DD205695A1

DD205695A1 - Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DD205695A1
Application number: DD24192782A
Authority: DD
Inventors: Maud Bullmann; Christine Gwenner; Uwe Iske
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1982-07-26
Publication date: 1984-01-04

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR STEIGERUNG DER RAUM-ZEIT-AUSBEUTE VON MIKROBIELLEN PROZESSEN ZUR GEWINNUNG VON EIWEISSHALTIGEN BIOMASSEN UND/ODER STOFFWECHSELPRODUKTENUND WIRKSTOFFEN AUF DER BASIS VON KOHLENWASSERSTOFFEN, INSBESONDERE ERDOELSTILLATFRAKTIONEN BZW.- RAFFINATEN. DAS ZIEL DER ERFINDUNG BESTEHT IN DER ERHOEHNG DER WACHSTUMS- BZW.PRODUKTBILDUNGSGESCHWINDIGKEIT DES ALS PRODUKTIONSKULTUR VERWENDETEN ORGANISMENSTAMMES UNTER VERNEIDUNG ZUSAETZLICHER TECHNOLOGISCHER MASSNAHMEN, MIT DENEN EIN ERHOEHTER TECHNISCH- OEKONOMISCHER AUFWAND VERBUNDEN IST. ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DIE AUFGABE GELOESST, INDEM DEM FERMENTATIONSMEDIUM CITRONENSAEURE, BEVORZUGT IN FORM CITRONENSAEURE, BEVORZUGTIN FORM CITRONENSAEUREHALTIGER ABWAESSER UND/ODER FERMENTATIONSMEDIEN ZUGESETZT UND DAMIT EINE STEIGERUNG DER WACHSTUMS- UND/ODER PRODUKTBILDUNGSGESCHWINDIGKEIT ERREICHT WIRD.

Description

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Titel

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf der Basis der Konvertierung von Kohlenwasserstoffgemischen, insbesondere Erdöldestillaten bzw, -raf finaten mit einem n-Alkan-Kettenlängenbereich von Cq bis C-₂, mit dem Ziel der Gewinnung proteinhaltiger Biomassen und/oder mikrobieller Stoffwechselprodukte, wie zum Beispiel Citronensäure.

Sie kann in der mikrobiellen Industrie angewendet werden und ist in die ITK C 12 I einzuordnen·

Die industrielle Züchtung von Mikroorganismen mit dem Ziel der Gewinnung mikrobieller Eiweißkonzentrate und/oder der Gewinnung von Stoffwechselprodukten wie zum Beispiel Citronensäure oder Lysin bzw« der Gewinnung bestimmter Wirkstoffe hat zunehmend an Bedeutung gewonnen. Neben einer Vielzahl von Kohlenstoff trägern werden Kohlenwasserstoffgemische, insbesondere n-alkanhaltige Erdöldestillate oder -raffinate des Kohlenstoff· kettenlängenbereiches von Cg bis Co₂ als Energiequelle für mikrobielle StoffWandlungsprozesse eingesetzt.

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Entsprechende Verfahren sind beschrieben in DD-WP 12 984, DD-W? 105 825, DD-WP 140 150 für die Gewinnung von protein-' haltigen Einzellerkonzentraten und in DE-OS 2 005 848, DE-OS 2 134 826, DE-OS 2 212 929, DE-OS 2 323 106, DE-OS 2 356 970, DD-WP 130 046 für die Gewinnung zum Beispiel von Citronensäure. .

In den genannten Verfahren wird die Raum-Zeit-Ausbeute des ' Fermentationsprozesses bestimmt von der Wachstums- bzw. Produktbildungsgeschwindigkeit des als Produktionskultur eingesetzten Mikroorganismus, dem verwendeten Reaktortyp und den damit verbundenen realisierbaren Stoffübertragungsgeschwindigkeiten sowie den Fermentationsbedingungen. Bei Verwendung von höher siedenden Kohlenwasserstoffen als Substrat tritt auf Grund der geringen Löslichkeit dieser Verbindungen die Limitation des mikrobiellen Prozesses durch die Stoffübergangsgeschwindigkeit in den Vordergrund, Es sind deshalb Verfahren entwickelt worden und bekannt, bei denen mittels spezieller löslichkeitsvermittelnden Substanzen die Substratübergangsgeschwindigkeit im Fermentationsmedium und damit die Saum-Zeit-Ausbeute des Prozesses erhöht wird, DD-WP 105 827, DD-WP 96 727, DD-WP 104 099, US-DS 1 105 749, DE-OS 2 544 625.

Die Wirksamkeit derartiger Fermentationszusätze kann sowohl in einer Erhöhung der physikalisch-chemischen Löslichkeit des Substrates als auch in einer Beeinflussung der Durchlässigkeit der Zellmembran begründet liegen.

Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen in einer dem Fermentationsprozeß vorgeschalteten Reaktionsstufe die Kohlenwasserstoffsubstrate auf thermisch-katalytischem Wege zu lösliehen Alkoholen und/oder Säuren oxidiert werden, um die Effektivität des mikrobieilen Stoffwandlungsprozesses zu erhöhen (DE-OS 2 040 358).

Mit einer derartigen thermisch-katalytischen Voroxidation des Kohlenwasserstoffsubstrates sind jedoch erhöhte prozeß- und apparatetechnische Aufwendungen verbunden, die eine Effektivitätssteigerung in der Fermentationsstufe zumindest teilweise wieder kompensieren.

L· t

Der Einsatz spezieller oberflächenaktiver Substanzen zur Löslichkeitsverbesserung bzw. spezieller Verbindungen zur Beeinflussung der PenetrierfShigkeit der Zellmembranen der bekannten Verfahren ist mit einer Anzahl von Problemen verbunden· Die eingesetzten Stoffe dürfen im weiteren Verarbeitungs- bzw, Anwendungsprozeß des erzeugten mikrobiellen Produktes nicht störend wirken bzw. müssen vollständig abtrennbar sein, sie müssen billig und leicht verfügbar sowie physiologisch völlig unbedenklich sein. So ist zum Beispiel bekannt, daß das als Psnetrationshilfsmittel eingesetzte Dirnethylsulfoxid ^e nach Konzentration und Organismus sowohl fördernd als auch hemmend auf den Wachstumsprozeß von Mikroorganismen wirkt· Des weiteren belasten spezielle Fermentationszusätze durch ihre Preise die Ökonomie der Verfahren·

Das Ziel der Erfindung besteht in einer Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute mikrobieller Verfahren zur Gewinnung von Proteinkonzentraten und/oder Stoffwechselprodukten auf der Basis von Kohlenwasserstoffen bzw. Gemischen unter Vermeidung zusätzlicher technologischer Maßnahmen«

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, daß durch eine Verbesserung der Substrat-Übergangsgeschwindigkeit eine Erhöhung der Organismenwachstumsgeschwindigkeit und/oder der Produktbildungsrate durch Zusatz eines physiologisch unbedenklichen Fermentations hilfsmitteis ermöglicht

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem eine bestimmte Menge Citronensäure oder citronensäurebaltiges Abprodukt zum Beispiel aus dem Prozeß der mikrobiellen Citronensäuresynthese, dem kohlenwasserstoffhaltigen Fermentationsmedium zugesetzt wird, da überraschenderweise gefunden wurde, daß bei Anwesenheit geringer Konzentrationen an Citronensäure die Wachstumsgeschwindigkeit von Mikroorganismen auf Kohlenwasserst offfraktionen wesentlich erhöht wird.

I 3 L J

Die benötigten Citronensäuremengen liegen hierbei in der Größenordnung von 0,2 bis 5,0 g Säure/kg Fermentationsmedium·

Auf Grund dieser Tatsache bewirkt ein Zusatz von Citronensäure in der angegebenen Größenordnung zum Fermentationsmedium zu Beginn eines diskontinuierlichen Zellvermehrungsprozesses auf Kohlenwasserstoffen eine Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit und damit eine Verkürzung der diskontinuierlichen Ansatzdauer bzw, im Falle der kontinuierlichen Ver-Suchsführung eine Erhöhung der Durchflußrate im stationären Prozeßzustand und damit ebenfalls eine Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute·

Bei mikrobiellen ProduktSynthesen auf Kohlenwasserstoffen, die aus zeitlich getrennt ablaufenden Zellvermehrungs- und Produktbildungsphasen bestehen, kann durch Zusatz von Citronensäure zu Beginn des Zellvermehrungsprozesses die Wachs— tumsphase und damit die Gesamtansatzdauer verkürzt werden. Es ist bekannt, daß die Fähigkeit der Organismen zur Produktbildung bzw. die Produktbildungsgeschwindigkeit in direktem Zusammenhang steht mit dem physiologischen Zustand der Kultur, das heißt je optimaler die Wachstumsbedingungen umso höher die sich anschließende Produktbildungsrate. Im Falle der diskontinuierlichen bzw. semikontinuierlichen mikrobiellen Gewinnung von Citronensäure auf Kohlenwasserstoffen wurde gefunden, daß ein Zusatz von Citronensäure zu Beginn des Organismenwachstumsprozesses neben der Verkürzung der Wachstumszeitdauer eine Erhöhung der Produktbildungsrate zur Folge hat. Dadurch wird eine weitere Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute erreicht.

Der Zusatz der erforderlichen Citronensäure zu Beginn der Wachstumsphase kann in diesem Falle sinnvollerweise in Form citronensäurehaltiger Abwasser aus den Aufarbeitungsstufen oder durch Rückführung einer entsprechenden Menge citronensäurehaltigen Fermentationsmediums erfolgen* An den nachfolgenden Beispielen ist die Erfindung im Fäheren erläutert.

2 4 ι y ζ"/ y

In einem Laborfermentor von 30 1 Bruttovolumen werden 10 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben (bilanziert für 20 g Organismenwachstum)

126 g/l Erdöldestillat

2.5 g/l Citronensäure bzw, citronensäurehal

tiges Abwasser oder Fermentationsmedium in entsprechender Menge

9.6 g/l (Mi,),, SO₁

1,8 g/l KH₂PO₄

0,6 g/l H₃PO₄ (80 %ig)

0,38 g/l MgSO₄ ,7H₂O

0,003 g/l PeSO₄ . 7 H₂O

0,0024 g/l MnSO₄ . 7 H₃O

0,0016 g/l CaSO₄ . 5 H₃O

0,015 g/l ZnCl₂

Bs wird mit T 1 Kulturlösung von Lodderomyces elongisporus angeimpft und unter folgenden Bedingungen der Wachstumsprozeß durchgeführt: pH 4,2 (Regelung mit 10 %iger NaOH)

Temperatur 33 C Rührerdrehzahl 2100 Ü/min Luftdurchsatz 100 l/kg . h

Uach einer Prozeßdauer von 15h ist das Wachstum bei 20 g Biotrockensubstanz/l beendet, bedingt durch Stickstofflimitation.

Die maximale Wachstumsgeschwindigkeit, ermittelt aus der Abnahme der Stickstoffkonzentration im Medium, wird durch den Zusatz von Citronensäure um 15 % von 0,33 h" im citro· nensäurefreien Medium auf 0,38 h gesteigert.

\ Ό L·

Prozeßbedingungen, Reaktorsystem und Hährmedium analog

Beispiel 1·

Hacfa einer experimentellen Wachstumsdauer von 4 ta bzw» nach Erreichen einer Zellkonzentration von 5 bis 15 g/kg wird das Reaktorsystem auf kontinuierliche Betriebsweise umgestellt.

Bei einer Durcbflußrate von 0,33 ta werden die Zuflüsse wie folgt aufgeteilt:

499 g h"¹ Erdöldestillat

2833 g h"¹ Mhrmedium

Die Produktivität des Prozesses wird bei gleichbleibenden Ausbeutekoeffizienten durch den Zusatz von Citronensäure in der angegebenen Konzentration um 6,5 % von 3,1 g Biotrockensubstanz/kg . h auf 3,3 g/kg . h gesteigert.

Beis£iel_3

In einem Laborfermentor von 12 1 Bruttovolumen werden 4,5 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben (bilanziert für 20 g Organismenwachstum) 6 g/l UH₄Ol

1,4 g/l KH₂PO₄

0,7 g/l MgSO₄ . 7 H₂O

0,09 g/l QuSO₄ . 5 H₂O

0,042 g/l ZnCl₂

0,01 g/l CoSO₄ . 7 H₂O

0,08 g/l MnSO₄ . 4 H₃O

0,11 g/l H₃BO₃

0,09 g/l CaCl₂ . 6 H₂O

0,007 g/l PeCl₂

2,5 g/l CaCO₃

5 g/l Hefeextrakt 10 g/l η-Paraffin (Bereich C₁₀-

2»5 g/l Citronensäure "bzw, citronensäurehal-

tiges Abwasser oder Fermentationsmedium in entsprechender Menge

Es wird "bei 126°G über einen Zeitraum von 2 Stunden mit überhitztem Wasserdampf sterilisiert. Bach Abkühlen des Reaktorsystems wird mit 200 ml Kulturlösung von Candida lipolytica EH 59 angeiiapft und unter folgenden Bedingungen der Wachstumsprozeß durchgeführt:

pH 4,2 (Regelung mit 30 %iger IaOH)

Temperatur 31⁰C

Rührerdrehzahl 2000 ü/min

Luftdurchsatz 100 l/kg . b

ITach einer Prozeßdau.er von 1b h ist das Wachstum bei 20 g Biotrockensubstanz/l beendet, bedingt durch StickstoffIimitation*

Die maximale Wachst Ulmsgeschwindigkeit, ermittelt aus der Abnahme der Stickstoffkonzentration im Medium, wird durch den Zusatz von Citronensäure um 80 % von 0,22 h bei citronensäurefreiem Permentationsmedium auf 0,4 h gesteigert.

Prozeßbedingungen and Reaktorsystem analog Beispiel 3· Dem Sahrmedium Beispiel 3 werden 150 g/l Paraffin zugesetzt, lach einer Prozeßdauer von 16 h ist der Wachstumsprozeß bei 20 g Biotrockensubstanz/l, bedingt durch Stickstoff limitation, beendet und der Produktbildungsprozeß beginnt*

Durch die Zugabe von Citronensäure wird bei gleicher maximal erreichbarer Säureendkonzentration und gleichbleibenden Ausbeutekoeffizienten die Prozeßdauer verkürzt und somit eine Steigerung der Produktivität des Gesamtprozesses am 40 % erreicht, die sich zusammensetzt aus einer Verkürzung der Wachstumsphase um 40 % und einer Steigerung der Produktivität der Produktbildung um 30 % von 1,25 g/Säure/kg . h ohne Zusatz von Citronensäure zu Beginn des Y/achstums auf 1,63 g Säure/kg , h mit entsprechendem Zusatz von Citronensäure.

Claims

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"!•Verfahren zur Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute mikrobieller Prozesse zur Gewinnung eiweißhaltiger Biomassen und/oder mikrobieller Stoffwecbselprodukte oder Wirkstoffe auf Kohlenwasserstoffen bzw. -gemischen, insbesondere Erdöldestillaten bzw. -raffinaten, dadurch gekennzeichnet, daß dem Permentationsmedium Citronensäure im Konzentrationsbereicb zwischen 0,5 und 5>0 g/l oder eine dem Konzentrationsbereicb entsprechende Menge citronensäurehaltiges Abwasser oder Fermentation3inedium zugesetzt wird*