DD206791A1 - Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren - Google Patents
Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren Download PDFInfo
- Publication number
- DD206791A1 DD206791A1 DD23628881A DD23628881A DD206791A1 DD 206791 A1 DD206791 A1 DD 206791A1 DD 23628881 A DD23628881 A DD 23628881A DD 23628881 A DD23628881 A DD 23628881A DD 206791 A1 DD206791 A1 DD 206791A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- expression
- sequence
- fragment
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 31
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 18
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XJSHKQILXNVFJW-XKBRQERYSA-N 1-[(2r,4s,5s)-5-[fluoro(hydroxy)methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](C(F)O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XJSHKQILXNVFJW-XKBRQERYSA-N 0.000 description 1
- KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NC1CC(C)(C)NC(C)(C)C1 KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101000740112 Homo sapiens Membrane-associated transporter protein Proteins 0.000 description 1
- 101000838579 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TAO1 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102100037258 Membrane-associated transporter protein Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100028948 Serine/threonine-protein kinase TAO1 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN GENTECHNISCHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG UND VERWENDUNG VON HYBRID-EXPRESSIONSVEKTOREN, DAS FUER SAEMTLICHE GENFUNKTIONSPRUEFUNGEN IN DER MOLEKULARBIOLOGIE, ZUR SPEZIFISCHEN SYNTHESE DEFINIERTER GENPRODUKTE IN DER MIKROBIOLOGISCHEN INDUSTRIE SOWIE FUER DIE GENSUBSTITUTION ZU HUMANMEDIZINISCHEN ZWECKEN UND IN DER TIERPRODUKTION EINSETZBAR IST. ZIEL IST DIE WAHLWEISE EXPRESSION IENES INTEGRIERTEN FREMD-GENS ODER EINER CDNS IN BAKTERIEN ODER TIERISCHEN/MENSCHLICHEN ZELLEN UNTER ANWENDUNG EIN UND DESSELBEN VEKTORS. DAS ERFINDUNGSGEMAESSE VERFAHREN BERUHT AUF DER HINTEREINANDERSCHALTUNG DES BAKTERIELLEN LAC-PROMOTORS UND DES BEGINN DES LACZ-GENS SOWIE DES EUKARYOTISCHEN HSV-TK PROMOTORS UND EINES TEILS DER TK-FUEHRUNGSSAQUENZ. EIN NACHFOLGENDES FREMD-GEN WIRD SOWOHL IN DEN BAKTERIEN ALS AUCH IN TIERISCHEN ZELLEN EXPREMIERT.
Description
•-•f-
Dr. M. Strauss Dr. U. Kießling Dr. R. Kahler
"Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Expressionsvektoren"
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Hybrid-Expressionsvektoren, welche isolierte Gene oder cDNS wahlweise in bakteriellen oder tierischen Zellen zur Expression veranlassen. Die Erfindung ist in der Molekularbiologie, in der mikrobiologischen Industrie zur spezifischen Synthese definierter Genprodukte und für die Gensubstitution zu humanmedizinischen Zwecken und in der Tierproduktion einsetzbar.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Zur Klonierung von Genen in Bakterien werden gewohnlich Plasmide oder Phagen, in tierischen Zellen meist Virusvektoren eingesetzt (Übersicht in: Scott/Werner: Molecular Cloning of Recombinant DIiA, Miami Winter Symposia Vol. 13)· Um eine Expression des. klonierten Gens zu erreichen, muß eine dem System entsprechende Genstruktur gewährleistet sein. Im Bakteriensystem bedeutet das, daß die zu exprimierende DNS-Sequenz (Gen oder cDNS) am 5'-Ende einen bakteriellen Promoter und einen Ribosomenbindungsort aufweisen muß. Im tierischen Sy- . stern ist ebenfalls ein Promoter am 5'-Ende erforderlich, der sich allerdings vom bakteriellen bezüglich der Basensequenz unterscheidet. Während bakterielle Promotoren in der Regel durch konservative Sequenzen in den Positionen um etwa -10 und -35 Basenpaaren vor dem mRlS-Start gekennzeichnet sind (Übersicht in: Miller und Reznikoff: The Operon. Cold Spring
28.DEL1931*98Q479
Harbor 1978), sind die charakteristischen Sequenzen tierischer Promotoren etwa um -30 sowie -80 Basenpaare vor dem mJRUS-Start zu finden (Corden et al. /1980/ Science 209, 1406). Die Notwendigkeit von Spleiß-Signalen in cDHSs von Genen, die natürlicherweise Introns besitzen, ist noch umstritten; scheint aber zumindest kein absolutes Erfordernis zu sein. Dies trifft ebenso zu für die Polyadenylierungssignale am SV-Ende der zu exprimierenden Sequenz. Für die Expression von fremdem genetischäji Material in Bakterien existieren zahlreiche Prinziplösungen, die im wesentlichen auf der Kombination eines selektierbaren Plasmids mit einem natürlichen Promoter von E.coli beruhen. Besonders geeignet scheint der gut charakterisierte lac-Promoter zu sein, der nach Integration der Premd-DNS in der richtigen Lesephase neben der normalen Expression noch eine zusätzliche Stimulierung durch Effektoren (z. B. IPTG) erlaubt. Entsprechende Vektoren stehen international zur "Verfügung (Guarente et al. /1980/ Science 209, 1428).
Vektoren, welche die Expression von Premd-DHS in tierischen Zellen.ermöglichen, wurden bisher fast ausschließlich vom DUS-Tumorvirus SV 40 abgeleitet, wobei die Expression unter Kontrolle eines der beiden SV 40 Promotoren erfolgt und zusätzlich die Spleiß- und Polyadenylierungssignale der Virus-DHS ausgenutzt werden (Mulligan und Berg /1980/ Science 209, 1422) bzw. diese von anderen Genen, wie z. B. dem Globin-Gen "entliehen" werden (Hamer und Leder /1979/ Cell 17, 737; O'Hare et al. /1981/ PUAS 78,.1527). Ein erstes positives Ergebnis der Expression eines Premdgens unter Kontrolle des Promoters des Herpes -Virus -Thymidinlcinase-SSens in einem Hybridvektor wurde kürzlich publiziert (Colbere-Garapin et al. /1981/ J. Mol. Biol. 150, 1 - 14).
Bisher ist kein Vektor bekannt, der den Transfer und die Expression von Genen bzw. cDUS sowohl in bakteriellen als auch in tierischen Zellen erlaubt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Hybrid-Expressionsvektoren zu entwickeln, welche den Transfer und die Expression isolierter Gene oder cDN£ wahlweise in Bakterien oder tierischen Zellen gestatten.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung und Anwendung von Vektoren, die die Expression jeglicher codierender genetischer Information (einer kontinuierlich ablesbaren DUS-Sequenz mit einem Startkodon am 5'-Ende und einem Stopkodon am 3'-Ende) sowohl in Bakterien al-s auch in tierischen und menschlichen Zellen bewirken. Da bisher nur Vektoren bekannt sind, die entweder eine Expression fremder Gene in Bakterien oder tierischen Zellen erlauben, mußte ein Weg gefundän werden, einen einmal hergestellten Vektor-Gen-Verband in beiden Systemen zur Ausprägung zu veranlassen. Damit wird eine wesentliche Vereinfachung bei der kombinierten Verwendung eines klonierten Gens zur Gewinnung des Genprodukts in der Bakterienkultur einerseits und zum Zwecke der "Gentherapie" bei tierischen/menschlichen Zellen andererseits erreicht. Darüber hinaus kann die 3?unktionstestung synthetischer Gene oder cDHSs wahlweise in einem der beiden Systeme vorgenommen werden
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Expressionsvektoren beruht auf der Kombination der drei Komponenten
(a) selektierbares bakterielles Plasmid
(b) bakterieller lac-Promotor mit Anfang des lacZ-Gens sowie
(c) HSV-tk-Gen bzw. -Promotor
und besteht aus folgenden Arbeitsschritten:
(1) Als Ausgangsplasmid dient das übliche Klonierungsvehikel * pBR322 (Bolivar et al. /1977/ Gene 2, 95), das neben der für die.Replikation notwendigen Sequenz noch die beiden Gene für Ampizillin- bzw. Tetrazyklin-Resistenz enthält.
- 4 - LOOLOQ /
Da nur ein Resistenzgen unbedingt für die Selektion benötigt wird, kann das andere entfernt werden. Statt dessen wird ein Teil des Iac-Operons in das Plasmid integriert; und zwar wenigstens der komplette Promotor und der Beginn .des lacZ-Gens, in den noch wahlweise ein Spaltort für EcoRI oder BamHI integriert wird. Ein entsprechend konstruiertes Plasmid (pUR2) ist bereits in der Literatur beschrieben worden (Rüther /1980/ Molec. Gen. Genet. 178, 475)· Bei diesem Plasmid wurde der Bereich zwischen dem EcoRI- und dem PY/uII-Spaltort mit dem Tetrazyklin-Resistenz-Gen aus pBR322 entfernt und ein im Phagen M13 vorliegendes Stück des lac-Operons in einen Haell-Ort von PBR322 integriert (Abb. 1). Das Plasmid pUR2 wird daher zweckmäßigerweise als prokaryotischer Expressionsanteil verwendet. Es wird mit EcoRI im Bereich des lacZ-Gens geöffnet.
(2) Die DHS des Herpes Simplex Virus (HSV) Typ 1 enthält ein Gen (tk), das für die Thymidinkinäse kodiert. Dieses Gen konnte in einem etwa 3 %der Gesamt-DHA entsprechenden 3,6 kb großen BamHI-Fragment lokalisiert werden (Wigler et al. /1977/ Cell 2, 223) und wurde von mehreren Gruppen in pBR322.kloniert (z. B. Enquist et al. /1979/ Gene,7, 335, CoIbere-Garapin et al. /1979/ Proc. ITati. Acad. Sei. 76, 3755). Die DNS-Sgquenz des tk-Gens wurde bereits aufgeklärt, wobei sich herausstellte, daß der Promotor Stopkodons für die Translation in allen 3 möglichen Lesephasen sowie SHIHE-DALGARHO-ähnliche Sequenzen enthält. (Mc Knight /1980/ Nucleic Acid Res. 8, 5949, Wagner et al. /1981/ Proc. Hatl. Acad. Sei. 78, 1441). Die Promotorsequenz ließ sich zwischen einem der beiden EcoRI-Spaltorte und dem BgIII-Spaltort lokalisieren. Dieser AB-schnitt umfaßt auch die erste Hälfte der Führungssequenz des tk-Gens (Abb. 2). Ein 2,4 kb-EcoRI-Fragment aus dem 3,6 kb-BamHI-Fragment enthält das komplette tk-Gen, beginnend mit (vermutlich) dem 2. STükleotid der. sogenannten
-5- <.«JU t ö ö /
"consensus"-Sequenz (Corden et al. /1980/ Science 209, 1406) des Promotors.
Bei der erfindungsgemäß durchgeführten Integration in den BcoRI-Ort des lacZ-Gens wird eine funktionsfähige Promotorsequenz wieder hergestellt. In einem 2,0 kb-PvuII-Fragment ist das tk-Gen ebenfalls komplett enthalten und darüber hinaus noch einige Basenpaare vor dem Promotor,, die die Expression nicht beeinträchtigen. Während aber das EcoRI-Fragment direkt in das lac-Operon integriert werden kann (gleiche kohäsive Enden der Partner) muß für die Integration des Pvull-Fragments das kohäsive Ende des EcoRI-Ortes im lacZ-Gen erst entfernt werden (Klenow-Fragment oder S1-Huklease). Andererseits scheint der Promotor im EcoRI-Fragment nicht so optimal zu exprimieren (in tierischen Zellen) wie der im Pvull-Fragment. Das EcoRI- bzw. PvUli-Fragment wird direkt aus dem HSV-Genom oder zweckmäßigerweise aus einem der zur Verfugung stehenden Plasmide (pTK bzw. pFGS) durch Spaltung und präparative Elektrophorese isoliert
(3) Die entscheidende Kombination der prokaryotisehen und eukaryotisehen Kontrolleinheiten erfolgt erfindungsgemäß folgendermaßen: Das mit EcoRI gespaltene pUR2 wird mit dem HSV-tk-EcoRI-Fragment direkt^ (oder mit dem.tk-PvuII-Fragment nach vorheriger Behandlung mit Klenow-Fragment der DNH-Polymerase oder S1-Uuklease) zusammen mit DUS-Ligase inkubiert. Anschließend erfolgt eine E.coIi-Transfektion und Selektion auf Ampizillin-Resistenz. Mehrere entstandene Kolonien werden hinsichtlich der Plasmidstruktur durch Spaltung mit mehreren Restriktasen und Elektrophorese geprüft. Das gewünschte Plasmid muß beide Partner in einer Kopie mit der richtigen Orientierung enthalten. Die hybride Expressionskontrolleinheit in den beiden Varianten pSK1 (Eco) und pSK2(Pvu) hat die in ABB. 3 dargestellte Struktur. Bülde Plasmidvarianten erlauben die Expression des HSV-tk-Gens in Bakterien (Abb. 3a) und in tierischen/menschlichen Zellen (Abb. 3b).
(4) Eine fremde, zu exprimierende DKS-Sequenz muß in die tk-Führungssequenz integriert werden. Dies geschieht bevorzugt in den BgIII-Ort, kann aber auch im HincII- oder Pstl-Ort erfolgen. Büi Verwendung von pSK1 oder pSK2 folgt der integrierten Sequenz überflüssigerweise noch die iK-Sequenz. Um der zu exprimierenden Sequenz die zu optimaler Expression notwendige Polyadenylierungssequenz direkt nachzuschalten, kann die fck-Struktursequenz bei pSK2 mit BgIII-Smal-Doppelspaltung vor der Integration herausgespalten werden (pSK22, siehe Abb. 3c). Die Integration der Fremd-DHS erfolgt dann in den Pstl-Ort. . Die hybriden Expressionsvektoren mit der integrierten Fremd-DUS werden nun wahlweise in Bakterien oder tierischen/menschlichen Zellen zur Expression veranlaßt. Bakterien werden mit der üblichen Transfektionstechnik behandelt. Uach Selektion auf Ampizillin-Resistenz wird die gesuchte Genexpression durch biologische, biochemische oder immunologische Eigenschaften in vivo bzw. in vitro nachgewiesen.
Tierische oder menschliche Zellen werden mit Hilfe der Kalzium-Präzipitationstechnik mit Plasmid behandelt. Falls die integrierte Sequenz keine selektierbare Punktion kodiert, werden die Zellen parallel mit einem selektierbaren Gen (tk-Plasmid bei tk-negativen Zellen oder Methotrexat-Resistenz-Plasmid) behandelt. In den entsprechend selektierten Zellen wird die Expression des IPremd*- Gens mit spezifischem Test nachgewiesen. Soll nur die Punktionsfähigkeit der Fremd-DUS nachgewiesen v/erden, kann dies mit spezifischem Test ohne Selektion bereits 1-3 Tage nach der Transfektion erfolgen.
1. Herstellung von pSK 1
Entsprechend der erfindungsgemäßen Zielstellung soll ein 2,4 kb-Fragment mit dem HSV-tk-Gen hinter den lac-Promotor von E.coli geschaltet-werden, so daß ein exprimierendes Plasmid entsteht.
Als Plasmid, das bereits den lac-Promotor enthält, diente pUH2 (Rüther/1980/Molec. Gen. Genet. 178, 475). Dieses Plasmid (1 /Ug) wurde durch Inkubation mit der Restriktionsendonuklease EcoRI (1 Einheit) zwischen dem 15. und 19. lukleotid des lacZ-Gens (aus dem Phagen M13mp2; Gronenborn und Messing/1978/Uature 272, 375) gespalten. Durch Inkubation des Plasmids pFG5 (5 /U.g) das ein 3,6 kb-HSlT-tk-Fragment enthält (Colbere - Garapin et al. /1979/ Proc. latl. Acad* Sei. 76., 3755), mit 5 Einheiten EcoRI entstanden 3 Fragmente, die elektrophoretisch voneinander getrennt wurden (0,8 % Agarose). 1/10 der Probe wurde in einem separaten Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UT betrachtet. Das mittlere der drei aufgelösten Fragmente war das 2,4 kb-HSY-tk-Fragment. Der entsprechende Bereich wurde aus dem nichtgefärbten Gel herausgeschnitten, das Gel in der 4fachen Menge 6 M SaGlO, bei 450C (30 min) aufgelöst und die entstandene Suspension über ein ca. 6 mm großes Glasfaserfilter Typ Whatman GF/F filtriert. Das Filter wurde mit je 2 ml 6 M IaClO,, Isopropanol und Äthanol gewaschen. Von dem getrockneten Filter wurde dann das gebundene DITS-Fragment durch 3 Waschungen mit je 30 /al Elutionspoffer (5 mM Tris-HCl/0,5 mM EDTA, pH 7,5) durch Zentrifugation aus einer Eppendorf-Pipettenspitze in ein Eppendorf-Röhrchen eluiert (ca. 70 % Ausbeute). Das erhaltene HSY-Eco-Fragment (ca. 1 /Ug) wurde nun mit dem Ecogespaltenen püR2 gemischt und bei einer Konzentration von 50 /Ug/ml (40 /Ul) mit 0,2 Einheiten T4-DIfS-Ligase in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1O mM MgCl2AO mM DTT, 35 /U MATP über Hacht bei 40C inkubiert,
Durch Elektrophorese wurden die Ligierungsprodukte voneinander getrennt, die monomere Hybridbande von ca. 5 kb (etwa 30 % der gesamten DlTS) identifiziert und - wie oben beschrieben - aus dem Gel extrahiert. Diese DlTS wurde dann zur Transformation von E.coli G 600 eingesetzt. Transformanten wurden auf Agarplatten mit 50 /Ug/ml Ampizillin selektiert. Bei einer Transformationseffektivität von 5 χ 10^ Kolonien/1 /Ug pBR322 (5 x 10^ mit 1 ag) wurden mit dem Hybridplasmid (ca. 10 ng eingesetzt) ca. 105 Kolonien erhalten.
32
Eine Koloniehybridisierung mit dem v P-markierten Eco-tk-Fragment zeigte, daß nahezu alle Kolonien das Hybridplasmid enthalten mußten. Durch direkte Plasmidschnellisolation (nach Holmes und Quigley/1981/ Anal. Biochem. 114, 193) von 10 Kolonien konnte gezeigt werden, daß 9 Kolonien ein Plasmid enthielten, das größer als pUB2 (2,86 kb) aber kleiner als das Plasmid pAGQ (6,3 kb) war. An den gleichen Proben wurde die Orientierung des. HSV-tk-Fragments zum lac-Promotor durch Spaltung mit Pstl ermittelt. Der Plasmidanteil-enthält einen Spaltort und der HSY-Anteil zwei. Das interne HSV-Fragment von 840 bp entsteht in beiden Fällen. Bei richtiger Orientierung entstehen zwei zusätzliche Fragmente mit ca. 2630 bp sowie 1583 bp und bei falscher Orientierung zwei mit ca. 2918 bp sowie 1295 bp. Das gelelektrophoretische Bild zeigt, daß von den 9 Klonen 5 ein Plasmid mit richtiger Orientierung und 4 eins mit falscher Orientierung enthalten, d. h. statistische Verteilung liegt vor.
Aus jeweils einem Klon wurde nach Hassenkultur (1 1) ein Plasmid mit richtiger (pSK1-1) und eins mit falscher Orientierung (pSK1-2) präparativ gewonnen (ca. 0,6 mg). Die Identität der Plasmide und die Orientierung wurde durch Spaltung mit mehreren Restriktionsendonukleasen bestätigt..
Das Plasmid pSK1 steht damit als Expressionsvektor zur Verfügung.
2. Herstellung von pSK2
In ähnlicher Weise wie pSK1 wurde pSK2 durch Kombination von ptJH2 mit einem HSV-tk-Fragment hergestellt. Allerdings wurden hier parallel die beiden Plasmidvarianten pUR2-Eeo und -Barn eingesetzt. Es wurde jeweils 1 /Ug Plasmid-DHS mit 1 Einheit EcoRI bzw. BamHI gespalten.
( Da das zu koppelnde tk-Fragment ein glattes Ende hat, mußten die entstandenen Einstrangenden noch durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment der DHS-Polymerase (0,1 Einheit) aufgefüllt werden (in Anwesenheit der 4 Desoxynukleotide, je 30 /UM). Zur Vermeidung des einfachen Ringschlusses wurde die gespaltene DHS anschließend mit jeweils 0,01 Einheit alkalischer Phosphatase (aus Kälberdarm) 30 min bei 420C inkubiert, wobei die Phosphatgruppen an den 5'-Enden entfernt wurden (Ullrich et al./1977/Science 196, 1313). Aus dem Plasmid pAGO (Colbere-Garapin et al./1979/ Proc. Hatl. Acad. Sei. 76, 3755) wurde ein HSV-tk-Pragment durch Inkubation von 10 /Ug DHS mit 10 Einheiten PvuII herausgespalten. Die aus dieser Spaltung resultierenden
v- zwei Fragmente wurden elektrophoretisch voneinander getrennt und das 2025 bp-tk-Fragment wurde - wie im 1. Beispiel beschrieben - aus dem Gel zurückgewonnen (ca. 2 /ig). Die beiden dephosphorylierten pUE2-Varianten wurden anschließend mit je 1 /Ug tk-Fragment in Anwesenheit von 8 Einheiten T4-DHS-Ligase in 2 Tagen bei 40C ligiert. Die Iiigierungsprodukte wurden elektrophoretisch aufgetrennt, die dem zirkulären Hybrid-DHS-Molekül von 4,7 kb entsprechende Bande wurde aus dem Gel herausgeschnitten, die DHS aus dem Gel extrahiert und zur Transformation von E.coli €600 eingesetzt. Es wurden wieder Ampizillin-resistente (plasmidtragende) Kolonien isoliert, und durch Plasmidschnellisolation hinsichtlich ihres Plasmidtyps geprüft.
Die Orientierung des tk-Gens zum lac-Promotor wurde in diesem Fall durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Pstl bzw. HincII geprüft. Bei der richtigen Orientierung (pSK2-1) ergaben sich nach Pst-Spaltung 3 Fragmente mit 840, 1707 und ca· 2170 bp und bei der falschen (pSK2-2) 3 Fragmente mit 840, 1419 und ca. 2458 bp. Da die Größenunterschiede mit Pst-Spaltung nicht sehr deutlich ausfielen, wurde die Orientierung durch HincII-Spaltung bestätigt. Bei der richtigen Orientierung ergaben sich hier 2 Fragmente mit 2023 und ca. 2694 bp und bei der falschen solche mit 1139 und ca. 3578 bp (die genannten Werte beziehen sich auf die Abkömmlinge der pUR2-Ecο-Variante; bei der Bam-Variante ergibt sich das gleiche Muster, wobei ein Fragment jeweils geringfügig größer ist). Auch bei pSK2 ergab sich eine statistische Verteilung beider Orientierungen.
Beide Varianten wurden mit beiden Orientierungen in präparativem Maßstab isoliert und für die Funktionsprüfung und weitere Anwendung bereitgestellt.
3. Testung der Expression des HSV-tk-Gens in B.coli Zur Funktionstestung des tk-Gens wurde zunächst eine Mutante von E.coli G600 hergestellt, die keine nennenswerte endogene Aktivität der Thymidinkinase aufweist. Diese Mutante kann auf einem Selektivagar mit Blockierung der en-. dogenen Thymidin-lukleotidsynthese mit 5-Fluorurazil (oder 5'-Fluordesoxyuridin) und Angebot von Thymidin nicht wachsen. Diese Mutanten wurden nun parallel mit den verschiedenen tk-Gen enthaltenden Plasmiden (pFG5, pAGO, pSKT-2, pSK2-1 (Eco), pSK2-2 (Eoo), pSK2-1 (Barn), pSK2-2 (Barn)) transformiert. Plaamid enthaltende Bakterien wurden auf Ampizillin-Agar selektiert und anschließend auf Agar mit 25 /Ug/ml 5-Fluorurazil, 25 /Ug/ml Uridin und 50 /Ug/ml Thymidin replattiert.
- 11 - 4
Ήαν Bakterien, die mit pSK1-1 und den beiden Varianten pSK2-1 transformiert worden waren, wachsen auf dem Selektivagar zu. Kolonien aus. Demnach erlaubt die erfindungsgemäße Kombination des lac-Promotors mit dem HSV-tk-Gen in der richtigen Orientierung die Synthese-einer funktionsfähigen Thymidinkinase in E.coli, Die Überprüfung der Thymidinkinaseaktivitäten der verschiedenen Transformanten bestätigte das Ergebnis. %hrend in Bakterien mit pSK1-1 und pSK2-1 Thymidinkinase-Aktivitäten im Bereich der Normalaktivität Von E.coli C600 nachweisbar waren, ergaben sich in allen anderen Fällen Aktivitäten von weniger als 10 %. Das Ergebnis erlaubt die Voraussage, daß auch andere eukaryotische Strukturgeninformationen nach Integration in die tk-Führungssequenz von pSK1-1 oder pSK2-1 in Bakterien zur Expression gebracht werden können.
4. Testung der Expression des HSV-tk-Gens in tierischen ZeI-
len . ;
Die Expression des HSV-tk-Gens in tierischen Zellen unter Kontrolle seines eigenen Promotors ist vielfach belegt ( (z. B-'wigler et al./1977/Cell 2, 223, Golbere-Garapin et al./1979/Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 3755). Bs war zu überprüfen, ob die Expression des tk-Gens durch die Kombination der bakteriellen und eukaryotischen Promotorsequenzen beeinträchtigt wird.
Dazu wurden jeweils 5 σ 10 Ltk"-Zellen mit einem Kalziumphosphat -Kopräzipitat von je 0,1 /Ug Plasmid und 10 /Ug Kalbs-DNS als Träger für eine Dauer von 16. Stunden inkubiert. Nach 2 Wochen Kultivierung im sogenannten ΗΑΐ-Selektivmedium wurden die Kolonien der überlebenden tk-positiven Zellen gezählt. Während die Plasmide pSK2-1 und pSK2-2 eine Transformationseffektivität ähnlich der mit pFG5 und pÄGO (ca. 10"*^) ergaben,, war die Effektivität mit . pSK'1-i und pSK1-2 etwas reduziert, d. h. für die Ausprägung des tk-Gens in der tierischen Zelle spielt die Orien-
Λ Ο
tierung im Plasmidverband keine wesentliche Rolle, während die unvollständige eukaryotische Promotorsequenz von pSKl-1 und pSK1-2 offenbar zu einer reduzierten Expression führt. '-
Aus den Beispielen 3. und 4. folgt, daß pSK2-1 offenbar den günstigsten Hybridespressionsvektor für das bakterielle und das tierische System darstellt.
Pur die Expression anderer Fremd--Gene muß die jeweils günstigste Variante (Eco oder Barn) und der Integrationsort (BgIII, Psti-j Hindi) entsprechend der benötigten Lesephase ausgewählt werden. Zur optimalen Expression empfiehlt sich die erfindungsgemäße Verwendung von pSK2-2, wobei der tk-Bereich zwischen den BgIII- und Smal-Spaltorten vor der Integration der Fremd-DHS herausgespalten wird.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Expressionsvektoren, die sowohl in Bakterien als auch in tierischen Zellen die Expression von eMS oder bakteriellen sowie tierischen/ menschlichen Strukturgenen bewirken, dadurch gekennzeichnet, daß eine kovalente Verbindung der zu exprimierenden Sequenz mit einem DNS-Molekül? das außer dem Replications-bereich und einem ASSibiotika-Resistenz-Gen noch die für die Kontrolle der Expression in Bakterien und tierischen Zellen erforderlichen lukleotidsequenzen enthält, hergestellt wird, wobei eine prokaryotische und eine eukaryotisehe Kontrolleinheit (Promotor) direkt hintereinander angeordnet der zu exprimierenden Sequenz vorgeschaltet werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als prokaryotische Kontrolleinheit der Iac Promotor von E.coli verwendet wird, vorzugsweise mit dem sich anschließenden Beginn des lacZ-Gens und einem darin eingebauten EcoRI- oder BamHI-Spaltort kovalent verbunden.
3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eukaryotische Kontrolleinheit die Promotor- und Führungssequenz des tk-Gens von Herpes Simplex Virus Typ I verwendet wird, die ihrerseits Stopsignale und Startpunkte für die Translation in allen 3 Leserastern sowie SHIHE-DAIGARUO-ähnliche Sequenzen enthält.
4. Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß für den Pail der bevorzugten Expression in Bakterien - das lac-Operon im Bereich des lacZ-Gens bevorzugt mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten und die tk-Promotorsequenz an diesem Ort mit Hilfe von Ligase integriert wird. -
5. Verfahren nach Punkt 1 -4, dadurch gekennzeichnet, daß das gesamte HSV-tk-Gen einschließlich der Promotorsequenz bevorzugt in Form- eines 2,4 kb-Fragments nach Spaltung mit EcoRI wahlweise aus dem Virus oder einem tk-Gen enthaltenden Plasmid gewonnen und mit der Promotorsequenz in der Leserichtung in das lacZ-Gen integriert wird.
6. Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß für den Fall der parallelen bzw. der bevorzugten Expression in tierischen/menschlichen Zellen - das lac-Operon im Bereich des lacZ-Gens wahlweise mit den Bndonukleasen EcoRI oder BamHI gespalten wird, die kohäsiven Enden wahlweise mit dem Klenow-Fragment der E.coli-DNS-Polymerase aufgefüllt oder mit S1-Nuklease abgebaut werden und die tk-Promotorsequenz über die glatten Enden integriert wird.
7. Verfahren nach Punkt 1-3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das HSV-tk-Gen einschließlich der Promotorsequenz bevorzugt in Form eines 2,0 kb-Fragments nach Spaltung mit PvuII wahlweise aus dem Virus oder einem tk-Gen enthaltenden Plasmid gewonnen und mit der Promotorsequenz in der Leserichtung in das lacZ-GSn integriert wird.
8. Verfahren nach Punkt 1-3 und 6+7, dadurch gekennzeichnet, daß der größte Teil des HSV-tk-Strukturgens durch BgIII/Smal-Doppelspaltung entfernt wird, die beiden entstandenen Fragmente voneinander getrennt werden und das größere Fragment, das noch den Promotor, einen Teil der Führungssequenz sowie das Polyadenylierungssignal des tk-Gens enthält, nach Auffüllen oder Abdauen des BgIII-EHdes mittels Ligase zum Ring geschlossen ?ri.rd.
JjSeiten Zeichnungen
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD23628881A DD206791A1 (de) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD23628881A DD206791A1 (de) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD206791A1 true DD206791A1 (de) | 1984-02-08 |
Family
ID=5535858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD23628881A DD206791A1 (de) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD206791A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0167852A3 (en) * | 1984-06-11 | 1988-01-07 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Human interferon-gamma |
-
1981
- 1981-12-28 DD DD23628881A patent/DD206791A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0167852A3 (en) * | 1984-06-11 | 1988-01-07 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Human interferon-gamma |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3588199T2 (de) | Lymphokin-Herstellung und -Reinigung | |
| DE3486493T2 (de) | Klonieren von Superoxiddismutase und Expression in Mikroorganismen | |
| EP0099084B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Interferon und Expressionsvektoren dafür | |
| DE69024440T2 (de) | Verfahren zum spezifischen ersetzen einer genkopie, die sich in einem rezeptorengenom befindet, durch genintegration | |
| DE3486216T2 (de) | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren. | |
| DE3020528C2 (de) | ||
| DE3050722C2 (de) | ||
| DE69032743T2 (de) | Herstellung von fusionsproteinen | |
| EP0211299B1 (de) | Fusionsproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| DD212403A5 (de) | Verfahren zur synthetisierung von rinderwachstumshormon | |
| DE3382575T2 (de) | Dna-sequenzen, rekombinante dna-molekuele und verfahren zur herstellung von schweinewachstumshormonaehnlichen polypeptiden. | |
| DE3787820T2 (de) | Für Flagellin kodierende DNS und dieses enthaltender Vektor. | |
| DD212982A5 (de) | Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden | |
| DE69130494T2 (de) | Rekombinanter menschlicher Hepatozytwachstumsfaktor und Verfahren zu seiner Herstellung | |
| DE3789316T2 (de) | Herstellung von human-parathyroidhormon. | |
| DE69013495T2 (de) | Regulierung der genexpression. | |
| EP0453969B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in Streptomyceten | |
| DE3485923T2 (de) | Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid. | |
| DE3586830T2 (de) | Verfahren zur ligation von heterogenen genen. | |
| DD206791A1 (de) | Verfahren zur herstellung von hybrid-expressionsvektoren | |
| EP0244627A2 (de) | Expressionsvektoren zur Gewinnung von Polypeptiden | |
| EP0289936B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in Streptomyceten | |
| DE69229392T2 (de) | Neuartiges plasmid | |
| DE3587730T2 (de) | Kontrollsysteme für rekombinant-manipulationen. | |
| EP0316378A1 (de) | Expressionsvektor zur regulierbaren expression von fremdgenen in prokaryonten. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |