DE3884295T2

DE3884295T2 - Säure-Urease und ihre Herstellung.

Info

Publication number: DE3884295T2
Application number: DE88305854T
Authority: DE
Inventors: Shigeya Kakimoto; Yasuhiro Sumino; Takashi Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Kirin Food Tech Co Ltd
Priority date: 1987-07-09
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2008-06-29
Also published as: BG48218A3; EP0298641B1; PT87941B; HUT47316A; MX173764B; KR890002391A; AU615661B2; ES2058287T3; KR960014702B1; PT87941A; DE3884295D1; NZ225225A; EP0298641A3; AU1871688A; BR8803412A; US5093255A; MX12205A; EP0298641A2; CN1036405A; CN1037617C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Urease, welche als ein Enzym zur Qualitätsverbesserung von alkoholischen Getränken oder zur Harnstoffbestimmung bei klinischen Laboruntersuchungen oder in der Nahrung von Nutzen ist.
Urease (E. C. 3. 5. 1. 5) ist das Enzym, welches Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxidgas zersetzt, und ist im Naturreich, welches Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen umfaßt, weit verbreitet. Außer den Ureasen aus Canavalia Adans (Schwertbohnen) und Bacillus pasteurii, welche gewerblich hergestellt und verwendet werden, ist ferner die Urease mit einem Molekulargewicht von etwa 440000, welche von den Bakterienstämmen Corynebacterium lilium, Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter paraffineus, Proteus vulgaris, Microbacterium ammoniaphilum oder Bordetella bronchiseptica (japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-55119) erzeugt wird, die von Bacillus sp. UR-155 [japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (KOKAI) 59-17987] erzeugte Urease mit einem Molekulargewicht von etwa 440000 und die von Pseudomonas aeruginosa und Nocardia erythropolis [japanische ungeprüfte Patentanmeldung (KOKAI) 61-257183] erzeugte Urease mit einem Molekulargewicht von etwa 280000 bekannt.
Alle vorgenannten Ureasen besitzen optimale pH-Werte der Reaktion im neutralen bis alkalischen Bereich und sind im sauren Bereich nicht nur labil und neigen dazu, desaktiviert zu werden, sondern gehen nur unter Schwierigkeiten eine Reaktion ein. Insbesondere wenn die Reaktionstemperatur über Raumtemperatur liegt oder in einem Reaktionssystem, welches ein organisches Lösungsmittel wie etwa Alkohol enthält, zeigen diese Ureasen den Nachteil einer beträchtlichen Desaktivierung.
Die gegenwärtigen Erfinder unternahmen eine eingehende Überprüfungsuntersuchung zum Auffinden eines Mikroorganismus, welcher zum Produzieren einer Urease befähigt ist, welche einen optimalen pH im sauren Bereich besitzt und sehr stabil ist, und fanden, daß ein zur Gattung Lactobacillus und Streptococcus gehörender Stamm die gewünschte Urease innerhalb dieser Zellen anreichert. Die Erfinder isolierten und reinigten daraufhin ihr Enzym, führten eine weitere Untersuchung durch und gelangten zur vorliegenden Erfindung.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher, eine neue Urease mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften und mit einem optimalen pH im sauren Bereich bereitzustellen (nachstehend kurz als die saure Urease bezeichnet):

(1) Wirkung

Sie produziert 2 Mol Ammoniak und 1 Mol Kohlendioxidgas aus 1 Mol Harnstoff und 1 Mol Wasser.

(2) Substratspezifität

Sie wirkt am stärksten auf Harnstoff.

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Ihr optimaler pH ist 1,5 bis 5,5; sie ist bei pH 6-8 30 Minuten bei 37ºC stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Ihre optimale Temperatur beim optimalen pH ist 55º bis 75ºC; bei pH 6 bleibt sie 30 Minuten bis zu 50 ºC stabil.

(5) Hemmer

Sie wird von Quecksilber(II)-chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt.

(6) Molekulargewicht

Ihr durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht ist 100000 bis 250000.

(7) Spezifische Aktivität

Ihre spezifische Aktivität beim optimalen pH und 37ºC beträgt nicht weniger als 20 E/mg Protein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen einer sauren Urease durch Kultivieren eines Mikroorganismus, welcher zur Gattung Lactobacillus oder Streptococcus gehört, in einem Kulturmedium bereitzustellen. Als Mikroorganismus, welcher beim Herstellen der sauren Urease dieser Erfindung verwendet wird, können die neuen, Urease produzierenden Stämme der Gattung Lactobacillus oder Streptococcus angeführt werden. Insbesondere können als Beispiele Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM P-8990), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (IFO 14512, FERM P-8991), Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14513, FERM P-8992), Lactobacillus reuteri UM-12 (IFO 14629, FERM P-9456), Lactobacillus reuteri UM-18 (IFO 14630, FERM P-9457), Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14631, FERM P-9458), Lactobacillus ruminis PG-98 (IFO 14632, FERM P-9459), Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14633, FERM P- 9460), Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14634, FERM P-9461) und Streptococcus salivarius PG-303W (IFO 14746) angeführt werden. Die vorstehend angeführten IFO-Nummern sind Hinterlegungsnummern beim Fermentationsinstitut, Osaka (IFO) 17-85, Juso-honmachi 2- chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, und die FERM P-Nummern sind Hinterlegungsnummern beim Fermentationsforschungsinstitut (FRI), Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan.
Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (IFO 14512) und Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14513) sind bekannte, in vom IFO herausgegebenen Forschungsmitteilungen (Nr. 13, Seite 94, 1987) aufgeführte Stämme.
Diese Mikroorganismen, welche beim FRI am Datum der nachfolgenden Tabelle hinterlegt wurden, sind in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag überführt worden und werden beim FRI unter den in der folgenden Tabelle gezeigten FERM BP-Zugangsnummern aufbewahrt. Mikroorganismus Datum der Hinterlegung beim FRI Zugangsnummer unter dem Budapester Vertrag Lactobacillus fermentum Lactobacillus reuteri Lactobacillus ruminis Streptococcus mitior Streptococcus bovis Oktober 1986 Juli 1987
Der Stamm PG-303W ist beim FRI am 14. April 1988 als FERM BP- 1856 hinterlegt worden.
Die bakteriologischen Merkmale von Lactobacillus reuteri UM-12, Lactobacillus reuteri UM-18, Lactobacillus reuteri Rt-5 und Lactobacillus ruminis PG-98 werden nachstehend beschrieben. Stamm Herkunft Zellmorphologie Beweglichkeit Sporenbildung Gram-Farbüng Sauerstoffbedarf Oxidationsfermentationstest Fermentationstyp Katalase Oxidase Nitratreduktion Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Äsculin-Zersetzung Test Indolproduktion Schwefelwasserstoff-Produktion NH&sub3;-Produktion aus Arginin Lackmusmilch Gaserzeugung aus Glukose Mäusekot kurze Stäbchen mikroaerophil fermentativ heterofermentativ DL-Milchsäure produzierte Säure Rattenkot Stamm optimale Wachstumstemperatur ºC Wachstum bei ºC Wachstum bei pH Wachstum in Gegenwart von % NaCl Säureproduktion Adonit Arabinose Arabit Arbutin Cellobiose Dulcit Fructose Galactose Gluconat Glucose Glycerin Inosit Inulin Lactose Maltose Mannit Stamm Mannose Melezitose Melibiose α-Methylglucosid Raffinose Rhamnose Ribose Salicin Sorbit Sorbose Stärke Sucrose Trehalose Xylose Xylit Auxotrophie Niacin Thiamin Cholinchlorid Riboflavin Ca-Pantothenat Pyridoxal Folsäure GC-Gehalt (%) an DNA Peptidoglycan-Typ (schwach)
Die bakteriologischen Merkmale von Lactobacillus ruminis PG-98 sind wie folgt:
Herkunft Schweineblinddarm
Zellmorphologie kurze Stäbchen (0,6-0,8 x 1,0-15)
Beweglichkeit -
Sporenbildung -
Gram-Färbung +
Sauerstoffbedarf mikroaerophil
Oxidations-Fermentationstest fermentativ
Fermentationstyp Homo-L-milchsäure
Katalase -
Oxidase -
Nitratreduktion -
Gelatineverflüssigung -
Stärkehydrolyse + (schwach)
Äsculin-Zersetzung +
MR-Test + (schwach)
VP-Test -
Indolproduktion -
Schwefelwasserstoffproduktion -
NH&sub3;-Produktion aus Arginin -
Lackmus-Milch keine Änderung
Gaserzeugung aus Glucose -
optimale Wachstumstemperatur, ºC 30-37
Wachstum bei 45ºC -
Wachstum bei 15ºC -
Wachstum bei pH 4,0 -
Wachstum bei pH 9,6 -
Wachstum in Anwesenheit von 3% NaCl -
Wachstum in Anwesenheit von 6,5% NaCl -
α-Hämolyse -
β-Hämolyse -
Säureproduktion
Adonit -
Arabinose -
Arabit -
Arbutin -
Cellobiose +
Dulcit -
Fructose +
Galactose +
Gluconat -
Glucose +
Glycerin -
Inosit -
Inulin -
Lactose -
Maltose +
Mannit -
Mannose +
Melezitose -
Melibiose -
α-Methylglucosid -
Raffinose +
Rhamnose -
Ribose -
Salicin +
Sorbit -
Sorbose -
Stärke +
Sucrose +
Trehalose -
Xylose -
Xylit -
GC-Gehalt (%) an DNA 45,6
Peptidoglycan-Typ m-DAP Ala Glu
Die bakteriologischen Merkmale der Stämme PG-154, PG-186 und PG-303 W werden nachstehend beschrieben. Stämme Eigenschaften Herkunft Zellgestalt Beweglichkeit Sporenbildung Gram-Färbung Sauerstoffbedarf Oxidations-Fermentationstest Fermentationstyp Katalase Oxidase Stickstoffreduktion Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Äsculin-Zersetzung Test Schweinedünndarm Coccus fakultativ anaerob fermentativ Homo-L-milchsäure + (schwach) Schweinedickdarm Schweinezwölffingerdarm Stämme Eigenschaften Indolbindung NH&sub3;-Bildung aus Arginin Lackmusmilch Gasbildung aus Glucose optimale Wachstumstemperatur (ºC) Wachstum bei ºC Wachstum bei pH Wachstum in 4% wäßriger Natriumchloridlösung Wachstum in 6,5%iger wäßriger Natriumchloridlösung. Wachstum in 40% Galle-Agar mukoides Wachstum (Sucrosemedium) α-Hämolyse β-Hämolyse Säurebildung Adonit Arabinose Arbutin Cellobiose Fructose Galactose Gluconat produzierte Säure (schwach) + (schwach) Stämme Eigenschaften Glucose Glycerin Inosit Inulin Lactose Maltose Mannit Mannose Melezitose Melibiose Raffinose Rhamnose Ribose Salicin Sorbit Sucrose Trehalose Xylose Xylit GC-Gehalt (%) an DNA
In der vorstehenden Tabelle bedeuten Lys, Asp, Ala, Glu, Orn, Ser und m-DAP Lysin, Asparaginsäure, Alanin, Glutaminsäure, Ornithin, Serin beziehungsweise meso-Diaminopimelinsäure. Das Symbol "ND" bedeutet, daß Untersuchungen nicht durchgeführt wurden. Das zu Rate ziehen von Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2 (1986) zur taxonomischen Klassifizierung der Stämme auf der Grundlage der vorstehenden bakteriologischen Merkmale legte nahe, daß der UM-12-, UM-18- und Rt-5-Stamm in entsprechender Weise Lactobacillus reuteri zugeordnet werden kann, obgleich sie leichte Unterschiede zu den Literaturmerkmalen zeigten: der UM-18- und Rt-5-Stamm war bei der Säureproduktion aus Arabinose, Fructose und Ribose negativ (Rt-5 war jedoch bei der Säureproduktion aus Ribosen schwach positiv). Da übrigens UM-12 und Rt-5 von einander nur in der Wachstumstemperatur und Auxotrophie unterschiedlich sind, werden sie als gemeinsame Varianten angesehen. Die Merkmale des PG-98-Stamms sind im wesentlichen mit denjenigen von Lactobacillus rumines identisch. Weiter ist es richtig, daß, obgleich die α-Hämolyse negativ ist, der PG-154-Stamm derjenige von Streptococcus mitior ist, der PG- 186-Stamm, obgleich die Äsculinhydrolyse negativ ist, derjenige von Streptococcus bovis ist und der PG-303 W-Stamm derjenige von Streptococcus salivarius ist.
Die Kultivierung dieser Bakterienstämme zur Anreicherung von saurer Urease kann durch das übliche Verfahren einer stationären Kultur, Schüttelkultur, submersen aeroben Kultur oder Feststoffkultur entweder kontinuierlich oder auf absatzweiser Grundlage durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist die stationäre Kultur. Das Kulturmedium kann ein übliches Wachstumsmedium für Mikroorganismen sein. Als Kohlenstoffquellen können eine oder mehrere Substanzen verwendet werden, welche der zu züchtende Stamm assimilieren kann und welche aus verschiedenen Kohlenhydraten, Ölen und Fetten, Fettsäuren, organischen Säuren, Alkoholen und so weiter ausgewählt sein können. Als stickstoffquellen können organische, stickstoffhaltige Materialien, wie etwa Pepton, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Molke usw. und anorganische, Stickstoffverbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw. eingesetzt werden. Diese Quellen können nach Bedarf allein oder in Kombination verwendet werden. Außer derartigen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält das Medium vorzugsweise essentielle Faktoren und Promotoren, wie etwa Mineralien, Aminosäuren, Vitamine usw. zum Wachstum und zur Enzyminduktion. Außerdem können in einigen Fällen Harnstoff und Thioharnstoff zur Induktion der sauren Urease zugesetzt werden. Zur Kontrolle des pH und des Schäumens während der Kultur kann sich der Zusatz von Ätzalkalilösung, Natriumcarbonatlösung oder einer Calciumsalzlösung als vorteilhaft erweisen.
Als Inkubationstemperatur kann eine für das Wachstum des Stamms geeignete Temperatur ausgewählt werden. Üblicherweise kann die Kultur mit Erfolg bei 15 bis 55ºC und vorzugsweise bei 25 bis 45ºC ausgeführt werden. Die Inkubationszeit sollte für das Wachstum des Organismus und die Produktion saurer Urease ausreichend sein und reicht im allgemeinen von 5 bis 120 Stunden.
Nach der Kultivierung unter den vorstehenden Bedingungen, wird im allgemeinen festgestellt, daß die saure Urease in den Zellen des Mikroorganismus auftritt. Daher werden die aus der Kulturbrühe durch Zentrifugation, Sedimentation, Ausflocken oder Filtration durch eine poröse, polymere oder keramische Membrane gesammelten lebenden Zellen einer Gefrier-Tau-Behandlung, Homogenisierungsbehandlung, Ultraschallspaltung, osmotischer Druckbehandlung, Zellwandmembranlysis, Tensidbehandlung usw. oder einer Kombination unterzogen. Das auf diese Weise in Lösung gebrachte Enzym wird anschließend einer geeigneten Kombination üblicher Enzymreinigungsverfahren, wie etwa Protamin-Behandlung, fraktionierende Fällung, Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, isoelektrische Fokussierung, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Kristallisation und so weiter unterzogen, um ein Enzymprodukt zu ergeben, welches als Protein homogen ist.

Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität

Die in dieser Beschreibung angeführten Werte der Ureaseaktivität wurden durch das folgende Verfahren bei 37ºC und pH 4,0 bestimmt. Zwei Milliliter einer geeigneten Verdünnung der Enzymlösung wurden genau 5 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Dieser Enzymverdünnung wurden 2 ml der auf 37ºC vorgewärmten Substratlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde geschüttelt und die Reaktion wurde genau 30 Minuten bei 37ºC ausgeführt. Nach der Reaktion wurden sofort 4 ml 10%ige Trichloressigsäure zugesetzt und das Gemisch wurde zentrifugiert (8000 Upm, 5 min). Der Überstand (2 ml) wurde abgenommen und mit Wasser auf 20 ml aufgefüllt. Einer 4 ml-Portion der Lösung wurden 2 ml Farbreagenz A-Lösung zugesetzt, gefolgt von mäßigem Mischen. Anschließend wurden 2 ml Farbreagenz B-Lösung zugesetzt, erneut gefolgt von mäßigem Mischen, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC ausgeführt. Anschließend wurde bei Raumtemperatur die Absorption bei 640 nm mittels Wasser als Kontrolle bestimmt.
Daneben wurden 2 ml der vorstehenden Enzymverdünnung mit 2 ml 0,2 M Citratpuffer anstelle der Substratlösung geschüttelt und die Reaktion wurde genau 30 Minuten bei 37 ºC ausgeführt. Das sich daraus ergebende Reaktionsgemisch wurde zu einem Enzymblindtest demselben Verfahren wie vorstehend unterzogen.
Außerdem wurden 2 ml Ammoniumsulfat-Standardlösung (50 ug/ml), 1 ml 10%ige Trichloressigsäure und 0,5 ml 0,2 M Citratpuffer hergenommen und mit Wasser auf 20 ml verdünnt und die sich daraus ergebende Lösung wurde demselben Farbentwicklungsverfahren wie vorstehend unterzogen, um eine Standardlösung zu ergeben. Daneben wurden 1 ml 10%ige Trichloressigsäure und 0,5 ml 0,2 M Citratpuffer genommen und mit Wasser auf 20 ml verdünnt und die Verdünnung wurde zu einem Standardblindtest demselben Verfahren wie vorstehend unterzogen.
Die Enzymaktivität wurde mittels der folgenden Gleichung berechnet.
Enzymaktivität (E/mg) = OD der Enzymlösung - OD der Enzymblindprobe/OD der Standardlösung - OD der Standardblindprobe
x 0,76 x 4 x Verdünnungsfaktor/Enzymmenge (mg) x 1/30
Die Enzymmenge, welche 1 uMol NH&sub3; je Minute erzeugt, wird als Einheit (1 E) angenommen. Die bei den vorstehenden Bestimmungsmethoden verwendeten Reagenzien und Testlösungen wurden wie folgt hergestellt. Die Substratlösung wurde durch Auflösen von 1,0 g Harnstoff in 0,2 M Citratpuffer auf 100 ml hergestellt. Die 10%ige Trichloressigsäurelösung wurde durch Lösen von 10 g Trichloressigsäure in Wasser auf 100 ml hergestellt. Die Farbreagenz A-Lösung (Phenol-Nitroprussidnatrium-Lösung) wurde durch Auflösen von 5 g Phenol und 25 mg Nitroprussidnatrium in Wasser auf 500 ml hergestellt. Die Farbreagenz B-Lösung (alkalische Natriumhypochloritlösung) wurde durch Auflösen von 5,0 g Natriumhydroxid und 7,5 ml Natriumhypochloritlösung (Konzentration an wirksamem Chlor 5%) in Wasser zu 500 ml hergestellt. Der 0,2 M Citratpuffer wurde durch Auflösen von 25,18 g Citronensäure (Monohydrat) und 23,59 g Natriumcitrat (Dihydrat) in Wasser auf 1000 ml (pH 4,0) hergestellt. Die Ammoniumsulfat-Standardlösung (50 ug/ml) wurde durch Abwiegen von genau 250,0 mg Ammoniumsulfat, Lösen in Wasser auf 250 ml und Verdünnen von 5 ml der Lösung mit Wasser auf 100 ml hergestellt.
Anders als herkömmliche Urease besitzt die neue Urease gemäß dieser Erfindung einen optimalen pH für die Aktivität im sauren Bereich. Darüberhinaus ist sie der herkömmlichen Urease in der pH-Stabilität, Temperaturstabilität und Alkoholstabilität überlegen. Daher ist die Urease dieser Erfindung ein gewerblich nützlicheres Enzym. Insbesondere besitzt diese Urease eine spezifische Aktivität über 20 E/mg Protein und ist daher aktiv genug, um in verringerter Menge Harnstoff aus alkoholischen Getränken (japanische Patentanmeldung Nr. 179738/1987 = EP-A1-0- 266088) zu zersetzen und zu entfernen und ist auf diese Weise für den Zweck der Qualtitätsverbesserung derartiger Produkte von Nutzen. Daneben ist diese Urease als Reagenz zur Harnstoffbestimmung in Blut- und Urinproben bei klinischen Laboruntersuchungen oder in alkoholischen Getränken (japanische Patentanmeldung Nr. 171751/1987) und anderen Anwendungen sehr wirkungsvoll. Die Harnstoffbestimmung in Sake kann zum Beispiel mit hoher Genauigkeit durch Zersetzen des Harnstoffs mit diesem Enzym zu Ammoniak und Anwenden der Indophenol-Methode durchgeführt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1, 2, 3 und 4 zeigen die Beziehungen von pH und Temperatur mit der Enzymaktivität der Urease gemäß Beispiel 1.
In Fig. 1, welche eine bei 37ºC bestimmte pH-Aktivitätskurve zeigt, bedeuten , o und x die Ergebnisse der Bestimmung in 0,1 M Citratpuffer, 0,1 M Acetatpuffer beziehungsweise 0,1 M Veronal-Essigsäure-HCl-Puffer.
Fig. 2, welche die pH-Stabilität des Enzyms zeigt, gibt die Restaktivitäten nach 30 Minuten bei 37ºC an.
Fig. 3 zeigt die Temperatur-Aktivitätskurve in 0,1 M Citratpuffer mit pH 4
Fig. 4, welche die Temperaturstabilität des Enzyms zeigt, gibt die Restaktivitäten nach 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen an; o steht für pH 4 und für pH 6 in 0,1 M Citratpuffer.
Fig. 5 bis 8, Fig. 9 bis 12, Fig. 13 bis 16, Fig. 17 bis 20, Fig. 21 bis 24, Fig. 25 bis 29 und Fig. 29 bis 32 zeigen die Beziehungen von pH und Temperatur mit der Enzymaktivität der Urease gemäß Beispiel 2, 3, 4, 5, 6, 7 beziehungsweise 8. Die Experimente von Fig. 5 bis 32, ausgenommen die Tests der pH-Stabilität, wurden unter Verwenden von 0,1 M Citratpuffer durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung in weiteren Einzelheiten zu veranschaulichen und sollten keinesfalls als den Umfang der Erfindung begrenzend ausgelegt werden.

Beispiel 1

In einem handelsüblichen, halbflüssigen GAM-Medium (Nissui Seiyaku Co. Ltd., Japan) gezüchteter Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14631, FERM BP-1447) wurde in 10 Erlenmeyerkolben (200 ml Fassungsvermögen) eingeimpft, welche jeweils 50 ml eines sterilisierten Anzuchtkulturmediums enthielten, das aus 3% Glucose, 1,5% Polypepton, 1% Fleischextrakt, 0,8% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% wasserfreiem Natriumacetat, 0,005% Mangansulfat (etwa 4 H&sub2;O) und 0,001% Nickelsulfat (6 H&sub2;O) zusammengesetzt war (pH 7,0, neutralisiert mit 30% NaOH). Die Kolben wurden unter stationären Bedingungen 24 Stunden bei 34ºC inkubiert. Die auf diese Weise hergestellten Anzuchtkulturen wurden in 10 Erlenmeyerkolben (2 l Fassungsvermögen) überführt, welche jeweils 1 l eines sterilisierten Mediums derselben Zusammensetzung wie vorstehend enthielten und die Inkubation wurde 2 Tage unter stationären Bedingungen bei 32ºC durchgeführt. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 21,6 E/ml saure Urease-Aktivität zeigte.
Die vorstehende Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen, welche zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen und in 4 l einer 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2), 1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit enthaltenden Lösung suspendiert wurden. Nach dem Zusatz von 2 l Glasperlen, welche im Durchmesser von 0,1 bis 0,2 mm reichten, wurde die Zellsuspension 20 Minuten bei 4500 Upm mechanisch aufgebrochen. Die Suspension aufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und dem Überstand wurde Ethanol in einer Endkonzentration von 80% zugesetzt. Der Bodensatz wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), welcher 1 mM EDTA und 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Die Lösung wurde auf eine sephadex G- 100-Säule (7,5 cm Durchm. x 90 cm lang) zur Adsorption aufgebracht und die Elution wurde mit derselben Pufferlösung durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Dieses Eluat wurde auf eine Sephadex G-200-Säule (4,5 cm Durchm. x 150 cm lang) zur Adsorption aufgebracht, welche mit demselben Puffer äquilibriert worden war, und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Die wirksamen Fraktionen wurden zusammengefaßt und weiter auf eine DEAE-Sephadex CL-6B-Säule zur Adsorption aufgebracht, wobei die Elution durch das Gradientenelutionsverfahren mittels derselben Pufferlösung durchgeführt wurde, welche 0 bis 0,7 M Natriumchlorid enthielt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Diese Lösung wurde in einem Ultrafilter mit einer Amicon 8200 UK-50 Membrane (Grenzmolekulargewicht 50000) eingeengt. Der Puffer wurde in 1 mM 2-Mercaptoethanol enthaltenden 0,005 M Phosphatpuffer (pH 7,0) geändert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Affinitätsgelchromatographiesäule (4 cm Durchm. x 50 cm lang) aufgebracht, welche unter Verwendung von Affiprep 10 (dem Produkt von Bio-Rad) und Hydroxyharnstoff zur Adsorption hergestellt worden war, und die Gradientenelution wurde mittels 0,005 M - 0.044 M Phosphatpuffer durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt und mittels desselben Ultrafilters wie vorstehend angeführt eingeengt, gefolgt von fraktionierender Fällung und Lyophilisierung unter Ergeben von 104 mg gereinigtem Enzympulver. Dieses Enzympulver besaß eine spezifische Aktivität von 336,5 E/mg Protein und zeigte eine einzige Proteinbande in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Der Verlauf der Reinigung wird in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Reinigungsschritte Gesamtprotein Gesamtaktivität (x 10³E) spezifische Aktivität (E/mg Protein) Ausbeute (%) zellfreier Extrakt Ethanol Sephadex DEAE-Sepharose Affinitätsgel Lyophilisat
Die enzymchemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des durch das vorstehende Verfahren erhaltenen lyophilisierten sauren Enzyms werden nachstehend gezeigt.

Saure Urease A

(1) Wirkung

Das Enzym produziert 2 Mol Ammoniak und 1 Mol Kohlendioxidgas aus 1 Mol Harnstoff und 1 Mol Wasser.

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in gewissem Ausmaß auf Ethylharnstoff, Biuret, Methylharnstoff, Allantoinsäure und Allantoin (Tabelle 2). Tabelle 2 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoin Allantoinsäure Biuret Methylharnstoff Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 1 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 2 bis 4,5. Fig. 2 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 6-8 stabil und ist im Bereich von pH 2-10 mäßig stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 3 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 60-70ºC. Fig. 4 zeigt die Restaktivitäten, nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 4 und pH 6 und bei unterschiedlichen Temperaturen hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 60ºC stabil und ist bei pH 4 bis zu 60ºC mäßig stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 3 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid, Silbernitrat, Iodessigsäure und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 3 Hemmer Konzentation relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 220000.

(7) Isoelektrischer Punkt

Wie durch isoelektrische Fokussierung an Polyacrylamidgel bestimmt, zeigt das Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,7.

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 1,7 mM (pH 4, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 2

Eine auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhaltene Anzuchtkultur von Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP- 1454) wurde in 10 Erlenmeyerkolben (2 l Fassungsvermögen), welche jeweils 1 l sterilisiertes Medium enthielten, welches aus 4% Glucose, 1,5% Polypepton, 1% Fleischextrakt, 0,8% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% wasserfreiem Natriumacetat, 0,5% Harnstoff, 0,05% Mangansulfat (etwa 4H&sub2;O), 0,002% Nickelsulfat (6H&sub2;O), 0,002% Kobaltsulfat (7H&sub2;O), 0,005% Zinnsulfat und 0,001% Strontiumsulfat (pH 7,0, mit 30%igem NaOH eingestellt) zusammengesetzt war, eingeimpft und die stationäre Kultur wurde 2 Tage bei 32ºC ausgeführt. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 5,6 E/ml saure Urease-Aktivität zeigte.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren der vorstehenden Brühe gesammelt, zwei Mal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen und in 4 l einer 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2), 1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit enthaltenden Lösung suspendiert. Nach dem Zusatz von 2 l Glasperlen, welche im Durchmesser von 0,1 bis 0,2 mm reichten, wurde die Zellsuspension 20 Minuten bei 4500 Upm mechanisch aufgebrochen. Die Suspension aufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und dem Überstand wurde Ethanol in einer Endkonzentration von 80% zugesetzt. Der Bodensatz wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), welcher 1 mM EDTA und 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Die Lösung wurde auf eine Sephadex G-100-Säule (7,5 cm Durchm. x 90 cm lang) zur Adsorption aufgebracht und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt und auf eine Sephadex G-200-Säule (4,5 cm Durchm. x 150 cm) zur Adsorption auf gebracht und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Die wirksamen Fraktionen wurden zusammengefaßt und weiter auf eine mit demselben Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex A-50-Säule aufgebracht, wobei die Gradientenelution mit demselben Puffer durchgeführt wurde, welcher 0-0,7 M NaCl enthielt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Die spezifische Aktivität dieser Lösung betrug 35,2 E/mg Protein und die Aktivitätsausbeute betrug 43,7%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses Produkts waren wie folgt.

Saure Urease B

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in gewissem Ausmaß auf Ethylharnstoff, Biuret, Methylharnstoff und Allantoinsäure (Tabelle 4). Tabelle 4 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoin Allantoinsäure Biuret Methylharnstoff Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 5 gezeigt beträgt der optimale pH etwa pH 3. Fig. 6 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 6-8 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 7 gezeigt, ist die optimale Temperatur dieses Enzyms 60-70ºC. Fig. 8 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 4 und 6 hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 8 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 80 ºC und bei pH 4 bis zu 60 ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 5 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid, Silbernitrat, Kupfersulfat, Iodessigsäure und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 5 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 210000 bis 220000.

(7) Isoelektrischer Punkt

Wie durch isoelektrische Fokussierung an Polyacrylamidgel bestimmt, zeigt das Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,8.

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 1,0 mM (pH 2, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 3

In einem handelsüblichen halbflüssigen GAM-Medium (Nissui Seiyaku) gezüchteter Streptokokkus bovis PG-186 (IFO 14634, FERM BP-1449) wurde in 10 Erlenmeyerkolben (200 ml Fassungsvermögen) eingeimpft, welche jeweils 50 ml eines sterilisierten Anzuchtkulturmediums enthielten, das aus 4% Glucose, 1,5% Polypepton, 1% Fleischextrakt, 0,8% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% wasserfreiem Natriumacetat, 0,5% Harnstoff, 0,005% Mangansulfat (etwa 4 H&sub2;O) und 0,001% Nickelsulfat (6 H&sub2;O) zusammengesetzt war (pH 7,0, neutralisiert mit 30% NaOH). Die Kolben wurden unter stationären Bedingungen 24 Stunden bei 34ºC inkubiert. Die auf diese Weise hergestellten Anzuchtkulturen wurden in 10 Erlenmeyerkolben (2 l Fassungsvermögen) überführt, welche jeweils 1 l eines sterilisierten Mediums derselben Zusammensetzung wie vorstehend enthielten, und die Inkubation wurde 2 Tage unter stationären Bedingungen bei 32ºC durchgeführt. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 7,6 E/ml saure Urease- Aktivität zeigte.
Die vorstehende Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen, welche zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen und in 4 l einer 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2), 1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit enthaltenden Lösung suspendiert wurden. Nach dem Zusatz von 2 l Glasperlen, welche im Durchmesser von 0,1 bis 0,2 mm reichten, wurde die Zellsuspension 20 Minuten bei 4500 Upm mechanisch aufgebrochen. Die Suspension aufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und dem Überstand wurde Ethanol in einer Endkonzentration von 80% zugesetzt. Der Bodensatz wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), welcher 1 mM EDTA und 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Die Lösung wurde auf eine Sephadex G- 100-Säule (7,5 cm Durchm. x 90 cm lang) zur Adsorption aufgebracht und die Elution wurde mit derselben Pufferlösung durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Dieses Eluat wurde auf eine Sephadex G-200-Säule (4,5 cm Durchm. x 150 cm lang) zur Adsorption aufgebracht, welche mit demselben Puffer äquilibriert worden war, und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Die wirksamen Fraktionen wurden zusammengefaßt und weiter auf eine DEAE-Sephadex CL-6B-Säule zur Adsorption aufgebracht, wobei die Elution durch das Gradientenelutionsverfahren mittels derselben Pufferlösung durchgeführt wurde, welche 0 bis 0,7 M Natriumchlorid enthielt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Diese Lösung wurde in einem Ultrafilter mit einer Amicon 8200 UK-50 Membrane (Grenzmolekulargewicht 50000) eingeengt. Der Puffer wurde in 1 mM 2-Mercaptoethanol enthaltenden 0,005 M Phosphatpuffer (pH 7,0) geändert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Affinitätsgelchromatographiesäule (4 cm Durchm. x 50 cm lang) aufgebracht, welche unter Verwendung von Affiprep 10 (dem Produkt von Bio-Rad) und Hydroxyharnstoff zur Adsorption hergestellt worden war, und die Gradientenelution wurde mittels 0,005 M - 0,044 M Phosphatpuffer durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt und mittels desselben Ultrafilters wie vorstehend angeführt eingeengt, gefolgt von fraktionierender Fällung und Lyophilisierung unter Ergeben von 104 mg gereinigtem Enzympulver. Dieses Pulver besaß eine spezifische Aktivität von 124 E/mg Protein.
Die enzymchemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen lyophilisierten sauren Enzyms werden nachstehend gezeigt.

Saure Urease C

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff (Tabelle 6). Tabelle 6 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 9 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms etwa 5. Fig. 10 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 10 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 6-10 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 11 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 60-70ºC. Fig. 12 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 6 und verschiedenen Temperaturen hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 12 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 50ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 7 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 7 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure (6) Molekulargewicht Wie durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese [H. Eng et al., Can. J. Microbiol., 32, 487 (1986)] bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 190000.
Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 170000.

(7) Isoelektrischer Punkt

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 0,2 mM (pH 5,0, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 4

Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14633, FERM BP-1448) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 5,4 E/ml zeigte.
Die vorstehende Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen, welche zwei Mal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen und in 4 l einer 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2), 1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit enthaltenden Lösung suspendiert wurden. Nach dem Zusatz von 2 l Glasperlen, welche im Durchmesser von 0,1 bis 0,2 mm reichten, wurde die Zellsuspension 20 Minuten bei 4500 Upm mechanisch aufgebrochen. Die Suspension aufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und dem Überstand wurde Ethanol in einer Endkonzentration von 80% zugesetzt. Der Bodensatz wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), welcher 1 mM EDTA und 2- Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Die Lösung wurde auf eine Sephadex G-100-Säule (7,5 cm Durchm. x 90 cm lang) zur Adsorption aufgebracht und die Elution wurde mit derselben Pufferlösung durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Dieses Eluat wurde auf eine Sephadex G-200-Säule (4,5 cm Durchm. x 150 cm lang), welche mit demselben Puffer äquilibriert worden war, zur Adsorption aufgebracht und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt und weiter auf eine DEAE- Sephadex CL-6B-Säule zur Adsorption aufgebracht, wobei die Elution durch das Gradientenelutionsverfahren mittels derselben Pufferlösung durchgeführt wurde, welche 0 bis 0,7 M NaCl enthielt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt. Die spezifische Aktivität dieser Lösung betrug 76,3 E/mg Protein und die Aktivitätsausbeute betrug 38,7%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses Produkts waren wie folgt.

Saure Urease D

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in einem gewissen Ausmaß auf Biuret und Ethylharnstoff (Tabelle 8). Tabelle 8 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 13 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 4 bis 5. Fig. 14 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37 ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 14 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 4-8 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 15 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms ungefähr 60 ºC. Fig. 16 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 6 hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 16 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 60ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 9 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid, Iodessigsäure und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 9 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 160000. Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 170000.

(7) Isoelektrischer Punkt

Wie durch isoelektrische Fokussierung an Polyacrylamidgel bestimmt, zeigt das Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,6.

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 0,3 mM (pH 4, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 5

Streptococcus salivarius PG-303W (IFO 14746, FERM BP-1856) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 4,3 E/ml zeigte. Die vorstehende Kulturbrühe wurde demselben Reinigungsverfahren wie Beispiel 4 unterzogen, um das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 68,2 E/mg Protein zu ergeben. Die Aktivitätsausbeute war 41,2%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses Produkts waren wie folgt.

Saure Urease E

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in einem gewissen Ausmaß auf Biuret und Allantoinsäure (Tabelle 10). Tabelle 10 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 17 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 4. Fig. 18 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37 ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 18 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 6-11 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 19 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 60-70ºC. Fig. 20 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 6 und verschiedenen Temperaturen hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 20 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 60 ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 11 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 11 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 110000. Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 140000.

(7) Isoelektrischer Punkt

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 0,2 mM (pH 4, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 6

Lactobacillus ruminis PG-98 (IFO 14632, FERM BP-1906) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 5,2 E/ml saure Ureaseaktivität zeigte. Die vorstehende Kulturbrühe wurde demselben Reinigungsverfahren wie Beispiel 2 unterzogen, um das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 36,7 E/mg Protein zu ergeben. Die Aktivitätsausbeute war 42,8%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses Produkts waren wie folgt.

Saure Urease F

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in einem gewissen Ausmaß auf Ethylharnstoff und Biuret (Tabelle 12). Tabelle 12 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 21 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 5. Fig. 22 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 22 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 4-8 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 23 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 55-60ºC. Fig. 24 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 6 hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 24 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 55ºC und bei pH 4 bis zu 30ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 13 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid, Iodessigsäure und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 13 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 150000.

(7) Isoelektrischer Punkt

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 1,2 mM (pH 5, 0,1 M Citratpuffer).

Beispiel 7

Lactobacillus reuteri UM-12 (IFO 14629, FERM BP-1904) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Das Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 3,6 E/ml saure Ureaseaktivität zeigte. Die vorstehende Kulturbrühe wurde demselben Reinigungsverfahren wie Beispiel 2 unterzogen, um das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 33,4 E/mg Protein zu ergeben. Die Aktivitätsausbeute war 45,3%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses Produkts waren wie folgt.

Saure Urease G

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in einem gewissen Ausmaß auf Ethylharnstoff und Biuret (Tabelle 14). Tabelle 14 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 25 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 4. Fig. 26 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 26 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 4-8 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 27 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 70-75ºC. Fig. 28 zeigt die Restaktivitäten, nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 4 und pH 6 hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 28 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 75ºC und bei pH 4 bis zu 65ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 15 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 15 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 210000.

(7) Isoelektrischer Punkt

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 1,3 mM (pH 4, 0,1 M Citratpuffer). Beispiel 8 Lactobacillus reuteri UM-18 (IFO 14630, FERM BP-1905) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Daß Verfahren ergab 10 l einer Kulturbrühe, welche 4,5 E/ml saure Ureaseaktivität zeigte. Die vorstehende Kulturbrühe wurde demselben Reinigungsverfahren wie Beispiel 2 unterzogen, um das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 39,8 E/mg Protein zu ergeben. Die Aktivitätsausbeute war 41,7%. Die enzymchemischen Eigenschaften dieses produkts waren wie folgt.

Saure Urease H

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Das Enzym wirkt am wirkungsvollsten auf Harnstoff und in einem gewissen Ausmaß auf Ethylharnstoff, Biuret und Allantoinsäure (Tabelle 16). Tabelle 16 Substrat relative Aktivität (%) Harnstoff Allantoinsäure Biuret Ethylharnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Wie in Fig. 29 gezeigt beträgt der optimale pH des Enzyms 3. Fig. 30 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei 37 ºC und verschiedenen pH-Werten hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 30 ersichtlich ist, ist das Enzym bei pH 5-8 stabil.

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Wie in Fig. 31 gezeigt, ist die optimale Temperatur des Enzyms 70-75ºC. Fig. 32 zeigt die Restaktivitäten nachdem man das Enzym 30 Minuten bei pH 4 und pH 6 hat stehen gelassen. Wie aus Fig. 32 ersichtlich, ist das Enzym bei pH 6 bis zu 70ºC und bei pH 4 bis zu 65 ºC stabil.

(5) Hemmer

Wie in Tabelle 17 gezeigt, wird das Enzym durch Quecksilber(II)chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt. Tabelle 17 Hemmer Konzentration relative Aktivität (%) keiner Iodessigsäure Acethydroxamsäure

(6) Molekulargewicht

Wie durch Sephadex G-200 Gelfiltration bestimmt, besitzt das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 230000.

(7) Isoelektrischer Punkt

Wie durch isoelektrische Fokussierung an Polyacrylamidgel bestimmt, zeigt das Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,5.

(8) Kristallstruktur

Dieses Enzym ist schwer kristallisierbar.

(9) Elementaranalyse

Aufgrund der Kristallisationsschwierigkeiten nicht bestimmt.

(10) Km

Der Km-Wert dieses Enzyms ist 4,8 mM (pH 3, 0,1 M Citratpuffer).

Testbeispiel 1

Die Enzymaktivität der in den Beispielen 3-5 erhaltenen sauren Ureasen C, D und E wurde mittels der Ethanol in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Reaktionslösung bestimmt. Wie in Tabelle 18 gezeigt können diese Ureasen selbst in Gegenwart von 20 oder 50% Ethanol auf Harnstoff einwirken. Tabelle 18 Ethanolkonzentration (%) saure Urease relative Aktivität (%)

Testbeispiel 2

Die Konzentration der in den Beispielen 1, 2, 6, 7 und 8 erhaltenen sauren Ureasen A, B, F, G und H und Schwertbohnen- Urease wurde auf 10 E/ml eingestellt und diese Enzymaktivitäten wurden in Gegenwart von 20% Ethanol bei 20ºC bestimmt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle 19 saure Urease relative Aktivität % Schwertbohnen-Urease* Anmerkung: * Die aus Schwertbohnen erhaltene Urease, optimaler pH 7,0, ist das Produkt von P.L Biochemicals, Inc., USA

Claims

1. Saure Urease mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

Sie produziert 2 Mol Ammoniak und 1 Mol Kohlendioxidgas aus 1 Mol Harnstoff und 1 Mol Wasser

(2) Substratspezifität

Sie wirkt am stärksten auf Harnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

Ihr optimaler pH ist 1,5 bis 5,5; sie ist bei pH 6-8 30 Minuten bei 37ºC stabil

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Ihre optimale Temperatur beim optimalen pH ist 55 bis 75ºC; bei pH 6 bleibt sie 30 Minuten bis zu 50ºC stabil

(5) Hemmer

Sie wird von Quecksilber(II)-chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt

(6) Molekulargewicht

Ihr durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht ist 100000 bis 250000.

(7) Spezifische Aktivität

Ihre spezifische Aktivität beim optimalen pH und 37ºC beträgt nicht weniger als 20 E/mg Protein.

2. Verfahren zum Herstellen einer sauren Urease mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

(2) Substratspezifität

Sie wirkt am stärksten auf Harnstoff

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität

(4) Optimale Temperatur und Temperaturstabilität

Ihre optimale Temperatur beim optimalen pH ist 55º bis 75ºC; bei pH 6 bleibt sie 30 Minuten bis zu 50ºC stabil

(5) Hemmer

Sie wird von Quecksilber(II)-chlorid und Acethydroxamsäure gehemmt

(6) Molekulargewicht

Ihr durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht ist 100000 bis 250000.

(7) Spezifische Aktivität

Ihre spezifische Aktivität beim optimalen pH und 37ºC beträgt nicht weniger als 20 E/mg Protein,

welches das Kultivieren eines Mikroorganismus, welcher der Gattung Lactobacillus oder der Gattung Streptococcus angehört und zum Produzieren der sauren Urease mit den vorstehenden Eigenschaften befähigt ist, in einem Kulturmedium, wodurch das Bilden und Anreichern der sauren Urease in der Kulturbrühe bewirkt wird, und das Gewinnen der sauren Urease aus der Kulturbrühe umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri oder Lactobacillus ruminis angehört.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Streptococcus bovis, Streptococcus mitior oder Streptococcus salivarius angehört.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP-1454) ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14631, FERM BP-1447) ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus ruminis PG-98 (IFO 14632, FERM BP-1906) ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus reuteri UM-12 (IFO 14629, FERM BP-1904) ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Lactobacillus reuteri UM-18 (IFO 14630, FERM BP-1905) ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14634, FERM BP-1449) ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14633, FERM BP-1448) ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Streptococcus salivarius PG-303W (IFO 14746, FERM BP-1856) ist.