DD208989A5 - Verfahren zur synthetisierung von menschlichem insulin - Google Patents

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR SYNTHESE VON MENSCHLICHEM INSULIN, DAS DADURCH GEKENNZEICHNET IST, DASS MAN DIE SULFHYDRYLGRUPPEN IN DEN A- UND B- PEPTIDEN VON MENSCHLICHEM PROINSULIN OXYDIERT UNTER BILDUNG VON DISULFIBRUECKEN ZWISCHEN A- UND B- PEPTIDEN UND DANN DAS C- PEPTID AUSSCHNEIDET DURCH EINE HYDROLYSE, DIE VON EINEM ENZYM KATALYSIERT WIRD, WELCHES FUER DIE BINDUNGEN SPEZIFISCH IST, DIE DAS C- PEPTID MIT DEN A- UND B- PEPTIDEN VERBINDEN.

Description

J* I

2.81

23 8 5 63 5 -'- » ι«

AP C12H/223

Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Insulin Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Insulin»

Charakteristik der bekannten teähnischen Lösungen

Insulin ist ein Hormon, das hauptsächlich von den E-Zellen der Bauchspeicheldrüse produziert wird· Die Verwendung dieses Hormons zur Behandlung von Diabetes ist hinreichend bekannt. Obgleich von Schlachthöfen Rinder- und Schweine-Bauchspeicheldrüsen als Insulin-Quellen geliefert werden, entwickelt sich eine Knappheit bei diesem Hormon, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Außerdem entwickeln manche Diabetiker allergische Reaktionen gegen Rinder- und Schweineinstilin mit nachteiligen Wirkungen. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in für den Weltbedarf ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen, wird daher angestrebt. Die vorliegende Erfindung liefert Gene, die in Mikroorganismen inseriert und zur Herstellung von menschlichem Insulin verwendet werden können*

Insulin besteht aus zwei Polypeptidketten, die als A- und B-Kette bekannt sind und die über Disulfidbrücken verknüpft sind. Die Α-Kette besteht aus 21 Aminosäuren, die B-Kette aus 30 Aminosäuren, Diese Ketten werden in vivo nicht unabhängig voneinander synthetisiert, sondern sie entstammen einem direkten Vorläufer, der als Proins-ulin bezeichnet wird. Pro insulin ist eine einzige Polypeptidkette, in der ein Peptid, das als C-Peptid bezeichnet wird, die A- und B-Ketten verknüpft (vergleiche Steiner, D.P. et al.,

3 0. MP7

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Science J_57, 697 (1967))· Dieses C-Peptid wird beim Einlagern des Insulins in die Sekretionsgranulen der B-Zellen der Bauchspeicheldrüse vor der Sekretion ausgeschnitten, vergleiche Tager, H« S, et al«, Ann, Hev, Biochem, _43, 509 (1974). Die heutige Ansicht über die Punktion des C-Peptids geht dahin, daß es ntir zur Bildung der dreidimensionalen Molekülstruktur dient. Die Aminosauresequenz des menschlichen Proinsulins ist in Tabelle 1 dargestellt. In dieser Tabelle besteht die B-Kette aus den Aminosäuren 1 bis 30, das G-Peptid aus den Aminosäuren 31 bis 65 und die A-Kette aus den Aminosäuren 66 bis 86_O

Tabelle 1

1 10

I^-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-

AIa-Le u- Tyr-Le u-Yal-Cy s-.Gl y-Glu- Arg-Gly-Phe-Phe- Try- Thr·-

30 40

Pro-Lys-Tnr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-

50

Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gin-Pro-

60 Leu-AIa-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-

70 80

Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-

86

Try-Cys-Asn

Die chemische Synthese dieser Sequenz aus 86 Aminosäuren ist zwar mit konventionellen Verfahren machbar, jedoch schwierig.

23 85 6 3 5 -3- ₉.ι₂.βι

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In den B-Zellen der Bauchspeicheldrüse ist das ursprüngliche Übertragungsprodukt nicht das Pro insulin selbst, sondern ein Pre-Pro insulin, das mehr als 20 zusätzliche Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins besitzt; vergleiche Cahn, S. J» et al., Proc. Hat. Acad. Sei., USA 23, 1964 (1976) und Lomedico, P· T. et al., STucl. Acid Res. 2» 381 (1976). Die zusätzliche Aminosäuresequenz wird als Signal-Peptid be-(" ' zeichnet. Im menschlichen Pre-?roinsulin (vergleiche Fig· 2)

besitzt das Signal-Peptid 24 Aminosäuren der Sequenz -24 -20

M₀-Me t-Ala-Le u-T:r>-Met-Arg-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu~ AIa-Leu-Leu- -i82 ° _-, - ' - " " -

Ala-Leu-Trp-Gly-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-AIa. Es wird angenommen, daß die Sequenz aus 24 Aminosäuren ein spezifisches Signal für den vektorialen Transport des Polypeptide in das endoplasmische Reticulum der B-Zellen darstellt, sie wird in dieser Phase vom Proinsulin abgespalten (vergleiche Blobel, G. et al,, J. Gell. Biol. 67, 835 (1975)). '

Es sind mehrere Pälle von Signal-Peptiden für eukaryontische Proteine bekannt, die durch Membranbarrieren transportiert werden. Ein spezifisches Spaltungsenzym wurde in einem zellfreien System beobachtet, das die Peptidbindung zwischen Signal-Peptid und aktivem Protein gleichzeitig bei der Passage durch eine Zellmembran hydrolysiert (siehe Blobel,G. et al., Proc. Hat. Acad. Sei USA 7j>, .361 (1978)).

Die neueren Fortschritte in der Biochemie und der Technologie der ileukombination von DS^-A machten die Synthese von spezifischen Proteinen unter kontrollierten Bedingungen, unabhängig vom höheren Organismus, aus dem die Proteine gewöhnlich isoliert werden* möglich. Diese biochemischen synthetischen Methoden verwenden Enzyme und subzellulare Komponenten des Proteinsyntheseapparats lebender Zellen

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entweder in vitro in zellfreien Systemen oder in vivo in Mikroorganismen« In jedem Pail ist das Schlüsselelement die Bereitstellung einer Deoxyribonucleinsäure (DHA) spezifischer Sequenz, die die für die gewünschte Aminosäuresequenz erforderliche Information enthält. Eine solche spezifische ΏΈΑ wird als Gen bezeichnet. Die Code-Beziehung, bei der eine Deoxynucleotidsequenz verwendet wird zur Beschreibung der Aminosäuresequenz eines Proteins wird nachstehend kurz erläutert, sie basiert auf Grundprinzipien, die im gesamten Gebiet der lebenden Organismen gelten·

Bin kloniertes^: Gen kann' verwendet werden, um die Aminosäuresequenz von in-vitro-Systemen synthetisierten Proteinen aufzuklären» Auf DHA ausgerichtete Protein-synthetisierende Systeme sind bekannt, siehe z, B, Zubay, G,, Ann· Rev. Genetics 7, 2β7 (1973)· ferner kann eine einsträngige DlA in vitro die Wirkung einer,messenger-RUA erhalten, woraus eine sehr genaue Translation der DUA-Sequens folgt (Salas,J„ et al,, J, Biol* Chesu ,243, 1012.(1968). Andere bekannte Techniken können in Kombination mit obigen. Verfahrensweisen zur Verbesserung der Ausbeuten verwendet werden*

Die Entwicklung der Methoden der DITA-Heukombination machte es möglich, spezifische Gene oder Teile davon aus höheren Organismen zu isolieren, z. B, vom Menschen und anderen Säugetieren, und diese Gene oder Fragmente in einen Mikroorganismus, z« B, eine Bakterie oder Hefe, zu übertragen» Das übertragene Gen wird repliziert und vermehrt sich mit der Replication des transformierten Mikroorganismus, Als Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, jedes Protein zu erzeugen, das das Gen oder Gen-Fragment codiert, handle es sich um ein Enzym, ein Hormon, ein

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Antigen oder einen Antikörper oder ein Stück davon« Der Mikroorganismus vererbt diese !Fähigkeit seinen Nachkommen, so daß in der Tat die Übertragung zu einem neuen Stamm mit der genannten Fähigkeit führt (siehe z, B· Ullrich, A, et al., Science J_96, 1313 (1977) und Seeburg, P, J. et al·, Hature 270, 486 (1977)). Eine Voraussetzung, die der Anwendung dieser Technologie auf die Praxis zugrunde liegt besteht darin, daß die DUS aller lebenden Organismen, von Mikroben bis zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen'4 nucleotiden besteht, Die signifikanten Unterschiede liegen in den Sequenzen dieser Nucleotide im polymeren DHA-Molekül, Die Uucleotidsequenzen dienen znr Beschreibung der AminosäureSequenzen von Proteinen, die den Organismus bilden. Obgleich die meisten Proteine verschiedener Organismen sich voneinander unterscheiden, ist die Code-Beziehung zwischen UucTeotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle Organismen im Grunde gleich. Die Uucleotidsequenz, die z« B. die Aminosäuresequenz von menschlichem Wachstumshormon in menschlichen Hypophysenzellen codiert, codiert nach Übertragung in einen Mikroorganismus die gleiche Aminosäuresequenz,

Die vorliegend verwendeten Abkürzungen sind aus Tabelle 2 ersichtlich:

Tabelle 2

DUA - Deoxyrcibonucleinsäure A - Adenin.

EUA - Ribonuc leinsäure T - Thymin

cDITA - komplementäre DlJA G - Guanin

(enzymatisch synthetisiert G - Cytosin

aus einer rnBUA-Sequenz) U - Uracil

mRlA - messenger-RM AT? - AdenosintridATP - Deozyadenosintriphosphat phosphat

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9.12.81 60 148 18

dGTP - Deosygnanosintr!phosphat dCTP - Deoxyc-ytidintr !phosphat

TTP - Thymidintriphosphat EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

Die Code-Beziehung zwischen Hucleotidsequenz in DJiA und Aminosäuresequenz in Protein ist als genetischer Code bekannt, siehe Tabelle 3:

Tabelle 3	TTK
Genetischer Code	ΣΤΥ
Phenylalanin (PEe)	ATM
Leucin (Leu)	ATG
Isoleucin (lie)	GTL
Methionin (Met)	QHS
Valin (YaI)	GCL
Serie, (Ser)	ACL
Prolin (Pro)	GCL
Threonin (ThT)	TAK
Alanin (AIa)	TAJ
Tyrosin (Tyr)	TGA
Terminationssignal·
Terminationssignal

Histidin (His) CAK

Glutamin (Gin) CAJ

Asparagin (Asn) AAK

Lysin (Lys) AAJ

Asparginsäure (Asp) GAK

Glutaminsäure (GIu) GAJ

Cystein (Cys) TGK

Tryptophan (Try) TGG

Arginin (Arg) WGZ

Glycin (GIy) GGL

Schlüssel: jedes Deoxynucleotid-Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der mR2?A dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3^f-Snde rechts. Alle vorliegend angegebenen DHA-Sequenzen sind diejenigen des Strangs, dessen Sequenz der mRHA-Sequenz entspricht, wobei Uracil durch Thymin ersetzt ist. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Deoxynucleotidsequenz bilden:

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- 7 - 9.12*81.

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A = Adenin

G = Guanin

C = Cytosin

T = Thymin

X=T oder C, falls Y=A oder G

X=C, falls Y=C oder T

Y = A, G, C oder T, falls X=C

Y=A oder G, falls X=T

W = C oder A, falls Z=A oder G

W=C, falls Z=C oder T

Z = A, G, C oder T, falls W=C

Z=A oder G, falls W = A

QR = TC, falls S = A, G, C oder T

QR = AG, falls S=T oder C

S = A, G, C oder T, falls QR = TC

S=T oder C, falls QR = AG J=A oder G

K=T oder C

L = A, T, C oder G M = A, C oder T

Ein wichtiges Merkmal des Codes ist die Tatsache, daß jede Aminosäure beschrieben wird durch eine Trinucleotidsequenz, die auch als Uucleotid-Triplett bekannt ist· Die Phosphodiester-Bindüngen, die benachbarte Tripletts verbinden, sind chemisch von.allen anderen Internucleotid-Bindungen der DHA nicht zu unterscheiden· Daher kann die Hucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden ohne daß zusätzliche Information iiber den Leserraster vorliegt, womit die Gruppierung der Tripletts erkannt und in der Zelle die Entschlüsselung der genetischen lachricht erfolgt.

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Verschiedene Techniken der DITA-neukombination verwenden zwei Klassen von Verbindungen, Transfer-Vektoren und Bestriktionsenzyme, die nacheinander beschrieben werden· Sin Transfer-Vektor ist ein DM-Molekül, das unter anderem die genetische Information enthält, die die eigene implikation nach Übertragung in den Stamm eines Wirts-Mikroorganismus sicherstellt. Beispiele für häufig-verwendete Transfer-Vektoren sind Plasmide und die DSAs bestimmter Bakteriophagen, Bei den vorliegenden Arbeiten wurden zwar Plasmide als Transfer-Vektoren verwendet, doch können auch andere Arten von Transfer-Vektoren eingesetzt werden. Unter einem Plasmid versteht man eine sich autonom replizierende D3SA-Einheit, die in einer Mikroorganismus-Zelle neben dem Genom der Wirtszelle selbst vorliegen kann· Sin Plasmid ist mit dem Chromosom der .Wirtszelle nicht genetisch verknüpft. Plasmid-DUAs liegen als doppeIsträngige Ringe mit einem Molekulargewicht im allgemeinen in der Größenordnung von einigen Million Dalton vor, obgleich in manshen Fällen auch Molekulargewichte von

8 mehr als 10 Daltons vorkommen· Sie stellen gewöhnlich nur eine kleine prozentuale Menge der gesamten DIJA der Zelle dar. Eine Transfer-Vektor-DUA läßt sich gewöhnlich von der DSA der Wirtszelle aufgrund der erheblichen Größenunterschiede absondern. Transfer-Vektoren tragen genetische Information, die sie zur Replikation in der Wirtszelle befähigt, in den meisten Fällen unabhängig von der Geschwindigkeit der Zellteilung, Einige Plasmide besitzen die Eigenschaft, daß ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann* Mit geeigneten Techniken kann der Ring der Plasmid-DUA geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DlA wird inseriert und der Ring wird erneut geschlossen, wobei ein vergrößertes Molekül entsteht, das das inserierte DUA-Segment enthält. Bakteriophagen-DHA kann ein Segment haterologer DIiA inseriert enthalten anstel-

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le bestimmter nicht-essentieller Phagengene, In jedem Pail dient der Transfer-Vektor als Überträger oder Vektor eines inserierten Fragments aus heterologer DNA.

Die übertragung erfolgt in einem Verfahren, das als Transformation bezeichnet wird« Während der Transformation nehmen mit Plasmid-DHA vermischte Bakterienzellen gesamte Plasmidmoleküle in die Zellen auf« Obgleich der Mechanismus des Vorgangs unbekannt ist, ist es möglich, den inteil der zur Aufnahme von Plasmid-DITA und damit zur Transformation befähigten Bakterienzellen zu maximieren durch bestimmte, empirisch ermittelte Behandlungen, Sobald die Zelle ein Plasmid einverleibt hat, wird dieses in der Zelle repliziert und die Plasmid-Wiederholungen werden bei der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilt» Im Prinzip kann jede genetische Information, die in der Hucleotidsequenz der Plssmid-DNA enthalten ist, in der Wirtszelle esprimiert werden· Typischerweis.e erkennt man eine transformierte Wirtszelle daran, daß sie vom Plasmid beigesteuerte Züge angenommen hat wie z, B, Resistens,gegen bestimmte Antibiotika« Verschiedene Plasniide erkennt man an verschiedenen Fähigkeiten oder der Kombination von Fähigkeiten, die sie den Wirtszellen vermitteln* Jedes Plasmid kann vermehrt werden, indem man eine reine Kultur plasmidhaltiger Zellen vermehrt;und die Plasmid-DJIA daraus isoliert.

Restriktions-Endonucleasen sind hydrolytische Enzyme, die eine stellungsspezifische Spaltung von DHA-Molekülan katalysieren. Die Wirkungsstelle der Restriktions-Endonuclease wird durch das Vorliegen einer spezifischen Hucleotidsequenz bestimmt, Diese Sequenz nennt man die Erkennungsstelle der Restriktions-Sndonuclease. Restriktio_tns-Endonucleasen

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aus verschiedenen Quellen wurden isoliert und bezüglich der Hucleotidsequenz ihrer Erkennungsstellen charakterisiert. Einige Restriktions-Endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiester-Bindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so daß stumpfe Enden entstehen· Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige nucleotide voneinander entfernt sind, wobei freie einsträngige Hegionen an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbstkomplementär und daher' kohäsiv, sie können zur Wiedervereinigting der hydrolysierten DHA verwendet werden« Da jede DUA, die durch ein solches Enzym spaltbar ist, die gleiche Erkennungsstelle besitzen muß, entstehen gleiche kohäsive Enden, so daß es möglich ist, heterologe DHA-Sequenzen zu verknüpfen, die mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt wurden (vergleiche Roberts, R, J., Grit*. Rev. Bioche-m* J., 123 (1976)). Erkennungsstellen sind relativ selten, jedoch wurde die allgemeine Anwendbarkeit der Restriktions-Endonucleasen erheblich erweitert durch chemische Synthese äoppelsträngiger Oligonucleotide mit der·Sequenz der Erkennungssteile. Man kann daher praktisch jedes Segment einer DHA mit einem anderen Segment verknüpfen, indem man einfach das entsprechende Restriktions-Oligonucleotid an,die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions—Sndonuclease unterwirft, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen (vergleiche Heynecker, H. L· et al,, lature 263, 748 (1976) und Scheller, R, H. et al,, Science 1_9S, ]77 (1977)). Ein wesentliches Merkmal : ?r Verteilung von Erkennungsstellen von Restriktions-Sndonucleasen ist die Tatsache, daß sie im Bezug auf das Leseraster zufällig verteilt sind. Polglich kann die Spaltung durch Restriktions-Endonuclease zwischen benachbarten Godons oder. innerhalb eines Codons erfolgen«

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Weitere allgemeine Methoden zur DHA-Spaltung oder zur Modifizierung der Endsequenz stehen zur Verfügung. Mit verschiedenen nicht-spezifischen Endonucleasen kann DUA zufällig gespalten werden, wie nachstehend noch beschrieben wird. Endsequenzen können modifiziert werden, indem man Oligonucleotid-Schwänze aus dA an einem Ende und dT am anderen Ende, oder aus dG und dC bildet, um Bindungsstellen zu erzeugen, v._ die keiner spezifischen Bindegliedsequenzen bedürfen.

Die Bezeichnung "Expression" wird verwendet in Anerkennung der Tatsache, daß ein Organismus nur selten, wenn überhaupt, alle ihm genetisch, zustehenden Fähigkeiten zu einem bestimmten Zeitpunkt ausnützt« Sogar bei relativ einfachen Organismen wie Bakterien werden zahlreiche Proteine, zu deren Synthese die Zelle befähigt ist, nicht gebildet, obgleich sie unter geeigneten Milieubedingungen entstehen können· Wird das durch ein bestimmtes Gen codierte Proteinprodukt vom Organismus synthetisiert, so sagt man, daß das Gen exprimiert wird· Entsteht das Proteinprodukt nicht, so wird das Gen nicht exprimiert. Gewöhnlich wird die Expression von Genen in E· coli, wie nachstehend allgemein beschrieben, reguliert, derart, daß Proteine, deren Punktion in einem gegebenen Milieu nicht nützlich ist, nicht synthetisiert werden und Stoffwechselenergie gespart wird· Die Steuerung der Gen-Expression in E, coli ist als Ergebnis umfangreicher Studien im Verlauf der letzten 20 Jahre gut bekannt (siehe Hayes, W., The Genetics of Bacteria and their Viruses, 2. Aufl., John Wiley & Sons, Inc., lew York (1968), und Watson, J, D., The Molecular Biology of the Gene, 3· Auf1*, Benjamin, Menlo Park, California (1976)). Diese Untersuchungen haben ergeben, daß mehrere Gene, gewöhnlich solche, die Proteine zur Ausführung verwandter Punktionen in der Zeile codieren, als Cluster in kontinuierlicher Sequenz vorliegen*

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Das Cluster wird, als Operon bezeichnet. Alle Gene im Operon werden in gleicher Sichtung transkribiert, beginnend mit den die Έ-terminals Aminosäuresequenz des ersten Proteins der Sequenz codierenden Codons und fortlaufend bis zum C-terminalen Ende des letzten Proteins im Operon· Am Anfang des Operons, benachbart zum N-terininalen Aminosäure-Codon liegt eine Region der DIA, die als Kontrollregion bezeichnet wird und die eine Yielzahl steuernder Elemente umfaßt wie den Operator, Promotor und Sequenzen für ribosomale Bindungsstellen« Die Punktion dieser Stellen besteht darin, daß die Expression-der unter ihrer Kontrolle stehenden Gene auf die Bedürfnisse des Organismus reagiert« Beispielsweise werden Gene, die Enzyme codieren, welche ausschließlich dem Lactose-Abbau dienen, gewöhnlich nicht in erheblicher Menge exprimiert, wenn nicht Lactose oder ein Analogen davon tatsächlich im Medium vorhanden ist. Die Funktionen der Kontrollregion, die vorhanden sein müssen, damit Expression stattfindet, sind der Beginn der Transkription und Beginn der Translation» Die Expression des ersten Gens der Sequenz wird eingeleitet durch die Einleitung von Transkription und Translation in der die l-terminale Aminosäure des ersten Proteins des Operons codierenden Stellung· Die Expression «jedes Gens stromabwärts von dieser Stelle beginnt ihrerseits, mindestens bis ein Terminationssignal oder ein anderes Operon mit dessen eigener Kontrollregion eingreifen, die auf eine andere Kombination von Milieubedingungen reagieren* Bei zahlreichen Variationsmöglichkeiten dieses allgemeinen Schemas besteht die wichtige Tatsache darin, daß ein Gen zur Expression in einem Prokaryonten wie E, coli in Bezug auf eine Kontrollregion mit einem Initiator für Transkription und einem Initiator für Translation richtig angeordnet sein muß.

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Es wurde gezeigt, daß Gene, die kein üblicher Teil eines bestimmten Operons sind, in das Operon inseriert und von diesem gesteuert werden können. Die klassische Demonstration erfolgte durch Jacob, P. et al«, J« Mol· Biol. 13.» 704 (1965). Bei diesem Versuch wurden Gene, die Enzyme einer Purin-Biosyn these codierten, in eine durch das Lactose-Operon kontrollierte Region übertragen« Die Expression des Enzyms der Purin-Biosynthese wurde dann in Abwesenheit von lactose oder einem Lactose-Analogon unterdrückt und blieb unbeeinflußt von den Milieubedingungen, die gewöhnlich diese Expression regulieren»

Zusätzlich zur Operator-Segion, die die Einleitung der Transkription von Genen stromabwärts reguliert, gibt es Codons, die als Stopp-Signale wirken und das C-terminale Ende eines bestimmten Proteins anzeigen (vergleiche Tabelle 3)» Diese Codons. sind als ^:Terminationssignale und auch als UuIl-COdOnS bekannt, da sie gewöhnlich keine Aminosäure codieren· Die Streichung eines Terminationssignals zwischen strukturellen Genen eines Operons erzeugt ein fusioniertet Gen, das zur Synthese eines chimärischen Proteins führen könnte, das aus zwei von benachbarten Genen codierten Aminosäuresequenzen besteht, die über.eine Peptidbindung verknüpft sind* Die Bildung-solcher chimärischen Proteine bei Gen-Fusion wurde von Benzer, S. und Champe, S. P., Proc· Bat· Acad. Sei USA 43, 114 (1962) gezeigt.

Sobald ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert wurde, wa3 man als "Klonierung¹¹ des Gens bezeichnet, ist die Verfügbarkeit in ausreichenden Mengen sichergestellt. Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Mikroorganismus übertragen, in dem es sich repliziert und aus dem es nach konventionellen Verfahren wieder

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isoliert werden kann. Man erhält auf diese Weise eine stetig erneuerbare Quelle des Gens für weitere Versuche, Abwandlungen und Transfer in andere Vektoren oder an andere Stellen des gleichen Vektors· Die Expression wird erzielt, indem man das klonierte Gen bei richtiger Orientierung und Leseraster in eine Kontrollregion einführt, derart, daß das Ablesen des prokaryontischen Gens zur Synthese eines chimärischen Proteins führt, welches die vom klonierten Gen codierte Aminosäuresequenz enthält. Zahlreiche spezifische Proteinspaltungsverfahren können eingesetzt werden, um das chimärische Protein an einer gewünschten Stelle zn spalten, so daß die gewünschte Aminosäuresequenz frei wird, die dann in konventioneller Weise gereinigt werden kann. Techniken zum Aufbau eines Expressions-Transfer-Vektors mit dem klonierten Gen in geeigneter Stellung zu einer Kontrollregion wurden beschrieben von Polisky, B*, et al·, Proc· Hat, Acad. Sei· USA 73, 3900 (1976); Itakura,' Z. et al·, Science 1_98, 1056 (1977); Villa-Komaroff, L·- et al«, Proc, Hat. Acad« Sei USA TJj, 3727 (1978)·, Mercereau-Puijalon, 0. et al,, Nature 275, 505 (1978); Chang, A, C. ϊ· et al·,.-Nature 275, 617 (1978) und in der US-PS (US-Patentanmeldung 933 035).

Das Verfahren, durch das ein Säugetierprotein wie z· 3· menschliches Pre-Proinsulin oder Pro insulin mit Hilfe der Technologie der DNA-Rekombination erzeugt wird, erfordert zunächst die Klonierung des Säugetiergens, lach Klonierung kann das Gen in Mengen produziert, chemisch oder enzymatisch weiter modifiziert und in ein Expressions-Plasmid transferiert werden· Das klonierte Gen eignet sich auch zur Isolierung verwandter Gene oder, bei Kionierung eines Fragments, zur Isolierung des gesamten Gens, wobei das klonierte Gen als Hybridisierungsansatz verwendet wird» Ferner-ist das

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klonierte Gen brauchbar, um durch Hybridisierung die Idendität oder Homologie unabhängiger Isolate des gleichen oder verwandter Gene nachzuweisen· Aufgrund des genetischen Codes bestimmt das klonierte Gen nach Translation im geeigneten Leseraster die Produktion nur der Aminosäuresequenz, die es codiert und keiner anderen.

Über die Isolierung und Reinigung von Ratten-Pro insulin wurde bereits gearbeitet. Ullrich, A· et al,, loc· cit«, und Villa-Komaroff, L., et al., loc. cit. beschreiben die Isolierung und Reinigung von Ratten-Proinsulingen und ein Verfahren zur Übertragung dieses Gens in einen Mikroorganismus und dessen Replikation dort. Ullrich et al. erhielten mehrere rekombinante Plasmide, die die Codier-Sequenz für Proinsulin, die 3'-untranslierte Region und einen Teil des ?orpeptids enthielten. Die Expression der Ratten-DUA mit der Codier-Sequenz für Insulin ist in der US-PS (US-Patentanmeldung-933 Q35) beschrieben. Villa-Komaroff et al« erhielten ein rekombinantes Plasm id, das die Codier-Sequenz für die Aminosäuren 4 bis 86 von Proins tu. in' enthielt, Diese Proinsulin-Sequens wurde von den Aminosäuren 24 bis 182 der Penicillinase (ß-lactamase) getrennt durch die Codier-Sequenz von 6 Glvcinen. Diese Codier-Sequenz für Penicillinase-Proinsulin wurde exprimiert zur Bildung eines Ftisionsproteins. In den genannten Literaturstellen werden einige der Grundverfahren der Technologie der DM-Rekombination beschrieben* licht beschrieben wird jedoch die Isolation und Reinigung von menschlichem Pre-Proinsulingen oder menschlichem Proinsuiingen.

Einen anderen Versuch zur Herstellung von menschlichem Insulingen unternahmen Crea, R. et al., Proc, Hat, Acad. Sei ^USA 12* 5765 (1978). Hierbei folgte chemische Synthese der

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Codier-Sequenz en für (1) die A-Ke t te und. (2) die B-Kette von menschlichem Insulin unter Verwendung von Codons, die von E. cöli bevorzugt werden· Diese beiden Sequenzen können dann in Plasmide inseriert werden, die bei der Expression die A- und B-Ketten bilden, Menschliches Insulin könnte dann erzeugt werden durch Ausbildung der korrekten Disulfidbrükken zwischen den beiden Proteinketten«

Das klonierte Gen für menschliches Pre-Prο insulin ist in verschiedener Weise brauchbar. Die Transposition in einen Expressions-Transfer-Vektor erlaubt die Synthese von Pre-Proinsulin durch einen Wirfs-Mikroorganisinus, der mit dem das klonierte Gen tragenden Vektor transformiert wurde» Das Wachstum des transformierten Wirts führt zur Synthese von Pre-Prο insulin als Teil eines chimärischen Proteins, Ist der prokaryontische -Teil des Fusionsproteins das Signälstück eines ausgeschnittenen oder anderweitig abgeteilten. Wirtsproteins, so können Ausschnitt oder Abteilbildung erfolgen und Stabilität und Reinigungsfähigkeit des Pre-Prcinsulin/Fusionsproteins erheblich verbessern, Ist der prokaryontische Anteil kurz, so kann ein Ausschnitt aus dem prokaryontischen Wirt erleichtert werden durch das Vorpeptid selbst, falls die Pre-Sequenz im prokaryontischen Wirt so wirkt wie in der eukaryontischen Zelle, Das Pre-Proinsulingen kann auch verwendet werden, um Proinsulingen auf nachstehend beschriebene Weise zu erhalten.

Das klonierte Pre-Proinsulingen kann bei verschiedenen Techniken zur Produktion von Pre-Prοinsulin eingesetzt werderu Pre-Pro insulin ist von Nutzen, da es nach bekannten enzymatischen oder chemischen Verfahren in Pro insulin umgewandelt werden kann. Beispielsweise kann das Vorpeptid entfernt werden durch ein lösliches enzymatisches Präparat,

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siehe Biobei, G. et al·, loc. cit., das spezifisch Signalpeptide entfernt. Las klonierte Proinsulingen kann in verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Pro insulin eingesetzt werden· Das mit dem einen oder andern Gen produzierte Proinsulin läßt sich durch bekannte enzymatische oder chemische Verfahren in Insulin überführen, siehe Kemmber, W, et al·, J. Biol. Chem· 2A2_t 6786 (1971).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung iat die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem menschliches Insulin in für den Weltbedarf ausreichenden Mengen hergestellt werden kann·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein/Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Insulin zur Verfügung zu stellen·

Ein Verfahren zur Herstellung eines DJÜA-Transfer-Vektors zur Erhaltung und Replication einer menschliches ?re-Proinsulin codierenden Deosynucleotidsequenz zeichnet sich dadurch aus, daß man eine menschliches Pre-Proinsulin codierende Deosynucleotidsequenz mit einem DM-Molekül umsetzt, das durch Spaltung eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde.

Kloniert wurden eine cDIA mit der menschliches Pre-Proinsulin codierenden Basensequenz und eine cDM mit der menschliches Proinsulin codierenden 3asensequenz, Die Struktur der klonierten cDHAs wurde durch iTucleotidsequenzanalyse aufgeklärt·

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Die ursprüngliche Quelle des genetischen Materials war ein Insulin produzierender menschlicher Tumor, Aus den Zellen wurde die mRSA isoliert.

Zur isolierten inRUA komplementäre DHA (cDIA) wurde synthetisiert unter Verwendung von reverser Transkriptase in zwei Reaktionscyclen, wobei doppelsträngige cDUA erzeugt wurde. Die ungespaltene, heterogene, doppelsträngige cDHA wurde so behandelt, daß spezifische Verbindungs-oligonucleotidsequenzen an 3'edem Ende entstanden, um die Inserierung an einer Stelle mit gleicher Hestriktionsspezifität in einem Transfer-Vektor zu ermöglichen.

Zur Klonierung wurde ein Transfer-Vektor mit guten Selektions- und beständigen Seplikationseigenschaften ausgewählt. Die vorbehandelte cDÜSTA wurde in einen Transfer-Vektor an vor bestimmt er^: Stelle der Vektor-DHA inseriert unter.-Bildung eines rekombinanten Transfer-Vektors, unter Anwendung der gängigen Techniken,

Die Zellen des Wirts-Mikroorganisinus wurden durch den rekombinanten Vektor transformiert, die Transformationsprodukte wurden selektioniert nach den Kriterien, die für Inserierungen an vorbestimmter Stelle entwickelt wurden, Einzelkolonien, jeweils entstammend aus einer einzelnen transformierten Mikroorganismuszelle, wurden herausgenommen und in Sinzelktilturen gezüchtet, um die Replication der rekombinanten Transfervektor-DUA-Clone zu ermöglichen. Die Transfervektor- ΏΈΑ wurde in einer modofizierten Hybrid isierungsmethode auf . Insulinsequenzen untersucht. Kolonien, die rekombinante .Transf ervektor-DSTA für Insulinsequenzen ergaben, wurden in größeren Sinzelku.lt ure η gezüchtet, um Transf ervektor-DHA zu gewinnen und zu. analysieren«.Geeignete Clone wurden zur

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60 143 18

entgültigen Identifizierung der jtfucleotidsequenz der klonierten Pre-Proinsulin- oder Proinsulingene ausgewählt und zur Übertragung in geeignete Expressionsplasmide,

Sin Verfahren zur Herstellung einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Pro insulin codiert, welches zur Synthese von menschlichem Insulin dient, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die 3'-Enden einer menschliches Pre-Prο insulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, erhalten und repliziert gemäß der Erfindung, in ein oder mehreren Cyclen einer stufenweisen exonucleotlytischen Digerierung hydrolysiert, die durch T4-D2TA-Polymerase katalysiert wird, welche in Gegenwart von Deoxynucleotidtriphosphat wirksam ist, dann die 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz hydrolysiert durch eine nucleolytische Digerierung, die durch ein liucleaseenzym katalysiert wird, welches spezifisch ist für einsträngige DHA mit einem 5'-Ende.

Ein Verfahren zur Synthese von menschlichem Proinsulin, das A- und B-Peptide durch ein C-Peptid voneinander getrennt enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß man .einen Mikroorganismus inkubiert, welcher durch einen Expressions-Transfer-Vektor transformiert wurde, der eine Deoxynncleotidsequenz enthält, welche menschliches Proinsulin codiert, unter zur Expression der codierenden Sequenz geeigneten Bedingungen, und das menschliche Pro insulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von menschlichem Insulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Sulfhydrylgruppen in den A- und 3-Peptiden von menschlichem Proinsulin oxydiert unter Bildung von Disulfi-

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βθ 148 18

brücken zwischen Δ- und B-Peptiden und dann das C-?eptid ausschneidet durch eine Hydrolyse, die von einem Enzym katalysiert wird, welches für die Bindungen spezifisch ist, die das C-Peptid mit den A- und B-Peptiden verbinden.

Das Verfahren zur Synthetisierung von menschlichem Insulin, zeichnet sich dadurch aus, daß man

(a) menschliches Proinsulin herstellt, das A- und B-Peptide enthält, die durch ein C-Peptid voneinander getrennt sind, indem man einen Mikroorganismus inkubiert, der durch einen Escpressionstransfervektor transformiert wurde, der eine menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz enthält, die hergestellt wurde durch Hydrolysieren der 3'-Enden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, durch einen oder mehrere Zyklen einer stufenweisen exonucleolytischen Digerierung, die durch in Gegenwart eines Deosynucleotidtriphosphates arbeitenden T4-DlS-Polymerase katalysiert wird, anschließendes Hydrolysieren der .

5'-Enden der Deosynucleotidsequenz über eine nucleolytische Digerierung, die durch ein für einzelsträngige DHS mit 5'-Enden spezifischen Sucleaseenzym katalysiert wird und Umsetzen der so erhaltenen, menschliches Pro insulin codierenden Deoxynucleotidsequenz mit einem DIJS-Molekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restruktionsenzym hergestellt wurde, unter Bedin-ϊ gungen, die für die Egression der menschliches Pro insulin codierenden Sequenz geeignet sind, sowie das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des. Mikroorganismus reinigt, und

(b) Oxidieren der Sulfhydrylgruppen an den A- und B-Peptiden von menschlichem Pro insulin unter Herausbildung von Disulfidvernetzungen zwischen den A- und B-Peptiden und

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60 148 18

das C-Peptid in einer Enzym-katalysierten Hydrolyse, die spezifisch ist für die Bindungen, die das C-Peptid mit den A- und B-?eptiden verknüpfen, herausschneidet«

Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deozynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

₁TY₁₁GTL₁,,GAJ₁3GCI₁

₂₉₃₀

und die die Α-Kette codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist: 5'-GGL₆₆ATM₆₇GTL₆₈GAJ₆₉CAJ₇₀TGk₇₁TGK₇₂ACL₇₃

worin

A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deosycytosyl, T = Thymidyl, J = A oder C, K=T oder C, L = A, T, C oder G, M = A, C oder T,

X^ = T oder C, wenn Y_n = A oder G; und C, falls Y_n = C .oder

TI

Y = A, C-, C oder T, wenn X = C, und A oder G, falls

W„ = Coder A, wenn Z^ = G oder A, und C, falls Z^ = C oder T, Z_r = A, G, C oder T, wenn 7/ = C, und A oder G, falls

238583 5 -^- 9.12.81

60 148

QR_n = TC, wenn S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S_n = T

oder C, S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C, falls QR_n = AC-, .

und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins, dem jedes Triplett in der Hucleotidsequenz entspricht, nach dem genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen von Aminoende her beziffert sind.

Desweiteren zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß die menschliches Proinsulin codierende Deosgrnucleotidsequenz einen Plusstrang umfaßt, der (a) die Deosynucleotidseqnenz (2T_U,B_n) . mit einem 5'- und einem

a ο c j

3V-End.e aufweist, wobei U , H, und 3L die Bedeutung A, T, C- oder C haben können und j eine ganze Zahl von 2TuIl bis sein kann, wobei. N₃H^₀ nicht TGA, TAA oder TAG sein kann; (b) eine die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deoxynucleotidsequenz, die an die 5'-Enden von (JJ-H, 2T_n).

a 0 c j

gebunden ist, und (c) eine die Α-Kette von menschlichem Insulin codierende Beosynucleotidsequenz, die an die 3'-Enden

von . (H.l-jJS- )_· gebunden ist, enthält, a D c j

Die vorliegende Erfindung offenbart die essentiellen genetischen Elemente, die man zur Erzeugung von menschlichem Insulin in Verfahren benötigt, die auf industriellen Maßstab eingerichtet werden können· Das natürlich vorkommende Strukturgen wurde kloniert. Seine Expression in einer geeigneten Wirtszeile führt zu einem Proteinprodukt, das nach bekannten Verfahren in Insulin überführt werden kann· Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Proinsulin-Molekül und benützt die Tatsache, daß der C-Peptidbereich des Proinsulin-Moleküls

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eine spontane Faltung ermöglicht derart, daß die A- und B-Ketten richtig nebeneinander liegen» In dieser Konfiguration wird die korrekte Paarung der Sulfhydrylgruppen hergestellt und die Bildung der Disulfidbrücken, die im aktiven Insulinmolekül vorliegen, erfolgt leicht. Das Ausschneiden des G-Peptids erfolgt durch kombinierte Anwendung von Trypsin oder einem Enzym mit ähnlicher Substratspezifität und Carboxypeptidase B oder Cathepsin-3 unter Entfernung eines C-terminalen Arginins aus der B-Kette, wie dies bereits beschrieben wurde.

Der gesamte Codierungsanteil des menschlichen Insulingens wurde, wie vorliegend beschrieben, kloniert, einschließlich einem Teil der 5'-untranslatierten Region, der gesamten Vorpeptidsequenz, der gesamten Codier-Sequenz für die B-, C- und A-Peptide und der gesamten 3'-untranslatierten Region, Die- Wahl der* Wirtszelle hat Einfluß darauf, welche'Te-ile-·- des klonierten Gens verwendet werden* Die gesamte Pre-Proinsulin codierende Sequenz ist verwendbar zur Transformierung bestimmter Arten von höheren eukaryontischen Zellen, da die Pre-Sequenz als ein Einzelpeptid wirkt, um die Abgabe des Peptide aus der Zelle zu fördern« Außerdem katalysieren diese, zur Reaktion auf das Signalpeptid befähigten eukaryontischen Zell-Linien die spezifische Entfernung der -Pre--Sequenz während dem Transport des Proteins durch die Zellmembran^ Ferner können solche Zellen das abgegebene Produkt weiterverarbeiten, indem sie das C-Protein nach der katalysierten Bildung der richtigen Disulfidbrücken ausschneiden.

In prokaryontischsn Wirtszeiien wird heute die Verwendung der Pro insulin codierenden Sequenz bevorzugt« Die Stufe der Umwandlung von Proinsulin in Insulin erfolgt nach bekannten

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βθ 148 18

Methoden. Zwei Arten der Expression sind heute bekannt, die beide die Inserierung der Pro insulin codierenden Sequenz in eine Region der Transfer-Vektor-DUA umfassen, deren Expression durch einen prokaryontischen Promotor gesteuert wird. In einigen Fällen wird ein Teil des prokaryontischen Strukturgens und die Promotorkontrolle zwischengesehaltet, derart, daß das Produkt der Expression ein Fusionsprotein ist, dessen I- terminal er Teil aus dem Sf-terminal en 'Teil des prokaryontischen Proteins und dessen C-terminaler Teil die klonierte Sequenz, in diesem Pail Proinsulin, ist. Die Expression von Proinsulin in Form eines menschlichen Proteins hat den Vorteil, daß in der Wirtszelle das Fusionsprotein beständiger sein kann als Proinsulin selbst.. Ist das prokaryontische Protein ferner ein Protein, das normalerweise von der Wirtszelle abgegeben wird, so kann das Fusionsprotein ebenfalls abgegeben werden, wodurch die Reinigung des Expressiorisprodukts^: erleichtert wird. Die Verwendung von Fusionsproteinen besitzt einen lachteil, der darin besteht, daß sie spezifisch gespalten werden müssen, um das gewünschte Produkt zu ergeben. Im Fall von Proinsulin gibt es Verfahren, die die Aminosäuresequenz des Proteins zur spezifischen Spaltung eines Fusionsproteins nützen, siehe Beispiel 2.

Die klonierte Codiersequenz kann auch direkt in der prokaryontischen Zelle exprimiert werden, indem man die Sequenz direkt benachbart zu einem Promotor inseriert. Der Vorteil liegt hier darin, daß eine spezifische Spaltung überflüssig wird* Der wesentliche.Nachteil besteht in der Notwendigkeit einer weiteren Reinigung,

Die Expression von Säugetiergenen in E. coil wird heute ersielt durch Inserierung in der Sähe, der Iac, trp und

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ß-Lactamase-Promotoren. Der lac-Promotor ist geeignet, da seine genetischen Eigenschaften gut charakterisiert sind» Es gibt zwei mögliche Inserierungsstellen, die lange und kurze prokaryontische Führungen für das Fusionsprotein ergeben. Eine Vielzahl genetischer Varianten steht zur Verfügung mit verschiedenen Mengen des endogenen Repressors, die durch Temperatur induzierbar sind und dergleichen. Der trp-Promotor hat den Vorteil, daß nach Induktion hohe Expression erfolgt. Expressionsplasmide mit Inserierungsstellen im trp-Promotor stehen für alle drei Leseraster zur Verfügung. Der ß-Lactamase-Promotor bewirkt, was einem prokaryontischen Signalprotein zukommt, da die Lactamase gewöhnlich abgegeben wird. Das ß-Lactamase-Fusionsprodukt wird ebenfalls abgesondert oder im periplasmischen Raum gefunden. Als Ergebnis sind weniger Reinigungsstufen zur Erzielung von reinem Pro insulin erforderlich.

Die vorliegende Erfindung nützt die Funktion des C-Peptids von Pro insulin aus, nämlich die Erleichterung der spantanen Faltung des Proinsulins, so daß die A- und E-Setten in korrekter Konfiguration zusammenkommen derart, daß SuIfhydry!gruppen richtig gepaart sind und korrekte Disulfidbrücken entstehen, wie sie in natürlichem Insulin gefunden werden. Der Vergleich der C-Peptidsequenzen bei verschiedenen Arten zeigt, daß diese während der Evolution nicht gut konserviert wurden. Daher sind zahlreiche Substitutionen in der Aminosäuresequenz des C-Peptids möglich» Die Funktion des C-Peptids kann einfach darin bestehen, daß eine Aminosäureschleife entsprechender Länge gebildet wird, die zur Faltung der A- und B-Kette in geeigneter Konfiguration führt. Daher kann praktisch jede Codier-Sequenz anstelle der C-Peptidsequenz von menschlichem Proinsulin inseriert werden, ohne daß diese Kairo tf unkt ion wesentlich verändert wird«

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Bestimmte Vorteile sprechen allerdings für die Verwendung des natürlichen C-Peptids: beispielsweise muß die Entfernung des Peptids aus den Insulinpräparaten nicht vollständig sein, da das G-Peptid ein natürlicher Bestandteil von Insulinpräparaten ist* ferner kann ein gewisser Vorteil bezüglich der korrekten Konfiguration des Insulins oder bezüglich der Abspaltung durch Enzyme vorhanden sein».

Die vorliegende Erfindung demonstriert den iniversalen Charakter des genetischen Codes. Von Säugetierzellen bevorzugte Codons werden korrekt in E, coli translatiert, Ersatz-Codons, die die gleiche Aminosäure codieren, können in der Sequenz substituiert werden, ohne da£ Sequenz oder Funktion des exprimierten Proteins beeinträchtigt werden» Die vorliegende Erfindung umfaJ3t daher die Verwendung sämtlicher^ synthetischer Codier-Varianten der beschriebenen Codiersequenz, soweit diese Varianten menschliches Pre-Proinsulin und menschliches Pro insulin codieren*

A usf uhr'ungs beispiel

Beispiel 1 ,'

Kloniertes menschliches Pre-Proinsulingen

Das menschliche Insulingen wurde kloniert aus Rl^-A, die aus einem menschlichen insulin-produzierenden Tumor nach dem Verfahren von Ullrich et al«, loc, cit.zur Isolierung von RITA aus Inselzellen isoliert worden war. Die RUA, die nach dem Zentrifugieren in 5,7-molarer Cäsiumchloridlösung, enthaltend 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure, als Pellet erhalten worden war, wurde ohne weitere Reinigung als Vorlage für die cDITA-Synthese eingesetzt unter Verwendung von reverser Transkriptase und Sl-Uuclease, siehe

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Ullrich et al·, loc· cit. Aus 130 /Ug unfraktionierter wurden etwa 40 ng doppelsträngiger cDSTA erhalten»

Die unfraktionierte cDHA wurde mit erminaler Transferase in Gegenwart von dCTP behandelt zur Erzeugung von Oligo-C-Schwänzen an den 3'-Enden der cDUA-Moleküle·-Ebenso wurde . der Plasmid-Transfer-Vektor pBR322 mit der Restriktions-Endonuclease Pst I gespalten und mit terminaler Transferase in Gegnewart von dGTP behandelt unter Erzeugung von OligodG-Schwänzen an den 3'-Enden der linearen Plasmid-DHA· Die so behandelte Plasmid-DHA kann keine ringförmige DlA bilden, da die einsträngigen Enden nicht komplementär sind. Jedoch sind die Oligo-dC-Enden der behandelten cD¥A komplementär mit den Oligo-dG-Enden des Plasmids und können daher verwendet werden zur Bildung ringförmiger Plasmide, bei denen die cDHA in der Pst I-Stellung inseriert ist« Perner regeneriert die Inserierung beide Enden der Pst I-ErkennungsSequenzen; an beiden Enden der Insertion, womit für den Ausschnitt der inserierten Sequenzen gesorgt wird (Vergleiche Villa-Komeroff, et al·, loc. cit).

Das obige Verfahren zum Anbringen von Endstücken wurde angewandt zur Erzeugung von pBR-322-Plasmiden einer heterogenen Population von cDJTA-Insertionen an der Pst I-Stelle* Solche Plasmide sollten gegen Ampicillin empfindlich, da sich die Pst I-Stelle im ß-Iactamasegen befindet, gleichzeitig aber Tetracyciin-resistent sein· Ein E.coli-Stamm X 1776 wurde mit der Insertionen enthaltenden Plasmid-DHA transformiert, 525 Tetracvclin-resistente Transformationsprodukte wurden erhalten· Diese wurden auf Replica-Platten (replica-plated) auf Insulinsequenzen ausgesucht durch Kolonienhybridisierung in situ, im wesentlichen nach der Vorschrift von Gruenstein und Hogness, Proc. Hat. Acad. Sei., USA 72, 39b1 (1975).

9 3 Q £ fi 3 £ - 28 - . 9.12.81 4- Q Q J U 3 w 60 148 18

Die vorher klonierte Pre-Proinsulin-cDSA aus Ratten (Ullrich, A. et al., loc cit) wurde als Hybridisierungsansatz verwendet, nach Markierung der Raiten-cDSfA durch Translation unter Verwendung von DHA-Polymerase I. Da die Aminosäuresequenzen von Ratteninsulin und menschlichem Insulin sehr ähnlich sind (Insulin zu 92 % homolog, pro insulin zu 83 % homolog) wurde vorausgesetzt, daß die klonierte Ratten-cDIA unter den bekannten Bedingungen verminderter Schärfe mit menschlichen Insulinsequenzen kreuzhybridisieren würde« Die Autoradiographie ergab, daß zwei von 525 Kolonien mit dem klonierten Ratten-Pre-Proinsulin I hybridiesierten. Beide Kolonien waren gegen Ampicillin empfindlich. Die aus den Kolonien isolierten Plasmide waren etwa um 250 Basenpaare und 500 Basenpaare langer als pBR322. Das größere Plasmid erhielt die Bezeichnung pcHl-1.

Die Uucleotidsequenz des inserierten cDITA-Fragments von pcHI-1 ?/urde nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc» Eat. Aead. Sei. USA 74, 560 (1977) bestimmt. Ein schematisches Diagramm der Insertion zeigt Pig. 1. Die gesamte Codierungsregion für menschliches Pre-Proinsulin war in der Insertion enthalten, zusammen mit einem Teil der 5'-untranslatierten Region, der gesamten 3'-untranslatierten Region und einem Teil der 3^f-?olyd Region. Die Restriktionsstellen zur Abspaltung der Insertion für die Sequenzierung sind ebenfalls in Pig. 1 gezeigt, zusammen mit der Richtung der Sequenzierung in jedem Fragment und den überlappungsregionen*

Die aus der cDHA-Sequenz erhaltene mRUA-Sequenz und die aus einem der Leseraster abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt Fig, 2. Die Grundstruktur von auf diese Weise bestimmtem menschlichem Proinsulin stimmt genau überein mit der Struktur, die aus früheren Sequenzbestimmungen resultierte

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60 148 18

(siehe Dayhoff, M. D., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Suppl. 2, S. 127-130 (1976) und Supply 3, S, 150-151 (1978). Die Aminosäuren der Pro insulin codierenden Sequenz werden mit 1 bis 86 beziffert, die der Prosequenz mit -24 bis -1. Pig. 2 zeigt ferner den Ort bestimmter Bestriktionsstellen, die zum Bau des Pro insulingens aus der pcHi-1-Insertion brauchbar sind. Selbstverständlich ist die cDHA-Sequenz des codierenden Strangs der pcHI-1-Insertion gleich der in Fig. 2 gezeigten, mit der Abweichung, daß Thymin T anstelle von Uracil U steht.

Große Mengen an pcHI-1 und anderen Plasmiden werden hergestellt, indem man damit E.coli H3-101 transformiert. Der Stamm EB-101 dient als geeigneter Wirt zur Erhaltung und Replikation von Plasmiden mit den vorliegend beschriebenen klonierten Insertionen.

Beispiel 2

Bau des Pro insulin-Transfer-Vektors

Die inserierte cDHA von pcHl-1 enthält die gesamte Codiersequenz für menschliches Pre-Pro insulin. Bei bestimmten Verwendungen wie dem Transfer in eine andere Art eukaryoηtischer Zellen können bei normaler Weiterverarbeitung und Entfernung von Pre-Sequens und G-Peptid die Erzielung einer korrekt gefalteten Konfiguration und Bildung von aktivem Insulin erwartet werden. Unter anderen Umständen kann man vom Transfer in eine prokaryontische Zelle wie s. B. ein Bakterium die Bildung von unbehandeltem Protein erwarten· Im letzteren Pail ist der Bau einer Codier-Sequenz für Proinsulin von Vorteil, da Proinsulin nach bekannten Verfahren leicht in vitro in aktives Insulin umgewandelt werden kann, vergleiche Kemmler, W. et al., J. Bioi- Chem. 242, 6736

- 30 - 9.12,81

60 148 18

(1971). Drei alternative Methoden zum Bau einer Proinsulin codierenden Sequenz werden vorliegend beschrieben» Sin Plasmid-Transfer-Vektor enthaltend p3R322 mit einer inserierten Proinsulin codierenden Sequenz wird als pcHP-1 bezeichnet.

A. Eine chemisch synthetisierte Codier-Sequenz für die B-Kette von menschlichem Insulin wurde von Crea, R. et al., Proc. Hat» Acad. Sei» USA, £5, 5765 (1978) beschrieben. Die synthetische liucleotidsequenz unterscheidet sich von der natürlich vorkommenden, vorliegend beschriebenen Sequenz, da die synthetische Sequenz dazu bestimmt war, Codon-Zuordnungen ausfindig zu machen, die von einem prokaryontischen Wirt wie Ξ, coli stärker bevorzugt werden* Ferner wurde ein Methion in codierendes Triplett direkt vor der Aminosäure 1 (Phe) eingefügt. Zufällig jedoch sind die beiden Sequenzen in der Region der Aminosäure; 13 bis 14 identisch, die die einzige, beiden Seiten gemeinsame Alu !-Stelle enthält, Die Plazierungen der AIu-I-S teil en in der natürlichen Sequenz zeigt Fig.. 2.

Synthetische Proinsulin-DHA wird mit Alu I-Endonuclease behandelt, wobei man zwei Fragmente aus 43 bzw, etwa 5o Basenpaaren erhält. Ferner wird die cDKA-Insertion von pcHI-1,.. vorzugsweise erhalten durch Hha I-Spaltung gemäß Beispiel 2B, gespalten durch eine partielle, mit Alu I-Endonuclease katalysierte Hydrolyse unter Bildung von Fragmenten aus etwa 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 bzw. 455 Basenpaaren· Diese v/erden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert,- wobei man das Fragment mit 375 Basenpaaren erhält, Ergebnis einer Spaltung an einer einzigen Stelle im Godon für Aminosäure 3r. 14.

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60 148 18

Die Spaltungsfragmente des synthetischen Gens and das Spaltungsfragment aus 375 Basenpaaren der cDHA-Insertion werden über stumpfe Enden verknüpft. Die korrekte Verbindung des synthetischen Fragments mit 43 Basenpaaren mit dem cDIA-Fragment mit, 375 Basenpaaren wird maximiert, indem man vorsieht, daß die cDUA mit 375 Basenpaaren in molarem Überschuß vorhanden ist. Die Möglichkeiten einer unrichtigen Verbindung werden auch vermindert durch die Tatsache, daß die synthetischen Fragmente einsträngige vorstehende Enden besitzen, die mit den Enden des cDUA-Fragments mit 375 Basenpaaren nicht komplementär sind»

Das verknüpfte Molekül, eine Zusammensetzung aus der synthetischen Sequenz, die Methionin gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 13 codiert, und der natürlich vorkommenden Sequenz, die die Aminosäuren 14 bis 86 von Proinsulin codiert, ergibt eine-Codier-Sequenz für Pro insulin;. Die Proinsulin codierende. Sequenz kann in ein beliebiges Espressionsplasmid inseriert werden, entweder durch Füllung,oder Ausschneiden einsträngiger Enden und Anbringen der entsprechenden Bindungs-Oligonucleotide.

Die Expression ergibt ein Fusionsprotein, das am Methioninrest gespalten werden kann durch Behandlung mit Bromcyan,. wobei das Proinsulin erhalten wird, Proinsulin wird nach der Methode von Kemmler et al«, loc. cit, in Insulin überführt»

3, Die cDlA-Insertion von pcHI-1 besitzt eine Hha !-Stellung in der die Aminosäuren -14 bis ?13 codierenden Sequenz, wie aus Fig. 2 ersichtlich. Ferner besitzt der Transfer-Vektor pBH322 eine Hha !-Stellung 22 Basenpaare entfernt von der Pst I-Stelle am 5'-Ende der Insertion,

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60 148 18

Es ist daher möglich, daß eine Sequenz erneut zu isolieren, die die gesamte Proinsulin codierende Sequenz und eine Region aus 22 Basenpaaren von pBR322-DHA umfaßt, indem man pcHI-1 mit Hha I-Endonuclease behandelt. Dieses Verfahren wird der erneuten Isolierung der Insertion mit Pst I-Endonuclease vorgezogen, da die Insertion zwei innere Pst I-Stellen enthält und die Ausbeute an intakter Insertions-DUA durch Behandlung mit Pst I-Endonuclease niedrig ist. Die Hha I-isolierte Sequenz ist ebenfalls zur Verwendung in den "Verfahren der Beispiele 2A und 2C hervorragend geeignet.

Die Behandlung beider Isolate mit Hha I-Endonuclease führt zur Spaltung des plus-Strangs zwischen den Aminosäuren -14 und -13 der Pre-Sequenz (der plus-Strang ist derjenige Strang, dessen Hucleotidsequenz der mRUA-Sequenz entspricht, Der minus-Strang ist derjenige Strang, dessen Sequenz zur mRHA-Sequenz komplementär ist). Die restliche Pre-Sequenz kann spezifisch entfernt werden, indem man die 3'- bis 5'-Exonuclease-Aktivität von T4-DSA-Polymerase ausnutzt, die auf den minus-Strang as Code-Ende der Pre-Sequenz und auf den plus-Strang am entgegengesetzten Ende wirkt. Die exonucleolytische Reaktion kann bei einem bestimmten Hucleotid gestoppt werden, indem man das gleiche Hucleotid als Triphosphat in das Reaktionsgemisch einführt. Der esonucleolytischen Wirkung wirkt dann die Polymeraseaktivität des Enzyms entgegen,das stetig das spezifische JSucleotid ersetzt, siehe England, P. T*, J. Biol. Ghem. 246, 3269 (1971).und .J. Mol. 3iol. 66, 209 (1972).

Die verbleibende Pre-Sequens wird spezifisch zum H-terminalen Phenylalanin-Godon der Aminosäure ITr. 1 digeriert durch 3 Cyclen einer T4-Polymerase-Digerierung. Der Cyclus 1 erfolgt in Gegenwart von 'TTP, das die Digerierung gegen-

^ r^ "³³" ⁹'¹²·⁸¹

0 b 60 143 18

über von A des Glycin-Godons in Aminosäure-Stellung -7 beendet. Cyclus 2 erfolgt in Gegenwart von dCTP, das die Digerierung gegenüber G von Codon-Stellung -5 (Asp) beendet.. Cyclus 3 erfolgt in Gegenwart von dATP, das die Digerierung gegenüber T beendet, welches das erste Hucleotid in Stellung 1 von Pro insulin ist.

Hach jedem Cyclus der T4-Polymerase-Digerierung muß das Triphosphat im gerade beendeten Cyclus entfernt und das Triphosphat des nächsten Cyclus eingeführt werden. Zum Abtrennen der Triphosphate aus dem Heaktionsgemisch werden Minisäulen mit "Sephadex G-75" (Pharmacia Inc., üppsala, Schweden) verwendet. Die Säulen werden mit einem geeigneten Puffer ins Gleichgewicht gebracht, das Sammeln der Proben erfolgt mit einem Puffer, der das Triphosphat des folgenden Cyclus enthält. Auf diese Weise kann zusammen mit der DUA wanderndes Enzym die J)TiA nicht über den nächsten ausgewählten Stopp-Punkt digerieren. XL· eine Digerierung im unteren feil der Säule nach Abtrennung des vorangehenden Triphosphats zu verhüten, erfolgt die Chromatographie in der Kälte (4 ⁰C) und die Sluierung wird durch Zentrifugieren beschleunigt. Ferner kann man auch das Enzym vor der Chromatographierstufe durch Wärmeeinwirkung (65 ⁰C) inaktivieren. Der folgende Cyclus wird dann eingeleitet unter Zusatz von frischem aktivem Enzym· Als Ergebnis der 3 Digeriercyclen mit T4-Polymerase wird der Minus-Strang der DHA vollständig und insbesondere bis zum ersten Codon der Proinsulin codierenden Sequenz digeriert. Die Sequenz des plus-Strangs am entgegengesetzten Ende des Moleküls, die ebenfalls ein 3'-Ende besitzt, ist derart, daß nur einige wenige nucleotide bei den obigen Digeriercyclen entfernt werden,

Der plus-Strang am Pre-Sequenzende wird dann mit SI-Esonu-. clease spezifisch.digeriert, wobei diese auf einsträngige

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Enden einwirkt und ein stumpf end ige s Molekül ergibt.. Sorgfalt muß darauf verwendet werden, eine partielle Digerierung durch £31-Huelease über den Beginn des ersten Codons hinaus zu verhindern« Diese partielle Digerierung kann eintreten wegen dem "Atmen" der Helix, einer teilweisen und vorübergehenden Unpaarung von DM-Strängen. Das Atmen tritt im ganzen Molekül auf, jedoch am häufigsten in A-T-reichen Regionen und an den Enden der DSTA-Mo leküle. Eine vorübergehende Unpaarung des A-T-reichen Codons Hr. 1 könnte eine S1-nucleolytische Wirkung über den gewünschten Stopp-Punkt hinaus erlauben« Sin solches Ergebnis wird verhindert, indem man die - S1-Digerierung unter Bedingungen maximaler.Helix-Integrität, niedriger Temperatur (Raumtemperatur oder weniger) und hohem Salzgehalt ausführt, der gewöhnlich in S1-Reaktionspuffern vorliegt.

Proben von DIA, die in aufeinanderfolgenden Stufen der S1-Uucleasedigerierung erhalten werden, werden nach bekannten Methoden in einen geeigneten Transfer-"/ektor kloniert. Die Sequenz-Analyse des kleinsten Alu I-Pragments solcher Klone wird verwendet, um Pro insulin codierende Klone auszusondern, bei denen die gesamte Pre-Sequenz entfernt ist.

Sin interessantes Verfahren zum Klonieren von Proinsulin codierender cDHA umfaßt den Einbau von Oiigo Α-Enden mit terminaler Transferase an. den 3'-Enden der cDlTA« Qligo-T-Enden werden am 3'-Ende an geeigneter Stelle eines Expressions-Transfer-Vektors erzeugt, z» B, an der EcoRI-Stelle im ß-Galactosidasegen im Plasmid pTS-1 (Ullrich, A« et al.,), siehe auch die US-PS (US-Patentanmeldung 933 03 5). Die Inserierung der Proinsulin codierenden cDIJA nach dem obigen Verfahren führt zu einer korrekt orientierten Insertion in

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- 35 - . 9.12.31

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Phase, bezogen auf den Leseraster, mit dem 3-Galactosidasegen des Plasmids bei 1/6 Wahrscheinlichkeit, Die Expression der Oligo A-Snden führt zur Einführung von Lysin-Resten direkt vor Beginn der Proinsulinsequenz, Eine milde 'Trypsin-Digerierung des Fusionsproteins ergibt Proinsulin, das auf vorstehend beschriebene Weise in aktives Insulin überführt wird. Ferner ergibt das Fusionsprotein bei Behandlung mit einer Kombination aus Trypsin und Carboxypeptidase B (oder Cathepsin B) aktives Insulin aus dein Fusionsprotein in einer einzigen Reaktion,

C. Sine,Proinsulin codierende Sequenz wird aufgebaut durch selektive Spaltung an einer Innenstelle in der Pro insulin codierenden Region, gefolgt von einer Anknüpfung einer chemisch synthetisierten Sequenz, die den Teil der Pro insulin., codierenden Region -codiert,: d&r bei der vorangegangenen Spaltung entfernt wurde« Als Quelle der Proinsulin codierenden Region wird das Plasmid pcHI-1 verwendet, das selektiv ausgeschnitten wird durch Behandlung mit Pst-I-Endonuclease oder vorzugsweise durch Behandlung mit Hha I-Endonuclease, siehe Beispiel2B. Each der Isolierung wird jedes Fragment mit alkalischer Phosphatase behandelt zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppe, dann gespalten durch Behandlung mit einer Restruktions-Endonuclease mit einer einzigen Spaltungsstelle in der Pro insulin codierenden Sequenz,. Vorzugsweise befindet sich die Restriktionsstelle nahe einem Ende der Proinsulin codierenden Sequenz. Die Alu !-Stelle im Bereich der Aminosäuren 13-14 liefert eine geeignete Spaltstelle (vergleiche Fig. 2). Das Hha I-Frägrnent von pcHi-1 wird mit Alu I-Endonucleas^;e partiell geepalten und ergibt 2 Fragmente aus etwa 76 bzw. 375 Basenpaaren»

23 85 6 3 5 -36- ₉.ΐ2.βι

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Die Alu I-Fragmente werden durch Gel-elektrophorese fraktioniert (siehe Beispiel 21) und das Fragment der 375 Basenpaare wird gewonnen.

Nach der Phosphotriester-Hethode von Itakura, K», et al., J, Bioi..Chenu £50, 4592 (1975) und Itakura, K., et al., J. Am. Chem. Soc. j97, 7327 (1975) wird eine die ersten 13 Aminosäuren von Pro insulin codierende Uucleotidsequenz mit einem 5'-terminalen G (am plus-Strang) zur Komplettierung des Codons für Alanin in Stellung 14 synthetisiert. Der plus-Strang.der synthetischen DlTA besitzt die Sequenz 3¹-TTTGTGiACCAACiCCTG TGCGGCTCACACCTGGTGGAAG-5', entsprechend der natürlichen Sequenz, Jedoch können auch andere, die gleichen Aminosäuren codierende Sequenzen synthetisiert werden. Im allgemeinen lautet die Sequenz 3^f-TTKGTlAAKCAJCA-KZTYTGKGGIQRSCAIaTYGTICAJG-S'. Die resultierende Sequenz wird mit stumpfen Enden mit dem Fragment mit etwa 375 Basenpaaren des Hha I-Fragments von pcHI-1 verknüpft. Da letzteres nur am zu verknüpfenden Ende eine 5'-Phosphatgrnppe besitzt, werden die 2 Fragmente in korrekter Reihenfolge verbunden.. Das synthetische Fragment wird in etwa 50 % der Reaktionen korrekt mit dem größeren Fragment verknüpft.

Die mit Ligase behandelte DNA wird kloniert in ein geeignetes Expressionsplasmid, entweder durch Bildung von Oligo A-Snden (siehe Beispiel 2B) oder durch Anknüpfung von Bindegliedern und Inserierung in Expressionspiasmide mit bekannten Leserastern. Xm Fall von Insertionen mit Oligo A-Enden . wird Expression des Proinsulins in etwa 1/12 der Klone beobachtet. Im Fall der direkten Inserierung, wo man weiß, daß das. Leseraster korrekt ist, beträgt die Häufigkeit der Expressionsklone etwa 50 %.

- 37 - 9.12.81

60 148 18

Beispiel 3

Expression von menschlichem Pre-Proinsulin und Pro insulin

Die Pre-Proinsulin (Beispiel 1) oder Proinsulin (Beispiel 2) codierenden klonierten Insertionen werden in einen Expressions-Transfer-Vektor inseriert. Erfolgt die Inserierung in korrekter Orientierung in Bezug auf den Beginn der Translation an der Inserierungsstelle, und befindet sich die Insertion in einer Leseraster-Phase mit dem Promotor und der Ribosom-Bindungsstelle j so wird das Proteinprodukt des klonierten Gens synthetisiert durch aktive metabolisierende Wirtszellen, die durch den Transfer-Vektor transformiert wurden. Das Proteinprodukt ist ein Fusionsprotein, falls der Expressions-Transfer-Vektor einen Teil eines prokaryontischen Gens zwischen Promotor und der Inserierungsstelle enthält» Die Inserierung kann jedoch direkt benachbart au einer Promotorsteile ausgeführt werden. In solchen Fällen wird das von der Insertion codierte Protein direkt synthetisiert. Beide Techniken zeigen Vor- und Nachteile. Fusionsproteine besitzen den Vorteil, daß sie zur Stabilisierung des vom inserierten Gen codierten Fremdproteins neigen. Auch werden erwünschte funktionale Eigenschaften wie Abgabe aus der Wirtszelle durch Fusion mit bestimmten Wirtsproteinen wie z. 3. ß-Lactamase beigetragen» Andererseits wird die Heinigung der inserierten Code-Sequenz kompliziert durch den generellen Wunsch, den Wirtsteil des Fusionsproteins spezifisch zu e-ntfernen. Diese Entfernung erfolgt durch bekannte Techniken, die in den Beispielen 2A und 23 beschrieben sind. Die direkte Synthese des gewünschten Proteins umgeht die Notwendigkeit einer spezifischen Spaltung, schließt jedoch Im allgemeinen die Möglichkeit der Abgabe aus der Wirtszelle aus ο

- 38 - 9.12.81

23 8 5 5 3 5 ^6o ^s ^a

Es wurden Espressionsplasmide entwickelt, in denen die Expression durch.den lac-Promotor kontrolliert wird (siehe Itakura, et al·, Science 198, 1056 (1977), Ullrich, A. et al.j Sxcerpta Medica,.(1979))» durch den trp-Promotor (siehe Martial, et al·., Sei» 205., 602 (1979) oder durch den ß-Lactamase-Promotor (siehe US-PS (US-Patentanmeldung Hr..44 647)).

Die Expression wird festgestellt über ein Produkt, das befähigt ist, sich immunochemisch mit einem Anti-Insulin-Antikörper oder einem Anti-Pro insulin-Antikörper zu verbinden. Man wendet Radio immunteata, bei denen der Antikörper radioaktiv markiert ist und Antigen/Antikörper-Paare durch ein Präparat aus hitzegetöteten Staphyloccoccus aureus G ausgefällt wurden, an (vergleiche Morgan und Lazarow, Diabetes _1_2, 115 (19.63) und Kessler, S, W., J, Immunol.,, 115, 1617 (1975)). Zur Feststellung der Expression in Bakterienkolonien verwendet man das Radio immun-Screening, siehe Bruch, H. A., et al., Cell K), 681 (1978) oder Broome, S. und Gilbert, W,, Proc. Hat. Acad, Sei. USA, 75? 2746 (1978).

line Expression anzeigende,-Fusionsproteine werden ermittelt, indem man die Molekulargewichte von Wirtsprotein, welches.den I-terminalen 'Teil des Fusionsproteins beisteuert, in Y/irtszellen vergleicht, die durch Expressionsplasmide mit und ohne Insertion transformiert wurden. Sine bevorzugte Verfahrensvariante besteht in der Verwendung des Minizellen produzierenden Stamms von S.coli P 673-54 als Wirt. Radioaktiv markierte Aminosäuren werden den Minizellenproteinen einverleibt, wobei Stämme mit Expressions-Transfer-Vektoren mit und ohne inserierter Proinsulin cc-

DU J D 60 143 18

dierender Sequenz verglichen werden. Die Proteine werden durch SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und die Proteinpositionen werden autoradiographisch festgestellt, Die Expression von Pro insulin ergibt sich aus der Anwesenheit einer markierten Proteinbande, die nur bei Minizellen gefunden wird, die durch das Proinsulin-Expressionsplasmid. transformiert wurden. Die lage der elektrophoretischen Bande gibt ein Maß für das Molekulargewicht des exprimierten Proteins und stimmt überein mit der bekannten Länge des inserierten Gens und des Έ-terminalen prokaryontischen Anteils.

Die Entfernung.des prokaryontischen Anteils und Umwandlung von Proinsulin in Insulin in vitro erfolgen nach bekannten Verfahren, die vorstehend-bereits beschrieben wurden.

Claims (3)

1. 85 6 3 5 -⁴⁰- ⁹·¹²·³¹

   58 148 18

   Erf indungsans-pruch

   1, Verfahren zur Synthetisierung von menschiichein Insulin, gekennzeichnet dadurch, daß man

   a) menschliches Proinsulin herstellt, das A- und B-Pep tide enthält, die durch ein C-Peptid voneinander getrennt sind, indem man einen Mikroorganismus inkubiert, der durch einen Expressionstransfervektor transformiert wurde, der eine menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz enthält, die hergestellt wurde durch Hydrolysieren der 3'-Enden einer menschliches Pr e-Pr ο insulin codierenden Deosynucleotidsequenz, durch einen oder mehrere Zyklen einer stufen-

   . weisen exonucleolytischen Digerierung, die durch in Gegenwart eines Deozynucleotidtriphosphates arbeitenden T4-DUS-Polymerase katalysiert wird, anschließendes Hydrolysieren der 5'-Enden der Deoxynucleotidsequehz über eine nucleolytische Digerierung, die durch ein für einzelsträngige DITS mit 5^f-Snden spezifischen lucleaseenzym katalysiert wird und Umsetzen der so erhaltenen, menschliches Pro insulin codierenden Deoxynucleotidsequehz mit einem DE¹S-MoIekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, unter Bedingungen, die für die Expression der menschliches Proinsulin codierenden Sequenz geeignet sind, sowie das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt, und

   b) Oxidieren der Sulfhydrylgruppen an den A- und B-Peptiden von menschlichem Pro insulin unter Herausbildung von Disulfidvernetsungen zwischen den A- und S-Peptiden und das C-?eptid in einer Enzyin-katalysierten Hydrolyse, die spezifisch ist für die Bindungen, die das C-Peptid'mit den A- und 3-Peptiden verknüpfen,

   238553 ο -41- 9.12,81

   60 143

   herausschneidet.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die die B-Kette von menschlichem Insulin codierende Deosynucleotidsequens einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

   AAJ₂₉A

   und die die Α-Kette codierende Deosynucleotidsequenz einen Plus-Strang enthält, der folgende Sequenz aufweist:

   5'-GGI₆₆ATM₆₇GTI₆₈GAJ₆₉CAJ₇₀TGZ₇₁TGz₇₂ACI₇₃ QR₇₄S₇₄ATM₇₅TGK₇₆QR₇₇S₇₇X₇₈Ty₇₈TAK₇₉CAJ₈₀X₃₁Ty₈₁ caJ₈₂

   worin

   A = Deoxyadenyi, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = Thymidyl, J=A oder C, K=T oder C, I = A, T, C oder G, M = A, C oder T, X_n = T oder C, wenn Y_n = A oder G; und C, falls

   Y_n C oder T, Y_n = A, G, C oder T, wenn X_n = C, und A oder G, falls

   ^n - ^l> W_1n = Coder A, wenn S^ = G oder A₉ und C, falls Z_n = C oder T,

   Z = A, G, C oder T, wenn 7/ = C, und A oder G-, falls W_n = A,

   S 3 5 - 42 - 9.12.81

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   QR_n = TG, wenn S_n =. A, G, C oder T, und AC-, falls

   S_n = T oder G,
   S_n = A,- G, G oder T, wenn QR_n = TG, und T oder C, falls QR_n = AG,

   und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Pro insulins, dem jedes Triplett in der Nucleotidsequenz entspricht, nach dein genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäure-Stellungen -vom Aininoende her beziffert sind·
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pro insulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plusstrang umfaßt, der (a) die Deρsy-· nucleotidsequenz (H H₁F,). mit einem 5'- und einem

   a ο c j

   3'-Ende aufweist, wobei H , Hv und H die Bedeutung A, T, G oder C haben können und \j eine ganze Zahl von Hull bis 100 sein kann, wobei -2LIL ¥ nicht TGA, TAA

   el D G

   oder TAG sein kann; (b) eine die 3-Ketie von menschlichem Insulin codierende Deoistynucieotidsequenz, die an die 5'-Enden von (IJ₀]J-JSL)., gebunden ist, und (c) eine

   3. D G J

   die Α-Kette von menschlichem Insulin codierende Deozynucleotidsequenz, die an die 3'-Enden von (IT H-. H) .

   a υ G j

   gebunden ist, enthält.

   Zeichnungen