verwendung der Aktivitäten von Mikroorganismen der Geschlechter Pseudornonas, Laktobazillen, Escherichia, Aero» bacter, Arthrobacter, Bazillusf Streptomyces u„ eae Glukose und Fruktose enthält.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens für die Herstellung Fruktose und Fruktosesirup,,
5. 7. 1980
AP C 13 K/ 219 084
219 08 4 _V-
c^ des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die. Aufgabe zugrunde, einen neuen Mikroorganismenstamm als Isomeraseenzym aufzufinden.
Erfindungsgemäß wird Fruktose und Fruktosesirup in der Weise hergestellt, daß als Isomeraseenzym Mikroorganismen des Geschlechts Agrobakterium angewandt werden, die durch die Symbole NRRL 11291 und NRRL 11394 gekennzeichnet sind6
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Mikroorganismen des Geschlechts Agrobakteriura, die bisher noch nicht beschrieben worden sind, in der Lage sind, ein isornerisierendes Enzym zu produzieren, das bei Aufzucht in einem entsprechenden Medium Glukose isomerisiertβ
Diese Mikroorganismen, die von landwirtschaftlichem Boden isoliert und mit den Zahlen 1302 - 1303 - 1304 - gekennzeichnet sindf besitzen die folgenden morphologischen und biochemischen Spezifikationen:
Einzeln, manchmal gepaart, stäbchenförmig, gramnegativ, 0,8 durch 1,5=2,0 Mikronen, keine Kapseln und Sporen, beweglich durch 4 bis S zu den Peritriden gehörig Flagallaten«
Kolonien auf Agar-Nährstoffboden (Divco): leicht an-gehobener, nicht gebrochener Rand,, cremefarben,
5. 7· 1980
AP C 13 K/ 219 084
219084 - 3 -
durchsichtig, 0,5 bis 1 mm Oberflächendurchmesser, glatt, höchste Wachstumsrate auf Kalziumglyzerophosphat Mannit-Nitrat Nährboden, mit brauner Verfärbung und Bildung eines Lichthofes«
Wachstum zwischen 4 0C und 39 0C unter jeglichen normalen Laborbedingungen, auch ohne Anwesenheit eines Wachstumsfaktors und ohne Aminosäuren, unter Benutzung von NH* NO" oder Aminosäuren als einzige Stickstoffquellee Oxidase: positiv (N0 Kovacs, 1956, Natur, Londen, 178, 703) Katalase: positiv (M, Levine, D. Qe Anderson, 1932, D. Bakt«
23, 337 - 347).·
Aus Nitraten hergestellte Nitrite (C. E. Zobell, 1932, O0 Bact«
24, 273)·
Nichthydrolisierter Tween 80 (G„ Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek 23{ 15 - 22)
Kasein, Gelatinec Zellulose, Stärke; Agar: nichthydrolisiert (Vc,B6De Skerrnan: Ein Führer zur Identifikation des Geschlechtes öer Bakterien, 2O Ausgabe, The Williams and Wilkins Book Cocf Baltimore, 1967).
Produzierte 3-Ketoglykoside (Me O* Bernaerts, 3e DeLey, 1963/ Natur 197, 406)·
Anilin Blau«Mannit»Nährboden: Wachstum mit Absorption des Farbstoffes (A. A* Hendrickson, Cl, L„ Baldwin, Ae De Riker, 1934, Da Bakt· 28, 597 ~ 618)
Lackusmilch: graubraun
Verwendung von Karbohydraten: Oxidative (Re Hugh, E* Leifsons 1953, de Bact* 66, 24 - 26)
Folgende Verbindungen werden bis zum Ende als einzelne Kohlenstoffquelle im Anbaurnedium benutzt, wie von Re Ye Sta~ nier beschrieben (R, Ye Stanier et al,, 1966, D. Gen« Mlkro-
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biol, 43, 159 ~ 271): D(-i-) Glykose, L(+) Arabinose, D( + ) Xylose, D(+-) trealose, D(-)Ribose, L( + )Rhamose, Laktose , Zellobiose, Maltose, Zitrate, Azetate, Laktate,>Propionate, L-aspartische Säure, L-Asparagin, L-Histidin, L-Alanin, !-«.Arginin 6
Infektivität in den Scheiben von Karottenvvurzeln (Oe A» Lippincott, B9 B. Lippincott, 1969, O. Gene Mikrobiol» 59, (1) 57 «75).
Tumore Wurzeln
1302 ^ ' ~ -
1303 1304 +
Vergleicht man diese Eigenschaften mit der in Bergey's Handbuch der Determinativen Bakteriologie, VIII» Ausgabe, gegebenen Beschreibung, gehören die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung zur Familie der Rhizobiaceaef Geschlecht Agrobakterium, Tumefaciens-Muster (1304)6 Die mit 1302 und 1304 gekennzeichneten Arten sind in dem Northern Regional Research Centre in Peoria, 111 (USA) gelagert worden, wo sie die Symbols NRRL B 11291 bzWo NRRL B 11394 zugewiesen bekommen haben a Die Kulturen derjenigen Mikroorganismen, die Teil dieser Erfindung sindf können nach jedem herkömmlichen Verfahren unter aerobischen Bedingungen hergestellt werden, ze Be in Oberflachenkulturen oder vorzugsweise in Unterwasserkulturon, unter Benutzung bewegter (gerührter) Ferment-Stoffe» Das für die Kulturen benutzte Medium, das entweder flüssig oder fest sein kann, enthält eine Quelle assimilierbaren Karbons, eine -Phosphorquelle, eine Stickstoff-= quelle und eine Quelle-Mineralsalze.
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Die Kulturen können bei einer Temperatur zwischen 20 und 40 0C, vorzugsweise zwischen 25 und 35 0C, in einer Zeit zwischen 10 und 48 Stunden, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Stunden, bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,5, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 aufgezogen werden» Als Karbonquellen können Glukose, Xylose, Laktose, Laktate{ Azetate, Glycerol benutzt werden»
Ein entsprechendes Kulturmedium hat, beispielsweise folgende Zusammensetzung:
Glukose 10 g/l (Gramm pro Liter)
Xylose 5 "
KH2PO4 1 "
MgSO4 β 7H2O 1 "
NH4Cl 2 "
pH 7,0 ~ 7,2
Die Extraktion der Glukoseisomerase aus der Masse dor Bakterien wird mit den allgemeinen in der Enzymologie angewandten Verfahren durchgeführt«
Zu diesem Zweck werden die Zellen disintegriert mit speziell für diesen Zweck zur Verfugung gestellten Maschinen, wie Ze Bo die französische Druck-Zellenpresse, der Manton Gaulin Homogenisator, Rotationsintegratoren und auch Ultra« sonische Gerätee
Das Enzym kann gleichermaßen zufriedenstellend extrahiert werden aus azetonischen Pudern (Staub) und aus gefriergetrockneten Präparaten«
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Die Glukoseisomerase, die von den mikrobialen Arten, die Gegenstand dieser Erfindung sind, erhalten werden, wird durch eine gute Hitzebeständigkeit charakterisiert« Die Isomerisation der Glukose kann nach dem herkömmlichen Verfahren stattfinden. DieGlukoselösung kann einer Mikroorganismenkultur direkt zugesetzt werden, das heißt zu frischen Zellen, aber auch gefrorenen Zellen, azetonischem Puder oder gefriergetrockneten Zellen«
Es ist gleichermaßen möglich, Präparate zu benutzen, die Isomeräse und deren Extrakte und Konzentrate enthalten, Präparate aus roher und gereinigter Isomerase, sowie solche, die von den oben erwähnten Mikroorganismen erhalten werden« Letztendlich kann durch die Immobilisierung der Enzyme durch Kombination dieser Enzyme mit makromolekularen Verbindungen durch die Kombination chemischer Verbindungen mit dem Substrat, oder durch Bindungen ionischer Typs oder durch physikalische Immobilisation, eine technische und ökonomische Verbesserung erzielt werden«
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Ausführungsbei« spielen näher erläuterte
Die folgenden Beispiele erläutern andere Details bezüglich der vorliegenden Erfindung, aber sie stellen keine Einschränkung derselben dar«
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219 0 8 4 _ 7.
| Ein Kulturboden | worden | 4 | mit | • | 5 | der folgenden Zusammensetzung ist her- | It | ti |
| gestellt | 7H2O | 5 | Il | |||||
| Glukose | 7H2O | 13 | g/i | Il · | ||||
| Xylose | 6H2O | 2 | ||||||
| KH2PO4 | 5H2O | O1 | U ' | |||||
| (NH4)2S0 | 7H2O | 10 | ||||||
| MgSO4 . | 5H2O | 40 | 4 " | |||||
| FeSO4 . | 6H2O | 5 | mg/1 (Milligramm pro Liter) | |||||
| CaCl2 "* | 5 | If | ||||||
| MHSO4 . | 1 | |||||||
| ZnSO4 , | 1 | |||||||
| CuSO4 c | ||||||||
| COCl2 . |
Der pH Wert wurde auf 7,2 eingestellt mit NaOH und der Kulturboden wurde in 100 ml Portionen in 500 ml Erlenmeyerkolben aufgeteilt» Nach einer 30minütigen Sterilisation bei 110 0C wurden die Kolben mit einer Kultur der Art 1304 und Teilen, die den gleichen Kulturboden mit 2 % Nährboden (DIFCI) enthalten versetzt, und für 24 Stunden bei 30 0C bei kreisförmigem Rühren bei 220 rpm stehen gelassen«
Die Zellen wurden dann mit einer Zentrifuge zusammengefaßt und mit einem Puffer gewaschen bestehend aus/Na^SO-, 0,1 molar pH = 7, lf10"4 raol von CQ+* und 5 · 10~3 mol MG++). Aus 100 ml Nährlösung wurden 2 g feuchter Zellen erhalten« Die Zellen wurden in 20 ml des ob.en erwähnten Puffere getrocknet und die Zellenaufschlämraung wurde durch die französische Zellpresse gegeben, um die Zellen zu brechen.
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In dem so erhaltenen Extrakt wurde die enzymische Aktivität bestimmt«
Die Reakti-onsmischung enthält:
4,5 ml Substratlösung (D-Glykose 3*67 molar, Mg+* 5*10~3 Mol,
Co+"5" 10~4 Mol und Na3SO3 0,1 Mol in deionisiertem Wasser, pH 7,0, 0,5 ml Rohextrakt wurden zugesetzt«, Die Inkubation wurde 2 Stunden lang in einem Dampfbad durchgeführte DieReaktion wurde dadurch abgebrochen, daß die Mischung auf O 0C abgekühlt wurde« Die optischen Rotationen der Probe (2 Stunden) und die der Originalprobe ( O) wurden bei Zimmertemperatur mit einem Perkins=«Elmer Polarimeter 141, Na~Linie (549 Nanometer), optischer Weg* der Küvette 0,1 dm gemessen»
Wenn wir denjenigen Teil des Enzyms, der in einer Stunde 1 mg Fruktose unter den o„ge Testbedingungen produziert, als Snamprogetti-Einheit definieren, kann die Einheit der Enzyme pro Gramm der feuchten Zellen nach der folgenden Formel berechnet werden:
Einheit pro Gramm der feuchten Zellen = J^L^JLJlJLÜS-Ül0n
( glue)- Frukte)x
. )=+54,1.6 x.0,1 χ C χ 0,5x2
C =·. Konzentration in g Glukose pro ml der Lösung 0,1 = optischer Weg in dm
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JeI 2
Nährböden der Art N 1304 werden wie in Beispiel 1 erläutert, hergestellt«
Aus 500 ml Nährlösung wurden 10f2 g feuchter Zellen erhalten, diese wurden in 40 ml Puffer aufgeschlärnmt (Na^SO, 0,1
molar, pH 7) und bei -10 0C unter Rühren 200 ml Azeton zugesetzt· Nach iSminütiger Behandlung wurden die Zellen auf einem Papierfilter zusammengefaßt, mit Azeton gewaschen und bei Zimmertemperatur in einem Vakuum getrocknete So wurden 1,9 g getrockneter Zellen erhalten« Die Aktivität eines Gramms azetonischen Puders betrug so 2,200 Einheiten«,
Zellen öer Art Noβ 1304 wurdenwie unter Beispiel 1 erläutert, hergestellt und wie in Beispiel 2 mit Azeton behandelt»
Die mit Azeton behandelten Zellen wurden zur Bestimmung des Prozentsatzes der Glukoseisomerisation als Funktion der Zeit in der Reaktionsmischung verwendetβ Die Testbedingungen waren wie folgt:
a) Mit Azeton behandelte Zellen: 10 g
b) Substratvolutnen: 1 Liter
c) Reaktionstemperatur: 60 C
Das Substrat hatte folgende Zusammensetzung: Glukose 60 % (Gewicht/Volumen, MG**: 5 Milliraol, CO*+: 0,1 Milliraol) Na2SO3: 100 Millimol - pH 7,0. Der Prozentsatz άβν Isomerisation war wie folgt:
• · - 10 -
| .2Ii | 3084 | - 10 - |
| Zeit, Stunden | Konversion | |
| 3 | 12.5 | |
| 6 | 20,8 | |
| 9 | 27,8 | |
| 12 | 32,3 | |
| 15 | 37,7 | |
| 18 | 40,6 | |
| 23 | 44,8 | |
| Beispiel 4 |
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Nährlösungen der Arten 1302 und 1303 und die entsprechenden Zellextrakte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt» Aus 100 ml Nährlösung wurden 1,72 bzw, 1,85 g feuchter Zellen erhalten«,
Die Aktivität pro Gramm feuchter Zellen war412 Einheiten für Art 1302 und 476 Einheiten für die Art 1303»
- 11 -
Claims (1)
- AP C 13' K /219 084 56 958 1819ErfindungsanepruchVerfahren für die Herstellung von Fruktose und fruktosehaltigen Sirupen, gekennzeichnet dadurch, daß Glukose mit einem Isomerenenzym in Kontakt gebracht wird, welches von den Mikroorganismen des Geschlechts Agrobakterium, die durch die Symbole NREL 11291 und HEEL.B 11394 identifziert sind, erhalten wird.
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