DD212982A5 - Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Rinder-Wachstumshormonaehnlichen Polypeptiden in hoher Ausbeute durch Zuechtung eines mit einem DNA-Rekombinant-Molekuel transformierten Wirts und die Isolierung des entstandenen Polypeptids. Diese Polypeptide sind anabol wirksame Hormone fuer Rinder zur Erhoehung der Wachstumsgeschwindigkeit, der Gewichtszunahme und der Fleischproduktion.
Description
Titel der Erfindung:
Verfahren zur Herstellung von Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet anabol wirksamer Peptidhormone für Rinder, insbesondere zur Beschleunigung des Wachstums, der Gewichtszunahme und Erhöhung der Fleischproduktion.
Rinderwachstumshormon (BGH) ist ein im Hypophysen-Vorderlappen gebildetes Proteohormon. BGH wird vermutlich als Vorläuferprotein synthetisiert und während der Sekretion aus den Zellen in das reife Rinderwachstumshormon überführt. Es ist bekannt, daß Proteinfraktionen von natürlichem Rinderwachstumshormon Polypeptide enthalten, denen eine Anzahl von Aminosäuren am aminoterminalen Ende fehlen, die jedoch immer noch biologisch aktiv sind.
Eine für Rinderwachstumshormon kodierende DNA-Sequenz und eine Aminosäuresequenz sind bekannt; vgl. W.L. Miller et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 7521 bis 7524,· M.D. Dayhoff et al·., in "Atlas of Protein Sequence And Structure",
r ·
Herausgeber Dayhoff, 5, Süpp. 3, S. 345 bis 352 (1978) und M. Wallis, FEBS Lett., Bd. 35 (1973), S. 11 bis 14. BGH ist ein Polypeptid mit 191 Aminosäure-Einheiten. Es wird anscheinend zunächst als Vorläuferprotein mit 217 Aminosäure-Einheiten gebildet. Die Signalsequenz von 26 Aminosäuren wird vom N-terminalen Ende während der Synthese und Sezernie rung abgespalten; vgl. V.R. Lingapa et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 2432 bis 2436.
Wachstumshormone werden normalerweise während des Lebenszyklus gebildet, in der juvenilen Entwicklung anscheinend jedoch in höheren Mengen. Diese Hormone fördern das Knochenwachstum, die Stickstoffretention, die Proteinsynthese,und sie haben einen Einfluß auf den Glucose- und Lipid-Stoffwechsel. Dementsprechend sind Wachstumshormone anabol wirksame Proteohormone.
Wachstumshormone zeigen eine gewisse Species-Spezifität. Wachstumshormone"einer Species können biologisch aktiv sein als in einer unter der Evolutionsskala-angeordneten anderen Soecies. Der Mechanismus der Wirkung des Wachstumshormons ist zwar nicht vollständig geklärt, doch wurde gezeigt, daß die Verabfolgung vonWachstunshorziOn das Khochenwachstura , die Gewichtszunahme und die Fleischproduktion in Tieren erheblieh erhöht. Beispielsweise betrug bei einem Versuch bei Schweinen, denen täglich gereinigtes Schweinewachstumshormon injiziert v/urde, die durchschnittliche Gewichtszunahme 1,02 kg pro Tag' im Vergleich zu einer durchschnittlichen Gewichtszunahme von 0,99 kg pro Tag bei der Kontrollgruppe.
Die behandelten Schweine verbrauchten wesentlich weniger Nah rung pro Tag als die Kontrollgruppe, nämlich 3,18 kg gegenüber 3,81 kg. Die behandelten Schweine sind von wesentlich besserer Körperqualität. Die Körper der mit Wachstumshormon behandelten Schweine haben eine durchschnittliche Länge von 77,5 cm und 3,54 cm Rückenfett, während die Kontrollgruppe eine durchschnittliche Länge von 74,5 cm und eine Rückenfett
r ~ι
— J —
dicke, von 4,5 cm aufweist. Die chemische Zusammensetzung des genießbaren Fleisches ist bei den mit Wachstumshormon behandelten Schweinen ebenfalls deutlich verbessert, nämlich . .13/50 % Protein, 49,14 % Wasser und 36,76 % Fett im Vergleich zur Kontrollgruppe mit 10,8 % Protein, 39,43 % Wasser und 49,27 % Fett; vgl. E.J. Truman, "Some Effects Of Pituitary Anterior Growth Hormone On Swine" , Dissertation, Purdue Universität, April 1953.
.Das vorstehend beschriebene verbesserte Wachstum und die erhöhte Fleischproduktion bei. Tieren durch Verwendung von Wachstumshormon kann bei Rindern nicht in großem Umfang angewendet werden, weil BGH in unzureichenden Mengen zur Verfügung steht. BGH wird entweder durch Extraktion aus den Hypophysen von Rindern gewonnen oder durch DNA-Rekombinant-Technologie in geeigneten Wirtszellen hergestellt; vgl. z.B. W.L. Miller et al., J. Biol. Chem.,Bd. 255 (1980), S. 7521 bis 7524, EP-OS 47 600 und GB-OS 2 07.3 245A. Hypophysen stehen nicht in ausreichender Menge zur Verfugung, um die erforderlichen Mengen an.BGH zu gewinnen. Das bekannte Verfahren der DNA-Rekombinant-Technologie ist ebenfalls unbefriedigend, weil die Ausbeuten bei der Expression des BGH-Gens in verschiedenen Wirtszellen zu niedrig sind und deshalb das Verfahren unwirtschaftlich ist.
- ·
Ziel der Erfindung: ' .
Ziel der Erfindung ist es, neue anabol wirksame Rinder-Wachstumshormon-ähnliche Polypeptide bereitzustellen. 30
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Rinder-Wachstumshormon-ähnliche Polypeptide mit anaboler Wirkung bereitzustellen, wobei die Nachteile des Standes der Technik durch höhere Ausbeuten überwunden werden sollen.
Γ Π
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von neuen Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen mit einem Rekombinant-DNA-Molekül transformierten Wirt züchtet, das eine für das PoIypeptid kodierende DNA-Sequenz enthält, die funktionsfähig an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, und die DNA-Sequenz eine Deletion am aminoterminalen Ende der DNA-Sequenz aufweist, die für das reife Rinder-Wachstumshormon kodiert, und wobei diese DNA-Sequenz die Herstellung der Polypeptide in mindestens 100 mal höherer Ausbeute gestattet als die für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierende DNA-Sequenz, und daß man das Polypeptid isoliert. Der Ausdruck "funktionsfähig ge- ; bunden" bedeutet, daJ3 die DNA-Sequenz (Strukturgen) derart an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, daß die Expression ermöglicht wird.
Durch die Erfindung werden die vorstehend aufgeführten Schwierigkeiten dadurch gelöst, daß DNA-Sequenzen bereitgestellt und benutzt werden, die für neue BGH-ähnliche Polypeptide ko-
dieren und die in geeigneten Wirtszellen in sehr hoher Ausbeute Polypeptide mit der biologischen Aktivität von BGH zur Expression bringen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt es zum ersten Mal, Polypeptide mit BGH-Aktivität in technisch
brauchbaren Mengen herzustellen. Die erfindungsgemäß verwen-25
deten neuen DNA-Sequenzen und DNA-Rekombinant-Moleküle sind in der Lage, die Produktion großer Mengen Rinder-Wachstumshormon-ähnlicher Polypeptide zu erzeugen. Die erfindungsgemäß herstellbaren neuen Polypeptide eignen sich entweder als solche wie sie in der Wirtszelle gebildet werden oder nach ' '
Überführung in Derivate oder nach Modifizierung als Mittel zur Erhöhung des Wachstums und der Fleischproduktion von Rindern.
Erfindungsgemäß werden DNA-Sequenzen verwendet, die für Polypeptide mit BGH-Aktivität kodieren. Diese DNA-Sequenzen sind gekennzeichnet durch Deletionen am aminoterminalen Ende
der für reifes Rinderwachstumshormon kodierenden DNA-Sequenz. L- ' J
Γ _
Sie gestatten nach Einfügen in. geeignete Expressionsvektoren und nach Einschleusen der Hybrid-Vektoren in geeignete Wirtszellen die Herstellung BGH-ähnlicher Produkte in mindestens etwa 100 mal größerer Ausbeute und vorzugsweise mindestens et wa 1000 mal größerer Ausbeute als die bekannten, für reifes Rinderwachstumshormon kodierenden DNA-Sequenzen, die bisher für die Expression verwendet wurden.
Die erfindungsgemäß verwendeten DNA-Sequenzen enthalten beispielsweise die DNA-Inserts von pBGH-A4, pBGH-A9, pBGH-•A4(Ser), PBGH-.A9 (Ser) und andere DNA-Inserts, die durch eine Deletion am aminoterininalen Ende der DNA-Sequenz gekennzeichnet ist, die für reifes Rinderwachstumshormon kodiert. Diese Inserts gestatten die Produktion von Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden in mindestens 100 mal höherer Ausbeute als die DNA-Sequenz, die für reifes Rinderwachstumshormon kodiert.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Verfah-
rens zur Herstellung von DNA-Rekombinant-ilolekülen, die eine für BGH kodierende DNA-Sequenz enthalten.
Fig. 2 und 3 zeigen die Nucleotid-Sequenz eines DNA-Inserts, das für -ein Rinder-Wachstums-Prehormon kodiert. Die
Nucleotid-Sequenz ist numeriert vom Ende des oligo (dG)-Schwanzes bis zum Beginn des oligo (dC)-Schwanzes; Nucleotide 1 bis 713. Die wiedergegebene Sequenz umfaßt 25 der 26 Aminosäuren der Signalsequenz des vermuteten Rinder-Wachstums-Prehormons (Aminosäuren -25 bis -1)
und 191 der Aminosäuren.des reifen Rinder-Wachstumshormons (Aminosäuren 1 bis 191).
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstelluncr einer DNA-Sequenz der Erfindung mit einer . '
Deletion am aminoterminalen Ende des für BGH kodierenden DNA-Fragments.
L · -J
Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung von Expressionsvektoren der Erfindung mit DNA-Sequenzen, die eine sehr hohe Expression von
neuen Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden ge-
statten.
Fig. 6 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Verfahrens der Erfindung zur Herstellung von Expressionsvektoren mit DNA-Sequenzen, die ebenfalls eine sehr hohe Expression der neuen Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptide gestatten.
In der Beschreibung werden folgende Ausdrücke verwendet:
Nucleotid: Ein monomerer Baustein von DNA oder RNA. Ein Nucleotid besteht aus drei Komponenten, einer Purin- oder Pyrimidinbase, einem Phosphatrest und einem Fünf-Kohlenstoff-Zucker. Die Base ist über eine N-glykosidische Bindung an die 1-Stellung des Zuckers gebunden. Die Kombination einer 2C Base mit dem Zucker wird Nucleosid genannt. Jedes Nucleotid ist durch seine Base gekennzeichnet. Die vier DNA-Basen sind Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil (U).
DNA-Sequenz: Die einzelnen Nucleotide sind durch Phosphatbrücken zwischen dem 3'-C-Atom und dem 5'-C-Atom des benachbarten Zuckerrestes (Desoxyribose bzw. Ribose) verbunden.
Codon: Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), 3Q das über m-RNA für eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations-Stoppsignal kodiert.Beispielsweise kodieren die Nucleotid-Tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für die Aminosäure Leucin (Leu), TAG, TAA und TGA sind Translations-Stoppsignale und ATG ist.ein Translations-Startsignal.
Leseraster: Die Gruppierung von Codons während der Translation von m-RNA in Aminosäure-Sequenzen. Während der Trans-
lation muß der richtige Leseraster beibehalten werden. Bei-' spielsweise kann die Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Leseraster übersetzt werden, von denen jeder eine andere Aminosäure-Sequenz ergibt:
GCT GGT TGT AAG — Ala-Gly-Cys-Lys
G CTG GTT GTA AG — Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP) :
Polypeptid: Eine Anordnung von Aminosäure-Einheiten, die miteinander durch Peptid-Bindungen zwischen der(X-ständigen Aminogruppe und der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure verbunden sind.
Genom: Die gesamte DNA einer Zelle oder eines.Virus. Das Genom umfaßt unter anderem die für die Polypeptide des Orga- : nismus kodierenden Gene sowie Operator, Promotor und Ribosomen.-Bindungssequenzen und Wechselwirkungssequenzen, einschließlich solcher Sequenzen, wie der Shine-Dalgarno-Sequenzen.
20
Gen: Eine DNA-Sequenz, die über ihre Matrizen- oder Boten-RNA (m-RNA) eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein bestimmtes Polypeptid charakteristisch ist.
Transkription: Das Verfahren der Synthese von m-RNA aus einem Gen. -
Translation: Das Verfahren'der '. Synthese eines Polypeptids aus m-RNA
30
Expression: Das durch Transkription und Translation einer DNA-Sequenz oder eines Gens erzeugte Polypeptid.
Plasmid: Eine extrachromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz mit einem intakten Replikon, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle vermehrt. Beim Einbringen des Plasmids in
einen einzelligen Organismus können die Eigenschaften dieses Organismus als Folge der Plasmid-DNA geändert oder transformiert werden. Beispielsweise transformiert ein Plasmid/ das
R ein Gen für Tetracyclinresistenz (Tet ) trägt, eine vorher Tetracyclin-empfindliche Zelle in eine Tetracyclin-resistente. Eine durch ein Plasmid.transformierte Zelle wird als Transformante bezeichnet.
Phage oder Bacteriophage: Ein bakterielles Virus, das gewöhn-, lieh aus DNA-Sequenzen besteht, die in eine Proteinhülle (Capsid) verpackt sind.
Kloniervehikel: Ein Plasmid, Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die sich in einer Wirtszelle vermehren kann und die durch eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen diese DNA-Sequenzen in bestimmter Weise ohne gleichzeitigen Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA geschnitten werden können, z.B. der Replikation, der Bildung von Hüllproteinen oder den Verlust von Promotor- oder Bindungssteilen, und die zum Transformationsnachweis ein Markergen enthalten, z.B. ein Gen für Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz. Ein Kloniervehikel wird häufig als als Vektor bezeichnet.
Klonieren: Das Verfahren zur Herstellung einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von einem einzigen Organismus oder einer Sequenz durch asexuelle Reproduktion ableitet.
DNA-Rekombinant-Molekül oder Hybrid-DNA: Ein Molekül, das aus Segmenten von DNA unterschiedlicher Genome besteht, die Ende an Ende außerhalb lebender Zellen miteinander verbunden worden sind,und das in der Lage ist, bestimmte Wirtszellen zu infizieren und sich dort aufhalten kann.
Expressions-Kontrollsequenz: Eine Nucleotid-Sequenz, welche
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die Expression von DNA-Sequenzen oder Genen steuert und reguliert, wenn sie an derartige Sequenzen funktionsfällig gebunden ist. Beispiele für diese Sequenzen sind das lac-System, das trp-Systein/ die Haupt-Operator- und -Promotorbereiche des
5. Phagen/v / die Kontrollregion des fd-Hüllproteins und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Genexpression prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren oder deren Kombinationen steuern.
BGH: Rinder-Wachstumshormon
BGH-ähnliches Polypeptid: Ein Po'lypeptid, das die wachstumsfördernde biologische Wirkung von BGH zeigt.
Nachstehend wird die Herstellung eines DNA-Rekombinant-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, die für Rinder-Wachstumshormon kodiert, erläutert. In Fig. 1 ist ein Fließschema dieses Verfahrens wiedergegeben. Aus Hypophysen-Vorderlappen des Rindes wird durch Extraktion mit Guanidiniumchlorid RNA gewonnen. Der RNA-Extrakt wird an einer oligo(dT)-Säule der Affinitätschromatographie unterworfen; vgl. H. Goodman und R. MacDonäld, in Methods in Enzymology Recombinant DNA, Herausgeber R. Wu, Bd. 68 (1979), S. 75 bis 89; H. Aviv und P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 69 (1972), S. 1408 bis 1412. Sodann wird die erhaltene Gesamt-poly(A)-RNA an isokinetischen Sucrose-Gradienten (10 bis 20 %) der Größenselektion unterworfen; vgl. Buell et al., J. Biol.' Chem. , Bd. 253 (1978), S. 2471 bis 2482, und Wickens et al., J.Biol.
Chem., Bd. 253 (1978), S. 2483 bis 2495. ' 30
Die durch Größenfraktionieren bzw. -selektion erhaltene^ für Rinder-viachstumshormon kodierende poly (A) -mHHA (bestimmt durch einen Kaninehen-Reticulozyten-zellfreien Translationssvstem-Test nach H. Pelham und R. Jackson, Sur. J. Biochem., · ~ : '
Bd. 67 (1976), S. 247), wird als Matrize für eine reverse'
Transkription verwendet. Es wird einsträngige c-DNA L- " . · J
γ ~ι
-ΙΟΙ und aus dieser doppelsträngige c-DNA hergestellt, wie dies von Buell et al., a.a.O., und Wickens et al., a.a.O., beschrieben ist.
Nach Behandlung der doppelsträngigen c-DNA mit Nuclease S1 zur Öffnung der Haarnadelschleife werden mittels terminaler Transferase oligo(dC)-Schwänze angefügt; vgl. R. Roychoudhary et al., Nucleic Acids Research, Bd. 3 (1976), S. 101 bis 116. Sodann wird die c-DNA mit den oligo(dC)-Schwänzen in das mit Pstl linearisierte Plasmid pBR322 inseriert, an das vorher oligo(dG)-Schwänze angefügt worden sind. Mit dem rezirkularisierten Hybrid-Plasmid wird E. coli K12 HB101 transformiert; vgl. Küpper et al., Nature, Bd. 281 (1981), S. 555 bis 559, und Buell et al., J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 9277 bis 9283.
Zur Selektion der Klone mit einem BGH-entsprechenden DNA-Insert wird eine Klonbibliothek, die auf einem 15 μ9/Ίη1 Tetracyclin enthaltenden Nährmedium vermehrt worden ist, mit der Restriktionsendonuclease BstN1 unter Verwendung von Standard-Restriktionsbedingungen und Puffern geschnitten. Da die für BGH kodierende DNA-Sequenz eine einzige BstN1-Schnittstelle aufweist, gestattet diese Screening-Methode die Selektion von zwei Klonen, die lange, für BGH kodierende Sequenzen enthalten, aus den zahlreichen anderen Klonen der Bibliothek, die keine derartigen Sequenzen enthalten. Diese DNA-Rekombinant-Moleküle der beiden ausgewählten Klone werden mit pBGH 108 und pBGH 220 bezeichnet.
pBGH 108 wurde in großer Menge hergestellt und isoliert nach R.D. Klein et al., Plasmid, Bd. 3 (1980), S. 88 bis Seine Nucleotid-Sequenz wurde nach Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 560 bis 564, be- ^ stimmt. Die Sequenz und die entsprechende Aminosäure-Sequenz ist in Fig. 2 und 3 wiedergegeben. Die Amonosäure-Se-
L- ' J
r. ·. π
quenz stimmt mit der von Day hoff, a.a.O.., und Wallis, a.a.O., für BGH angegebenen Sequenz überein mit Ausnahme der Aminosäuren 47 und 66. Die Nucleotid-Sequenz stimmt mit der von Miller, a.a.O., angegebenen Sequenz für die für BGH kodierende DNA über ein mit Ausnahme der Stellungen 177., 240 und 454. Die Unterschiede der Stellung 177 und 240 haben keine Änderung der Aminosäure zur Folge, während der Unterschied in der Stellung 454 eine Änderung einer Aminosäure zur Folge hat. Diese Änderung stimmt überein mit der von Wallis, a.a.O., berichteten Heterogenität in dieser Stellung.
Aus den Fig. 2 und 3 ist ersichtlicht, daß die DNA-Sequenz des Inserts von pBGH 108 für 25 der 26 Aminosäuren der vermuteten Signalsequenz von Rinder-Wachstums-Prehormon und den 1^ 191 Aminosäuren von Rinder-Wachstumshormon kodiert. Die DNA-Sequenz enthält noch 65 Nucleotide des nicht-translatierten 3'-Endes der für 3GH kodierenden DNA; vgl. Fig. 3.
Nachstehend werden Versuche der Expression einer DNA-Sequenz die für Rinder-Wachstumshormon kodiert, beschrieben. , Aus dem Klon pBGH 108 wird die DNA-Sequenz isoliert, die für die 191 Aminosäuren von Rinder-Wachstumshormon kodiert. Es werden verschiedene Expressionsvektoren konstruiert, die diese Sequenz unmittelbar gebunden an ein ATG-
Start-Codon enthalten und die unter·der Kontrolle verschiedener Expressionskontrollsequenzen stehen, um das Ausmaß der Synthese von f-met-BGH (die 191 Aminosäuren von BGH mit einem Methionin-Rest am aminoterminalen Ende) in verschiedenen E. coli-Wirtsstämmen zu untersuchen. Die Ergebnisse die-
ser Konstrukte. und Synthesen sind nachstehend wiedergegeben:
Promotor Ausbeute an BGH BGH-ähnliche Mole-
Aktivität, mg/1 küle pro Zelle
trp 0.001 50
PL 0.01 ~ 1000
-
Aus diesen Ausbeuten ist zu schließen, daß Konstrukte, bei denen lediglich ein ATG-Start-Codon an dem Beginn der DNA-Sequenz für das reife Rinder-Wachstumshormon angeordnet ist, nicht die Synthese von BGH in E. coli in brauchbaren Mengen gestatten.
Ferner wurden verschiedene Expressionsvektoren mit 5 Aminosäuren des Rinder-Wachstums-Prehormons (Aminosäuren -1 bis -5 in Fig. 2)- zwischen dem ATG-Start-Codon und dem Codon GCC für die erste Aminosäure (AIa) des reifen Rinder-Wachstumshormons konstruiert. Diese Konstrukte sollten ein Polypeptid mit den 191 Aminosäuren von BGH und mit 6 Aminosäuren am aminoterminalen Ende (Methionin und die 5 Aminosäuren) liefern. Die Ergebnisse dieser Konstrukte und Synthesen sind nachstehend wiedergegeben:
Promotor Ausbeute an BGH BGH-ähnliche Mole-Aktivität, mg/1 küle pro Zelle
__ p 0.01 500
P L 0.01 1000
Aus. den ersten Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Änderung des Abstandes zwischen der Expressionskontrollsequenz des jeweiligen Konstrukts und dem ATG-Start-Codon die Expression nicht nennenswert verbessert wird. Ferner scheint eine Änderung des Abstandes zwischen dem Startcodon und der ersten Aminosäure des reifen Rinder-Wachstumshormons keine Verbesserung zu ergeben.
Nunmehr wurde eine Anzahl von Modifikationen im P -kontrol-
Xj
lierten Konstrukten der vorstehend beschriebenen Art durchge-
führt, um den Abstand zwischen der BGH-Kodiersequenz (Strukturgen) und der Shine-Dalgarno-Sequenz im Expressionsvektor zu verkürzen, die Promotor-Effizienz durch Deletionen im 99-Nucleotid-Fragment, das die Shine-Dalgarno-Sequenz (vom Phagen mu) des Vektors trägt, zu erhöhen, das nicht-translatierte 3'-(dC)-Ende des BGH-Gens zu entfernen und die Plasmid-Copyzahl der transformierten Wirtszellen zu erhöhen. Keine dieser Änderungen beeinflußte jedoch signifikant das Ausmaß der Expression von BGH in mit diesen Vektoren transformierten Wirtszellen. Es scheint deshalb, daß die BGH-Kodiersequenz einige inhärente Eigenschaften besitzt, die eine hohe Expression dieses Gens in E. coli unterdrückt. Die beobachtete niedrige Expression kann nicht durch enzymatischen Abbau von BGH in E. coli erklärt werden, weil natürliches BGH in E. coli-Zellextrakten anscheinend stabil ist.
Vermutlich ist das geringe Ausmaß der Expression der BGH-kodierenden Sequenzen in diesen Vektoren darauf zurückzuführen, daß die A/G-reichen Sequenzen um und einschließlich der Shine-Dalgarno-Sequenzen (mu oder trp) der Vektoren mit den T/C-reichen Sequenzen an den Anfang der kodierenden Sequenz für reifes BGH hybridisieren
Beispielsweise: mu-Expressionskontroll-Sequenz AACTTAGGAGGGTTTTT trp-Expressionskontroll-Sequenz ACGTAAAAAGGGTATCG BGH-Genanfang ATG GCCTTCCCA GCC ATG TCC TTG TCC 5
Diese Hybridisierung kann das ATG-Start-Codon abschirmen oder abdecken und auch eine gute Bindung der Ribosomen an die entsprechenden Sequenzen verhindern. Diese Annahme wird dadurch weiter gestützt, daß hohe Expression von BGH-ähnlichen Polypeptiden beobachtet wird, wenn die BGH-Kodiersequenz an eine DNA-Sequenz gebunden ist, die für 99 Aminosäuren des Phagen MS2 kodiert, so daß ein Fusionsprotein gebildet wird. Ein derartiges Fusionsprotein ist jedoch für die Behandlung von Rindern nicht bevorzugt, weil diese zusätzlichen Aminosäuren bei den behandelten Tieren Immunreaktionen hervorrufen können.
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Dementsprechend wurde versucht, diejenigen T/C-reichen Bereiche am Anfang der BGH-kodierenden Sequenz zu ändern, um auf diese Weise eine Hybridisierung mit den erforderlichen A/G-reichen Bereichen der Shine-Dalgarno-Sequenz zu unterdrücken.
Eine Methode zur Modifikation der T/C-reichen Bereiche der BGH-kodierenden Sequenz könnte darin bestehen, Punktmutationen in den ersten aminoterminalen Codons der BGH-kodierenden Sequenz durchzuführen, um die T/C-reichen Bereiche zu modifizieren, jedoch die Aminosäuren, die für diese Bereiche kodiert werden, beizubehalten. Eine Durchsicht der ersten aminoterminalen Aminosäuren von BGH und der degenerierten Codons, . die für diese Aminosäuren kodieren, zeigt jedoch, daß der T/C-Gehalt der ersten aminoterminalen Codons durch derartige, die Aminosäuren konservierenden Mutationen, nicht signifikant beeinflußt werden kann. Dies führte erfindungsgemäß dazu, einige der Codons in diesem T/C-reichen Bereich der ersten aminoterminalen Codons der BGH-kondierenden Sequenz zu entfernen.
Äusführüngsbeispiele:
Nachstehend wird die erfindungsgemäJBe Konstruktion von neuen DNA-Sequenzen mit Deletionen am aminoterminalen Ende erläutert, welche die Produktion von BGH-ähnlichen Peptiden in hoher Ausbeute gestatten.
In Fig. 4 ist ein Fließschema einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konstruktion von DNA-Sequenzen erläutert, welche die Produktion von neuen BGH-ähnlichen Polypeptiden in hoher Ausbeute in geeigneten Wirtszellen gestatten.
10 μg pBGH-(Met-Ala) (das Plasmid wurde aus E. coli K 12 (pBGH-(Met-Ala) isoliert) werden 60 Minuten bei 37°C mit Ncol (12 Einheiten) in 10 χ HindIII Puffer und 100 μΜοΙ NaCl verdaut. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 μΐ EDTA
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(O725 M) und 1 μΐ Ribonuclease abgebrochen. Nach 5minütigem Erwärmen des Gemisches auf 37°C wird ein Tropfen Phenol zugegeben und das Gemisch durchgeschüttelt. Sodann wird die linearisierte DNA durch Chromatographie an A5M (Biorad) und Eluieren mit 10 mM Tris-HCl Puffer pH 8, 1 mM EDTA chromatographisch gereinigt. Die DNA-enthaltenden Hauptfraktionen (400 μΐ) werden vereinigt. Sodann werden 100 μΐ BaI 31-Puffer und 1 Einheit BaI 31 zugegeben, und das Gemisch wird bei 300C inkubiert. Es werden Deletionen in der linearisierten DNA erzeugt, wie dies beschrieben worden ist von N. Panayotatos und K.
Truong, Specific Deletion Of DNA Sequences Between Pre-selected Bases, Nucleic Acids Research, Bd. 9 (1981), S. 5679 bis 5688. Es werden 100 μΐ Anteile aus dem Gemisch zu 5 verschiedenen Zeiten (10 Sekunden, 20 Sekunden, 30 Sekunden, 45 Sekunden und 60 Sekunden) entnommen, um verschiedene Klassen von Deletionen aus der linearisierten DNA zu erzeugen.
Die Deletionsreaktioh in jedem entnommenen Anteil wird durch Zugabe von Phenol abgebrochen. Das Gemisch wird einmal mit 250 μΐ Phenol und einmal mit 0,5 μΐ Diäthyläther extrahiert. ,Die DNA wird mit Äthanol ausgefällt und 8 Minuten bei 8000 U/ min zentrifugiert. Es werden in jedem Anteil etwa 10μg erhalten. .
Da die Ncol-Schnittstelle (CCATGG) im pBGH-(Met-Ala) in der Nähe des Beginns der DNA-Sequenz liegt, die für f-met-BGH in diesem Plasmid kodiert (vgl. Fig. 4), werden durch Schneiden mit Ncol und Rückschneiden der linearisierten DNA mit BaI 31 verschiedene Deletionen in der DNA-Sequenz erzeugt, die für BGH kodiert. Deshalb werden DNA-Sequenzen gebildet, die für BGH-ähnliche Polypeptide kodieren, denen eine oder, mehrere Aminosäuren am aminoterminalen Ende feh- len im Vergleich zum authentischen BGH (vgl. Fig. 4).
Zur Selektion derjenigen Deletionen, die mit..,einem T enden (ausgewählt aufgrund der zweckmäßigen Lage einer Hindlll-Schnittstelle außerhalb der BGH-kodierenden Sequenz, wie
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nachstehend beschrieben), wird die von N. Panayotatos und K. Truong, a.a.O., beschriebene Methode verwendet. Die DNA wird in 34 μ.1 Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 4 μΐ 10 χ HindIII Puffer und 20 Einheiten HindIII versetzt,und das Gemisch wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Durch diese Reaktion wird das nicht-BGH-Ende der linearisierten DNA an der Hindlll-Schnittstelle geschnitten (vgl. Fig. 4). Sodann wird die Hindlll-Schnittstelle durch Vermischen der DNA mit 5 μΐ 1mM dNTP's, 1 μΐ Klenow-Fragment (1 Einheit) und 15ia-inütiges Inkubieren des Gemisches bei 37°C aufgefüllt. Nach dem Größenfraktionieren der aufgefüllten DNA an Agarosegel werden 2 Banden beobachtet, nämlich eine kleine 100 Basenpaar-Bande entsprechend dem kleineren Hindlll-Fragment der DNA und eine große Bande entsprechend den DNA-Hauptfragmenten (in Fig. 4) gezeigt).
Die DNA-Hauptfragmente werden aus dem Gel eluiert, mit Äthanol gefällt und durch 8minütiges Zentrifugieren bei 8000 U/min isoliert. In Fig. 4 ist wiedergegeben, daß diese DNA-Fragmente am einen Ende eine aufgefüllte Hindlll-Schnittstelle (AAGCT) und am anderen Ende eine der verschiedenen Deletionen in der BGH-kodierenden Sequenz tragen, die durch die vorstehend beschriebene Resektion mit BaI 31 erzeugt worden sind. Die Rezirkularisierung der DNA wird eine Hindlll-Schnittstelle (AAGCTT) an der Verknüpfungsstelleinur in denjenigen Fällen wiederbilden, wenn die BaI 31 Deletion in der BGH-kodierenden Sequenz mit einem T endet. Deshalb wird die DNA selbstligiert und sodann erneut mit HindIII geschnitten, um die gewünschten, mit T endenden Deletionen, zu isolieren; vgl. Fig. 4
Zur Rezirkularisierung der DNA wird also die vorstehend erhaltene Äthanol-Fällung der DNA-Hauptfragmente in 33 μΐ Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 4 μΐ 10 χ Ligierungspuffer und 2 ul T4 DNA-Ligase versetzt, und das Gemisch wird 16 Stunden bei 140C inkubiert, wie dies im wesentlichen-von N. Panayotatos und K. Truong, a.a.O., beschrieben worden ist. Sodann
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wird die Reaktion durch 15minütiges Erhitzen auf 700C abgebrochen und die rezirkularisierte DNA auf die vorstehend beschriebene Weise isoliert.
Zur Isolierung der DNA-Fragmente mit den gewünschten DeIetionen, d.h. derjenigen Fragmente, die mit einem T enden, wird nun die erhaltene rezirkularisierte DNA mit HindiII und BamHI geschnitten. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, gestattet dieses Schneiden die Selektion eines DNA-Fragments, das die deletierte BGH-kddierende Sequenz enthält. Die rezirkularisierte DNA wird in 5 μΐ 10 χ HindIII Puffer gelöst, sodann werden 20 Einheiten HindIII und 20 Einheiten BamHI zugegeben, und das Gemisch wird 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Verdauung wird das Gemisch auf einem Acrylamidgel fraktioniert.
1^ Das etwa 665 Basenpaare enthaltende Fragment der gewünschten DNA wird aus dem Gel eluiert, mit Äthanol gefällt und auf die vorstehend beschriebene Weise durch Zentrifugieren isoliert. Dieses Fragment (in einem Strang) trägt an einem Ende den Hindlll-Spaltrest mit dem Nucleotid T7 welches das Ende der speziellen Deletion anzeigt, das in der BGH-kodierenden Sequenz durch Resektion mit BaI 31 bewirkt wurde, und am anderen Ende den Bam HI-Spaltrest, der jenseits des COOH-terminalen Endes der BGH-kodierenden Sequenz angeordnet ist. Zur Be-
Stimmung der Nucleotid-Sequenz der verschiedenen Deletionen,
d.h. zur Feststellung, bei welchem Nucleotid T die Deletion abgebrochen ist, wurde das Barn HI-Hindlll-Fragment in das mit Hindlll-Bam HI linearisierte Plasmid pBR322 folgendermaßen inseriert: Die DNA wird in 10 μΐ Wasser gelöst und die Lösung mit 0,1 μg Hindlll-Bam HI verdautem pBR322 (1 μΐ),
_
1,2 μΐ 10 χ L.igationspuffer und 0,5 μΐ T4 DNA-Ligase versetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 140C inkubiert.
Nach dem Abbrechen der Ligierungsreaktion werden 200 μΐ kompetente E. coli Κ12Λ· in Gegenwart von 10 μΐ 0,1 M MgCl2 transformiert. Die Zellen werden zunächst 15 Minuten im Eisbad abgekühlt, sodann 2 Minuten auf 420C erhitzt und an-
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schließend TO Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zusatz von 2 ml L-Nährlösung werden die Zellen 1 Stunde bei 370C gezüchtet und danach wird ein 200 μΐ Anteil auf Petriplatten überimpft, die L-Nährlösung, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, enthalten. Die Kolonien werden 16 Stunden bei 37°C gezüchtet. Aus den gegen Ampicillin resistenten Kolonien werden 24 Klone statistisch ausgewählt. .
Jeder dieser Klone wird in 5ml L-Nährlösungr ergänzt mit 50μg/ ml Ampicillin}12 Stunden bei 37°C gezüchtet. Aus 1 ml der Zellen jeder Kultur wird nach der von Klein et al./ a.a.O., beschriebenen Miniprep-Methode gereinigte Plasmid-DNA hergestellt. Sodann werden die Hindlll-Bam HI-Inserts in den 24 Plasmid DNA's durch Hindlll-Bam HI-Schneiden und Polyacrylamidgel-Fraktionierung größenfraktioniert. Es werden 9 Plasmid-DNA-Fragmente ausgewählt, die lange Inserte aufwiesen. Einige . der Inserte wurden, durch Isolieren des Hindlll-Pstl-Fragments nach der Methode von Maxam und Gilbert, a.a.O., sequenziert.· Die Sequenz-Analyse ergab, daß einer der Inserts beim Nucleotid 104 (T) in Fig. 2 begann, d.h. die Kodierregion für die Aminosäuren 1 bis 9 von BGH war verlorengegangen. Das andere der Inserts begann beim Nucleotid 89 (T) in Fig. 2, d.h. die Kodierregion für die Aminosäuren 1 bis
4 von BGH war verlorengegangen
25
Nachstehend wird unter Bezugnahme auf Fig. 5 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konstruktion eines Expressionsvektors wiedergegeben, der eine DNA-Sequenz enthält, welche die Produktion neuer BGH-ähnlicher Polypeptide in hoher Ausbeute gestattet.
Bei dem Versuch zur Expression von DNA-Sequenzen aus den beiden Klassen der vorstehend beschriebenen Deletionen (A4 undA9) wurden die DNA-Inserts aus der Plasmid-DNA durch Spaltung des Plasmids mit Hindlll, Auffüllen des Hindlll-
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Fragments mittels des Klenow-Fragments und dNTP's und anschließende Spaltung der DNA mit 10 Einheiten Bam HI unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen isoliert. Sodann wird das gewünschte DNA-Fragment, das für BGH kodiert, an einem 5gewichtsprozentigen . Polyacrylamidgel gereinigt. Dieses Fragment trägt in einem "Strang an seinem BGH-kodierenden Ende die Sequenz AGCTT, wobei AGCT vom Auffüllen der Hindlll-Schnittstelle kommt und das letzte T entweder das Nucleotid 104 von Fig. 2 (Δθ) oder das Nucleotid'89 von Fig. 2 (A4) ist.
Zur Herstellung des Expressionsvektors zum Inserieren dieser DNA-Sequenz wird der identische Vektor der vorher zur Expression von BGH-Sequenzen unter der Kontrolle des P-
1S Promotors verwendet wurde,(z.B. pBGH-(Met-Ala)) mit Ncol geschnitten, das Fragment mittels des Klenow-Fragments und dNTP's aufgefüllt und die linearisierte DNA mit Bam HI unter, üblichen Bedingungen und mit den üblichen Puffern geschnitten. Dieses Fragment trägt in einem Strang an einem Ende die Sequenz CCATG vom Auffüllen der Ncol-Schnittstelle und am anderen Ende den Rest von der Barn HI-Spaltung (Fig. 5) . Sodann werden 0,2 μg des hergestellten Vektors (2 μΐ) und 0,5 ng der hergestellten DNA in 1 μΐ Ligierungspuffer und 0,5 μΐ Τ4 DNA-
Ligase vermischt und 16 Stunden bei 140C inkubiert. 25
Diese Rezirkularisierung erzeugte zwei Vektoren. Bei einem Vektor ist die Nucleotid-Sequenz, die mit dem ATG-Codon beginnt, ATGAGCTTG, gefolgt vom Codon der Aminosäure 6 der BGH-ko-
direnden Sequenz von Fig. 2 (pBGH-A 4 (Ser) ; Fig. 5). Bei 30
dem anderen Vektor ist die Nucleotid-Sequenz, die mit dem ATG-Codon beginnt, ATGAGCTTG/gefolgt vom Codon der Aminosäure . der BGH-kodierenden Sequenz von Fig. 2 (ρΒΟΗ-.Δ.9 (Ser) ; Fig. 5). Deshalb wurde im ersten Konstrukt die kodierende Region für.die ersten vier Aminosäuren des reifen BGH entfernt, das Codon AGC (Serin) eingesetzt und die kodierende Region für die fünfte Aminosäure des reifen BGH von ATG in
Γ . -20-
TTG abgeändert. Die Aminosäure Methionin wird dadurch in Leucin geändert. Bei dem anderen Konstrukt, einem bevorzuge ten Konstrukt der Erfindung, wurde die kodierende Region für die ersten 9 Aminosäuren des reifen BGH entfernt, das Codon AGC .(Serin) eingesetzt und die kodierende Region für die zehnte Aminosäure des reifen BGH von CTG in TTG abgeändert. Diese Änderung bewirkt keine Änderung der Aminosäure (Leucin) . Deshalb sollte das erste Konstrukt ein Protein der folgenden Sequenz Met-Ser-Leu-Aminosäuren β bis 191 des reifen BGH und das andere Konstrukt ein Protein der Sequenz Met-Ser-Aminosäuren 9 bis 191 des reifen BGH exprimieren. Es ist natürlich klar, daß das f-Met aus diesen Polypeptiden entweder während der Expression oder danach zur Herstellung von Polypeptiden der Formel Ser-Leu-AAg bis AA, g.. von BGH und Ser-AAg bis A gg von BGH abgespalten werden kann. Tatsächlich zeigt die anschließende ,Sequenzierung der Aminosäuren von BGH-A9(Ser), daß das f-Met entweder während der Expression oder bei der Reinigung abgespalten worden ist.
Dementsprechend wurden die beiden Vektoren mit pBGH-A.4-(Ser) und pBGHA9 (Ser) bezeichnet; vgl. Fig. 5.
Die rezirkularisierten Plasmide werden auf die, vorstehend beschriebene Weise zur Transformation von E. coli K1 2 /v. verwendet. Es werden wieder diejenigen Kolonien ausgewählt, die Ampicillinresistenz zeigen. Sodann werden Kulturen von 12 der ampicillinresistenten Klone gezüchtet und ihre Plasmid-DNA nach der Miniprep-Methode auf die vorstehend beschriebene Weise isoliert. Sodann werden die Inserts durch Schneiden mit Pst I/Eco RI unter den üblichen Bedingungen größenselektioniert. Aufgrund der Ergebnisse der Größenselektion wird diejenige Plasmid-DNA mit der geeigneten Größe des Inserts isoliert. Sodann wird diese DNA zur Transformation von E. coli MC 1061 verwendet, wie dies im wesentlichen von G.N. Buell et al., J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 9279 bis 9283, beschrieben ist. Die Zellen werden auch mit pcI857
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transformiert. pcl357 ist ein kleines Plasmid, das eint temperaturempfindliches PT-Repressor-Gen und das Gen für Kanamycinresistenz trägt. Es werden die mit der BGH-kodierenden Plasmid-DNA sowie pcl85 7 transformierten Zellen durch Kultivieren der Kolonien f ür 1 6 Stunden bei 300C in Ampicillin sowie 40 nm/ml Kanamycin enthaltender L-Nährlösung selektioniert..
Es werden statistisch ampicillin- und kanamycinresistente Kolonien ausgewählt und über Macht bei 300C in 5 ml L-Nährlösung gezüchtet, die Ampicillin und Kanamycin enthält. Die Kulturen werden bei 42°C mit 25 ml L-Nährlösung verdünnt und sodann 2 Stunden bei 42°C bis zu einer optischen Dichte von 1 gezüchtet. Die Wachstumsbedingungen sind identisch·mit den Wachstumsbedingungen für die P -kontrollierte Expression von
^5 BGH unter Verwendung der DNA-Sequenz, die für reifes BGH kodiert.
Zur Isolierung der von den transformierten Zellen gebildeten BGH-ähnlichen Polypeptide werden 1 ml der Zellen 4 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Sodann werden 50 μΐ Laemmli-Puffer (1 % SDS) zugegeben; vgl. Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 681. Das Gemisch wird 15 Minuten gekocht. Danach werden die Zellen 4 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer abzutrennen. Der überstand' wird mittels des Radioimmuntests für BGH mit Kaninchen-Antiseren gegen authentisches BGH untersucht. Diese Isolierungsmethode und der RIA sind für die PT-kontrollierte Expression von BGH
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mit der für reifes BGH kodierenden DNA-Sequenz und den Nachweis von BGH verwendet worden.
Es werden folgende Expressionswerte für BGH-ähnliche Polypeptide erhalten:
Ausbeute an BGH BGH-ähnliche Moleküle Deletion Aktivität, mg/1 pro Zelle
A4(Ser) 30.0 j 1.5 x 106
A9(Ser) 100 j 5.0 x 106
L .
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Es werden auch die A4 (Ser) und A9(Ser) DNA-Sequenzen in dem trp-enthaltenden Vektor verwendet/ der früher zur Expres sion von BGH mit der für reifes BGH kodierenden DNA-Sequenz verwendet worden ist. Bei diesen Konstrukten wurden folgende Expressionswerte erhalten:
Ausbeute an BGH BGH-ähnliche Moleküle Deletion Aktivität,, mg/1 pro Zelle
A4(Ser) 0.15 8000.
A9(Ser) 0.50 50000
Beispiel 3
Schließlich werden gemäß Fig. 6 aus den Konstrukten das AGC-Codon (Serin) deletiert, das durch die Auffüllung der Hindlll-Schnittstelle hinzugefügt worden war. Die AGC-deletierten Konstrukte pBGH-Δ4 und pBGH-JÜS sind die bevorzugten Konstrukte der Erfindung, wobei pBGH-Ä9 besonders bevorzugt ist. Das bei der Expression dieser Konstrukte erzeugte aminoterminale f-Met kann aus diesen BGH-ähnlichen Polypeptiden entweder während der Expression oder danach abgespalten werden. Aufgrund der Erfahrung mit der tatsächlichen Aminosäure-Sequenz von BGH-A9(Ser) ist zu erwarten, daß das f-Met entweder während der Expression oder bei der Reinigung abgespalten wird.
Zur Herstellung dieser Konstrukte wird die Auffüllung in der Hindlll-Schnittstelle der vorstehend beschriebenen,für BGH kodierenden Sequenz so modifiziert, daß nur dATP im Gemisch vorliegt. Durch diese Modifikation wird nur ein einzelnes A während der Auffüllung angefügt; vgl. Fig. 6. .Dann wird das Reaktionsgemisch 10fach mit S1-Puffer (30 mM Natriumacetat, pH 4,5, 300 mM NaCl, 3 mM ZnCl3) verdünnt. Hierauf werden zwei Einheiten pro^g-DNA von S1-Nuclease zugegeben, und das Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert, um den nicht-aufgefüllten DNA-Einzelstrang.abzuknabbern; vgl. Fig.6.
Sodann wird die Reaktion mit Phenol abgebrochen und auf die vorstehend beschriebene Weise das DNA-Fragment mit Bam HI geschnitten und in den gewünschten Expressionsvektor einge-
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setzt. Unter Verwendung dieser Vektoren werden folgende Expressionswerte erhalten:
Deletion
Δ9
Promotor
Ausbeute an BGH Aktivität, mg/1
100
BGH-ähnliche Moleküle pro Zelle
5 x 106
Die A 4-und Δ9-DNA-Sequenzen sowie, ein BGH-^i-Kon-'strukt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, wurden unter Pr-Kontrolle (mit einer, vom Phagen mu abcreleiteten Ribosomen-Sindungsstelle) zur Transformation verschiedener E. coli Stämme verwendet, um die Expressionswerte zu vergleichen.Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen-
gefaßt. .
12 3
Deletion Wirtszelle ' Ausbeute
| Δ1 | MC HB PR | 1061 101 7 | 2 χ 104 10 χ 104 30 χ 104 |
| 0 Δ4 | MC HB PR | 1061 101 7 | 3.6 χ 105 6.0 χ 106 13 χ 105 |
| Δ9 | MC HB PR | 1061 101 7 | 1.4 χ 106 1.1 x 10ö 1.5 χ 106 |
| Met-AIa-BGH (Kontrolle) | MC PR | 1061 7 | 7.5 χ 102 20 χ 10* |
Anm.: 1) Sämtliche Wirtszellen enthielten das pcl857 Repressor-Plasmid
2) Genotypen der Wirtszellen sind wie folgt:
PR 7 : thr leu pnp thi ms mal xal mti Sm R HB 101 : leu Iac pro thi hsr hsm supE recA Sm MC 1061: ara leu Iac gal hsr hsm StrA
3) RIA-Ausbeuten in Molekülen pro Zelle nach Induktion während 2 Stunden bei 420C in Schüttelkolben.
r - - -- ·- J24.
Aus der Tabelle ist ersichtlich/ daß DNA-Sequenzen und DNA-Rekombinant-Moleküle mit diesen ...Sequenzen, und bei. denen Teile der BGH-kodierenden Sequenz deletiert sind, die Produktion von Rinder--Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden in hoher Ausbeute gestatten. Die Ausbeute ist mindestens 100 mal höher als bei DNA-Sequenzen, die für reife Rinder-Wachstumshormone in den gleichen Expressionsvektoren und -Wirten kodieren. Vorzugsweise ist die Expression 1000 mal höher. Derartige Deletionen gestatten die Expression neuer Rinder-Wachs tumshormon-ähnlicher Polypeptide, die in üblicher Weise gereinigt und als Proteohormone mit anaboler Wirkung für Rinder verwendet werden können, insbesondere zur Beschleunigung des Wachstums und der Gewichtszunahme sowie der Erhöhung der Fleischproduktion. Beispielsweise zeigt nach Reinigung auf etwa 90 % Homogenität das jd 9-BGH, das von dem besonders be- . vorzugten Stamm E. coli MC 1061 (PT-mu-A9-BGH) erzeugt worden ist, etwa 80 % der Wachstumsförderung von nativem BGH im Standard-Rattentibia-Test.
Das tatsächliche Ausmaß der Deletion der DNA-Sequenzen am aminoterminalen Ende ist nicht kritisch für die Erfindung und für die hohe Ausbeute an neuen BGH-ähnlichen Polypeptiden, die erfindungsgemäß hergestellt werden können, weil das Ausmaß der Deletion von der Expressionskontroll· ~Sequenz oder
2^ vom Wirtssystem abhängt. Die aminoterminale Deletion soll ausreichen, daß die DNA-Sequenz mindestens etwa 100 mal mehr Moleküle pro Zelle eines BGH-ähnlichen Polypeptids und vorzugsweise mindestens etwa 1000 mal mehr erzeugt als sie von der für reifes BGH kodierenden DNA-Sequenz in einem bestimmten Wirts- und Expressionsvektor erzeugt wird. Derartige DNA-Sequenzen und Tests können vom Fachmann aufgrund * der hier gegebenen Beispiele konstruiert werden. Deshalb sind diese 'DNA-Sequenzen, die diese DNA-Sequenzen enthaltenden DNA-Rekornbinant-Moleküle und die von diesen hergestell-
ten Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptide Teil der Erfindung.
Γ . ~1
Die spezielle Methode zur Bewirkung der Deletionen ist ebenfalls nicht kritisch. Es wurde eine Ausführungsform beschrieben / bei der die Deletion durch Resektion mit BaI 31 durchgeführt und nach Deletionen gesucht wurde, die mit einem T enden. Es können jedoch auch andere Deletionsmethoden angewendet werden. Beispiele für diese Methoden sind die Spaltung der BGH-kodierenden Sequenz und der Ersatz eines Teils der gespaltenen Sequenz durch ein synthetisches Fragment, BaI 31-Resektion und Selektion für andere Deletionen als die, die mit T enden, Kombinationen der beiden Methoden oder andere bekannte Deletionsmethoden.
Selbstverständlich können auch andere Wirtszellen und Expressionsvektoren zur Expression der neuen DNA-Sequenzen und zur Herstellung der neuen Polypeptide der Erfindung verwendet werden.. Beispiele für derartige Wirtszellen sind andere Stämme von E. coli sowie Stämme von Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Hefen und anderen Pilzen sowie Pflanzen- und Tierzellen in Kultur'. Streptomyces ist ein besonders bevorzugter Wirt. Zur Expression der DNA-Sequenzen der Erfindung in diesen Wirtssystemen werden die DNA-Sequenzen in Expressionsvektoren inseriert, die mit dem jeweils verwendeten Wirtssystem und den vorstehend beschriebenen Vektoren verträglich sind.
Folgende Mikroorganismen und DNA-Rekombinant-Moleküle, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, wurden am 16. August 1982 bei der American Type Culture Collection hinterlegt:
A. E. coli K12 λ (pBGH-(Met-Ala)) ; ATCC Nr. 39 173 Β.· Ξ. coli K12 λ (pBGH-A4(Ser)) ; ATCC Nr. 39 174
C. E. coli K12 λ (pBGH-A9(Ser)) ; ATCCMr. 39 175
Claims (5)
- Erfindungsanspruch·: ..1. Verfahren zur Herstellung von Rinder-Wachstumshormonähnlichen Polypeptiden, gekennzeichnet dadurch, daß man einen -mit einem DNA-Rekombinant-Molekül transformierten Wirt züchtet/ das eine für das PoIypeptid kodierende DNA-Sequenz enthält, die funktionsfähig an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist und die DNA-Sequenz eine Deletion am aminoterminalen Ende der DNA-Se-1^ quenz aufweist, die für das reife Rinder-Wachstumshormon kodiert, und wobei diese·DNA-Sequenz die Herstellung der Polypeptide in mindestens 100 mal höherer Ausbeute gestattet als die für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierende DNA-Sequenz,und da-ß man das Polypeptid isoliert.
15 - 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als DNA-Sequenz Inserts von pBGH- A 1, pBGH-^4 (Ser) , pBGH-A4, pBGH-49(Ser), pBGH-Δ 9 oder andere DMA-Inserts verwendet, die sich auf Rinder-Wachstumshormon beziehen und die durch eine aminoterminale Deletion der für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierenden DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, und welche die Produktion eines Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptids in mindestens 100 mal höherer Ausbeute gestatten als die für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierende DNA-Sequenz.
- 3. Verfahren nach Punkt 1· oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man eine DNA-Sequenz verwendet, welche die Produktion eines Rinder-Wachstumshormon-ähnlichen Polypeptids in mindestens 1000 mal höherer Ausbeute gestattet als die für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierende DNA-Sequenz.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch,daß man Rinder-Wachstumshormon-ähnliche Polypeptide der Formel metPhe-AA, bis AA von BGH, Phe-ΑΛ-, bis AA. Q1 von BGH,MetSerLeu-AA, bis AA. n. von BGH, SerLeu-AA,. bis AA. n. von BGH, ο i y ι b ι y πL Jr .- '. ηMetLeu-AA, bis AA1n. von BGH, Leu-AA,- bis AA1n. von BGH, ο ι y ι ο ι y ιMetSer-AAg bis AA ' von BGH, Ser-AAg bis AA191 von BGH, Met-AAg bis AA qi von BGH, AAg bis AA Q.. von BGH und Polypeptide herstellt, die von DNA-Sequenzen kodiert werden, die durch eine aminoterminale Deletion der für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierenden DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, und welche die Produktion des Polypeptids in mindestens 100 mal höherer Ausbeute gestatten als die für reifes Rinder-Wachstumshormon kodierende DNA-Sequenz.
- 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als Expressions-Kontrollsequenz das lac-System, das trp-System, die Hauptoperator- und Promotor-Reg.ionen des Phagen A , die Kontrollregion des fd-Hüllproteins oder andere bekannte Sequenzen zur Kontrolle der Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren und Kombinationen verwendet.Hierzuj£jSeiten Zeichnungen
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