DD201693A5 - Verfahren zur synthetisierung von menschlichem proinsulin - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von menschlichem Proinsulin, das A- und B-Peptide durch ein C-Peptid voneinander getrennt enthaelt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus inkubiert, welcher durch einen Expressions-Transfer-Vektor transformiert wurde, der eine Deoxynucleotidsequenz enthaelt, welche menschliches Proinsulin codiert, unter zur Expression der codierenden Sequenz geeigneten Bedingungen, und das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt.

Description

Berlin, 10. 12. 1981 AP C 12 H / 223 873 60 147 18

Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Proinsulin

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Proinsulin, enthaltend A- und B-Peptide, die durch ein C-Peptid voneinander getrennt sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Insulin ist ein Hormon, das hauptsächlich von den B-Zellen der Bauchspeicheldrüse produziert wird. Die Verwendung dieses Hormons zur Behandlung von Diabetes ist hinreichend bekannt. Obgleich von Schlachthöfen Rinder- und Schweine-Bauchspeicheldrüsen als Insulin-Quellen geliefert ?/erden, entwickelt sich eine Knappheit bei diesem Hormon, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Außerdem entwikkeln manche Diabetiker allergische Reaktionen gegen Rinder- und Schweineinsulin mit nachteiligen Wirkungen. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in für den Weltbedarf ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen, wird daher angestrebt. Die vorliegende Erfindung liefert Gene, die in Mikroorganismen inseriert und zur Herstellung von menschlichem Insulin verwendet werden können.

Insulin besteht aus zwei Polypeptidketten, die als A- und B-Kette bekannt sind und die über Disulfidbrücken verknüpft sind. Die Α-Kette besteht aus 21 Aminosäuren, die B-Kette aus 30 Aminosäuren. Diese Ketten werden in vivo nicht'unabhängig voneinander synthetisiert, sondern sie entstammen einem direkten Vorläufer, der als Proinsulin bezeichnet wird. Proinsulin ist eine einzige Polypeptidkette, in der ein Peptid, das als C-Peptid

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bezeichnet wird, die A- und B-Ketten verknüpft (vergl. Steiner, D, P. et al·, Science, 157, 697 (1967)). Dieses C-Peptid wird beim Einlagern des Insulins in die Sekretionsgranulen der B-Zellen der Bauchspeicheldrüse vor der Sekretion ausgeschnitten (vergl. Trager, H. S. et al., Ann. Rev, Bi ο ehem. , 43., 509 (1974)). Die heutige Ansicht über die Punktion des C-Peptids geht darin, dai3 es nur zur Bildung der dreidimensionalen Molekülstruktur dient, Die Aminsäuresequenz des menschlichen Proinsulins ist in Tabelle 1 dargestellt. In dieser Tabelle besteht die B-Kette aus den Aminosäuren 1 bis 30, das C-Peptid aus den Aminosäuren 31 bis 65 und die Α-Kette aus den Aminosäuren 66 bis 86.

Tabelle 1

1 10

UH₂-P.he-Yal-Asn-C-ln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Yal-Glu

20 Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pke-Try-Thr-

30 40

Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-

- -. 50

Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-

60 ' Leü-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Iie-Val-Glu-

70 80

Gln^-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-

86'"

Try-Cys-Asn

Die chemische Synthese dieser Sequenz aus. 86 Aminosäuren ist zwar mit konventionellen Verfahren machbar, .jedoch schwierig.

In den B-Zellen der Bauchspeicheldrüse ist das ursprüngliche Übertragungsprodukt nicht das Proinsulin selbst, sondern ein Pre-Proinsulin, das mehr als 20 zusätzliche Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins besitzt; vergl.

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Cahn, S. J. et al· ,·Proa. Nat. Äcad. Sei, USA, 72» (1976) und Lomedico, P. T. et al·, Fuel. Acid Res., 3.» 381 (1976). Die zusätzliche'Aminosäuresequenz wird als Signal-Peptid bezeichnet. Im menschlichen Pre-Proinsulin (vergl. Pig. 2) besitzt das Signal-Peptid 24 Aminosäuren

-24 -20

der Sequenz M^-Met-Ala-Leu-Trn-Met-Arg-Leu-Leu-Pro-Leu-

^ά -10 ' -1

Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu-Trp-Gly-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala,, Es wird angenommen, daß die Sequenz aus 24 Aminosäuren ein spezifisches Signal für den vektorialen Transport des Polypeptids in das endoplasm.isc.he Reticulum der B-Zellen darstellt, sie wird in dieser Phase vom-Proinsulin abgespalten (vergl·· Blobel, G. et al., J. Cell. Biol., 67, 835 (1975))·

Es sind mehrere Fälle von Signal-Peptiden für eukaryontische Proteine bekannt, die durch Merabranbarrieren transportiert werden. Sin spezifisches Spaltungsenzym wurde in einem zellfreien System beobachtet, das die Peptidbindung zwischen Signal-Peptid und aktivem Protein gleichzeitig bei der Passage durch eine Zellmembran hydrolysiert (s. Blobel, G·. et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 75, 361 (1978)).

Me neueren Portschritte in der Biochemie und der Technologie der Neukombination von DBA machten die Synthese von spezifischen Proteinen unter kontrollierten Bedingungen, unabhängig vom höheren Organismus, aus dem die Proteine gewöhnlich isoliert werden, möglich. Diese biochemischen synthetischen Methoden verwenden Enzyme und subzellulare Komponenten des Proteinsyntheseapparats lebender Zellen entweder in vitro in zellfreien Systemen oder in vivo in Mikroorganismen. In jedem Pail ist das Schlüsselelement die Bereitstellung einer Deoxyribonucleinsäure (DlA) spezifischer Sequenz, die die für die ge-

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wünschte· Aminosäuresequenz erforderliche Information enthält«. Eine solche spezifische DNA wird als Gen bezeichnet. Die Code-Beziehung, bei der eine Deoxynucleotidsequenz verwendet wird zur Beschreibung der Aminosäuresequenz eines Proteins, wird nachstehend kurz erläutert, sie basiert auf Grundprinzipien, die im gesamten. Gebiet der lebenden Organismen gelten.

Sin kloniertes Gen kann verwendet .werden, um die Aminosäuresequenz von in-vitro-Systemen synthetisierten Proteinen aufzuklären. Auf DUA ausgerichtete Protein-synthetisierende Systeme sind bekannt (s. z. B. Zubay, G., Ann» Rev. Genetics, ]_, 267 (1973)). Ferner kann eine einsträngige DIIA in vitro die Wirkung einer messenger-HNA erhalten, woraus eine sehr genaue Translation der DSA-Sequenz folgt (Salas, J. et al., J. Biol. Chem. , 243., 1012 (1968)). Andere bekannte Techniken können in Kombination mit obigen Verfahrensweisen zur Verbesserung der Ausbeuten verwendet werden.

Die Entwicklung der Methoden der DUA-Ieukombination machte es möglich, spezifische Gene oder Teile davon aus'höheren Organismen zu isolieren, z. B. vom Menschen und anderen Säugetieren, und diese Gene oder Fragmente in einen Mikroorganismus, z. B. eine Bakterie oder Hefe, zu übertragen. Das übertragene Gen wird repliziert und vermehrt sich mit der Replikation des transformierten Mikroorganismus. Als Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, jedes Protein zu erzeugen, das das Gen oder Gen-Fragment codiert, handle es sich um ein Enzym, ein Hormon, ein Antigen oder einen Antikörper oder ein Stück davon. Der Mikroorganismus vererbt diese Fähigkeit seinen nachkommen, so daß in der Tat die Übertragung zu einem neuen Stamm mit der genannten Fähigkeit führt (s. z. B. Ullrich, A. et al., Science, 196, 1313

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(1977) "¹^d- Seeburg. P. J, et al., Nature, 270, 486 (1977)). Eine Voraussetzung, die der Anwendung dieser Technologie auf die Praxis zugrunde liegt, besteht darin, daß die DNA aller lebenden Organismen, von Mikroben bis zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen 4 Nucleotiden besteht. Die signifikanten Unterschiede liegen in den Sequenzen dieser-Nucleotide, im polymeren DNA-Molekül, Die Nucleotidsequenzen dienen zur Beschreibung der Aminosäuresequenzen von Proteinen, die den Organismus bilden. Obgleich die meisten Proteine verschiedener Organismen sich voneinander unterscheiden, ist die Code-BeZiehung zwischen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle Organismen im Grunde gleich. Die Nucleotidsequenz, die z. B. die Aminosäuresequenz von menschlichem Wachstumshormon in menschlichen Hypophysenzellen codiert, codiert nach Übertragung in einen Mikroorganismus die gleiche Aminosäuresequenz.

Die vorliegend verwendeten Abkürzungen sind aus Tabelle 2 ersichtlich;

Taoelle	2
DNA	Deoxyribonucleinsäure
RNA	Ribonucleinsäure
cDNA	komplementäre DNA (enzymatisch synthetisiert
	aus einer mEETA—Sequenz)
mRNA .	messenger-RNA
dATP	Deoxyadenosintriphosphat
dGTP	Deoxyguanosintriphosphat
dCTP	Deoxycytidintriphosphat
A	Adenin
T	Thymin
G	Guanin
C	Cytosin
U	Urac.il

O Q P IT C Q O 10, 12, 1981

L J O D U ü L _{δ0 147}.

Tabelle 2 (Portsetzung) - ο -

ATP Adenosintriphosphat TTP Thymidintriphosphat SDTA Ethylendiamintetraessigsäure

Die Cοde-BeZiehung zwischen lucleot.idsequenz in DIA und Aminosäuresequenz in Protein ist als genetischer Code bekannt, s. Tabelle 3:

Tabelle 3 Genetischer Code

Phenylalanin (Phe) TTK

Leucin (leu) XTY

Isoleucin (lie) ATM Methionin (Met) ATG

Valin (VaI) GTl

Serin (Ser) QRS

Prolin (Pro) CCL

Threonin (Thr) ACL

Alanin (Ala) GCL

Tyrosin (Tyr) TAK

Tenainationssignal TAJ Terminationssignal TGA O Histidin (His) CAK

Glutamin (Gin) CAJ

Asparagin (Asn) AAK

Lysin (Lys) . AAJ

Asparginsäure (Asp) GAK

Glutaminsäure (GIu) GAJ

Cystein (Cys) TGK

Tryptophan (Try) TGG

Arginin (Arg) WGZ

Glycin (GIy) GGL

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Schlüssel: Jedes Deozynucleotid-Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der mBUÄ dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Alle vorliegend angegebenen DNA-Sequenzen sind diejenigen des Strangs, dessen Sequenz der mBUA-Sequenz entspricht, wobei Urac.il durch Thymin ersetzt ist. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Deosynucleotidsequenz bilden:

A = Adenin

G = Guanin C = Cytosin

T = Thymin

X = T oder C, falls Y = A oder G X=C, falls Y=C oder T

Y = A, G, C oder T, .falls X = C

Y = A oder G, falls X=T W=C oder A, falls Z=A oder G W= C, falls Z=C oder T Z = A, G, C oder T, falls W = C Z=A oder G, falls W=A QR = TC, falls S = A, G, C oder T QR = AG, falls S=T oder C S = A, G, C oder T, falls QR = TC S=T oder C, falls QR = AG

J=A oder G K=T oder C L = A, T, C oder G M = A, C oder T

Ein wichtiges Merkmal des Codes ist die Tatsache, daß jede Aminosäure beschrieben wird durch eine Trinucleotidsequenz, die auch als Fucleotid-Triplett bekannt' ist. Die Phosphodiester-Bindungen, die benachbarte Tripletts verbinden, sind chemisch von allen anderen Internucleotid-

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Bindungen der DUA nicht su unterscheiden» Daher kann die Eucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden, ohne daß zusätzliche Information über den Leseraster vorliegt, womit die Gruppierung der Tripletts erkannt und in der Zelle die Entschlüsselung der genetischen Nachricht erfolgt,

Verschiedene Techniken der DHA-Meukombination verwenden zwei Klassen von Verbindungen, Transfer-Vektoren und Restriktionsenzyme , die nacheinander beschrieben werden. Sin Transfer-Vektor ist ein DHA-Molekül, das unter anderem die genetische Information enthält, die die eigene Replikation nach Übertragung in den Stamm eines Wirts-Mikroorganismus sicherstellt. Beispiele für häufig verwendete Transfer-Vektoren sind Plasmide und die DlAs bestimmter Bakteriophagen. Bei den vorliegenden Arbeiten wurden zwar Plasmide als Transfer-Vektoren verwandt, doch können auch andere Arten von Transfer-Vektoren eingesetzt werden. Unter einem Plasmid versteht man eine sich autonom replizierende DNA-Einheit, die in einer Mikroorganismus-Zelle neben dem Genom der Wirtszelle selbst vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit dem Chromosom der Wirtszelle nicht genetisch verknüpft. Plasmid-DNAs liegen als doppelsträngige Ringe mit einem Molekulargewicht im allgemeinen in der Größenordnung von einigen Millionen Daltons vor, obgleich in manchen Fällen auch Molekulargewichte von

mehr als 10 Daltons vorkommen, Sie stellen gewöhnlich nur eine kleine prozentuale Menge der gesamten DUA der Zelle dar. Eine Transfer-Vektor DiTA läßt sich gewöhnlich von der DIiA der Wirtszelle aufgrund der erheblichen Größenunterschiede absondern. Transfer-Vektoren tragen genetische Information, die sie zur Replication in der Wirtszelle befähigt, in den meisten Fällen unabhängig von der Geschwindigkeit der Zellteilung. Einige Plasmide besitzen die Eigenschaft, daß ihre Replikationsgeschwindigkeit

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durch Verändern der Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann- Mit geeigneten Techniken kann der Ring der Plasmid-DlTA geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DNA wird inseriert, und der Ring wird erneut geschlossen, wobei ein vergrößertes Molekül entsteht, das das inserierte DNA-Segment enthält.. Bakteriophagen-DNA kann ein Segment heterologer DBA inseriert enthalten anstelle bestimmter nicht-essentieller Phagengene.. In jedem Fall dient der Transfer-Vektor als Übertrager oder Vektor eines inserierten Fragments aus heterologer

Die Übertragung erfolgt in einem Verfahren, das als Transformation bezeichnet wird. Während der Transformation nehmen mit Plasmid-DNA vermischte Bakterienzellen gesamte Plasmidmoleküle in die Zellen auf. Obgleich der Mechanismus des Vorgangs unbekannt ist,, ist es möglich, den Anteil der zur Aufnahme von Plasmid—DITA und damit zur Transformation befähigten Bakterienzellen zu maximieren durch bestimmte, empirisch ermittelte Behandlungen, Sobald die Zelle ein Plasmid einverleibt hat, wird dieses in der Zelle repliziert, und die Plasmid-Wiederholungen werden bei der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilt. Im Prinzip kann jede genetische Information, die in der Hue Ie ο tidse quenz der Pia smid-DETA enthalten ist, in der Wirtszelle exprimiert werden. Typischerwe.ise erkennt man eine transformierte Wirtszelle daran, daß sie vom Plasmid beigesteuerte Züge angenommen hat, wie z. B. Resistenz gegen bestimmte Antibiotika. Verschiedene Plasmide erkennt man an verschiedenen Fähigkeiten oder der Kombination von Fähigkeiten, die sie den Wirtszellen vermitteln. Jedes Plasmid kann vermehrt werden, indem man eine reine Kultur plasmidhaltiger Zellen vermehrt und die Plasmid-DNA daraus isoliert.

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Restrikt.ions-Endonucleasen sind hydrolytische Enzyme, die eine stellungsspezifische Spaltung von DNA-Molekülen katalysieren. Die Wirkungsstelle der Restriktions-Endonuclease wird durch das Vorliegen einer spezifischen Nucleotidsequenz bestimmt,. Diese, Sequenz nennt- man die Erkennungsstelle der Restriktions-Sndonuclease» Restriktions-Endonucleasen aus verschiedenen Quellen wurden isoliert und bezüglich der Nucleotidsequenz ihrer Erkennungssteilen charakterisiert. Einige Re'striktions-Endonucleasen hydrolygieren die Phosphodiester-Bindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so daß stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wobei freie einsträngige Regionen an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbstkomplementär und daher kohasiv, sie können zur Wiedervereinigung der hydrolysierten DNA verwendet werden. Da jede DM, die durch ein solches Enzym spaltbar ist, die gleiche Erkennungsstelle besitzen muß, entstehen gleiche kohäsive Enden, so daß es möglich ist, heterologe DNA-Sequenzen zu verknüpfen, die mit einer Restriktions-Sndonuclease behandelt wurden (vergl. Roberts, R, J., Crit, Rev, Biochem., 4, 123 (1976)), Erkennungsstellen sind relativ selten, jedoch wurde die allgemeine Anwendbarkeit der Restriktions-Endonucleasen erheblich erweitert durch chemische Synthese doppe1strängiger Oligonucleotide mit der Sequenz der Erkennungsstelle. Man kann daher praktisch jedes Segment einer DNA mit einem anderen Segment verknüpfen, indem man einfach das entsprechende Restriktions-Oligonucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restriktions-Endonuclease unterwirft, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen (vergl. Heynecker, H. L. et al., Nature, 263, 748

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(1976) und Scheller, R- H, et al., Science, 196, 177 (1977)). Ein wesentliches Merkmal der Verteilung· von Erkennungssteilen von Restriktions-Endonucleasen ist die Tatsache, daß sie in bezug auf das Leseraster zufällig verteilt sind. Folglich kann die Spaltung durch Restriktions-Sndonucfease machen benachbarten Codons oder innerhalb eines Codons erfolgen.

Weitere allgemeine Methoden zur DHA-Spaltung oder zur Modifizierung der Endsequenz stehen zur Verfügung» Mit verschiedenen nicht-spezifischen Endonucleasen kann DlIA zufällig gespalten werden, wie nachstehend noch beschrieben wird. Endsequenzen können modifiziert werden, indem man Qligonucleotid-Schwänze aus dA an einem Ende und dT am anderen Ende oder aus dG und dC bildet, um Bindungsstellen zu erzeugen, die keiner spezifischen Bindegliedsequenzen bedürfen.

Die Bezeichnung "Sspression" wird verwendet in Anerkennung der Tatsache, daß ein Organismus nur selten, wenn überhaupt, alle ihm genetisch zustehenden Fähigkeiten zu einem bestimmten Zeitpunkt ausnützt. Sogar bei relativ einfachen Organismen wie Bakterien werden zahlreiche Proteine, zu deren Synthese die Zelle befähigt ist, nicht gebildet, obgleich sie unter geeigneten Milieubedingungen entstehen können. Wird das durch ein bestimmtes Gen codierte Pro— teilprodukt vom Organismus synthetisiert, so sagt man, daß das Gen exprimiert wird. Entsteht das Proteinprodukt nicht, so wird das Gen nicht exprimiert. Gewöhnlich wird die Expression von Genen in E. coli, wie nachstehend allgemein beschrieben, reguliert, derart, daß Proteine, deren Funktion in einem gegebenen Milieu nicht nützlich ist, nicht synthetisiert werden und StoffWechselenergie gespart wird. Die Steuerung der Gen-Expression in E. coli ist als Ergebnis umfangreicher Studien im Verlauf der

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letzten 20 Jahre gut bekannt (s. Hayes, W., The Genetics,of Bacteria an their Viruses, 2« Aufl., John Wiley & Sons, Inc, Few York (1968) und Watson, J, D., The Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., Benjamin, Menlo Park, California (1976)).. Diese Untersuchungen haben ergeben, daß mehrere Gene, gewöhnlich solche,, die Proteine zur Ausführung verwandter Punktionen in der Zelle codieren, als Cluster in kontinuierlicher Sequenz vorliegen. Das Cluster wird als Operon bezeichnet. Alle· Gene im Operon werden in gleicher Richtung transkribiert, beginnend mit den die IT-tenninale Aminosäuresequenz des ersten Proteins der Sequenz codierenden Codons und fortlaufend bis zum C-terminalen Ende des letzten Proteins im Operon, Am Anfang des Operons, benachbart zum U-terminalen Aminosäure-Codon, liegt eine Region der Dl^-A, die als Kontrollregion bezeichnet wird und die eine Vielzahl steuernder Elemente umfaßt wie den Operator, Promotor und Sequenzen für ribosomale Bindungsstellen.. Die Punktion dieser Stellen besteht darin, daß die Expression der unter ihrer Kontrolle stehenden Gene auf die Bedürfnisse des Organismus reagiert. Beispielsweise werden Gene, die Enzyme codieren, welche ausschließlich dem Lactose-Abbau dienen, gewöhnlich nicht in erheblicher Menge exprimiert, wenn nicht Lactose oder ein Analogon davon tatsächlich im Medium vorhanden ist. Die Punktionen der Kontrollregion, die vorhanden sein müssen, damit Expression stattfindet, sind der Beginn der Transkription und Beginn der Translation. Die Expression des ersten Gens der Sequenz wird eingeleitet durch die Einleitung von Transkription und Translation in der die N-terminale Aminosäure des ersten Proteins des Operons codierenden Stellung, Die Expression jedes Gens stromabwärts von dieser Stelle beginnt ihrerseits, mindestens bis ein Terminationssignal oder ein anderes Operon mit dessen eigener Kontrollregion eingreifen, die auf eine andere Kombination von MiIieubedingungen reagieren. Bei

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zahlreichen Variationsmöglichkeiten dieses allgemeinen Schemas besteht die wichtige Tatsache darin, daß ein Gen zur Expression in einem Prokaryonten wie E- coli in bezug auf eine Kontrollregion mit einem Initiator für Transkription und einem Initiator für Translation richtig angeordnet sein muß,-

Es wurde gezeigt, daß Gene, die kein üblicher Teil eines bestimmten Operons sind,- in das Operon inseriert und von diesem gesteuert werden können. Die klassische Demonstration erfolgte durch Jacob, P. et al·, J. Mol. Biol. 13« -'704 (1965). Bei diesem Versuch wurden Gene, die Enzyme einer Purin-Biosynthese codierten, in eine durch das lactose-Operon kontrollierte Region übertragen. Die.Expression des Enzyms der Purin-Biosynthese wurde dann in Abwesenheit von Lactose oder einem Lactose-Analogon unterdrückt und blieb unbeeinflußt von den Milieubedingungen, die gewöhnlich diese Espression regulieren.

Zusätzlich zur Operator-Region, die die Einleitung der Transkription von Genen stromabwärts reguliert, gibt es Codons, die als Stopp-Signale wirken und das G-terminale Ende eines bestimmten Proteins anzeigen (vergl. Tabelle 3)-Diese Codons sind als Terminationssignale und auch als lull-Codons bekannt, da sie gewöhnlieh keine Aminosäure codieren. Die Streichung eines Tenninationssignals zwischen strukturellen Genen eines Operons erzeugt ein fusioniertes Gen, das zur Synthese eines chimärischen Proteins führen könnte, das aus zwei von benachbarten Genen codierten AminosäureSequenzen besteht, die über eine Peptidbindung verknüpft sind. Die Bildung solcher chimärischen Proteine bei Gen-Pusion wurde von Benzer, S. und Champe, S. P., Proc. Nat. Acad, Sei. USA, 48, 114 (1962) gezeigt.

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Sobald ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert wurde, was man als "Klonierung" des Gens bezeichnet, ist die Verfügbarkeit in ausreichenden Mengen sichergestellt. Das klonierte Gen wird in einen geeigneten. Mikroorganismus übertragen, in dem es sich repliziert und aus dem es nach konventionellen Verfahren wieder isoliert werden kann. Man erhält auf diese Weise eine stetig erneuerbare Quelle des Gens für weitere Versuche, Abwandlungen und Transfer in andere Vektoren oder an andere Stellen des gleichen Vektors.

Die Expression wird erzielt, indem man das klonierte Gen bei richtiger Orientierung und Leseraster in eine Kontrollregion einführt, derart, daß das,Ablesen des prokaryontischen Gens zur Synthese eines chimärischen Proteins führt, welches die vom klonierten Gen codierte Aminosäuresequenz enthält. Zahlreiche spezifische Proteinspaltungsverfahren können eingesetzt werden, um das chimärische Protein an einer gewünschten Stelle zu spalten, so daß die gewünschte Aminosäuresequenz frei wird, die dann in konventioneller ?/eise gereinigt werden kann. Techniken zum Aufbau eines Expressions-Transfer-Vektors mit dem klonierten Gen in geeigneter Stellung zu einer Kontrollregion wurden beschrieben von Polisky, B., et al. , Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 73, 3900 (1976); Itakura, K. et al., Science, 1_98, 1056 (1977); Villa-Komaroff, L. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 75., 3727 (1978); Mercereau-Puijalon, 0. et al., Nature, 275., 505 (1978); Chang. A. 0. Y. et al. , Nature, 275., 617 (1978) und in der US-PS (US-Patentanmeldung 933 035).

Das Verfahren, durch das ein Säugetierprotein wie z, B,. menschliches Pre-Proinsulin oder Proinsulin mit Hilfe der Technologie der D¥A-Rekombination erzeugt wird, er-

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fordert zunächst die Klonierung des Säugetiergens. Nach Klonierung kann das Gen in Mengen produziert, chemisch, oder enzymatisch, weiter modifiziert und in ein Expressions-Plasmid transferiert werden» Das klonierte Gen eignet sich auch zur Isolierung verwandter Gene oder, bei Klonierung eines Fragments, zur Isolierung des gesainten Gens, wobei das klonierte Gen als Hybridisierungsansatz verwendet 'wird. Ferner ist das klonierte Gen brauchbar, um durch Hybridisierung die Idendität oder Homologie unabhängiger Isolate des gleichen oder verwandter Gene nachzuweisen. Aufgrund des genetischen Codes bestimmt das klonierte Gen nach Translation im geeigneten Leseraster die Produktion nur der Aminosäuresequenz, die es codiert, und keiner anderen.

Über die Isolierung und Reinigung von Ratten-Proinsulin wurde bereits gearbeitet. Ullrich, A. et al., loc* cit. und Villa-Komaroff, L-, et al-, loc. cit. beschreiben die Isolierung und Reinigung von Ratten-Proinsulingen und ein Verfahren zur Übertragung dieses Gens in einen Eikroor— ganismus und dessen Replication dort. Ullrich et al. erhielten mehrere rekombinante Plasmide, die die Codier-Sequenz, für Proinsulin, die 3 '-untranslierte Region und einen Teil des Yorpeptids enthielten. Die Expression der Ratten-DNA mit der Codier-Sequenz für Insulin ist in der US-PS (US-Patentanmeldung 933 035) beschrieben. Villa-Komaroff et al. erhielten ein rekombinantes Plasmid, das die Codier-Sequenz für die Aminosäuren 4 bis 86 von Proinsulin enthielt. Diese Proinsulin-Sequenz wurde von den Aminosäuren 24 bis 182 der Penicillinase (ß-Lactamase) getrennt durch die Codier-Sequenz von 6 Glycinen. Diese Codier-Sequenz für Penicillinase-Proinsulin wurde exprimiert zur Bildung eines Fusionsproteins. In den genannten Literaturstellen werden einige der Grundverfahren der. Technologie der DNA-Rekombination beschrieben. Nicht beschrieben ?/ird jedoch die Isolation und Reinigung

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3 8 5 63 Z _.₁₆_.

von menschlichem Pre-Proinsulingen oder menschlichem Proinsulingen*.

Einen, anderen Versuch zur Herstellung von menschlichem Insulingen unternahmen Crea,. R.. et al., Proc. Hat, Acad, Sei, USA, 75, 5765 (1978),. Hierbei folgte chemische Synthese der Codier—Sequenzen für (1) die Α-Kette und (2) die B—Kette von menschlichem Insulin unter Verwendung von Codons, die von E. coil bevorzugt werden« Diese beiden Sequenzen können dann in Plasmide^: inseriert werden, die bei der Expression die A- und B-Ketten bilden» Menschliches Insulin könnte dann erzeugt werden durch Ausbildung der korrekten Disulfidbrücken zwischen den beiden Proteinketten.

Das klonierte Gen für menschliches Pre-Proinsulin ist in verschiedener Weise brauchbar. Die Transposition in einen Expressions-Transfer-Vektor erlaubt die Synthese von Pre-Proinsulin durch einen Wirts-Mikroorganismus, der mit dem das klonierte Gen tragenden Vektor transformiert wurde. Das Wachstum des transfornrerten Wirts führt zur Synthese von Pre-Proinsulin als Teil eines chimärischen Proteins. Ist der prokaryontische Teil des Fusionsproteine das Signalstück eines ausgeschnittenen oder anderweitig abgeteilten ?/irtsproteins, so können Ausschnitt oder Abteilbildung erfolgen und Stabilität und Reinigungsfähigkeit des Pre-Proinsulin/Pusionsproteins erheblich verbessern. Ist der prokaryontische Anteil kurz, so kann ein Ausschnitt aus dem prokaryontisehen Wirt erleichtert werden durch das Vorpeptid selbst, falls die Pre—Sequenz im prokaryontisc.ta.en Wirt so wirkt wie in der eukaryontisehen Zelle. Das Pre-Proinsulingen kann auch verwendet werden, um Proinsulingen auf nachstehend beschriebene Weise zu erhalten.

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3 ο 5 6 d 2 .₁₇.

Das klonierte Pre-Proinsulingen kann bei verschiedenen Techniken zur Produktion von Pre-Proinsulin eingesetzt werden. Pre-Proinsulin ist von Nutzen, da es nach bekannten enzymatisehen oder chemischen Verfahren in Proinsulin umgewandelt werden kann. Beispielsweise kann das Vorpeptid entfernt werden durch ein lösliches enzymatischem Präparat (s. Blobel, G-, et al., loc cit.), das spezifisch Signalpeptide entfernt. Das klonierte Proinsulingen kann in verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Proinsulin eingesetzt werden. Das mit dem einen oder anderen Gen produzierte Proinsulin läßt sich durch bekannte enzymatisch^ oder chemische Verfahren in Insulin überführen (s. Kemmber, W. et al., J* Biol, Chem., 242, 6786 (1971)).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem menschliches Proinsulin in ausreichenden Mengen hergestellt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Proinsulin zur Verfugung zu stellen.

Ein Verfahren zur Herstellung eines DIA-Transfer-Vektors zur Erhaltung und Replikation einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz zeichnet sich dadurch aus, daß man eine menschliches Pre-Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz mit einem DITA-Molekül umsetzt, das durch Spaltung eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde.

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Kloniert wurden eine cDKA mit der menschliches Pre—Proinsulin codierenden Basensequenz und eine cDEA mit der menschliches Proinsulin codierenden Basensequenz, Die . Struktur der klonierten cDÜTAs wurde durch Nucleotidsequenzanalyse aufgeklärt.

Die ursprüngliche Quelle des genetischen Materials war ein Insulin produzierender menschlicher Tumor. Aus den Zellen wurde die mJRHA isoliert.

Zur isolierten mfOTA komplementäre DHA (cDNA) wurde synthetisiert unter Verwendung von reverser Transkriptase in zwei Reaktionszyklen, wobei doppelsträngige cDUA erzeugt wurde. Die ungespaltene, heterogene, doppelsträngige cDÜTA wurde __ so behandelt, daß spezifische Verbindungs-Oligonucleotidsequenzen an jedem Ende entstanden, um die Inserierung an einer Stelle mit gleicher Restriktionsspezifität in einem Transfer-Vektor zu ermöglichen.

Zur Klonierung wurde ein Transfer-Vektor mit guten Selektions- und beständigen Replikationseigenschaften ausgewählt. Die vorbehandelte cDJFA wurde in einen Transfer-Vektor an vorbestimmter Stelle der Vektor-DNA inseriert unter Bildung eines rekombinanten Transfer-Vektors, unter Anwendung der gängigen Techniken.

Die Zellen des Wirts-Mikroorgartismus wurden durch den rekombinanten Vektor transformiert, die Transfonnationsprodukte wurden selektioniert nach den Kriterien, die für Inser.ierung.en an vorbestimmter Stelle entwickelt wurden. Einzelkolonien, jeweils entstammend aus einer einzelnen transformierten I/Iikroorganismuszelle, wurden herausgenommen und in Einzelkultüren gezüchtet, um die Replikation der rekombinanten Transfervektor-DITA-Clone zu ermöglichen. Die Transfervektor-DITA wurde in einer modifizierten Hy-

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bridisierungsmethode auf Insulinsequenzen untersucht. Kolonien, die rekombinante Transfereektor-DHA für Insulinsequenzen ergaben, wurden in. größeren Sinzelkulturen gezüchtet,, um Transfervektor-DHA zu gewinnen und zu analysieren. Geeignete Clone wurden zur endgültigen Identifizierung der ÜTucleotidsequenz der klon±rten Pre-Proinsu— lin— oder Proinsulingene ausgewählt und zur Übertragung in geeignete Expressionsplasmide.

Sin Verfahren zur Herstellung einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Proinsulin codiert, welches zur Synthese von menschlichem Insulin dient, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die 3'-Enden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, erhalten und repliziert gemäß der Erfindung, in ein oder mehreren Zyklen einer stufenweisen exonucleotlytischen Digerierung hydrolysiert, die durch T4-DiTA-Polymerase katalysiert wird, welche in Gegenwart von Deosynucleotidtriphosphat wirksam ist, dann die 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz hydrolysiert durch eine nucleolytische Digerierung, die durch ein ETucfeaseenzym katalysiert wird, welches spezifisch ist für e.insträngige DlA mit einem 5'-Ende.

Sin. Verfahren zur Synthese von menschlichem Insulin zeichnet sich dadurch aus,, daß man die Sulfhydrylgruppen in den A- und B-Peptiden von menschlichem Proinsulin oxydiert unter Bildung von Disulfidbrücken zwischen A- und B-Pep— tiden und dann das C-Peptid ausscheidet durch eine Hydrolyse, die von einem Enzym katalysiert wird, welches für die Bindungen spezifisch ist, die das C-Pepti.d mit den A- und B-Peptiden verbinden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von menschlichem Proinsulin, das A- und B-Peptide durch ein C-Peptid voneinander getrennt enthält, das da-

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10. 12, 1981 .60 147 18 - 20 -

durch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus inkubiert, welcher durch einen Expressions-Transfer-Vektor transformiert wurde, der eine Deoxynucleotidsequenz enthält, Vielehe menschliches Proinsulin codiert, unter zur Expression der codierenden Sequenz geeigneten Bedingungen, und das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt..

Die Deoxynucleotidsequenz wurde hergestellt durch Hydrolysieren der 3'-Enden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz in einem oder mehreren Zyklen einer stufenweisen exonucleolytischen Digerierung, die durch in Gegenwart eines Deoxynucleotidtriphosphates arbeitenden T4-DHS-Polymerase katalysiert wird, anschließendes Hydrolysieren der 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz über eine nucleolytische Digerierung,' die durch ein für einzelsträngige DNS mit 5'-Enden spezifischen Fucleasesenzym katalysiert wird, und Umsetzen der so erhaltenen, menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz mit einem DUS-Molekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, unter Bedingungen, die für die Expression der menschliches Proinsulin codierenden Sequenz geeignet sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin dadurch aus, daß die die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

5 ' -TTK₁ GTL₉AAK^CAJ,CAKr-

I c. _p ¹V P

-O ^f

und die die Α-Kette codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

10. 12. 1981 _{A A} 60 147 13

2 38 5 69 2 -21-

5 ' -GGLr rATVL^r₇G¹SLr-GAJ,- ,.CAJ^_nTGlC₇.IGK^₀ACL₇., oo o7 . 00 02 70 /i (2 73

/--3 ^f; worin

uD

A = Deoxyadenyl

G = Deoxyguanyl

C = Deorsycytosyl

T = Thymidyl

J = A oder G

K=T oder C

L = A, T, C oder C-

M = A, C oder T

X_n = T oder C, wenn Y_n = A oder G, und C, falls Y_n = C oder T

Y = A, G, C, oder T, wenn X. = C, und A oder G, falls X_n = T W_n = C oder A, wenn Z_n = G oder A, und C, falls Z_n = C

oder T Z = A, G. C oder T, wenn W_n = C, und A oder G, falls

W=A

QR_n = TC, wenn S_n = A, G, C- oder T, und AG, falls S = T oder C

S_n = A, G. C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C, falls QR_n = AG,

und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins, dem jedes Triplett in der Nuc-leotidsequenz entspricht, nach dem genetischen Code bedeuten, wobei die AminosäureStellungen vom Aminoende her beziffert sind.

Die menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz umfaßt einen Plus-Strang, der (a) die Deoxynucleo-

tidsequenz (N N₁JT ). mit einem 5'- und einem 3^r-3nde aufa ο c j

3 ο

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^δ° ^{147 18}

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weist, wobei JF , ¥, und TT die Bedeutung A, T, G oder C haben können und 3 eine ganze Zahl von lull bis 100 sein kann, wobei. Έ I,H nicht TGA₁ TAA oder TAG sein kann; (b) eine die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz, die an die 5'-Enden von (N₀F, F.).

a υ c j

gebunden ist; und (c) eine die A—Kette, von menschlichem Insulin codierende Deo^qrnucleotidsequenz, die an. die 3'-Enden von (F 35T₁IT). gebunden ist, enthält.

a υ c j

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin, dadurch aus, daß der Transfervektor mit Pstl-Endonuclease geschnitten wird, um das DFS-Molekül pBR322 zu erhalten, und dieses DE^-S-Molekül mit der menschliches Proinsulin codierenden Deozynucleotidsequenz umgesetzt wird, um zu dem Plasmid pcHP-1 zu gelangen.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Molekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, an einer Stelle innerhalb einer expriinierbaren Kontrollregion geschnitten wird.

Die vorliegende Erfindung offenbart die essentiellen genetischen Elemente, die man zur Erzeugung von menschlichem Insulin in Verfahren benötigt, die auf industriellen Maßstab eingerichtet werden können. Das natürlich vorkommende Strukturgen wurde kloniert. Seine Expression in einer geeigneten Wirtszelle führt zu einem Proteinprodukt, das nach bekannten Verfahren in Insulin überführt werden kann. Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Proinsulin-Molekül und benutzt die Tatsache, daß der C-Peptidbereich des Proinsulin-Moleküls eine spontane Faltung ermöglicht, derart, daß die A- und B-Ketten richtig nebeneinander liegen. In dieser Konfiguration wird die korrekte Paarung

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23 8 5 6 3 2 .₂₃ -

der Sulfhydrylgruppen hergestellt, und die Bildung der Sisulfidbrücken, die im aktiven Insulinmolekül vorliegen, erfolgt 'leicht. Das Ausscheiden des C-Peptids erfolgt durch kombinierte Anwendung von. Trypsin oder einem Enzym mit ähnlicher Substratspezifität und Carboxypeptidase B oder Cathepsin-B unter Entfernung eines C-terminalen Arginins aus der 3—Kette, wie' dies bereits beschrieben wurde.

Der gesamte Godierungsante.il des menschlichen Insulingens wurde, wie vorliegend beschrieben, kloniert, einschließlich einem Teil der 5'-untranslatierten Region, der gesamten Yorpeptidsequenz, der gesamten Codier-Sequenz für die B-, C- und A-Peptide und der gesamten 3^f-untranslatierten Region. Die Wahl der Wirtszelle hat Einfluß darauf, welche Teile des klonierten Gens verwendet werden. Die gesamte Pre-Proinsulin codierende Sequenz ist verwendbar zur Transformierung bestimmter Arten von höheren eukaryontischen Zellen, da die Pre-Sequenz als ein Einzelpeptid wirkt, um die Abgabe des Peptids aus der Zelle zu fördern. Außerdem katalysieren diese zur Reaktion auf das Signalpeptid befähigten eukaryontischen Zell-Linien die spezifische Entfernung der Pre—Sequenz während des Transports des Proteins durch die Zellmembran, Ferner können solche Zellen das abgegebene Produkt weiterverarbeiten, indem sie das C-Protein nach der katalysierten Bildung der richtigen Disulfidbrücken ausscheiden.

In prokaryontischen Wirtszellen wird heute die Verwendung der Proinsulin codierenden Sequenz bevorzugt. Die Stufe der Umwandlung von Proinsulin in Insulin erfolgt nach bekannten Methoden. Zwei Arten der Expression sind heute bekannt, die beide die Inserierung der Proinsulin codierenden Sequenz in eine Region der Transfer-Vektor-DSA umfassen, deren Expression durch einen prokaryontischen Promotor gesteuert wird, In einigen Fällen wird ein Teil des prokaryontischen Strukturgens und die Promotorkontrolie zwischenge-

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schaltet, derart, daß das Produkt der Expression ein Fusionsprotein ist, dessen N-terminaler Teil aus dem IT-terminalen Teil des prokaryont.ischen Proteins und dessen C-terminaler Teil die klonierte Sequenz, in diesem Pall Proinsulin, ist. Die Expression von Proinsulin in Form eines menschlichen Proteins hat den Vorteil', daß in der Wirts— zelle das Fusionsprotein beständiger sein kann als Proinsulin selbst, lsi; das prokaryontische Protein ferner ein Protein, das normalerweise von der Wirtszelle abgegeben wird, so kann das Fusionsprotein ebenfalls abgegeben werden, wodurch die Reinigung des Sspressionsprodukts erleichtert wird* Die Verwendung von Fusionsproteinen besitzt einen ! Jachteil, der darin besteht, daß sie spezifisch gespalten werden müssen, um das gewünschte Produkt zu ergeben. Im Fall von Proinsulin gibt es Verfahren,die die Aminosäuresequenz des Proteins zur spezifischen Spaltung, eines Fusionsproteins nützen, s, Beispiel 2.

Die klonierte Codiersequenz kann auch direkt in der prokaryontisehen Zelle exprimiert werden, indem man die Sequenz direkt benachbart zu einem Promotor inseriert. Der Vorteil liegt hier darin, daß eine spezifische Spaltung überflüssig wird» Der wesentliche Nachteil besteht in der Notwendigkeit einer weiteren Reinigung.

Die..Expression· von Säugetiergenen in E, coli wird heute erzielt durch Inserierung in der Nähe der Iac-, trp- und ß-Lactamase-Promotoren, Der lac-Promotor ist geeignet, da seine genetischen Eigenschaften gut charakterisiert sind. Es gibt zwei mögliche Inserierungsstellen, die lange und kurze prokaryontische Führungen für das Fusionsprotein ergeben. Eine Vielzahl genetischer Varianten steht zur Verfugung mit verschiedenen Mengen des endogenen Repressors, die durch Temperatur induzierbar sind und dergleichen.

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Der trp-Frcmotor hai; der. Verteil, daß nach Induktion hohe Expression erfolgt» Expressionsplasmide mit Inserierungs— stellen im trp-Promotor stehen für alle drei Leseraster zur Verfügung, Der ß-Lactamase-Promotor bewirkt, was einem prokaryontisehen Signalprotein zukommt, da die Lactamase gewöhnlich abgegeben wird* Das ß-Lactamase-Fusionsprodukt wird ebenfalls abgesondert oder im periplasinisehen Raum gefunden* Als Ergebnis sind weniger Reinigungsstufen zur Er-_N zielung von reinem Proinsulin erforderlich*

Die vorliegende Erfindung nützt die Funktion des G-Peptids von Proinsulin aus, nämlich die Erleichterung der spontanen faltung des Proinsulins, so daß die A- und B-Ketten in korrekter Konfiguration zusammenkommen, derart, daß SuIfhydrylgruppen richtig gepaart sind und korrekte Disulfidbrücken entstehen,, wie sie in natürlichem Insulin gefunden werden» Der Vergleich der C-Peptidsequenzen bei verschiedenen Arten zeigi:, daß diese während der Evolution nicht gut konserviert wurden. Daher sind zahlreiche Substitutionen in der Aminosäuresequenz des C-Peptids möglich. Die Funktion des C—Peptide kann einfach darin bestehen, daß ^ eine Aminosäureschleife entspechender Länge gebildet wird^ ^y die zur Faltung der A- und B-Kette in geeigneter Konfiguration führt. Daher kann praktisch jede Codier-Sequenz anstelle der C-Peptidsequenz von menschlichem Proinsulin inseriert werden, ohne daß diese Hauptfunktion wesentlich verändert wird* Bestimmte Vorteile sprechen allerdings für die Verwendung des natürlichen G-Peptids; beispielsweise muß die Entfernung des Peptids aus den Insulinpräparaten nicht vollständig sein, da das C-Peptid ein natürlicher Bestandteil von Insulinpräparaten ist. Femer kann ein gewisser Vorteil bezüglich der, korrekten Konfiguration des Insulins oder bezüglich der Abspaltung durch Enzyme vorhanden sein*

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^6014Y18

Die vorliegende Erfindung demonstriert den universalen Charakter des genetischen. Codes. Von. Säugetierzellen bevorzugte Codons werden korrekt in Ξ. coil translatiert, Ersatz-Codons, die die gleiche Aminosäure codieren,, können in der Sequenz substituiert werden, ohne daß Sequenz oder Funktion des exprimierten Proteins beeinträchtigt werden.. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher die Verwendung sämtlicher synthetischer Codier-Varianten. der beschriebenen Codiersequenz, soweit diese Varianten menschliches Pre-Proinsulin und menschliches Proinsulin codieren.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Kloniertes menschliches Pre-Proinsulingen

Das menschliche Insulingen wurde kloniert aus RlJA, die aus einem menschlichen. Insulin-preduzierenden Tumor nach dem Verfahren von Ullrich et al·-, loc· cit. zur. Isolierung von RNA aus Inselzellen isoliert worden war· Die RNA, die nach dem Zentrifugieren in 5,7molarer Cäsiumchlorid-, lösung, enthaltend 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure, als Pellet erhalten worden war, wurde ohne weitere Reinigung als Vorlage für die cDHLA-Synthese eingesetzt unter Verwendung von reverser Transkriptase und Sl-Hucle-ase (s. Ullrich et al., loc. cit,). Aus T30yUg unfraktionierter RSA wurden etwa 40 ng doppelsträngiger cDUA erhalten.

Die unfraktionierte cDUA wurde mit terminaler Transferase in Gegenwart von dCTP. behandelt zur Erzeugung von Oligo-C-Schwänzen an den 3'-Enden der cDNA-Moleküle. Ebenso wurde der Plasmid-Transfer-Vektor pBR322 mit der Restriktions-Endonuclease Pstl gespalten und mit terminaler Transferase in Gegenwart von dGTP behandelt unter Erzeugung von Oligo-

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dG-Schwänzen an den 3*-Enden der linearen Piaamid—DNA»· Die so behandelte Plasmid-DNA kann keine ringförmige DlIA bilden, da die einsträngigen Enden nicht komplementär sind. Jedoch sind die Oligo-dC-Enden der behandelten cDITA komplementär mit den Oligo-dG-Enden des Plasmids und können daher verwendet werden zur Bildung ringförmiger Plasmide, bei denen die cDNA in der Pstl-Stellung inseriert ist. Ferner regeneriert die Inserierung beide Enden der Pstl-Erkennungssequenzen an beiden Enden der Insertion, womit für den Ausschnitt der inserierten Sequenzen gesorgt wird (vergl. Villa-Komaroff, et al., loc. cit.).

Das obige Verfahren zum Anbringen von Endstücken wurde angewandt zur Erzeugung von pBR-322-Plasmiden einer heterogenen Population von cDMA-Insertionen an der Pstl-Stelle, Solche Piasffiide sollten gegen Ampicillin empfindlich, da sich die Pstl-Stelle im ß-Lactamasegen befindet, gleichzeitig aber Tetracyclin-resistent sein. Ein E, coli-Stamm J. 1776 wurde mit der Insertionen enthaltenden Plasmid-DHA transformiert. 525 Tetracyclin-resistente Transformationsprodukte wurden erhalten. Diese wurden auf Replica-Platten (replica-plated) auf Insulinsequenzen ausgesucht durch Kolonienhybridisierung in situ, im wesentlichen nach der Vorschrift von Gruenstein und Hogness, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 22, 3961 (1975)· Die vorher klonierte Pre-Proinsulin-cDNA aus Ratten (Ullrich, A, et al,, loc. cit,) wurde als Hybridisierungsansatz verwendet, nach Markierung der Ratten-cDNA durch Translation unter Verwendung von DNA-Polymerase I. Da die Aminosäuresequenzen von Ratteninsulin und menschlichem Insulin sehr ähnlich sind (Insulin zu 92 % .:homolog, Proinsulin zu 83 % homolog) wurde vorausgesetzt, daß die klonierte Ratten-cDlTA unter den bekannten Bedingungen verminderter Schärfe mit menschlichen Insulinsequenzen kreuzhybridisieren würde. Die Autoradiographie ergab, daß zwei von 525 Kolonien mit dem

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238 5 69 2 -*>-

klonierten Ratten-Pre-Proinsulin I hybridisierten» Beide Kolonien waren gegen Ampicillin.empfindlich. Die aus den Kolonien isolierten Plasmide waren etwa um 250 Basenpaare und 500 Basenpaare langer als pBR322, Das größere- Plasmid erhielt die Bezeichnung pcHI-1'.

Die Fucleotidsequenz des inserierten cDUA-Pragments von pcHI-1 wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Hat,. Acad. Sei, USA, 74, 560 (1977) bestimmt. Sin schematisehes Diagramm der Insertion zeigt Pig. 3* Die gesamte . Codierungsregion für menschliches Pre-Proinsulin war in der Insertion enthalten, zusammen mit einem Teil der 5'-untranslatierten Region, der gesamten 3'-untranslatierten Region und einem Teil der .3'-Polyd-Region, Die Restriktionsstellen zur Abspaltung der Insertion für die Sequenzierung sind ebenfalls in Pig,. 1 gezeigt, zusammen mit der Richtung der Sequenzierung in jedem Pragment und den Überlappungsregionen...

Die aus der cDHA-Sequenz erhaltene mRHA-Sequenz und die aus einem der Leseraster abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt Pig* 2, Die Grundstruktur von auf diese Weise bestimmtem menschlichem Proinsulin stimmt genau überein mit der Struktur, die aus früheren Sequenzbestimmungen resultierte (s, Dayhoff, M. D,, Atlas of Protein Sequence and Structure, % Suppl, 2, S. 127 - 130 (1976) und Suppl. 3, S, 150 (1978)), Die Aminosäuren der Proinsulin codierenden Sequenz werden mit 1 bis 86 beziffert, die der Prosequenz mit -24 bis -1, Pig. 2 zeigt ferner den Ort bestimmter Restriktionsstellen, die zum Bau des Proinsulingens aus der pcHI-1-Insertion brauchbar sind. Selbstverständlich ist die cDNA-Sequenz des codierenden Strangs der pcHI-1-Insertion gleich der in Pig. 2 gezeigten, mit der Abweichung, daß Thymin T anstelle von Uracil U steht.

2 0

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βο 147 is

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Große Mengen, an pcHI-1 und anderen Plasmiden werden hergestellt,, indem, man damit Ξ... coli HB-101 transformiert. Der Stamm HB-101 dient als geeigneter Wirt zur Erhaltung und Replikation von Plasmiden mit den vorliegend beschriebenen klonierten Insertionen.

Beispiel 2

Bau des Proinsulin-Transfer-Vektors

Die inserierte cDNA von pcHI-1 enthält die gesamte Codiersequenz für menschliches Pre-Proinsulin· Bei bestimmten Verwendungen wie dem Transfer in eine andere Art eukaryontischer Zellen können bei normaler Weiterverarbeitung und Entfernung von Pre-Sequenz und C-Peptid die Erzielung einer korrekt gefalteten Konfiguration und Bildung von aktivem Insulin erwartet werden· Unter anderen Umständen kann man vom Transfer in einer prokaryontische Zelle, wie z, B* ein Bakterium, die Bildung von unbehandeltem Protein erwarten. Im letzteren Fall ist der Bau einer Codier-Sequenz für Proinsulin von Vorteil, da Proinsulin nach bekannten Verfahren leicht in vitro in aktives Insulin umgewandelt wer- ~j den kann, (vergl. Kemmler, W. et al., J. Biöl. Chem. , 242, 6786 (1971)). Drei alternative Methoden zum Bau einer Proinsulin codierenden Sequenz werden vorliegend beschrieben. Ein Plasmid-Transfer-Vektor, enthaltend pBR322 mit einer inserierten Proinsulin codierenden Sequenz, wird als pcHP-1 bezeichnet.

• A. Sine chemisch synthetisierte Codier-Sequenz für die B-Kette von menschlichem Insulin wurde von Crea, R. et al., Proc. Hat.. Acad. Sei. USA, 75., 5765 (1978) beschrieben. Die synthetische Efucleotidsequenz unterscheidet sich von der natürlich vorkommenden, vorliegend beschriebenen Sequenz, da die synthetische Sequenz dazu bestimmt war, Codon-Zuordnungen ausfindig zu machen, die

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2_λλ _Γ ρ Α Ύ 60 147 18

3 8 5 6 S 2 - 30 -

von einem prokaryontischen Wirt wie S- coli stärker bevorzugt werden. Ferner wurde ein Methion .incodierendes Triplett direkt vor der Aminosäure 1 (Phe) eingefügt. Zufällig .jedoch, sind die beiden Sequenzen in der Region der Aminosäure 13 bis 14 identisch., die die einzige, beiden Seiten gemeinsame Alul-Stelle enthält. Die Plazierungen der AIuI-Stellen in der natürlichen Sequenz zeigt .Pig, 2.

Synthetische Proinsulin—DNA wird mit Alil-Endonuclease behandelt, wobei man zwei Fragmente aus 43 bzw, etwa 56 Basenpaaren erhält. Ferner wird die cDHA-Insertion von pcHI-1, vorzugsweise erhalten durch Hhal-Spaltung gemäß Beispiel 2B, gespalten durch eine partielle, mit Alul-Endonuclease katalysierte Hydrolyse unter Bildung von Fragmenten aus etwa 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 bzw. 455 Basenpaaren. Diese werden durch Gel-Elektrophorese- fraktioniert, wobei man das Fragment mit 375 Basenpaaren erhält, Ergebnis einer Spaltung an einer einzigen Steile im Godon für. Aminosäure Nr, 14,

Die Spaltungsfragmente des synthetischen Gens und das Spaltungsfragment aus 375 Basenpaaren der cDiFA-Insertion werden über stumpfe Enden verknüpft. Die korrekte Verbindung des synthetischen Fragments mit 43 Basenpaaren mit dem cDNA-Fragment mit 375 Basenpaaren wird maximiert, indem man vorsieht, daß die cDEA mit 375 Basenpaaren in molarem Überschuß vorhanden ist. Die Möglichkeiten einer unrichtigen Verbindung werden auch vermindert durch die Tatsache, daß die synthetischen Fragmente einsträngige vorstehende Enden besitzen, die mit den Enden des cDlIA-Fragments mit 375 Basenpaaren nicht komplementär sind.

Das verknüpfte Molekül, eine Zusammensetzung aus der synthetischen Sequenz, die Methionin gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 13 codiert, und der natürlich vorkommenden

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2 *s Α s- /* A η 60 147 18

Sequenz, die die Aminosäuren 14 "bis 86 von Proinsulin codiert, ergibt eine Codier-Sequenz für Proinsulin, Die Proinsulin codierende Sequenz kann in ein beliebiges Expresaionsplasmid inseriert werden, entweder durch Füllung oder Ausschneiden einsträngiger Enden und Anbringen der entsprechenden Bindungs-Oligonvucleotide«,

Die Expression ergibt ein Pusionsprotein, das am Methioninrest gespalten werden kann durch Behandlung mit Bromcyan, wobei das Proinsulin erhalten ?/,ird, Pro.insulin wird nach der Methode von Kemmler et al,, loc, cit, in Insulin überführt ,

B, Die cDHA-Insertion von pcHI-1 besitzt eine Hhal-

Stellung in der die Amino säuren -14 bis -13 codierenden Sequenz, wie aus Pig» 2 ersichtlich- Ferner besitzt der'Transfer-Vektor pBR322 eine Hhal-Stellung 22 Basenpaare entfernt von der Pstl-Stelle am 5'-Ende der Insertion, Es ist daher möglich, eine Sequenz erneut zu isolieren, die die gesamte Proinsulin codierende Sequenz und eine Region aus 22 Basenpaaren von' pBR322-DUA umfaßt, indem man pcHI-1 J mit Hhal-Endonuclease behandelt. Dieses Verfahren wird der erneuten Isolierung der Insertion mit Pstl-Endonuclease vorgezogen, da die Insertion zwei innere Pstl-Stellen enthält und die Ausbeute an intakter Insert.ions-DNA durch Behandlung mit Pstl-Endonuclease niedrig ist. Die Hhal-isolierte Sequenz ist ebenfalls zur Verwendung in den Verfahren der Beispiele 2A und 20 hervorragend geeignet.

Die Behandlung beider Isolate mit Hhal-Endonuclease führt zur Spaltung des Plus—Strangs ζτ/ischen den Aminosäuren -14 und -13 der Pre-Sequenz (der Plus-Strang ist derjenige Strang, dessen Hucleotidsequenz der mRUA-Sequenz entspricht, der Minus-Strang ist derjenige Strang, dessen Sequenz zur inRNA-Sequenz komplementär ist). Die restliche

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Pre-Sequenz: kann spezifisch entfernt werden, indem man die 3'-bis 5'-Exonucleass-Aktivität von T4-DHA-Polymerase ausnutzt, die auf den Minus-Strang am .Code-Ende der Pre-Sequenz und auf den. Plus-Strang am entgegengesetzten Ende wirkt.. Die exonucleolytische Reaktion kann bei einem bestimmten Fucleotid gestoppt werden, indem man das gleiche Uucleotid als Triphosphat in das Reaktionsgemisch einführt«. Der exonucleolytisehen Wirkung wirkt dann die Polymeraseaktivität des Enzyms entgegen, das stetig' das spezifische lucleotid ersetzt (s. Englund, P. T.,. J. Biol. C.hem., 246, (1971) und J. Mol* Biol*,. 66, 209 (1972)).

Die verbleibende Pre-Sequenz wird spezifisch zum IF-terminalen Phenylalanin-Codon der Aminosäure Έτ, 1 digeriert, durch 3 Zyklen einer T4-Polymerase-Digerierung. Der Zyklus 1 erfolgt in Gegenwart von TTT _r das die Digerierung gegenüber von A des Glycin-Codons in Aminosäure-Stellung -7 beendet. Zyklus 2 erfolgt in. Gegenwart von dCT?,. das die Digerierung gegenüber G von Codon-Stellung -5 (Asp) beendet, Zyklus 3 erfolgt in Gegenwart von dATP, das die Digerierung gegenüber T beendet, welches das erste lucleotid in Stellung 1 von Proinsulin ist.

Nach jedem Zyklus der T4-Polymerase-Digerierung muß das Triphosphat im gerade beendeten Zyklus entfernt und das Triphosphat des nächsten Zyklus eingeführt werden. Zum Abtrennen der Triphosphate aus dem Reaktionsgemisch werden l/Linisäulen mit "Sephadex G-75" (Pharmacia Inc., Uppsala, Schweden) verwendet. Die Säulen werden mit einem geeigneten Puffer ins Gleichgewicht gebracht, das Sammeln der Proben erfolgt mit einem Puffer, der das Triphosphat des folgenden Zyklus enthält. Auf diese ¥/eise kann zusammen mit der DiLA wanderndes Enzym die D¥A nicht über den nächsten ausgewählten Stopp-Punkt digerieren. Um eine Digerierung im unteren Teil der Säule nach Abtrennung des vorangehenden Tri-

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phosphats zu verhüten, erfolgt die Chromatographie in der Kälte (4 ⁰C), und die Eluierung wird durch Zentrifugieren beschleunigt.

Ferner kann man auch das Enzym vor der Chromatographierstufe durch Wärmeeinwirkung (65 ⁰C) inaktivieren. Der folgende Zyklus wird dann eingeleitet unter Zusatz von frischem aktivem Enzym. Als Ergebnis der 3 Digerierzyklen mit T4-Polymerase wird der Minus-Strang der DFA vollständig und insbesondere bis zum ersten Codon der Proinsulin codierenden Sequenz digeriert. Die Sequenz des Plus-Strangs am entgegengesetzten Ende des Moleküls, die ebenfalls ein 3'-Ende besitzt, ist derart, daß nur einige wenige Nucleotide; bei den obigen Digerierzyklen entfernt werden.

Der Plus-Strang am Pre-Sequenzende wird dann mit Sl-Exonuclease spezifisch digeriert, 'wobei diese auf einsträngige Enden einwirkt und ein stumpfendiges Molekül ergibt. Sorgfalt muß darauf verwendet werden, eine partielle Digerierung durch Sl-Nuclease über den Beginn des ersten Codons hinaus zu verhindern. Diese partielle Digerierung kann eintreten wegen des "Atmens" der Helix, einer teilweisen und vorübergehenden Unpaarung von DHA-Strängen» Das Atmen tritt im ganzen Molekül auf, jedoch am häufigsten in A-T-reichen Regionen und an den Enden der DlTA-Moleküle. Eine vorübergehende Unpaarung des A-T-reicaen Codons Hr. 1 könnte eine Sl-nucleolytische Wirkung über den gewünschten Stopp-Punkt hinaus erlauben. Ein solches Ergebnis wird verhindert, indem man die Sl-Digerierung unter Bedingungen maximaler Helix-Integrität, niedriger Temperatur (Raumtemperatur oder weniger) und hohem Salzgehalt ausführt, der gewöhnlich in Sl-Reaktionspuffem vorliegt.

Proben von DlA₃ die in aufeinanderfolgenden Stufen der Sl-

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Uucleasedigerierung erhalten werden, werden nach bekannten Methoden in einen geeigneten Transfer-Vektor kloniert. Die Sequenz-Analyse des kleinsten AIuI-Fragments solcher Klone wird verwendet, um Proinsulin codierende Klone auszusondern, bei denen die gesamte Pre-Sequenz entfernt ist.. '

Ein interessantes Verfahren zum Klonieren von Proinsulin codierender cDIJA umfaßt den Einbau von Oligo A-Snden mit terminaler Transferase an den 3'-Enden der cDETA» Oligo T-Enden werden am 3'-Ende an geeigneter Stelle eines Expressions-Transfer-Vektors erzeugt, z. B. an der EcoRl-Stelle im ß-Galactosidasegen im Plasmid pTS-1 (Ullrich, A.' et al), siehe auch die US-PS (US-Patentanmeldung 933 035). Die Inserierung der Proinsulin codierenden cD¥A nach dem obigen Verfahren führt zu einer korrekt orientierten Insertion in Phase, bezogen auf den Leseraster, mit dem ß-Galactosidasegen des Plasinids bei ¹/6 Wahrscheinlichkeit, Die Expression der Oligo Α-Enden führt zur Einführung von Lysin-Resten direkt vor Beginn der Proinsulinsequenz,- Eine milde Trypsin-Digerierung des Fusionsproteins ergibt- Pro— insulin, das auf vorstehend beschriebene Weise in aktives Insulin überführt wird, Ferner ergibt das Fustionsprotein bei Behandlung mit einer Kombination aus Trypsin und Carboxypeptidase B (oder Cathepsin B) aktives Insulin aus dem Fusionsprotein in einer einzigen Reaktion,

C. Eine Proinsulin codierende Sequenz wird aufgebaut

durch selektive Spaltung an einer Innenstelle in der Proinsulin codierenden Region, gefolgt von einer Anknüpfung einer chemisch synthetisierten Sequenz, die den Teil der Proinsulin codierenden Region codiert, der bei der vorangegangener- Spaltung entfernt wurde. Als,Quelle der Proinsulin codierenden Region wird das Plasmid pcHI-1 verwendet, das selektiv ausgeschnitten wird durch Behandlung mit Hhal-Endonuclease, siehe Beispieles.

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ο ο Q r c η λ ^{δ0 147 18}

£. O O 0 D α £

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ach der Isolierung wird jedes .!Fragment mit alkalischer hosphatase behandelt zur Entfernung der 5'-terminalen hosphatgruppe,. dann gespalten durch Behandlung mit einer estriktions-Sndonucleäse mit einer einzigen Spaltungstelle in der Proinsulin codierenden Sequenz. "Vorzugseise "befindet sich die Restriktionsstelle nahe einem nde der Proinsulin codierenden Sequenz, Die Alul-Stelle m Bereich der Aminosäuren 13 bis 14 liefert eine geeig-.ete .Spaltstelle (vergl, Pig. 2)«.. Das Hhal-Fragment von cHI-1 wird mit Alul-Sndonuclease partiell gespalten und rgibt 2 Fragmente aus etwa 76 bzw. 375 Basenpaaren, Die .luI-Fragmente werden durch Gelelektrophorese fraktioniert siehe Beispiel 2A), und das Fragment der 375 Basenpaare d.rd gewonnen..

fach der Phosp.hotriester-Methode von Itakura, .K, , et al. , '. Biol. Chem., 250, 4592 (1975) und Itakura, K., et al., '. Am. Chem.. Soc., 97., 7327 (1975) wird eine die ersten aninosäuren von Proinsulin codierende Hucleotidsequenz mit iinem 5'-terminalen G (am Plus-Strang) zur Komplettierung Les Codons für Alanin in Stellung 14 synthetisiert. Der r'lus-Strang der synthetischen DlTA besitzt die Sequenz 3^fiTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAG—S', entsprechend Ler natürlichen Sequenz. - Jedoch können auch andere die gleichen Aminosäuren codierende Sequenzen synthetisiert rerden. Im allgemeinen lautet die Sequenz 3^f-TTKGTLAAKCA rCAKXTYTGKGGLQRSCAKXTYGTLCAJG-S^?. Die resultierende Sequenz wird mit stumpfen Enden mit dem Fragment mit etwa 575 Basenpaaren des Hhal-Fragments von pcHl-1 verknüpft* Da letzteres nur am zu verknüpfenden .Ende eine 5^f-Phosphatgruppe besitzt, werden die 2 Fragmente in korrekter Reihenfolge verbunden. Das synthetische Fragment wird Ln etwa 50 % der Reaktionen korrekt mit dem größeren Fragment verknüpft.

238569 2

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Die mit Ligase behandelte DlTA wird kloniert in ein geeignetes Expressionsplasmid, entweder durch Bildung von Oligo Α-Enden (siehe Beispiel 2B) oder durch Anknüpfung von Bindegliedern und Inserierung in Expressionsplasniide mit bekannten Leserastern., Im Fall von Insertionen mit Oligo Α-Enden wird Expression des Proinsulins in etwa 712 der Klone beobachtet. Im Fall der direkten Inserie— rung, wo man weiß, daß das Leseraster korrekt ist, beträgt die Häufigkeit der Expressionsklone etwa 50 %,

Beispiel 3

Expression von menschlichem Pre-Proinsulin und Proinsulin·

Die Pre-Proinsulin (Beispiel 1) oder Proinsulin (Beispiel 2) codierenden klonierten Insertionen werden in einen Expressions-Transfer-Vektor inseriert. Erfolgt die Inserierung in korrekter Orientierung in bezug auf den Beginn der Translation an. der Inserierungsstelle, und befindet sich die Insertion in einer .Leseraster-Phase mit dem Promotor und der Ribosom-Bindungsstelle, so wird das Proteinprodukt des klonierten Gens synthetisiert durch aktive metabolisierende Wirtszellen, die durch den Transfer-Vektor transformiert wurden., Das Proteinprodukt ist ein Fusionsprotein, .falls der Expressions-Transfer-Vektor einen Teil eines prokaryontisehen Gens zwischen Promotor und der Inserierungsstelle enthält. Die Inserierung kann jedoch direkt benachbart zu einer Promotorstelle ausgeführt werden. In solchen Fällen wird das von der Insertion codierte Protein direkt synthetisiert. Beide Techniker zeigen Vor- und lachteile. Fusionsproteine besitzen den Vorteil, daß sie zur Stabilisierung des vom inserierten Gen codierten Fremdproteins neigen. Auch werden erwünschte funktionale Eigenschaften wie Abgabe aus der Wirtszelle durch Fusion mit bestimmten Wirtsproteinen wie z. B. ß-Lactainase beigetragen. Andererseits wird die Reinigung der inserier-

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ten Code-Sequenz; kompliziert durch den generellen Wunsch, den Wirtste.il des Fusionsproteine spezifisch zu entfernen. Diese. Entfernung erfolgt duch bekannte Techniken, die in den Beispielen. 2A und 2B beschrieben sind. Die direkte Synthese des gewünschten Proteins umgeht die Notwendigkeit einer spezifischen Spaltung, schließt jedoch .im allgemeinen die Möglichkeit der Abgabe aus der 'vVirtszelle aus*

Es wurden Expressionsplasmide entwickelt, in denen die Expression durch den lac-Promotor kontrolliert wird (siehe Itakura, et al., Science, 198» 1056 (1977), Ullrich, A, et al*, Excerpta Medica, (1979)), durch den trp-Promotor (siehe Martial, et al., Sei.-, 2O5_, 602 (1979)) oder durch, den ß-Lactainase-Promotor (siehe US-PS (US-Patentanmeldung 44 647)).

Die Expression wird festgestellt über ein Produkt, das befähigt ist, sich iminunochemisch mit einem Anti-Insulin-Antikörper oder einem Anti-Proinsulin-Antikörper zu verbinden. Man wendet Radioimmuntests, bei denen der Antikörper radioaktiv markiert ist und Antigen/Antikörper-Paare durch ein Präparat aus hitzegetöteten Stap.hyloc.coecus aureus C ausgefällt wurden, an (vergl. Morgan und Lazarow, Diabetes, r2_, 115 (1963) und Kessler, S. W., J. Immunol», 115, 161.7 (1975)). Zur Feststellung der Expression in Bakterienkolonien verwendet man das Radioiinmun-Screening (siehe Erlich, H. A., et al., Gell, 1£, 681 (1978) oder Broome, S, und Gilbert, W., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 2746 (1978)).

Eine Expression anzeigende Fusionsproteine werden ermittelt, indem man die Molekulargewichte von Wirtsprotein, welches den IJ-terminalen Teil des Fusionsproteins beisteuert, in Wirtszellen vergleicht, die durch Expressionsplasmide mit und ohne Insertion transformiert wurden. Eine bevorzugte

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238 5 69 2 -38- ^{60 U718}

Yerfahrensvariante besteht in der Verwendung des Minizellen produzierenden Stamms von S* coli P 678-54 als Wirt, Radioaktiv markierte Aminosäuren werden den Minizellenproteinen einverleibt, wobei Stämme mit Expressions-'Transfer-Vektoren mit und ohne inserierter Proinsulin codierender Sequenz verglichen werden,. Die Proteine werden durch SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert, und die Proteinpositionen werden autoradiographisch festgestellt. Die Expression von Proinsulin ergibt sich·aus der Anwesenheit einer markierten Proteinbande, die nur bei Minizellen gefunden wird, die durch das Proinsulin-Sspressionsplasmid transformiert wurden. Die Lage der elektrophoretisehen Bande gibt ein Maß für das Molekulargewicht des esprimierten Proteins und stimmt überein mit der bekannten Länge des inserierten Gens und des K-terminalen prokaryontischen Anteils,

Die Entfernung des prokaryontischen Anteils und Umwandlung von Proinsulin in Insulin in vitro erfolgen nach bekannten Verfahren, die vorstehend bereits beschrieben wurden.

Claims (5)

10. 12. 1981 Ο O Q C C Q O 60 147 18

Erf indungsan Spruch:

1. Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Proinsulin, enthaltend A- und B-Peptide, die durch ein C-Peptid voneinander getrennt sind, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus inkubiert, der durch einen Expressions-Transfer-Vektor transformiert wurde, der eine menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz enthält, die hergestellt wurde durch Hydrolysieren der 3'-Enden einer menschliches Pre—Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz in einem oder mehreren Zyklen einer stufenteisen exonucleolyt.isehen Digerierung, die durch in Gegenwart eines Deoxynucleotidtriphosphates arbeitenden 1!4-DlTS-PoIymerase katalysiert wird, anschließendes Hydrolysieren der 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz über eine nucleolytische Digerierung, die durch ein für einzelsträngige ΏΈ3 mit 5'-Enden spezifischen Hucleaseenzym katalysiert wird, und Umsetzen der so erhaltenen, menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz mit einem DUS-MoIekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde,.unter Bedingungen, die für die Expression der menschliches Proinsulin codierenden Sequenz geeignet sind, sowie das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt,

2» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

238 5 63

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und die die A-Kette codierende Deozynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist;

5'-GGL^ATM^GTL^GAJ.qCAJ^TGK^ TGK₇₀ACL₇-ob of bo by (U (I id Ij

QR₇₄S₇₄ATM₇₅TGK₇₆QR₇₇S₇₇X₇₈TAK₇₉CAJ₈₀X₈₁Ty₈₁CAJ₈₂ AAK₈₃TAK₈₄TGK₈₅AAK₈₆-3'; worin

A = Deoxyadenyl

G = Deoxyguanyl

C = Deoxycytosyl

T = Thymidyi

J = A oder G

K = T oder C

L = A, T, C oder G

M = A, C oder T

X = T oder C, wenn Y=A oder G, und C, falls Y=C η η . η

oder T Y = A, G, C₇ -oder T, wenn X_n = C, und A oder G, falls

X_n = T W = C oder A, wenn Z=G oder A, und C, falls Z=C

oder T Z = A, G, C oder T, wenn W=C, und A oder G, falls

W_n = A QR_n = TC, wenn S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S_n = T

oder C S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C, falls

QR_n = AG,

_ IQ. 12. 1981

2 3 8 R- β Q 7 ^{6ο 14718}

und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der _/ Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins, dem .jedes Triplett in der Nucleotidsequenz entspricht, nach dem genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäure Stellungen vom Aminoende her beziffert sind.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Proinsulin.codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plusstrang umfaßt, der (a) die Deoxynucleotidsequenz (lyyy.. mit einem 5'- und einem 3'-Ende aufweist, wobei Έ^ I_fe und N₀ die Bedeutung A, T, G oder C haben können und j eine ganze Zahl von Null bis 100 sein kann, wobei iyyT_c nicht TGA, TAA oder TAC-sein kann; (b) eine die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz, die an die 5'-Enden von (Ν_β\Ι₀;κ gebunden ist; und (c) eine die A-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz, die an die 3'-Enden von (M^lf^ gebunden ist, enthält.

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Transfervektor mit Pstl-Endonuclease geschnitten wird, um das BNS-MoIekiil pBR322 zu erhalten, und dieses DITS-Molekül mit der menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz umgesetzt wird, um zu dem Plasmid pcHP-1 zu gelangen.

5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das DHS-Molekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, an einer Stelle innerhalb einer expr.iinierbaren Kontrollregion geschnitten sind.

Hierzu Z Seiten Zeichnungen

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