DD204942A1

DD204942A1 - Verfahren zur semikontinuierlichen produktsynthese

Info

Publication number: DD204942A1
Application number: DD23330681A
Authority: DD
Inventors: Uwe Iske; Brigitte Heinritz; Evamaria Stichel; Christine Gwenner; Maud Bullmann
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1981-09-15
Filing date: 1981-09-15
Publication date: 1983-12-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur semikontinuierlichen Produktsynthese. Das Ziel der erfindungsgemaessen Loesung ist die Senkung der spezifischen Stoffverbraeuche und die Erhoehung der Produktbildungsraten bei der mikrobiellen Stoffwandlung in bestimmte Produkte oder Produktgemische, wie Citronensaeure/Isocitronensaeure. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, dass es auf dem Weg ueber die Kontrolle der Nutzung der Energie- und Kohlenstoffquelle durch die Mikroorganismen ermoeglicht, das Ziel, Senkung der spezifischen Stoff- und Energieverbraeuche und Erhoehung der Raum-Zeit-Ausbeuten bei hoher Stabilitaet des biologischen Systems und Einsatz hoher Zelldichten zu erreichen. Das Ziel wird erfindungsgemaess durch die Steuerung des Austausches von Fermentationsmedium bei der semikontinuierlichen Produktsynthese nach dem Zustand der Mikroorganismen erreicht, so dass der Austausch vorzugsweise der Haelfte des Fermentationsmediums nach Durchlaufen einer Biomassebildungsphase unter optimalen Wachstumsbedingungen und einer Produktbildungsphase unter fuer die Produktbildung guenstigen Bedingungen bei Erreichen einer bestimmten Produktkonzentration oder bei Abnahme der Produktbildungsrate erfolgt und dass Fermentationsloesungen mit hohen Zelldichten zum Einsatz gelangen.

Description

Titel

Verfahren zur- semikontinuierlichen Produktsynthese

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen semikontinuierlichen Produktsynthese, z.B. zur Synthese von organischen Säuren wie Citronensäure, und ist in die IPK C 12 Ii einzuordnen«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur semikontinuierlichen Produktsynthese werden vorwiegend Verfahren angewandt, bei denen der/größte Teil des Perraentationsmediums nach Abbruch des diskontinuierlichen Satzes abgelassen wird. Der im Reaktor verbleibende Anteil des Fermentationsmediums, bevorzugt 1/10 des Gesamtinhaltes, dient beim nachfolgenden Satz als Impfmaterial, DD-WP 130 046*

Nachteil dieses und anderer bekannter diskontinuierlichen und semikontinuierlichen'Verfahren zur mikrobiellen Citronensäuresynthese (DE-OS 20 50 361, DE-OS 22 15 141, DE-OS 21 15 514, US-PS 3 902 965) ist die hohe Aufenthaltsdauer der Organismen im Reaktorsystem von ca* 5 bis 7 Tagen, Damit verbunden sind geringe Raum-Zeit-Ausbeuten (< 1,2 g Cäure/kg,h), hohe spezifische Stoff- und Energieverbräuche auf Grund der Speicherung essentieller Nährstoffe und Re·- servestoffbildung sowie erhöhte Kuhlkos.ten«

Den bekannten technischen Lösungen zur kontinuierlichen Citronensäuresynthese (PR-PS 2 209 840, GB-PS 14 18-561, DE-OS 23 23 106, DE-OS 23 60 091, 5¹R-PS 14 28 440) liegt der Nachteil zu gründe, daß 2 oder mehrere Prozeßstufen '5' erforderlich sind, die einen erhöhten Inve's tauf wand sowie hohe laufende Betriebskosten erfordern, oder daß im Palle der 1-stufigen Prozeßführung eine kontinuierliche Prozeßdauer·· von ca« 200 h auf Grund mangelnder Stabilität des mikrobiologischen Systems nicht überschritten werden kann« Ein weiterer Nachteil der bekannten technischen Lösungen ist der Einsatz geringer Zelldichten*

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Senkung der spezifischen Stoff- und Energieverbrauche und die Erhöhung der spezifischen Produktbildungsrate bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der mikr-obiellen Stabilität des Permentationsprozesses sowie die Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute durch Einsatz hoher Zelldichten*

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu gründe, ein Verfahren zu entwickeln, daß es auf dem Wege über die Kontrolle der Nutzung der Energie- und Kohlenstoffquelle durch die Mikroorganismen ermöglicht, das Ziel, Senkung der spezifischen Stoff- und Energieverbräuche und Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeuten bei hoher Stabilität des biologischen Systems und Einsatz hoher Zelldichten zu erreichen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Synchronisation der Mikroorganismenpopulation, wobei die Synchronisation der Mikroorganismenpopulation durch einen Austausch der Hälfte des Permentationsmediurns gegen eine äquivalente Menge frischer "Nährlösung erreicht wird, die eine Verdopplung der Zellzahl ermöglicht,

Die erfindungsgemäße Lösung besteht darin, daß zunächst das Biomassewachstum unter den Bedingungen des optimalen Wachstumprozesses, bei kontinuierlicher Zuführung der Kohlenstoff quelle, geführt wird« Nach Erreichen einer für den nachfolgenden Produktbildungsprozeß optimalen Zellkonzentration, wird'der Wachstumsprozeß über die StickstoffVersorgung oder einen anderen außer Kohlenstoff und Sauerstoff für das Wachstum essentiellen Nährstoff begrenzt* Am Ende der Wachstumsphase, markiert durch den übergang der Zellen aus dem Wachstumszustand zum Einzelzellzustand, wird kontinuierlich Kohlenstoff- und Energiequelle entsprechend der zu er-• reichenden Produktionsrate zugesetzt. Bei Abnahme der Produktionsrate bzw» bei Erreichen einer bestimmten gewünschten Produktkonzentration im Medium erfolgt der Austausch des Reaktorinhaltes« Dabei wird vorzugsweise die Hälfte des Reaktorinhaltes gegen ein Hährmedium, das eine Verdopplung der Zellmasse und Zellzahl ermöglicht, ausgetauscht. Der Übergang der Zellen vom Wachstums- zum Einzelzellzustand kann durch mikroskopische Verfolgung des Wachstumsprozesses ermittelt werden.

Das Verfahren ist ebenfalls anwendbar, wenn mehrere Kohlenstoff- und Energiequellen zur biologischen Stoffwandlung entsprechend einem optimalen Kohlenstoff-Energieverhältnis eingesetzt werden,

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:

Beispiel 1

In einen Laborfermentor von 12 1 Bruttovolumen werden 5 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben (bilanziert für 20 g Organismenzuwachs)

6 g/l M₄Cl 1,4 g/l KH₂PO₄

0,7 g/l MgSO₄ . 7 H₂O

0,09 g/l CuSO, . 5 H₂O

0,042 g/l ZnCl₂..

0,01 g/l CoSO₄ . 7 H₉O 0,08 g/l MnS0_A , 4 HpO

O,11g/1 H₃BO₃ 0,09 g/l CaCl₂ ♦ 6 H₂O 0,007 g/l PeCl₂ . 2,5 g/l CaCO₃ 5 g/l Hefextrakt

10 g/l Paraffin (Bereich C₁₀ bis C₂₀)

Es wird in üblicher Weise 30 min bei 128° C sterilisiert* !Jach Abkühlen des Reaktorsystems wird mit 200 ml Kulturlösung von Candida lipolytica EH 59 angeimpft und unter folgenden Bedingungen der Wachstumsprozeß durchgeführt:

pH 4,2 (Regelung mit 30%iger NaOH) Temperatur 31° C Rührerdrehzahl 2 000 U/min

Luftdurchsatz 100 l/kg ·· h

Die Dosierung des Paraffins erfolgt entsprechend des Wachstumsprozesses, so daß die Restkonzentration im Medium > 1 g/l beträgt»

Nach einer Prozeßdauer von 16 h ist der Wachstumsprozeß bei 20 g Biotrockensubstanz/l, bedingt durch Stickstofflimitation, beendet und der Produktbildungsprozeß mit einer Produktivität von 2,2 g Säure/1 » h beginnt* STach 48 Stunden Prozeßdauer wird bei Erreichen einer Produktkonzentration von 105 g Säure/1 der .Produktakkumulationsprozeß durch Austausch von 50% des Permentationsmediums unterbrochen und eine erneute Wachstumsphase eingeleitet, die nach Zellverdopplung stickstofflimitiert erneut in die Produktbildungsphase eintritt.

Kohlenstoff- und Energiequelle werden entsprechend der Produktbildungsrate kontinuierlich dosiert unter Einhaltung einer Restkonzentration während des Produktbildungsprozesses

Die spezifischen Ausbeutekoeffizienten betragen

XZ. = 0,75 g Parex/g Säure und P

Der Austauschprozeß ist beliebig wiederholesr*

%J

Beispiel 2

Prozeßbedingungen und Reaktorsystem wie Beispiel 1„ Nährmedium bilanziert für 50 g Organismenzuwachs. Nach Animpfen mit 500 ml einer 1,0 %igen Kulturlösung von Candida lipoytica EH 59 beginnt die Wachstumsphase über eine Zeitdauer von 28 h, Nach Erreichen der Zellkonzentration von 50 g/l beginnt, ausgelöst durch Stickstofflimitation, der Porduktbildungsprozeß mit einer Produktivität von 3,1 g Säure/1 « h. Nach 35 h Produktionsdauer erfolgt bei 108 g Saure/1 analog Beispiel 1 der 1» Austauschprozeß*

Ausbeutekoeffizienten:

o^ ·** = 0,81 g Parex/g Säure P

r ⁰P

-C = 3,2 g 0₂/g Säure

Beispiel 3

Prozeßbedingungen und Reaktorsystem analog Beispiel 1, Dem Nährmedium Beispiel 1, wird Glukose im Anteil von 40 g/l zugesetzt und die Paraffindosierung in den angegebenen Restkonzentrationsgrenzen beibehalten. Nach Animpfen des Mediums analog Beispiel 1 beginnt der Wachstumsprozeß, der nach ca* 14 h bei einer Konzentration von 20 g EIS /1 beendet ist. Die Produktivität des anschließenden Produktbildungsprozesses beträgt 2,9 g Säure/1,h, Nach 40 h Produktionsdauer beginnt bei einer Produktkonzentration von 116 g Säure/1 der Austauschprozeß*

Ausbeutekoeffizienten:

j^ = 0,65 g Substrat/g Säure ρ

χ °2= 2,90 g 0₂/g Säure

Claims

Srfindungsanspruch '

1. Verfahren zur semikontinuierlichen Produktgewinnung, wie zur Gewinnung von organischen Säuren auf allen mikrobiell verwertbaren Substraten und Substratkombinationen dadurch gekennzeichnet, daß das liährmedium in Zeitintervallen zugegeben wird, die gleich der Dauer der Wachstumsphase und Produktbildungsphase sind* 2« Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoff- und Energiequelle ausreichend für das notwendige Biomassewachstum beim Austausch des Fermentationsmediums zugegeben wird und zu Beginn der Produktbildungsphase kontinuierlich entsprechend der zu erreichenden Produktbildungsrate dosiert wird, bis die Produktbildungsrate abnimmt«

3· Verfahren nach Punkt 1 und' 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Wachstumsprozeß'über die Stickstoffquelle oder einen anderen geeigneten Nährstoff begrenzt wird und die Kohlenstoff- und Energiequelle für das Biomassewachstum in geringem Überschuß bilanziert wird« 4* Verfahren nach Punkt 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die beim Austausch des Fermentationsmediums zugegebene Stickstoffquelle für eine bis drei vorzugsweise für eine Verdopplung der Zellzahl ausreicht,

5« Verfahren nach Punkt 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß beim Austausch des Fermentationsmediuins die Hälfte oder- mehr- als die Hälfte vorzugsweise die Hälfte des ?9rrne:atationsmediums abgelassen wird und eine entsprechen.de Menge Nährmedium, das die zum Wachstum notwendigen !Jährstoffe enthält, ergänzt v/ird,

6« Verfahren nach Punkt 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet.

daß die nach dem Austausch des Ferrnentationsmediums verbleibende Produktmenge bei Auftreten einer Wachstums- " hemmung durch hohe Produktkonzentration durch Dialyse oder Ausfällung entfernt wird»

7* Verfahren nach Punkt 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß Zelldichten größer/gleich 50 g/l eingesetzt werden»