DD227449A1 - Verfahren zur herstellung einer thermostabilen proteinase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung einer thermostabilen Proteinase aus Thermoactinomyces vulgaris mit speziellen Eigenschaften fuer einen partiellen Kleberabbau in der Naehrmittel-, Waffel- und Backwarenherstellung, fuer die Herstellung von Protein-Partialhydrolysaten und andere Prozesse. Das Verfahren besteht darin, dass man fortlaufend auf einem speziellen Naehrmedium aus der in pigmentierte und nichtpigmentierte Kolonien aufspaltenden Sporenpopulation von Thermoactinomyces vulgaris braungefaerbte Varianten isoliert, an einer speziellen Erde konserviert und dann in bekannter Weise die Fermentation durchfuehrt.

Description

Erfinder: Dr. Peter Klingenberg Dieter Körner Dr. Andreas Leuchtenberger Dr. Ulrich Behnke Prof. Dr. Heinz Ruttloff

Verfahren 'zur Herstellung einer thermostabilen Proteinäse Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Proteinase mit einer pigmentierten Stammvariante von Thermoactinomyces vulgaris (nachfolgend als . . Thermitase bezeichnet), die spezielle Eigenschaften zur partiellen Hydrolyse von tierischen und pflanzlichen Proteinen besitzt. Das Enzym ist geeignet, als Rohpräparat oder in teilgereinigter Form bei verschiedenen Prozessen in der Lebensmittelindustrie sowie hochgereinigt als Biofeinchemikalie eingesetzt zu v/erden. Als Applikationsgebiete kommen die Klebererweichung bei der Nährmittel-, Waffel- und Backwarenherstellung, die Gewinnung von Protein-Partialhydrolysaten für diätetische Zwecke bzw. für die Ernährung von Kranken, Rekonvaleszenten und für andere Zielgruppen in Betrachte

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen (ζ'. B. solche der Gattung Aspergillus, Bacillus und Streptomyces) unter geeigneten Kulturbedingungen Proteinasen produzieren,

die sich hinsichtlich ihrer eigenschaften voneinander unterscheiden. Für einige Einsatzgebiete ist es günstig, wenn, der Wirkungsbereich des Enzyms auch oder aber vorrangig bei höheren Temperaturen liegt (WP 155 482). Ss ist weiter bekannt, daß bei der Fermentation des Stammes Therrnoactinomyces vulgaris auf geeigneten l^ahr subs trat en eine thermostabile Proteinase erzeugt werden kann, deren Temperaturoptimum bei 60 - 70 ⁰G liegt und die eine weitgehend unspezifische Spaltung tierischer und pflanzlicher Proteine bewirkt /TU. BBHEKE, Ξ. ACIiERIiLAlTlT und H. RUTTLOPP, Nahrung 28 (1984) (im Druck) J.

Der Ausgangsstamm sov/ie eine leistungsverbesserte Mutante desselben sind in der Zentralen Starnmsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Thera- pie in Jena unter den Bezeichnungen ΙΜΞΤ 9512 und ILOET 9515 hinterlegt. Die Charakteristik des Stammes sowie die Kultivierungsbedingungen zur submersen Gewinnung von Thermitase · sind im WP 112 662 beschrieben. In einem weiteren Patent WP 117 083 ist das Verfahren zur Enzymgewinnung in der "/eise verbessert worden, daß Zusätze von Rapsöl, Trockenhefe und Essigsäure zum Nährmedium zu einer Erhöhung der- Enzymausbeute führen. Eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit des Herstellungsverfahrens ist Gegenstand des WP 156 714« Durch Begrenzung des Sauerstoffpartialdruckeswährend der Vorkultivierung wird eine quantitative Sporenkeimung erzielt, und durch zusätzliche Nährstoffzuführung während der Fermentation werden sowohl die Bioniassebildung als auch die Proteinaseproduktion gegenüber dem im WP 117 083 beschriebenen Verfahren erheblich gesteigert. Bei einer Permentationsdauer von 16 - 24 h werden Enzymaktivitäten von 10 - 12 ΤΞ/ ml nährlösung gegenüber 6 TE/ml nach dem früheren Verfahren erreicht. Die Aktivitätsangabe erfolgt in Tyrosineinheiten (TE). 1 TE entspricht derjenigen Enzymmenge, die aus einer o,625 %igen Caseinlösung bei pH 8,0 und 55 ⁰C so viel in 4 %iger Trichloressigsäurelösung lösliche Caseinbruchstücke je 1 min freigesetzt,welche bei 274 nm die gleiche

Absorption bewirken wie 1 u Hol Tyrosin £\J, BWdEXE,

A. TAUI¹SL, H. RUTTLOPP, B. HÄPHSR und G. LSHMAHH, Lebensmittelind. 25., 485 - 438, 545, 546, 573 (1978)7.

Bs ist bekannt, daß durch die Vielkernigkeit des Mycels und die hohe spontane Transformationsrate (10~-0 bei Thermoactinomyces vulgaris die Heterogenität des Sporenmaterials sehr groß ist /~D.A. HOPWOOD and H.H. WRIGHT, J. gen. Microbiol. TJ. 383 (1972) J. Daraus resultiert, daß die Reproduzierbarkeit der beschriebenen Verfahren infolge der Variabilität des verwendeten Stammaterials hinsichtlich Morphologie und Biosyntheseleistung noch unbefriedigend ist. Es ist weiterhin bekannt, daß bei verschiedenen der zur Ordnung der Actinomycetales gehörenden Stämme sowohl Morphologie als auch Farbe von auf Agarplatten wachsenden Kolonien eine große Variationsbreite aufweisen und gelegentlich eine Beziehung zur Produktsynthese beobachtet.wird. Diese phänotypischen Merkmale werden z. B. von V.S. MALIK L Advances in Genetics 20, 37 (1979) 7 mit Erfolg für die Selektion von Antibiotikabildnern genutzt. ITach M. TYC und T. KADZIKIEWICZ /'Acta Hicrobiol. Pol. 4, 217 (1972) / korreliert eine gesteigerte Viomycinsynthese bei Streptomyces griseus mit der Bildung eines melaninähnlichen Pigments. Nach Untersuchungen von L.G.. LOGIlIOVA, J.A. USAITS und L.M. SSRSGIlTA /TAppl. Bio ehem. and Microbiol. J_6, 24 (1980)7 produzieren große und gefaltete im Vergleich zu kleinen, ebenfalls gefalteten Kolonien von Thermoactinomy- ··· ces vulgaris 122 - 4a eine höhere Proteinaseaktivität. J.A. USAITS und M.B. YAKOVLSVA /TAppl. Biochem. and Microbiol. 1_6, 925 (1980)7 fanden, daß der- Stamm Thermoactinomyces vulgaris RA-II-4a in weiße, graue und braune Varianten aufspaltet, wobei die graue Form eine gesteigerte Proteinaseaktivität aufweist.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, das Sekundärmerkmal Färbung von

Kolonien auf Agarplatten als phänotypischen Marker für den Screening von Leistungsstämmen zu nutzen, wodurch die Reproduzierbarkeit der bekannten Herstellungsverfahren erhöht und eine Steigerung der Proteinaseausbeute herbeigeführt werden soll. Dadurch können unter industriellen Bedingungen eine höhere Enzyinausbeute erzielt und die Ökonomie des Verfahrens verbessert v/erden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die unterschiedliche Färbung des Stammes auf einem Agarmedium als Auswahlkriterium für leistungsverbesserte Stammvarianten zu nutzen. Es wurde nun gefunden, daß "he i der Anzucht der Mutante IMEI 9515, wie sie im WP 112 662 beschrieben ist, auf einem Agarmedium mit den Bestandteilen Maisquellwasser, Maisstärke, Natriumchlorid und Kalziumchlorid eine Aufspaltung in braune und weiße Kolonien (Substratmycel) erfolgt» Werden mit diesen Varianten nach dem bereits bekannten Verfahren Fermentationen angesetzt, so wird bei den braunen Varianten in Schüttelkultur und Rührfermentoren mit IMET 9515 eine Proteinaseaktivität von 12-15 ΙΞ/ml erzielt, während diese bei den weißen nur bei 1-2 TE/ml und bei Mischstämmen bei etwa 5-8 TE/ml liegt. Im einzelnen geht man so vor, daß von einer Sporenkonserve mit einem Mikrospatel eine Aufschwemmung in 2 ml 0,01 %iger Tween-80-Lösung hergestellt wird, die je nach Bedarf bis auf 1 : 100 verdünnt werden kann. Mit 0,1 ml dieser Aufschwemmung wird eine Schrägagarkultur (MQW-I) zur Stammhaltung angelegt. Mittels einer verdünnten Spοrenabschwemmung werden Einzelkolonien auf MQW-I-Platten angezüchtet. Diese Kolonien überprüft man makroskopisch und mikroskopisch hinsichtlich ihrer Morphologie und Färbung. Von den braunen und weißen Varianten werden jeweils 30 Schrägagarkulturen auf MQW-I-Medium angelegt und 20 h bei 55 C bebrütet. Von jeder Stammkultur wird MQW-I-Medium mit einer Sporenkonzentration ron 3 x 10 /ml beimpft, und es

wird nach 20 - 24 h Kulturdauer (50 ⁰G) auf einem Rundschv/ingtisch (180 - 220 U/min) oder im Rührfermentor die Proteinaseaktivität bestimmt· Mr die Überprüfung auf morphologische Einheitlichkeit sowie Pigmentierung v/erden aus einher entsprechenden Verdünnungsstufe Selektionsplatten auf MQY/-I-Medium beimpft. Die braunen und weißen Varianten werden nach Abschwemmung ihrer Sporen von der entsprechenden Schrägagarkultur als Erdsporenkonserven (Luvos-Heilerde) aufbewahrt. Durch fortlaufende Kombination von Selektion und Konservierung ist die Proteinaseaktivität der braunen Form um-den Faktor 10 bei einer Variabilität von ca. 10 % gesteigert worden. Die weißen Varianten sind mit ihrer geringen Leistung und der relativ großen Variabilität von ca. 70 % mit dem Y/ildstamm vergleichbar. Es besteht eine Korrelation zwischen Pigmentierung (braun) und hoher Proteinaseaktivität sowie zwischen weißen Varianten und niedriger Proteinaseaktivität. Damit wird eine Reproduzierbarkeit und Leistungssteigerung in den Versuchsansätzen gesichert, und das Sekundärmerkmal "braun" ist als phänotypischer Marker für den Screening in Kombination mit der Konservierung von Sporen an Luvos-Heilerde geeignet.

Die braunen Varianten sind auf den Selektionsplatten folgendermaßen zu charakterisieren: Kolonieoberseite erhaben, stark gefaltetes Luftmycel (weiß/grau bis cremefarben), Kolonieunterseite hell- bis dunkelbraunes Substratmycel.

Im Unterschied dazu ist das Luftmycel der weißen Varianten kreidig/weiß, glatt und anliegend; das Substratmycel ist nicht pigmentiert. Der Sporulationsgrad ist bei beiden Stämmen vergleichbar.

Außer den Unterschieden hinsichtlich Pigmentierung des Mycels und Proteinaseaktivität bestehen auch solche hinsichtlich Zusammensetzung des Spektrums der Proteinasekomponenteno Das Verhältnis van kationisch zu anionisch wandernder Komponente bei der Polyacrylamidgel-Slektrophorese (pH-Wert des Puffers = 8,3), beträgt für die braune

Selektante 70 : 1 und für die weiße nur 15 : 1; dieser Befund ist von besonderer Bedeutung, weil die für das Enzympräparat "Thermitase" charakteristischen Eigenschaften vorrangig auf diese kationische Komponente zurückzuführen sind. Die Therrnostabilität der Proteinase unterscheidet sich nicht.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Ausgehend von einer Sporenkonserve werden mit einem Mikrospat el ca. 0,1 g entnommen und in 2 ml einer 0,01 %ig.en Tween-80-Lö'sung zur Herstellung einer Sporenaufschwemrnung gegeben. Mit 0,1 ml dieser Aufschwemmung wird die Schrägagarkultur (Stammkultur) auf MQW-I-Agar angelegt: Maisquellwasser (50 %ig) 1,0 % HaGl 0,5 %

Maisstärke 1,0%

CaCl₂ 0,05 %

pH-Wert 6,8 - 7,2

Agar-Agar 2,0 %

Das Nährmedium wird im Autoklaven 20 min bei 120 ⁰G sterilisiert. Nach einer Bebrütungszeit von 20 h bei 55 C wird die Stammkultur mit 10 ml der o.g. Lösung angeschwemmt und auf 10 verdünnt, so daß nach Ausspatalung von 0,1 ml der entsprechenden Verdünnung auf MQW-1-Agar nach 20 h bei 55 C Einzelkolonien entstehen. Diese Kolonien werden makroskopisch und mikroskopisch auf morphologische Einheitlichkeit und Pigmentierung überprüft. Man isoliert von diesen Selektionsplatten 30 Kolonien mit braungefärbtem Substratmycel sowie 30 Kolonien mit weißem Substratmycel und legt Schrägagarkulturen auf MQW-I-Agar an, die wiederum 20 h bei 55 ⁰G bebrütet werden. Sowohl den braunen als auch weißen Varianten werden Sporenabschwemmungen nach der bereits beschriebenen Methode hergestellt. Mit einem Sporentiter von 3 χ 10^ Sporen je ml Kulturmedium (MQW-I-Medium in der

ο. g. Zusammensetzung ohne Agar-Agar) beimpft man die entsprechende Anzahl 100 rnl-Steilbrustflaschen mit jeweils 30 ml Medium. Diese Kulturen werden auf einem Rundschwingtisch bei 180 bis 220 U/min bei 50 ⁰G 24 h geschüttelt. Die Proteinaseaktivität beträgt für die braunen Varianten ca. 11,4 TB/ml und für die weißen ca. 1,2 TE/ml. Eine Überprüfung der Pigmentierung und Morphologie erfolgt über Selektionsplatten auf MQ\7-I-Agar. Von der leistungsgesteigerten braunen bzw. der leistungsgeminderten weißen Variante werden jeweils 0,9 nil der Spοrenabschwemmung von den entsprechenden Schrägagarkulturen in Ampullen gefüllt, die ca. 1 g sterile Luvos-He Herde enthalten und 1 bis 2 Tage bei -20 G gelagert sowie anschließend lyophilisiert. Die Ampullen werden ohne Begasung zugeschmolzen und im Kühlschrank gelagert.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 züchtet man über Selektionsplatten, braune und weiße Varianten und stellt von diesen eine entsprechende SOorenmenge her, die für die Beimpfung von 20 1 Medium gemäß Beispiel 1 mit einem Sporentiter von 3 x 10 /ml ausreichend ist. Pur den 30 1-Permentor beträgt die.Rührerdrehzahl 400 Umdrehungen pro min, es wird Luft mit 300 l/min zugeführt, und die Permentationstemperatur beträgt 50 C. ! lach 24 h wird die Proteinaseaktivität für die braune Variante mit ca. 14,3 TE/ml und für die weiße mit ca. 1,2 TE/ml bestimmt. Überprüft man die Stabilität der in den Beispielen 1 und 2 gezüchteten braunen und weißen Varianten, so variieren die braunen nur hinsichtlich der Pigmentintensität, während aus der weißen. Variante braune Kolonien mit einem Anteil von ca. 3,δ % segregieren, die aber die Proteinaseaktivität nicht positiv verändern.

Claims (3)

1. 3 Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Protein- ase des Stammes Thermoactinoniyces vulgaris und/oder seiner Mut ante - hinterlegt in der Zentralen Staninisamnilung der DDR in Jena unter den Bezeichnungen HiIEIl 9512 und ΙΜ3Ί 9515 (Mutante) - in einem Rührfermentor unter Einsatz eines bekannten Mediums mit Kohlenhydratquelle, Stickstoffquelle und Salzen bei 50 C mittels Rührung und Belüftung dadurch gekennzeichnet', daß ein durch Selektionierung braun pigmentierter Kolonien erhaltenes leistungsverbessertes St animate rial eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß

   • braun pigmentierte Kolonien auf Agarplatten auf einem Medium bestehend aus 1 % Maisquellwasser, 1 % Mais- \ stärke, 0,5 % NaCl, 0,05 % CaCl₂ und 2 % Agar-Agar' gebildet werden, wobei die braun gefärbte Variante eine 2 - bis >3fach höhere Proteinasebildung sowie eine '10 bis 80 % geringere Variabilität aufweist als die weiße.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2 dadurch gekennzeichnet,-, daß das hohe Protein_asebildungsvermögen der braun pigmentierten Stammvariante aufrecht erhalten wird,

   ' indem durch Ausplattieren einer Sporensuspension und 20 h Bebrütung bei 55 ⁰C erneut Kolonien angezüchtet werden, von denen man wieder nur die braunen isoliert und die Sporen gegebenenfalls an Luvos-Heilerde angetrocknet über längere Zeit kpnserviert werden.