DD202047A5

DD202047A5 - Verfahren zur herstellung des makrolids 20-dihydro-20,23-dideoxytylonolid

Info

Publication number: DD202047A5
Application number: DD81231394A
Authority: DD
Inventors: Richard H Baltz; Eugene T Seno
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-07-02
Filing date: 1981-07-02
Publication date: 1983-08-24
Also published as: GR74938B; HU189515B; DE3162648D1; US4366247A; IL63221A; PL231943A1; AU7238581A; FI812065L; IE811462L; SU1069631A3; IE51361B1; NZ197585A; FI812065A7; EP0043280B1; ES8205018A1; KR830006425A; BG35749A3; CS221839B2; EP0043280A1; GB2079279B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung des Makrolids 20-Dihydro-20,23-dideoxytylonolid, welches auch als Tylacton bezeichnet wird, und von an den 3- sowie 5-Hydroxylgruppen veresterten Acylesterderivaten hiervon. Diese Verbindungen eignen sich als Zwischenprodukte zur Herstellung 16gliedriger Makrolidantibiotika. Die Herstellung von Tylacton oder Esterderivaten hiervon erfolgt durch Zuechtung von Stremptomyces fradiae NRRL 12188 oder einer tylactonproduzierenden Mutante oder Rekombinante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen fuer Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen unter eventueller nachfolgender Veresterung d. hierdurch erhaltenen Tylactons.

Description

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung des Makrolids 20-Dihydro-20,23-dideoxytylonolid

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Makrolids 20-Dihydro-20_/23-dideoxytylonolid, das im folgenden der Einfachheit halber auch lediglich als Tylacton bezeichnet wird *

Tylacton hat die folgende Struktur I

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•Ίο s I! I

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H₃-* ι a βf-CHa-CHa

1 18 19

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und eignet sich beispielsweise zur Herstellung von damit verwandten Acy!derivaten der Struktur II

(ID ,

worin R und R₁ einen Acylrest bedeuten.

Die Verbindungen der obigen Strukturen I und II stellen wertvolle Zwischenprodukte dar, aus denen sich 16-gliedrige Makrolidantibiotika herstellen lassen. In den obigen Strukturen sind zwar keine stereochemischen Zuordnungen enthalten, doch ist die Stereochemie dieser Verbindungen identisch mit derjenigen von Tylosin.

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Tylacton kann durch Veresterung der in den Stellungen 3 und 5 vorhandenen Hydroxylgruppen in Acylesterderivate überführt werden, und solche Veresterungen werden unter Einsatz bekannter Acylierungen nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt. Die Acylesterderivate von Tylacton stellen wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung neuer Makrolidantibiotika dar.

Zu Beispielen für hierzu geeignete Acylierungsmittel gehören die Säureanhydride, die Säurehalogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem sonstigen Säurefänger) und die aktiven Ester'organischer Säuren. Die Acylierung kann ferner auch unter Verwendung eines Gemisches aus einer organischen Säure und einem Dehydratisierungsmittel, wie N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid, durchgeführt werden. Ferner lassen sich Acylierungen dieser Art auch unter Anwendung enzymatischer Verfahren durchführen, wie sie beispielsweise aus US-PS 4 092 473 hervorgehen. Die in dieser Weise gebildeten Acylderivate können unter Anwendung bekannter Methoden abgetrennt und gereinigt werden.

Die Herstellung solcher Derivate erfolgt unter Anwendung allgemein bekannter Veresterungstechniken, beispielsweise durch Behandlung der Verbindung mit einer stöchiometrischen Menge (oder einem geringen Überschuß) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids, in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Pyridin, bei. etwa 0⁰C bis Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktisch vollständigen Veresterung. Das hierbei erhaltene Esterderivat läßt sich aus dem Reaktionsgemisch in üblicher Weise isolieren, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.

Beispiele für geeignete Ester sind diejenigen organischer Säuren unter Einschluß aliphatischer, cycloaliphatische^

arylischer, aralkylischer oder heterocyclischer Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Alkoxycarbonsäuren mit jeweils 1 bis 18 Kohlenstoffatomen sowie anorganische Säuren, wie Schwefelsäure oder Phosphorsäure.

Zu Beispielen für derartige Ester gehören.die Ester von . Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Glucuronsäure, Alkoxycarbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure, ß-Cyclohexylpropionsäure, 1 -Adarnantancarbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure, die Ester von Alkylsulfonsäuren, Arylsulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren, und die Ester von Arylsäuren und Aralkylsäuren, deren aromatischer Anteil gegebenenfalls Substituenten aufweist, wie Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.

Tylacton läßt sich hersteifen, indem man einen diese Verbindung produzierenden Stamm von Streptomyces fradiae unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen in einem geeigneten Kulturmedium solange züchtet, bis eine wesentliche Menge der gewünschten Verbindung gebildet ist.

Zum Wachsenlassen von Streptomyces fradiae läßt sich irgendeines der verschiedenen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierung des gewünschten Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen für eine, großtechnische Fermentation gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin, Glucose, Stärke oder Maismehl, oder auch öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl, Sojabohnen-

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mehl, Fischmehl oder Aminosäuren. Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien einverleibt sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche beispielsweise Ionen von Eisen, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat oder Nitrat liefern.

Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in so hoher Menge vor, wie sie für ein Wachsen des Mikroorganismus erforderlich ist. Besteht das Problem einer zu starken Schaumbildung, dann kann erforderlichenfalls der Zusatz kleiner Mengen (nämlich Mengen von etwa 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie PoIypropylenglykol (mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) , zu großtechnischen Fermentationsmedien erforderlich sein.

Zur Bildung wesentlicher Mengen an Tylacton wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an Tylacton lassen sich auch durch Züchtung in Schüttelkolben erhalten. Infolge der verzögerten Produktion des Antibiotikums bei einer Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus'wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Die Herstellung eines solchen vegetativen Inoculums erfolgt durch Beimpfen eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstükken des Organismus, wodurch man zu einer frisch und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das hierdurch erhaltene vegetative Inoculum wird dann in einen größeren Tank übertragen. Das für das vegetative Inoculum verwendete Medium kann das gleiche sein wie es auch für größere Fermentationen verwendet wird, es lassen sich hierfür jedoch auch andere Medien einsetzen.

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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in einer Züchtung eines neuen Mikroorganismus, den man durch chemische Mutagenese eines tylosinproduzierenden Stammes von Streptomyces fradiae erhält. Der durch Mutagenese erhaltene Mikroorganismus produziert lediglich minimale Mengen Tylosin, bildet Tylacton jedoch als überwiegende Komponente.

Die Erfindung bezieht sich ferner auch auf den neuen Mikroorganismus, der Tylacton produziert. Dieser neue Mikroorganismus stellt klassifikationsmäßig einen Stamm von Streptomyces fradiae dar. Eine Kultur dieses Mikroorganismus ist in der Kulturensammlung von Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North university Street, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt und kann von dort unter der Nummer NRRL 12188 frei bezogen werden.

Der Mikroorganismus Streptomyces fradiae ist genauso wie auch andere Organismen einer Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise Rekombinanten, Mutanten oder künstliche Varianten des Stammes NRRL 12188 herstellen, indem man diesen Stamm mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen mutagenen Mitteln behandelt, wie beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Alle natürlichen und künstlichen Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces fradiae NRRL 12188, die die charakteristische Bildung von Tylacton beibehalten, können erfindungsgemäß verwendet werden und sind daher auch Teil der Erfindung.

Streptomyces fradiae NRRL 12188 kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 40⁰C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Tylacton scheint es bei einer Temperatur von etwa 28°C zu kommen.

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Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch beim vorliegenden Verfahren, durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Für eine entsprechend wirksame Bildung an Tylacton soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion etwa 30 % oder darüber betragen (bei 28⁰C und etwa 1 bar Druck).

Die Bildung von Tylacton läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter UV-Detektion untersucht. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingewiesen auf J. Chromatographie Science.16, 492 bis 495 (1978).

Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man das Tylacton unter Anwendung von in der Fermentationstechnik üblichen Methoden aus dem Fermentationsmedium gewinnen. Tylacton ist in Wasser nur begrenzt löslich, so daß es sich in "dem Medium, in welchem es gebildet wird, gegebenenfalls überhaupt nicht löst. Die Gewinnung von Tylacton _caläßt sich daher erreichen durch (1) Extraktion der Fermentationsbrühe oder (2) Filtration der Fermentationsbrühe und Extraktion von sowohl der filtrierten Brühe als auch dem Mycelkuchen. Die Extraktionsverfahren können nach den verschiedensten Techniken durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren für die filtrierte Brühe besteht darin, daß man die Brühe (im allgemeinen ohne pH-Einstellung) mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, wie Amylacetat oder Petrolether, und die erhaltene organische Schicht dann unter Vakuum konzentriert, wodurch man zu Kristallen oder einem öl gelangt. Fällt hierbei ein öl an, dann läßt sich dieses beispielsweise durch Adsorptionschromatographie reinigen.

Die Verbindungen der eingangs genannten Strukturen I und II sind wertvolle Zwischenprodukte, aus denen 16-gliedrige

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Makrolidantibiotika hergestellt werden können. So läßt sich beispielsweise Tylacton der Struktur (I) durch Bioumwandlung in Tylosin überführen, indem man es zu einer wachsenden Kultur eines bioumwandelnden Mikroorganismus gibt. Dieser bioumwandelnde Mikroorganismus kann ein Stamm von Streptomyces fradiae sein, der entweder selbst Tylosin bildet oder zur Bildung von Tylosin befähigt ist, wenn er bezüglich der Bildung von Tylacton -blockiert ist.

Ein dann'zur Bildung von Tylosin befähigter Stamm, wenn er bezüglich seiner Bildung von Tylacton blockiert ist, läßt sich herstellen, indem man einen tylosinproduzierenden Stamm mit einem mutagenen Mittel behandelt und durch ein entsprechendes Screening nur'die überlebenden Mikroorganismen auswählt, die kein Tylosin produzieren können. Die hierbei erhaltenen überlebenden Mikroorganismen, die kein Tylosin produzieren können, werden dann einem weiteren Screening unterzogen, um hierdurch zu bestimmen, welche Stämme auch kein Tylacton bilden können.. Die Identifizierung dieser Stämme erfolgt durch Zusatz von Tylacton zu kleinen Schüttelkolbenkulturen der ausgewählten überlebenden Mikroorganismen, um hierdurch zu bestimmen, ob diese Tylosin bilden oder nicht.

Beispiele für Stämme von Streptomyces, die zur Bildung von Tylosin befähigt sind, sind die Stämme Streptomyces fradiae NRRL 27 02 und NRRL 2703. Ein zur Bildung der ausgewählten Stämme geeignetes mutagenes Mittel ist beispielsweise N-Methyl-N'-nitronitrosoguanidxn.

Die Verbindung der obigen Struktur I eignet sich insbesondere zur Herstellung markierter Verbindungen für metabolische Untersuchungen. Durch Markierung entweder des Tylactonteils oder der angefügten Zuckerreste läßt sich der metabolische Weg von Tylosin verfolgen.

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Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. . - '

Beispiel 1

A. Schüttelkolbenfermentation von Tylacton

Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces fradiae NRRL

12188 wird in 1 bis 2 ml'sterilem Wasser dispergiert. Mit einer Teilmenge der hierdurch erhaltenen Lösung (0,5 ml) beimpft man dann ein vegetatives Medium (150 ml) folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Maisquellwasser 1,0

Hefeextrakt 0,5

Sojabohnenschrot 0,5 ;

CaCO₃ 0,3

Sojabohnenöl (roh) 0,45

Deionisiert.es Wasser 97,25

Statt dessen kann man auch eine in flüssigem Stickstoff aufbewahrte vegetative Kultur von Streptomyces fradiae NRRL 12188 in jeweils einem Volumen von 1 ml verwenden, rasch auftauen und zum Beimpfen des vegetativen Mediums einsetzen.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.

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Mit dem hierdurch erhaltenen bebrüteten vegetativen Medium (0/5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Rübenmelasse ' 2,0

Maismehl 1,5

.Fischmehl . . 0,9

Maisgluten 0,9

NaCl ' · 0,1

(NH₄)₂HPO₄ 0,04

CaCO₃ 0,2

Sojabohnenöl (roh) 3,0

Deionisiertes Wasser 91,36

Das inokulierte Fermentationsmedxum wird in einem 50 ml fassenden Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa Tagen in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von .300 UpM bebrütet.

B. Tankfermentation von Tylacton

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoculum verwendet man 60 ml des inkubierten vegetativen Mediums, das in ähnlicher Weise wie oben unter Abschnitt A. beschrieben hergestellt wird, und beimpft damit 38 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe mit folgender Zusammensetzung;

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Bestandteile Menge (%)

Maisguellwasser I₇O

Sojabohnenmehl 0,5

Hefeextrakt 0;5

CaCO₃ 0,3

Soja'bohnenöl (roh) 0,5

Lecithin (roh) - 0,015

Wasser 97,185

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. -

Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 68 1 fassenden Tank etwa 47 Stunden bei 29⁰C bebrütet. -

Mit dem auf diese Weise erzeugten inkubierten Medium der zweiten Stufe (4 1) beimpft man dann 40 1 steriles Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Fischmehl . 0,92

Maismehl 1 ,57

Maisgluten 0,92 ,

CaCO₃ 0,21

NaCl , 0,10

(NH₄)₂HPO₄ 0,04

Rübenmelasse . 2,10

Sojabohnenöl (roh) 3,15

Lecithin 0,09

Wasser 90,90

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxxdlösung auf 7,2 eingestellt.

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 68 1 fassenden Tank etwa 5 Tage bei 28°C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird derart mit steriler Luft belüftet? daß die Menge an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 3 0 und 50 % · bleibt, und es wird mittels herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 300 UpM gerührt.

Beispiel 2 Isolierung von Tylacton

Die nach*Beispiel 1„ erhaltene Fermentationsbrühe (1600 1) wird mittels einer Filterhilfe (3 % Hyflo Supercel, eine Diatomeenerde von Johns Manville Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird durch Zusatz von 2 %-igem Natriumhydroxid auf etwa 9 eingestellt. Das Filtrat wird mit Amylacetat (400 1) extrahiert. Der Amylacetatextrakt (der über einen hohen optischen Dichtewert bei 282 nm verfügt, jedoch nicht antimikrobiell wirksam ist) wird.unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Das öl wird in Benzol (5 1) gelöst. Die Benzollösung wird über eine mit Silicagel (Grace, Sorte 62, -Davison Chemical Co.) gefüllte Säule mit den Abmessungen 14 χ 90 cm chromatographiert, dessen Gel in Benzol gepackt ist. Die Elution wird dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel überwacht, wobei zur Elution ein 3:2-Gemisch aus Benzol und Ethylacetat als Lösungsmittelsystem verwendet wird und die. Detektion durch Besprühen mit Schwefelsäure erfolgt. Die Säule wird zur Entfernung von Lipidsubstanzen zuerst mit Benzol eluiert und dann mit einem 9:1-Gemisch aus Benzol und Ethylacetat, um das Tylacton abzutrennen und zu isolieren. Die tylactonhaltigen Fraktio- nen werden vereinigt und· unter Vakuum eingedampft. Durch Umkristallisation des Tylactons aus einem Gemisch aus Benzol und Hexan oder aus heißem Hexan gelangt man zu etwa 2 g Produkt, das bei 162 bis 163°C schmilzt.

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Das Infrarotabsorptionsspektrum von TyIacton in Chloroform geht aus der anliegenden Zeichnung hervor.

Tylacton ist ein wei"ßer Feststoff, der aus Hexan oder einem Gemisch aus Ethylacetat" und Hexan kristallisiert und bei etwa 162 bis 163°C schmilzt. Tylacton hat etwa folgende prozentuale Elementarzusammensetzung: Kohlenstoff = 70 %, Wasserstoff = 9,7 %, Sauerstoff = 20,3 %. Es hat die empirische Formel ^C2 3^H38^S ^unc^ ^wei^st ein Molekulargewicht von etwa 394 auf. .

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Tylacton in Chloroform geht aus der beiliegenden Zeichnung hervor. Es lassen sich Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (10 ) beobachten: 3534 (mittel), 2924 (stark), 2398 (schwach), 2353 (schwach), 1709 (sehr stark), 1678 (sehr stark), 1626 (schmal), T592 (sehr stark), 1458 (stark), 1441 (Schulter), 1404 (stark), 1379 (schmal), 1316 (stark), 1284 (mittel), 1181 (sehr stark), 1143 (stark), 1103 (mittel), 1078 (mittel), 1049 (sehr schmal), 1025 (mittel), 984 (sehr stärk), 958 (stark), 923 (mittel), 911 (Schulter), 859 (schmal), 868 (mittel), 840 (mittel), 820 (sehr schmal) und 661 (schmal).

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Tylacton in neutralem Ethanol zeigt ein Absörptionsmaximum bei etwa 282 nm

Tylacton hat folgenden spezifischen Drehwert:

/älpha7^⁵ =-55,23° (c = 1, CH-OH).

Eine elektrometrische Titration von Tylacton in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid ergibt, daß keine titrierbaren Gruppen vorhanden sind. _;

Tylacton ist in Wasser praktisch unlöslich, löst sich jedoch in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Chloroform, Diethylether, Petrolether, Benzol oder Dimethylsulfoxid.

Tylacton läßt sich von Tylosin durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel unterscheiden. Zur Detektion kann eine Besprühung mit Schwefelsäure, und zwar entweder konzentrierter Schwefelsäure oder verdünnter.(50 %-iger) Schwefelsäure, verwendet werden. In diesem Detektionssystem erscheint Tylacton zu Beginn als gelber bis brauner Fleck. Werden zur Chromatographie Silicagelplatten mit fluoreszierendem Hintergrund verwendet, dann bietet sich eine Detektion mittels UV-Licht an. Die ungefähren Rf-Werte von Tylacton gehen aus.der folgenden Tabelle I hervor.

Tabelle I

Dünnschichtchromatographie von Tylacton

Rf-Werte

Verbindung A .B

Tylacton 0,50 0,62

Tylosin 0,0 0,0

^aMedium: Silicagel

Lösungsmittel: A = Benzol: Ethylacetat (4:1)

B = Benzol: Ethylacetat (3:2)

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Beispiel- 3 3, S-Di-O-äcetyltylactön

Man löst das nach Beispiel 2 hergestellte Tylacton (200 mg) in Pyridin (4 ml). Sodann versetzt man die erhaltene Lösung mit Essigsäureanhydrid (4 ml). Anschließend läßt man das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen und engt es dann unter Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Methanol (5 ml) versetzt, worauf man die erhaltene Lösung 0,5 Stunden auf 60⁰C erwärmt und dann unter Vakuum konzentriert. Das auf diese Weise erzeugte 3,5-Di-O-acetyltylacton verfügt aufgrund einer Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel über einen Rf-Wert von etwa 0,59 in einem Lösungsmittelsystem aus 4 Teilen Benzol und 1 Teil Ethylacetat. Der Rf-Wert von Tylacton beträgt in diesem System etwa 0,3.

Beispiele 4 bis 7

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung von Propionsäureanhydrid wiederholt, wodurch man zu 3,5-Di-O-propionyltylacton gelangt.

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird.unter Verwendung von Isovaleriansäureanhydrid wiederholt, wodurch man 3,5-Di-O-isovaleryltylacton erhält.

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird unter Einsatz von Benzoesäureanhydrid wiederholt, wodurch man zu 3,5-Di-O-benzoyltylacton gelangt.

Das in Beispiel-3 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung von n-Buttersäureanhydrid wiederholt, wodurch man 3,5-Di-O-(n-butyryl)tylacton. erhält.

"Beispiel 8 Herstellung von Tylosin aus Tylacton

Nach dem unter Abschnitt A. von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Anwendung einer Temperatur von 28⁰C fermentiert man einen Stamm von Streptomyces fradiae, der vorher Tylosin gebildet hat, bezüglich des Makrolidringschlusses jedoch blockiert worden ist. 48 Stunden nach erfolgter Inokulation versetzt man das Fermentationsgemisch mit Tylacton.. Sodann wird solange weiter fermentiert, bis eine wesentliche Menge Tylosin produziert ist, was etwa 3 weitere Tage dauert. Im Anschluß daran ermittelt man die Anwesenheit von Tylosin durch Untersuchung von Proben der Brühe gegenüber Mikroorganismen, von denen man weiß, daß sie gegenüber Tylosin empfindlich sind. Ein hierzu geeigneter Versuchsorganismus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144. Dieser Bioversuch wird zweckmäßigerweise durch eine automatische turbidometrische Methode, durch Dünnschichtchromatographie oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter üV-Detektion durchgeführt.

Claims

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Erfindungsan s ρ r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von Tylacton oder einem Esterderivat hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces fradiae NRRL 12188 oder eine tylactonbildende Mutante oder Rekombinante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen und Bildung von Tylacton.züchtet, und das hierdurch erhaltene Tylacton gegebenenfalls verestert. .
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRL 12188 durchführt.
3. ' Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es den Mikro-. Organismus Streptomyces fradiae NRRL 12188 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Hierzu 1 Blatt Zeichnung