DD211039A3 - Verfahren zur zuechtung von methylotropen bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zuechten von obligat oder fakultativ methylotrophen Bakterien. Die Erfindung hat das Ziel, die Wachstumsrate der Bakterien zu steigern. Die Aufgabe besteht darin, zur Erzeugung von Biomasse Bakterienstaemme einzusetzen, die auf den Zusatz von chemischen Verbindungen mit verstaerktem Wachstum reagieren. Die Aufgabe wird durch den Einsatz von Staemmen wie Methylomonas alba, Methylomonas mathanica u.a. geloest, wobei als Wachstumsstimulatien quaternaere Ammoniumverbindungen wie Carnitin, Cholin o. dgl. eingesetzt werden.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Züchtung von methylοtrophen Bakterien

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von raet.hylotrophen Baicterien, die als Biomasse von Bedeutung sind·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, Bakterien zu züchten und die Produkte der Züchtungsverfahren als Biomasse zu verwenden» So ist es weit verbreitet, als Kohlenstoffquelle für die Kultivierung von Bakterien Ethanol, Glucose, organische Säuren oder aliphatisch^ Kohlenwasserstoffe einzusetzen» Darüber hinaus gewinnt auch die Verwertung von Methan/ Methanol durch bestimmte Mikroorganismen zunehmend an praktischem Interesse. Um das Wachstum der Bakterien auf diesen Kohlenstoff- und Energiequellen zu beschleunigen, v/erden - da die Nährst of fansprüche der Mikroorganismen sehr komplex sind - im allgemeinen dem Kultur« medium Hefe-, Fleisch-, Malzextrakt, Serum,Maisquellwasser oder andere, Wachstumsfaktoren enthaltende Verbindungen zugesetzt.

Außerdem ist bekannt, daß das Wachstum von Bakterien und/oder die Ausbeute an Biomasse außer durch verfahrenstechnische Lösungen auch durch die Optimierung der

Kultivierungsbedingungen beschleunigt bzw, erhöht werden kann. Dazu gehören z.B. die gesteuert® Zugabe von Nähr-= Substraten, die Ausbalancierung des Kohlenstoff/St ick» Stoffangebots, die Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes und/oder der Temperatur, der Zusatz von Spurenelementen wie z.B. Ou oder verschiedener Nährsalze, von Siliconöl entsprechender Viskosität o.dgl. Die Mehrzahl der Verfahren ist dabei auf ein bestimmtes Substrat oder MikroDttganiarnenspezies fixiert oder schlägt verfahrenstechnische Lösungen vor, die sich darauf beziehen.

Weiterhin ist bekannt, Wachstumsförderer zur Effektivität ssteigerung bei der Erzeugung von Biomasse einzusetzen. So beschreibt die DE-OS 2 454 048 die Verwendung von quaternären Ammoniumverbindungen ebenso wie die SU™ PS 540 578 und SU-PS 712 029 als Wachstumsstimulantien für Hefen. An eine Übertragung auf den Wachstumsprozeß für Bakterien ist bisher nicht gedacht worden. Das erklärt sich daraus, daß sich Bakterien als Prokarv.ont@ii grundlegend von Hefen, die zu den Eukaryonten gehöreß, unterscheiden. Analogieschlüsse z.B. hinsichtlich der Lokalisation bestimmter Stoffwechselwege (Atmungskette, Fettsäureabbau) zwischen Hefezellen und tierischen Zellen sind näherliegend als solche zwischen Hefe- und Bakterienzellen. Entsprechendes gilt für die physiologische Punktion von Carnitin im Intermediärstoffwechseldas unter Beteiligung der Carnitinaeetyltransferase für die Aufnahme von Fettsäuren in die Mitochondrien von Hefen und tierischen Zellen von Bedeutung ist« Eine entsprechende C&rnitinacetyltransferase, die in Bakterienkulturen eine Wirkung entfaltet, ist nicht bekannt«

In der Fachliteratur (I.Silveira-Schrank, AeDrozdowiez, Ann. Microbiol. (Institut Pasteur), 134 A₉ 411, (1983)? B.L.Zamost, D.O.McClary, Biotechnol.Lett. 5,₉ 179, (1983) u.a.) wird über die wachstumsstimulierend© Wir-

kung von Pflansenhormonen auf Bakterien und Pilze berichtet, während über Hefen keine Aussagen gemacht werden, weil offensichtlich Analogieschlüsse nicht möglich sind. Wach vorherrschender Meinung der Fachleute bedingt die unterschiedliche chemische Struktur der Zellbegrensung zwischen Bakterien und Hefen Differenzen im Aufnahmemechanismus und damit in der Verwertung der qua«ternären Ammoniumverbindungen· Es wurde beschrieben (T. Hakahara, K.Hisatsuka, Y.Minoda, J.Ferment.Technol. £g, 415, (1981)), daß das jeweils gleiche Tensid bei Hefen und Bakterien unterschiedlichen, z.T. gegensätzlichen Einfluß auf das Wachstum der jeweiligen Species ausübt.

Wünschenswert ist eine Methode zum Züchten von Bakterien, die durch den Zusatz definierter Stoffe das Wachstum stimuliert.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, das Wachstum von Bakterien im Verlauf des Züchtungsprosesses zu steigern, die Aus?- beute zu erhöhen und damit die Ökonomie der Herstellung verwertbarer Biomasse wesentlich zu verbessern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, die Kultivierungsdauer der Bakterien zu vermindern, indem zur Erzeugung von Biomasse Bakterienstämme eingesetzt werden, die auf den Zusatz von chemischen Verbindungen mit verstärktem Wachstum reagieren. Es soll dabei unerheblich sein, ob die Zusätze von den Bakterien als Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle bzw. Elektronen- oder Wasserstoffdonatoren mit verwendet werden.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß Bakterienstämrae in einem flüssigen Minimalmedium_s flüssigen oder festen Komplexmedium unter Verwendung von Acetat, Malat, Glucose, Methan, Methanol o.dgl. als Kohlenstoffquelle und

NH^Cl ο.dgl. als Stickstoffquell© gezüchtet werden, wobei erfindungsgemäß als wachstumsstimulierend® Mittel quater« näre Ammoniumverbindungen, insbesondere Gholin, Acetylcholin, D,L-, LO)- oder D(+)-Carnitinj dessen Vorläufer wie z.B. Lysin, Abbauprodukte oder Derivat© eingesetzt werden.

Carnitin ist nicht nur Bestandteil tierischer Zellen bzw. Organe (Muskel, Leber), sondern kommt auch weitverbreitet in Mikroorganismen (Neurospora, Streptokokken) vor. Di© Rolle des Carnitine im Stoffwechsel der Fettsäuren eukaryontischer Zellen bzw. Zellkompartiment® (Mitoehondr&en) ist in den letzten beiden Jahrzehnten intensiv untersucht worden. Trotz der Beschäftigung der Fachwelt mit dem Carnitin und seiner Rolle im Stoffwechsel von Mikroorganismen ist es bisher nicht bekannt geworden, daß Carnitin selbst, Derivate davon oder Vorläufer von ihm auf das Wachstum von Bakterien einen merklichen Einfluß ausüben« Es ist zweifellos überraschend, daß Carnitin und seine Derivate auf Bakterienstämme der Gattung Methylomonas, speziell Methylomonas alba EG 18 und Methylosionas metha·» nica sowie auf Misdhkulturen anderer Art b®i Anwesenheit ein oder mehrerer Spezies o.g. Bakterien wachstumsstimulierend wirken. Als Camitinderivate sind insbesondere DL-Öarnitin selbst, Acetylearnitin, Cholin, AeetylcholiSj, Betainhydrat, Lysin, γ-Butyrobstain, Grotonobetain als wirkdam erkannt worden, jedoch sind auch Salz© des Carnitine und seiner Vorläufer wi® Halogenide oder Nitrat©, Sulfate und Phosphate einsetzbar.

Beispiele für verwendbare Garnitind®rivet® sind weiter™ hin solche Verbindungen, die zu Carnitin gespalten werden können, wie kurzkettige oder langkettige Aeylcarnitine wie Prop>ionylcarnitin, Butyrylcarnitiö₉ Palmitoylcarnitin und Stearoylcarnitin, sowie Alkylester, wi© Methyl» und Bthylester des Carnitine... Beispiel© für Derivate von Grotonobetain, und Butyrobetaia siad di®

sprechenden Alkylester, wie der Methyl- und Ethylester sowie Doppelester, wie z.B. Acetylcarnitinmethylester.

Im erfindungsgemäßen Sinne können über das eingangs angegebene flüssige Minimalmedium hinaus Nährmedien mit beliebigen, durch Bakterien verwertbaren Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele für dies© Kohlenstoff quell en sind neben Methan oder methanhaltigen Gasgemischen Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Cj-Verbindungen wie Formiat, Formaldehyd, methylierte Amine, Dimethylester, Zucker wie Glucose oder Stärke, Carbonsäuren wie Essigsäure, gasförmige Kohlenwasserstoffe wie Ethan ο.dgl.

Das Nährmedium enthält ferner Stickstoffquellen wie Ammoniumsalze, beispielsweise Atnmoniumsulfat oder Ammoni·» umchlorid, Nitrate wie Natriumnitrat oder Harnstoff. Ferner kann das Nährmedium anorganische Salze, wie Kaliumsalze, Magnesiunmsalze, Salze der Phosphorsäure, Zinksalze und Mangansalze, wi® Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Zinksulfat odei? Mangansulfat enthalten. Ferner können dem Nährmedium Spurenmengen an Vitaminen, wie Biotin, Pantothensäure oder Vitamin B₁, Melassen und Maisquellwasser, die dies® Vitamin® enthalten, zugesetzt werden.

Die Züchtung kann entweder auf festen oder flüssigen Nährmedien unter Verwendung üblicher Fermenter und bei den üblichen Temperaturen durchgeführt werden» Züehtungstemperatüren von 25 bis 4O⁰O sind besonders günstig< Der pH-Wert des Nährmediums beträgt bei Verwendung von Methan/Methanol vorzugsweise 6 bis 8„ Das erfindungsgemäß verwendete Carnitin oder dessen Derivate bssw* Vorläufer werden dem Nährmedium in einer Konzentration von maximal 5ömg/l, berechnet als Carnitinchlorid» zugesetzt. In höheren Konzentrationen hemmt das Carnitin oder dessen Derivate das Wachstum der Bakterien» Die bevorzugte Konzentration liegt bei 10/Ug bis 5 mg/1. Die Erfindung wird an Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Bs wird auf einen pH-Wert von 6,6 eingestelltes Minimalmedium verwendet, das aus 0,68 g KH₂PO₄; 0,87 g K₂HPO₄; 1 mg CaCl₂; 71 mg MgSO₄ . 7 H₂0; 5 mg PeSO_{4 β} 7 E₂Qi 812 /Ug MnSO₄ . 4 HgO; 785 /Ug CuSO₄ , 5 H₂O; 440 /Ug ZnSO₄ . 7 H₂O und 252 /Ug Na₃MoO₄ . 2 H₃O in 1 Liter bidestilliertem Wasser hergestellt wird. Als einzige Kohlenstoff quelle diente Methan; N-Quelle ist NaNO., (0,2 g/l). Dieses Grundmedium wird mit D,L-»Carnitin in den nachstehenden, in Tabelle I angegebenen Mengen versetzt,

100 ml dieses Mediums werden in 500 ml fassende Schüttelkolben mit Einstichen und Begasungsaufsatz gegeben und mit 12,0 ml einer Kulturflüssigkeit (optische Dichte bei 600 nm etwa 0,6) von Methylomonas alba beimpft, Di© KuI~ turflüssigkeit wird durch Abschwemmen von 24h alten Schrägagarröhrchen mit Minimalmedium gewonnen« Die Züchtung wird bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt« Me Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßte

Tabelle I

D,L-Carnitin- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach Konzentration angegebener Züchtungsdauer (h) (g/l) 21 42 65

—	. 280	490	660
0,01	340	580	790
0,05	290	500	700

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt; anstelle von D,L~Carnitin wird Lysin als Zusatz verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt..

Tabelle II

Lysinkonzen- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach antrat ion gegebener Züchtungsdauer (h)

(g/l) 24 48 72 78 95

-	40	55	160	360	670
0,001	60	70	415	700	740
0,005	410	730	910	940	1350

Beispiel 3

Beispiel 1 wild wiederholt? anstelle von DL»Carnitin wird Acetylcarnitin als Zusatz verwendet. Die Ergebnisse sind in Tafeelle III zusammengefaßt«,

Tabelle III

Acetylcarnitin- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach Konzentration angegebener Züchtungsdauer (h)

(g/l) 24 48 72

250 . 480 660

0,01 300 552 .725

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt ι anstelle τοη BL-Carnitin wird Glycinbetain als Zusatz verwendet <, Bi@ Ergebnisse sind Iu Tabelle IV zusammengefaßt«

Tabelle IY

Glycinbetain- Bakterientrockengewicht (mg/1) nach konzentration angegebener Züchtungsdauer (h) (g/l) 24 48 72

16.0 360 670 0,05 186 425 805

Claims (16)

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Züchtung von methylotrophen Bakterien in einem flüssigen Minimalmedium, flüssigen oder festen Komplexmedium unter Verwendung von Acetat, Malat, Glucose, Methanol, Ethanol, Methan ο.dgl. als Kohlenstoffquelle und NH^Cl o.dgl. als Stickstoffquelle,

dadurch gekennzeichnet, daß als wachstumsfördernder Zusatz quaternäre Ammoniumverbindungen, insbesondere DL·?, LC-)- oder D(+)-Carnitin, dessen Vorläufer, Abbauprodukte und/oder Derivate eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Methylomonas alba gezüchtet wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Methylomonas methanica gezüchtet wird*

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeich» net, daß Mischkulturen gezüchtet werden»

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Methylomonas alba, Methylomonas methanica jeder für sich oder in Kombination miteinander anwesend sind bei der Züchtung beliebiger anderer Arten von Mischkulturen.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet daß als Oarnitinvorläufer Crotonobetain, Bgtyrob©tain oder Lysin verwendet werden_β

7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet ₉ daß als Carnitinderivate Aoylcarnitin, Alkylcarnitin oder Acyl-alkyl-carnitin verwendet werden<,

'JE' 40

8. Verfahren nach Punkt 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylcarnitine solche mit Fettsaureresten der Kettenlänge zwischen C₂ und C₂* wie zu B₈ Acetyl«» carnitin, Propionylcarnitin₉ Butyry!carnitin, Palmitoylcarnitin oder Stearoylcarnitin verwendet«

9. Verfahren nach Punkt 1 und T₉ dadurch gekennzeichnet_t daß man als Alkylc^rnitin Methyl- oder Äthylcarnitin verwendet.

10« Verfahren nach Punkt 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Crotonobetainderivat ein Alkylcrotonobeverwendet«

11« Verfahren nach Punkt 1₉ 6 und 1O₉ dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylcrotonobetain Methyl·» oder Äthyl= crotonobetain verwendete

12« Verfahren nach Punkt 1 und 6₉ dadurch gekennzeichnet₉ daß man als Butyrobetainderivat ein Alkylbutyrobetain verwendet.

13«, Verfahren nach Punkt I₉ 6 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylbutyrobetain Methyl«- oder Äthylbutyrobetain verwendet.

14» Verfahren nach Punkt 1_s dadurch gekennzeichnet, daß man Nitrile und Amide der entsprechenden Betaine eingesetzte

15. Verfahren nach Punkt 1 - Η, dadurch gekennzeichnet, daß unter partiell anaeroben Bedingungen gezüchtet

16. Verfahren nach Punkt 1-14? dadurch gekennzeichnet» daß unter mikroaerophilen Bedingungen gezüchtet wird»