DD200432A1 - Verfahren zur herstellung eines proteolytischen enzym-praeparates - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzym-Praeparates. das fuer die Chemotherapie von Erkrankungen des Menschen, fuer den Aubbau eiweisshaltiger Verbindungen und den Aufschluss komplexer Substrate in der mikrobiologischen Industrie von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines neuen proteolytischen Enzym-Praeparates unter Verwendung eines Mikroorganismus, der bisher nicht fuer die Herstellung von Enzymen des Typs der Proteinasen herangezogen wurde. Der Mikroorganusmus, Stamm ZIMET 43647, wird aufgrund seiner taxonomischen Eigenschaften als Nocardiopsis dassonvillei benannt. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines proteolytischen Enzym-Praeparates mit fibrinolytischen, Bioschlamm klaerenden Eigenschaften sowie dem Vermoegen, Polypeptidhaltige Substrate der Fermentationsindustrie aufzuschliessen, um die Palette derartiger Biokatalysatoren zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation eines Mikroorganismus in Medien mit geeigneten C- N-Quellen und Mineralsalzen das Enzym gebildet, mit Methoden der Ultrafiltrationstechnik im Kulturfiltrat konzentriert und gegebenenfalls auf ueblichem Wege Iyophilisiert wird.
Description
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Titel der Erfindung
Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzym-Präparates
Anwendungsgebiet der Erfindung
Bis Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Snzym-Präparates, aas aufgrund seiner fibrinolytischen Eigenschaften für die Humanmedizin, aufgrund. seiner proteolytischen Wirkung für die Klärung von Bioschlamm und den Aufschluß komplexer Substrate in der Abwasser- und der mikrobiologischen Industrie von Nutzen ista Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung einer Proteinase unter Verwendung eines bisher als Proteinase-Bildner nicht bekannten Mikroorganismus*
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Zahlreiche Vertreter der Gattungen Bacillus., AsOergillus und Streptomyces können unter geeigneten Fermentationsbedingungen Proteinasen synthetisieren* die sich bezüglich ihrer proteolytischen Eigenschaften auf Serin- CB- C* 3« ** 21), Cystein-(S* C, 3. 4« 22)* Aspartic*. (S0 C9 3o 4· 23) und Metalle-Proteinasen (B* C» % 4, 24) unterscheiden«. Häufig bilden die bekannten Proteinase-Bildner Gemische von Proteinasen, z* B0 werden in diesem Palle alkalische und neutrale Proteinasen simultan gebildet« Andererseits schränken die Art der Temperatur- und der pH-Optima bekannter proteolytischer Präparate deren Anwendungsmöglichkeiten ein«
Für bestimmte Anwendungszwecke ist wünschenswert, daß die proteolytische Aktivität eines Enzym-Präparates unter 30 0C sehr gering ist, dafür bei Temperaturen zwischen 35 und 70 QC voll zur Entfaltung kommt» Die Verwendung von mesophilen Ver-
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tretern der Gattung ITocardiopsis als Proteinasen-Bildner ist "bisher nicht· bekannt geworden, Ss ist auch nicht "bekannt, daß proteolytische Enzym-Präparate aus Nocardiopsis mit einem so hohen Temperatur-Optimum erhalten wurden, wie sie sonst nur von thermophilen Mikroorganismen, z„ B0 Thermoactinomyces«, "bekannt sind, Fermentationen mit letzteren sind dabei durch ein ungünstiges Verhältnis von Energieaufwand zu Snzymertrag gekennzeichnet O
Ziel der Erfindung
Die Erfindung dient der Herstellung eines proteolytischen Snzym-Präparates mit einem hohen Temperatur-Optimum mit Hilfe eines Mikroorganismus, der aufgrund seiner mesophilen Eigenschaften vom energetischen Standpunkt thermophilen Mikroorganismen vorzuziehen ist, Damit sollen die aufgeführten Nach*» teile bisher bekannter Verfahren zur Herstellung proteolytischer Enzym-Präparate vermieden und die Palette derartiger Präparate durch einen Vertreter mit breitem Anwendungsgebiet erweitert werden·
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde} ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, das es gestattet, aus leicht zugänglichen und billigen Einsatz stoffen in hohen Ausbeuten ein proteolytische s Enzym-Präparat mit hohem Temperatur-Optimum herzustellen* ohne auf thermophile Mikroorganismen zurückzugreifend
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- sowie Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen der nachfolgende beschriebene Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet werden·
Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet,, wurde unter der Registriernummer ZIMST 4-3647 in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinst&tut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der
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Wissenschaften der DDS, 69 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt 3 Der Stamm. ZIMBT 4364-9 wird der Art üfocardiopsis das son-Tillei (Brocq-Eousseu) Meyer (InW J* Syst« Bacteriole26 (4): 487 bi3 493 (1976)) augeordnet* Sr wurde aus verschimmeltem Stroh isoliert» Der Stamm ist aerob, GrampositiT und katalasepositiT» Sr hat den Zellwandchemotyp III (meso-Diaminopimelinsäure» Arabinose und Galaktose fehlen)« läycolsäuren und Madurese, fehlen,* Das Substratinycel entwickelt sich bei 23 0G gut auf dem organischen Medium 79 (Prauser und Palta* 1968» Z* Allgs Mikrobiol* 8 (i): 39 Ms 46) und auf den IS?-Medien 2f33^ und (Gottlieb und" Shirlinge. 1966O Inta J» Syst« Bacteriol* j1§ (3)j 313 bis 3^)* 23s ist nahezu farblos bis schwach gelblichbräunlich (Medium 79) « Oberflächlich liegende Substratmycelhyphen wachsen meist rechtmnklig sum Kolonisrand nach aiiSen« Ton ihnen gehen mehr oder weniger rechtwinklige Verzweigungen aus« Lösliche Pigmente fehlen im Agar* Luftaycel wird am besten auf dein Medium 79 gebildet«, 3s ist mehlig, weiß mit schwach gelblich-gräulicher lönung« Auf den anderen 'Medien wird Luftmycel nur an den Kolonie rändern entwickelt oder die LuxirnsycelhvTphen sind nur mit dem Mikroskop erkennbar* Die Luft— mycelhyphen fragmentieren in länglichelliptische Sporen mit glatter Oberfläche* Stamm ZIMBT 43647 bildet keine melanoiden Pigmente <, Er reduziert Hitrate a peptonisiert Milch,* verflüssigt Gelatine, hydrolysiert Stärke und baut Xanthin und Aeskulin aba Der Stamm wächst auf D-Glukose* D-Mannose, Maltose^. D-Mannitt D-Fruktose, Saccharose und Glyzerin· Sr wächst nicht auf L-Arabinose, D-XyIose, L-Bhamnose., Lactose, Haffinose, Adonitj, Dulcit und meso-Inosite Das entgegen der Beschreibung von Meyer (loccit«) fehlende Wachstum auf Arabinose, Zylose* Lactose und Ehamnose wird beim gegenwärtigen Stand der taxonomischen Bearbeitung der Gattung Nocardio?sis nicht zum Anlaß genommen, eine neue Art dieser Gattung au beschreiben«
Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43 647 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen* In GIucose-Gelatine lyophilisierte Mycelfragmente werden in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel
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wird in an sieb bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 0C (vorzugsweise 28 0O) über einen Zeitraum von 2 bis 10 Tagen (vorzugsweise 6 Tagen) bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,5 und pH 7>2 liegt» Das üährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen, sowie aus anorganischen Salzen« Als Kohlenstoff-Quellen können Stärke, Glucose, Glyzerin, Mannit, Dextrin, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden« Ais Stickstoff-Quellen kommen außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage Λ
Gute Ergebnisse sind bei Zusatz von Mineralsalzen zu erzielen· Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in. Abhängigkeit vom eingesetzten Hährmedium« In komplexen Medien* die verschiedene Mehle enthalten, sind Zusätze von Kalziumkarbonat i; Natriumnitrat bzw« Kaliumphosphat vorteilhaft»· Die Fermentation des Bildners kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in ?2A-Tanks durchgeführt werdend
Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität der rohen Kai— turbrühen des Stammes ZIMET 43 64? der Art lüocardiopsis dassonvillei und des daraus gewonnenen Enzym-Präparates- E-ZIMBT 43 647 erfolgte mit einer von Ma Kunitz 1946 beschriebenen UY-spektroskopischen Methode (J» Gen· Physiol*,. 29 »14-9) ^ 2^s Isolierung des proteolytischen Enzym-Präparates wird in der Weise durchgeführt, daß die Kulturlösung auf übliche Weise in Jfycel und KuIturfiltrat separiert, das Kulturfiltrat mit Hilfe der ültrafiltrationstechnik konzentriert und nachfolgend lyophilisiert wirde
Das lyophilisierte neue Snzym-Präparat ist eine bräunliche, amorphe Substanz, die sich gut in Wasser löst|; Das proteolytische Snzym-Präparat wurde in seiner eiweiBdegradierenden Wirksamkeit an verschiedenen Substraten untersucht« Das Präparat kann durch folgendes Substratprofil charakterisiert werden:
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Substrate Proteolytische Wirkung
von. B-ZIMBT 43 64?
Gelatin© +
Casein +
Hinder se rumalbumin +
Gamma-Globulin -.
Kollagen *
Fibrin *·
Das Temperaturoptimum des proteolytischen Enzym-Präparates S— ZDflBT -43 647 liegt zwischen 35 und yO 0G (vorzugsweise bei 60 0O) s wenn bei. pH '7*6 als Substrat Casein bzw* Diazo-Casein verwendet Wurde (Abbe.. 1)» Das pH=-Qptimum liegt smschen pH 6,0 und pH 10,0 (vorzugsweise pH 9*0), wenn als 'Temperatur 60 0G gewählt, wurden (Abb· 2)*
Die ThermoStabilität des proteolytischen Snzym-Präparates B-ZIMBiD 43 64? wurde bei 35 und 60 0C für die Dauer von 6 Stunden bei pH 9j.O untersucht« Dabei zeigt sich, daß bei einer 2« stündigen Vorinkubation des Präparates bei 35 °C kein Aktivität sabf all s. nach 6stündiger Vorinkubation dagegen ein Abfall der proteolytischen Aktivität auf 90 % erfolgt«
Im Gegensatz dazu wird nach 2stündiger Vorinkubation des Präparates bei 60 0C bereits ein Abfall der proteolytisc-hen Aktivität auf 35 % und nach 6stündiger Vorinkubation auf ca. 8 % beobachtet (Abb. 3)»'
Sowohl frische lermentationslösungen des Bildners ZIMEI 43 647 als auch das aus ihnen gewonnene Enzym—Präparat B-ZIMST 43 647 besitzen spezielle Eigenschaften zur Löslichmachung bzw« partiellen Hydrolyse von tierischen, pflanzlichen, aber auch menschlichen Proteinen« Daraus ergeben sich verschiedene Anwendungsgebiete in Landwirtschaft, Industrie und Humanmedizin»
Die proteolytische Wirkung des Präparates E-ZIMST 43 647 auf Gelatine wurde mit Hilfe der bei Taufel et al* (J, Chromate, 93, 48? Ms 490, 1974) beschriebenen Methode bestimmt. Die Wirkung des Snzym-Präparates auf Casein wurde anhand der Methode
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M Q M
nach Kunitz (J* Gen* Physiol«, 22, 149, 1946) ermitteil;. Darüber hinaus ist die proteolytische Aktivität des Enzym-Präparates auch am Diazo-Gasein nach einer üblichen Methode untersucht worden (J* Biolo Chem·, 171t 501, 1947). Auch bei den Substraten Rinder se rumalbumin und Gamma-Globulin ist die vorhandene oder fehlende proteolytische Wirkung von E-ZIMBT 43 anhand, der DY-spektroskopisch bestimmten Tyrosin-Freisetzung nach der Kunitz-Methode gemessen worden-, Die proteolytische Wirkung des Enzym-Präparates auf Kollagen wurde mit Hilfe der Hide-^owder-Azur-Technik geprüft» Beim Hide-Powder-Azur ist jede freie Hydroxyl—Gruppe des Koilagens mit einem !Farbstoff rest verbunden, so daß bei der enzymatischen Spaltung eines einzigen Moleküls eine große Zahl von Farbstoffmolekülen (Remazolbrilliantblau) in Lösung gehen« Dadurch wirkt Hide-Powder-Azur als "Verstärker-Substrat" .(Rinderknecht et al»3 Olin. Ohim*. Acta, 21, 197 bis 2O3t 1968) *
Die fibrinoIytische Aktivität wurde mit Hilfe einer Pibrinagar-Plattentechnik nach Astrup und Müllertz (In: Gerinnungslaboratorium in Klinik und Praxis (Edit, Ε· Perlick und ΑΛ Bergmann, Verlag Georg Thieme-Leipzig? 1971 j S, 374)) bestimmt»
Ausführungsbeispiele
1* Als Impfmaterial für die Beimpfung einer Vorzucht-Kultur werden in Glukose-Gelatine lyophilisierte Mycelfragmente des Uocardiopsis dassonvillei, Stamm ZIMET 43 647, verwendet Ü Als Vorzucht-Medium eignet sich ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung:
Glukose 1,5 % Sojamehl 1,5 %
CaCO- 0,1 % FaGl
Leitungswasser, Sterilisation: 35 Min, bei 115 G* Acidität zwischen pH 6,5 und. pH 7,0
Die Inoculum-Menge für 80 ml Vorzucht-Medium in einer 500 ml-Steilbrustflasche besteht aus 1 ml resuspendierten Mycelfragmente-Lyophilisats« Nach 2tägiger Vorzucht-
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Kultur "bei 28 0G auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180/Min·. werden 80 ml einer Produktions-Kultur in 500 ml Steilbrustflaschen mit 8 ml der Vorzucht-Kultur "beimpft*
Als Produktions-Medium eignet sich ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung;
Saccharose Q,.25 %
O3 2 %
0,1 %
4 pO 0fP5 %
KCl " ~ 0*05 %
PeSO2^ 0,001%
Aqua desto Sterilisation; 35 Min,, bei 115 0O Acidität zwischen pH 7*2 und pH 7*8
Die Jermentationsdauer beträgt S bis 10 Tage bei 28 0G auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180/Min·s ehe die maximale proteolytische Aktivität erreicht wird,
2e:' Man geht wie im Beispiel 1 vor mit dem Unterschied., daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hati
Sojamehl 2*0 %
Glukose 2,0 %
CaGOo · 0,3 %
HaCI . 0,5 %
In Leitungswasser« Sterilisations 35 Miru
bei 115 0G* Acidität bei pH St5«
3'ir ^as Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Bei~ spiels 1 dadurch,, daß das zur Beimpfung der Vorsucht-Sultur verwendete Impfmaterial auf einem festen Agarmedium folgender Zusammensetzung für die Dauer von 10 Tagen angezüchtet wirdi
Glukose 1*0 %
Pepton 1,0 %
Hefe-Extrakt 0,2 %
Gasamino acids 0,1 %
NaGl 0,6 %
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Agar-Agar 1t5 %
Leitungswasser. Sterilisation: 35 Min· bei
115 0C* Acidität pH 7,0·
Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Beispiels 1 dadurch, daß eine 1O Vorkultur, wie in Beispiel 1 beschrieben-, angelegt wird, nachfolgend jedoch eine 2» Vorkuitur durch Beimpfen von 400 ml des Vorzucht-Mediums in 21-Glasflaschen mit 10 ml Suspension aus der 1. Vorkultur für die Dauer von 24 Stunden gezüchtet wircU-
400 ml der auf diese Weise erhaltenen 2· Vorkultur dienen zur Beimpfung von HO 1 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 321-Giasfermenter enthalten ist* Während der Fermentation^ die bei 28 0O mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 Ü/En, und einer Luftzufuhr von 15 l/Minρ ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden* Die nach ca« 120stündiger Fermentationsdauer erhaltene Aktivität des proteolytischen Enzyms entspricht; 0,9 bis 1t4 /Umol freigesetztes Tyrosin/ml im überstand der Kulturlösung des Wildstammes«
5* Nach Abtrennen des üycels aus der nach Beispiel 4 erhaltenen Fennentationslösung mittels Separator werden 20 1 KuI-turfiltrat durch Ultrafiltration auf 3*5 1 konzentriert♦ Zur Ultrafiltration wird eine Sigenbau-Apparatur verwendet·,, die mit Zelluloseacetat-Membranen vom Typ UI 1 bestückt ist. Der Aufkonzentrierungsfaktor beträgt 5*7» Die je 1 ml native Kulturlösung gebildete proteoiytische Aktivität bewirkt die Freisetzung von 0,9 /umol Tyrosin in einer Oaseinlösung nach 20 Mi nuten bei +60 0O· Die prote?- 01ytische Aktivität je 1 ml Konzentrat beträgt dagegen 4,0 /Umol freigesetztes Tyrosin unter gleichen Bedingungen» Der Aufkonzentrierungsfaktor bezüglich der Proteinasenaktivität beträgt 4,4* Die Enzymausbeute nach der Konzentrierung beträgt 77»7 % der Ausgangsiösung« Die Filtrat-
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stromdichte erreicht einen Wert von 16 1 pro Stunde und m und die Selektivität rf> » (1-
Nach der Ultrafiltration wird das proteolytische Enzym-Präparat iyophil getrocknet und bei -20 0G gelagert«
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung eines proteoiytischen Snzym-iPräparates auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Nooardiopsis dassonvillei«. Stamm ZIMBI 43 547 j unter aeroben Bedingungen in flüssigen ITahrmedien, di© eine Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle sowie Mineralsalze ent« halten, bei einer !Temperatur zwischen 25 und 37 0O während eines Zeitraumes von 5 bis 10 Tagen kultiviert wird und das dabei gebildete proteolytische Enzym Ε-Ζ1ΜΞ2 4-3 647 im Kulturfiltrat mit Hilfe der Ultrafiltrationstechnik konzentriert und gegebenenfalls nachfolgend lyophilisiert wird*Hierzo^2_Seit8n Zeichnungen
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1981
- 1981-09-08 DD DD23312581A patent/DD200432A1/de not_active IP Right Cessation
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