DD209476A5 - Verfahren zur stabilisierung und selektierung von wirtszellen, die rekombinierende dna enthalten - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Stabilisierung und Selektierung von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche einfunktionelles Polypeptid ausdrueckt, das darin besteht, dass man a) die Wirtazellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsfaktor transformiert, der sowohl ein Repressorgen als auch ein Gen enthaelt, welches ein funktionelles Polypeptid ausdrueckt, und b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Praeger enthaelt, welcher in den Wirtszellen letal oder konditionell letal ist, der aber in den transformierten Wirtszellen durch das in dem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthaltene Repressorgen repressiert wird, mit der Massgabe, dass der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikon und einen Promotor enthaelt, welche fuer den Repressor nicht sensitiv sind, und mit der weiteren Massgabe, dass bei Lysogenisierung der transformierten Wirtszellen mit dem lysogenen Organismus, der ein Gen enthaelt, welches konditionell letal ist, die erhaltenen Wirtszellen unter restrektiven Bedingungen kultiviert werden.

Description

Titel der Erfindung; Verfahren zur Stabilisierung und

Selektierung von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung und Selektierurig von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid ausdrückt. Ferner ist die Erfindung auch auf neue Organismen und klonbildende Vektoren gerichtet, die bei diesem Verfahren verwendet werden. Die Erfindung läßt sich so anpassen, daß sie eine einfache, bequeme und wohlfeile Methode zur Lyse von Wirtszellen schafft, um hierdurch intrazellulare Produkte zu reinigen.

Im einzelnen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung und Selektierung von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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a) die Wirtszellen mit einem rekpmbinierenden DNA-Klonierungsvektor transformiert _e der sowohl ein Repressorgen als auch ein Gen enthält, welches ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, pnd

b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogeiiisiert, der einen Präger enthält, welcher in den Wirtszellen letal oder konditionell letal ist, der aber in den transformierten Wirtszellen durch das in dem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthal tene Repressorgen repressiert wird,

mit derMaßgabe, daß ι der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikpn und elften Promotor enthält, welche für den Represser nicht sensitiv sind, und mit der weiteren Maßgabe, daß bei Lysogenisierung der. transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der ein Gen enthält,| welches konditionell.letal ist, die erhaltenen Wirtszellen unter restriktiven Bedingungen kultiviert werden.'

Weiter ist die Erfindung auch auf eine transformierte Wirtszelle gerichtet, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie besteht aus

a) einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor, der sowohl ein Repressorgen als auch ein Gen enthält, welches ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, und

b) einem chromösomalen Präger, der letal oder konditionell letal ist, jedoch durch das Repressorgen, das im rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten ist, repressiert wird, .....-!

mit der Mäßgabe, daß;der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikon und einen Promotor enthält, die für den Repressor nicht sensitiv sind.

Schließlich betrifft die Erfindung auch noch ein Verfahren zur Lyse von Wirts ze 11 en ,.das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen letalen oder konditionell letalen Präger, der

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zu einer Wirtszellenlyse führt, entweder einführt in

a) Wirtszellen, die mit einem r^kombinierenden DNA^Klonierungsvektor transformiert sind, der ein Repressorgen enthält, welches einen Präger repressiert, der eine Wirtszellenlyse hervorruft und der bei oder oberhalb einer Temperatur innerhalb eijies bestimmten Temperaturbereiches inaktiviert ist, und die transformierten

Wirtszellen mit einem:lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Präger enthält, welcher in den Wirtszellen letal oder köhditiönell letal ist, der jedoch in den transformierten Wirtezellen durch das Repressorgen, .V¹. · ·. : welches in dem rekombinierenden DNA-K lonierungs vektor enthalten ist, repressiert wird, oder einführt in

b) Wirtszellen, indem man die Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der einen konditionell letalen Präger enthält, lysogenisiert oder indem man die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor, der einen koiiditioneM 'letalen Präger enthält^ trans-

' formiert- · , ' . ' ' ..· λ, ' ' " '

' . und die hierdurch jeweils-erhaltenen Wirtszeilen bei einer Temperatur, die den Repressor inaktiviert, oder, im Fall eines konditionell .leta&en Prägers, bei einer Temperatur, W die nicht innerhalb des. Temperaturbereichs liegt, der eine _w Züchtung der Wirtszellen erlaubt, züchtet.

Durch die Erfindung wird ein selektives System zur Verfügung gestellt, durch welches sich rekombinierende DNA-Wirtszellen stabilisieren oder selektieren lassen, indem man hierzu einen letalen chromosomalen Präger verwendet, der durch ein Gen repressiert wird, das an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor getragen wird. Dies ist besonders wichtig, weil rekombinierende DNA-K lonierungs vektoren, wie Plasmide,· häufig rasch aus Bakterienpopulationen verloren gehen und bei großtechnischen Fermentationen mehr als 10 Zellgenerationen erforderlich sein können. Sobald daher die rekom-

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a) die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor trans fo™^ Repressorgen als auch ein Gen enthält, welches ein fünktionelles Polypeptid ausdrückt, und

b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert» der einen Präger enthält, welcher in den Wirtszellen letal oder konditioneil letal ist, der aber in den transformierten Wirtszellen durch das in dem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthaltene Repressorgen repressiert wird,

mit der Maßgabe, daßι der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikpn und einen Promoter enthält, welche für den Represser nicht sensitiv sind, und mit der weiteren Maßgabe, daß bei Lysogenisierung der transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der ein Gen enthält, >, welches konditioneil letal ist, die erhaltenen Wirtszellen unter restriktiven Bedingungen kultiviert werden.⁷

Weiter ist die Erfindung auch auf eine transformierte Wirtszelle gerichtet, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie besteht aus

a) einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor, der sowohl ein Repressorgen als auch ein Gen enthält, welches ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, und

b) einem chromosomalen Präger, der letal oder konditionell letal ist, jedoch durch das Repressorgen, das im rekombinierenden DNA-K lonierjungs vektor enthalten ist, repressiert wird, !

mit der Maßgabe, daß;derrekombinierende DNA-Klohierungsvektor ein Repliken und einten Promotor enthält, die für den Repressor nicht sensitiv sind.

Schließlich betrifft die Erfindung auch noch ein Verfahren zur Lyse von Wirtszellen,; das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen letalen oder konditionell letalen Präger, der

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zu einer Wirtszellenlyse führt, entweder einführt in

a) Wirtszellen, die mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor transformiert sind, d&r ein Repressorgen enthält, welches einen Präger repressiert, dereine Wirtszellenlyse hervorruft und der bei oder oberhalb einer Temperatur innerhalb eines bestimmten Temperatur"

bereiches inaktiviert ist, und die transformierten Wirtszellen mit einem:lysogenen Organismus lysogenisiert, der eihen Präger enthält, welciher in den Wertstellen letal oder fco^^ der jedoch in den transformierten Wirtszellen durch das Repressorgen, welches in dem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten ist, repressiert wird, oder einführt in

b) Wirtszellen, indem man die Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der einen konditioneil letalen Präger enthält, lysogenisiert oder indem man die Wirtszellen mit einem rekömbinierenden DNA-Klonierungsvektor, der einen kortditipneM Ietäl/fen Präger enthält> trans-

' formiert · ' .' ' '. ^: .. · ^;.ί: " .· " '' · " ' und die hierdurch jeweils; erhaltenen Wirtszellen bei einer Temperatur, die den Repr.essor inaktiviert, oder, im Fall eines konditionell letal«n Prägers, bei einer Temperatur, die nicht innerhalb des. Temperaturbereichs liegt, der eine Züchtung der Wirtszellen erlaubt, züchtet.

Durch die Erfindung wird ein selektives System zur Verfugung gestellt, durch welches sich rekombinierende DNA-Wirtszellen stabilisieren oder selektieren lassen, indem tcian hierzu einen letalen chromosomalen Präger verwendet, der durch ein Gen repressiert wird, das an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor getragen wird. Dies ist besonders wichtig, weil rekombinierende DNA-Klonierungsvektoren, wie plasmide,· häufig rasch aus Bakterienpopulationen verloren gehen und bei großtechnischen Fermentationen mehr als 10 Zellgenerationen erforderlich sein können. Sobald daher die rekom-

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binierende DNA-Codierung für das gewünschte Produkt einmal in ein Plasmid eingesetzt ist, dann ist es wünschenswert oder sogar essentiell, daß die das Plasraid enthaltende Mikroorganismenkultur so stabilisiert ist, daß alle Zellen der Kultur, das gewünschte Plasmid enthalten. Dies ist schwierig und kritisch, weil rekombinierende Plasmide mit fremder DNA notorisch instabil sind und oft mehr als 90 % der Zellen in einer Population das rekombinierende Plasmid nicht enthalten können, nachdem eine Kultur über Nacht gewachsen ist. Es kommt datier iu einer ganz dramatischen Verringerung der Produktionskapazität, weil eine Expression der gewünschten Gene nur in denjenigen Zellen möglich ist, die das Plasmid beibehalten.

Charakteristik ,der· bekannten technischen Lösungen;

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· Es gibt bisher nur sehr Wenige wirksame Methoden zur Stabilisierung r^kömbinierender Plasmide, und diese haben alle ernsthafte Nachteile.

Eine dieser Methoden besteht- in einer Einführung antibiotisch resistenter Gene in refcombinierende Plasmide und einem anschließenden Zusatz des jeweiligen Antibiotikums zum Kulturmedium. Zellen, die das Plasmid mit dem antibiotisch resistenten Gen enthalten, werden dabei als geeignet selektiert, während Zellen, die das Plasmid verlieren, als ungeeignet selektiert und daher eliminiert werden. Der wesentliche Nachteil dieser Methode besteht darin, daß man hierbei ein großtechnisches Wachstum an antibiotisch resistenten Bakterien benötigt, im Permehtationsmedium ein teures Antibiotikum braucht und schließlich das Antibiotikum vom gewünschten Produkt durch eine nachfolgende Reinigung entfernen muß.

Die andere bekannte Methode zur Stabilisierung rekombinie-

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render Plasmide besteht in einer Komplementierung einer auxotropen Mutation auf dem Chromosom. Bei dieser Methode sind der Zusammensetzung des Fermentationsmediums starke Grenzen gesetzt, wobei die Fermentation zudem in einem Medium durchgeführt werden muß, das den von den Wirtsbakterien benötigten Nährstoff ^icbt erit:hä"lt. Durch Syn1;rophie kann es ferner dazu koiraien, daß die Zellen nach Verlust des Plasmids noch weiter wachsen können. Beide Arten an Selektion sind daher abhängig von einer speziellen Manipulation der Medien. Solche Beschränkungen führen zu einer Erhöhung der Kosten der Fermentation und begrenzen die für •eine Verbesserung der Produktivität; verfügbaren Möglichkeiten. ·, ;, ... :' ' ·. /.-. .^{Λ ;} \>vi— -:: '·-.. :.v, · ^r._;V;^:· ;'. . . -^] :,,''

Aufgabe der Erfindung

Die bekannten Methoden ziip Stabilisierung rekombinieren-der_; Plasmide haben .soM4^i:i^e/_:^ve.ifes.ipM^*^ili^ls:*?^!#^ri Nachteile, und Aufgabe der Erfindung ist xlaher diei Bereitstellung anderer Selektlonsmethoden, <die von der Zusammensetzung der Medien unabhängig sind und bei denen der rekombinierende IMJA^Kloiliergn^yek^pr unter allen Fermentationsbedingungen aufrechterhalten '^ '

Darlegung des Wesens der Erfindung

Diese Aufgabe läßt sich nun durch einen Zellsuicid lösen, da sich suicide Zellen konstruieren lassen, die einen letalen Präger auf einem Chromosom und einen Repressor oder ein komplementierendes Gen auf einem rekombinierenden DNA-Klönierungsvektor enthalten. Diesen Merkmalen ent sprechend aufgebaute Zellen sterben ab, wenn sie den Vektor verlieren. Die Erfindung baut auf diesem Prinzip auf und sorgt hierdurch dafür, daß alle lebenden Zellen in ei ner Kultur den gewünschten rekombinierenden DN₁A-Klonie-

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rungsvektor enthalten. Dies ist besonders wichtig* weil hierdurch das Produktionsvermögen solcher Kulturen verbessert wird, ohne daß dies mit den bereits oben erwähnten Nächteilen verbunden ist. Durch die Erfindung wird somit ein Verfahren zur Selektierung und Aufrechterhaltung einer plasmidhal^igen, Bakterienpopulation bereitgestellt, indem hierzu Gebrauch gemacht wird von einem letalen chromosomalen Präger, der durch ein von einem Plasmid getragenes Gen repressiert wird.

Erfindungsgemäß wird unter einem rekombinierenden DNA-KIonierungsvektor jedes Mittel unter Einschluß rekombinierender Plasmide, Bakteriophage und Viren verstanden, das aus einem DNA-Molekül besteht> an welches ein oder mehr zusätzliche DNA-Segmente gebunden sein können.

Unter einem Repressor wird ein Gen verstanden, das an einem rekombinierenden DNÄ-Klonierungsvektor angeordnet ist und das eine Expression eines letalen oder kohditionell letalen Gens in einem Chromosom einer Wirtszelle repressiert oder verhindert.

Ein funktionelles Polypeptid ist ein gewinnbares bioaktives vollständig heterologes Polypeptid oder ein entsprechender Vorläufer, ein gewinnbares bioaktives Polypeptid aus einem heteirologen Polypeptid und einem ganzen homologen Polypeptid oder einem Teil hiervon oder ein gewinnbares bioinaktives Fusionspolypeptid aus einem heterologen Polypeptid und einem bioinaktivierenden homologen Polypeptid, das speziell gespalten werden kann.

Ein verschmolzenes Genprodukt ist ein gewinnbares heterologes Polypeptid, das mit einem ganzen homologen Polypeptid oder einem Teil hiervon verschmolzen ist.

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Ein Präger ist ein Gen oder eine Kombination von Genen bekannter Funktion und Stellung an einem Chromosom oder einem rekombinierenden DNA-Kl onierungsVektor. "*·'

Die Erfindung kann angewandt werden zum Wachsenlassen von Kulturen, durch welches Produkte gebildet werden, die von rekombinierendef DNA codiert sind. Ohne ein Wirksames Selektionssystem verlieren viele Zellen in solchen Kulturen das gewünschte Plasmid, so daß die Bildung des gewünschten Produkts stark verringert ist. Durch die Erfindung wird sichergestellt, daß alle lebenden Zellen in einer Kultur den rekömbinierenden DNÄ-KionierungsvektCrr tragen, so daß die mögliche Produktivität einer solchen Kultur erfindungsgemäß verbessert wird. ,

Die Erfindung ist besonders vielseitig, da sie auf die Bildung irgendeiner Substanz" angewandt werden kann, deren Synthese von einem rekömbinierehden DNA-Klonierungsvektor bestimmt wird. Ein bevorzugter rekombinierender DNA-Klonierungsvektor ist das Plasmid, wobei erfindungsgemäß _% statt dessen selbstverständlich auch bakteriophage oder andere Vektoren verwendet werden können. Erfindungsgemäß kann ferner auch Gebrauch gemacht werden von irgendeinem letalen Präger* der in ein Wirtszellchromosom eingebaut istV falls die Letalität von einem Präger kompensiert oder . - ' · - ι ' komplementiert wird, der sich auf einem geeigneten rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor befindet. Die Brauchbarkeit der Erfindung ist unabhängig von anderen Prägern, die auf dem Klonierungsvektor geklont sind, so daß erfindungsgemäß rekombinierende Stämme verwendet werden können, die ein oder mehr Gene enthalten, die aus der technischen Produktion oder der Forschung stammen.

Die Anwendbarkeit eines Zellsuicids zur Aufrechterhaltung und Stabilisierung rekombinierender DNA-Wirtszellen wird

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anhand der Wechselwirkung von Baktexipphag X mit Escherichia %

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coil K12 gezeigt. Das Bakteriophag X ist ein temperiertes -^:k

Bakteriophag, das bei der Infizierung von Escherichia coli |i

K12 einem von zwei gegenseitig exklusiven Zyklen folgt. In f|

der Iytisehen Phase repliziert sich das Bakteriophag DNA %

autonom, lenkt die Synthese;und Anordnung der Bakteriophag- i|

komponenten und tötet die Zellen gleichlaufend mit der Frei- »;i

Setzung von reifem Bakteriophag. in der lysogenen Phase ist %

das Bakteriophag in das Wirtschromosom als ein Prophag in- |

tegriert, repliziert sich als Präger auf dem Chromosom und ^:f

blockiert die Synthese der Bakteriophagkomponenten. Ein >f

Bakteriophaggen, nämlich XcI, codiert für einen Repressor, -^

der den lysogenen !Zustand aufrechterhält und eine Expres- W

sion von Genen für Bakteriophagkomponenten und eine Rei- |

fung blockiert. Ist der Represspr inaktiviert oder von der J

Zelle entfernt, dann entwickelt sich das Prophag aus dem :|

Chromosom, tritt in den lytischen Kreis ein und tötet die * Zelle. Ein Bakteriophag mit einöm unvollkommenen Xcl-Gen

kann den lysogenen Zustand nicht beibehalten und ist für ³

die Zelle letal, es sei denn, daß von einer anderen Quelle ; für einen funktioneilen Repressor^^ gesorgt wird. Bei einer beispielsmäßigen Ausführungsform der Erfindung wird XcISO

als ein repressorabhängiges Prophag verwendet und ein el- ; Gen als funktioneller Repressor verwendet, das in einen

rekombinierenden DNA-Klonierüngsvektor geklont ist. ^!

Das selektive System und die Brauchbarkeit der Erfindung lassen sich zeigen, indem man das Xcl857 Repressorgen vom Bakteriophag X auf das Insulinplasmid pIA2 klont. Das Plasmid pIA2 erhält man aus pIAl αμΓσΙι Insertion eines tetracyclinresistenten Prägers (Proc. Nat. Acad. Sei. 76, 106 bis 110 (1979)). Die Insertion von tetracyclin-.undanderen antibiotikaresistenten Prägern auf bekannte Plasmide ist eine dem Fachmann geläufige Maßnahme und läßt sich in bekannter Weise erreichen.

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Die Restriktionsstelle und der Funktionsplan vonPlasmid pIA2 gehen aus Fig. 1 der Zeichnung h^ryqr_r Die Klonung des Repressorgens XcI857 von Bakteriophagλ auf Plasmid pIA2 führt zu; einem neuen Plasmid, das als Plasmid pAR2 bezeichnet wird, welches die lytische Entwicklungvon Bakteriophag λ blockiert u,n4 die bildung, eines v^r^tocj^ighen GenprQ-dukts von Humaninsulin-Ä-Kette codiert.

Die Restriktionsstelle und der Punktionsplan für das Pias-' mid pAR2

Das neue RekombinationsplarSmid pAR2 kann zu Eseherichia coli K12 RV308 (J.Mol. BiOl. 13^9, 14? bis 161 (1980)) transformiert werden, und 4er hierdurch erhaltene Stamm läßt sich dann mit Bakteriophagλσΐ90 lysogenisieren. Das Bakteriophag XcI90 bildet keinen funktionellen cI-Repressor,so daÄ der konstruierte Sfcanro Sscherich^ pAR2 eine Retention des Plasmids pAS2 erfordert, während der konstruierte Stanun Eseherichia coli K12RV308/pAR2 ohne das Plasmid gleich gut überlebt. Ein Vergleich der Plasmid^- retention in den beiden Stäitoen zeigt deutlich, daß praktisch alIe lebenden Zellen im^;.«rfindungsgemäßen Stamm das gewünschte Plasmid haben. Ferner behält der Stamm Escherichia coli K12 RV308\ci90/pAR2 nicht nur das Plasmid pAR2, sondern bildet darüber hinaus auch noch das gewünschte verschmolzene <3enprodukt, wie sich dufceh Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel zeigen liäßti J

Das Plasmid pAR2 läßt sich ferner auch in Eseherichia coli •Kl-2 C600R_k-M_k- (Proc. Nat. Acad^ Sei. 71y 103U bis 1034 (1974)) transformieren,^ und den hierdurch erhaltenen Stamm kann man dann mit dem Bakteriophag λσΙ90 lysogenisieren. Der hierdurch konstruierte Stamm Eseherichia coli Kl2 C600R_k-M_k-Xcl90/pAR2 braucht zürn^ Überleben das Plasmid pAR2 und dies stellt daher ebenfalls ein Beispiel für die Erfin-

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Die Erfindung läßt sich auch noch anhand anderer Plasmide Hj erläutern. So kann man beispielsweise das cro-Gen von Bak- || teriophag λ auf PlasmidpBR322 (Life Sei.25, 807 bis 818 Ii (1979)) klonen^ indem man da% Pfagment BamHI-EcoRI vom Bakteriophag ΛCI857 inseriert. Das hierdurch erhaltene neue Plasmid, welches als Plasmid ρ ARl bezeichnet wird, kann in Escherichia coli Kl2 RV308 transformiert werden, und der so erzeugte Stamm läßt sich dann mit Bakteriophag Xcl90 lysogenisieren. Eine ähnliche Operation läßt sich auch unter Verwendung von Escherichia coli Kl2 C600R.-M.- oder Escherichia coli K12 C600 als Wirt und von Bakteriophag XcI857 als Iysogenem Organismus durchführen. Das Gen Aero bildet einen Repressor, der die Funktion des Repressors el ersetzt, und dies macht deutlich, daß die konstruierten Stämme Escherichia coli K12 RV308>\cI90/pARl, Escherichia coli K12 G60D Κ^-Μ^-λοΐ857/ρ7αΐ1 vind Escherichia coli K12 C600XcI857/pARl zum überleben ein Plasmid brauchen, welches Xcro enthält. Der Repressor Xcl857 wird bei 38 bis 44 °c oder darüber (restriktive Bedingungen) inaktiviert und bei niedrigeren Temperaturen (zulässige Bedingungen) aktiviert, so daß das Xcro enthaltende Plasmid nur zum Überleben im letztgenannten Stamm unter restriktiven Kulturbedingungen erforderlich ist. Ein Vergleich der Plasmidretention in Escherichia coli K12 C600Rj-M,-XcI857/pARl unter zulässigen Bedingungen und somit ohne die Erfindung, sowie unter restriktiven Bedingungen und somit mit der Erfindung, zeigt deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in der Kultur bei der Erfindung das gewünschte Plasmid haben. Ähnliche Ergebnisse zeigt auch ein Vergleich der Plasmidretention in erfindungsgemäß konstruierten Stämmen Escherichia coli K12 RV308Xcl90/pARl sowie in nicht erfindungsgemäß konstruierten Stämmen Escherichi coli K12 RV308/PAR1. Die Anwendung von Plasmid pARl ist

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besonders vorteilhaft, weil dieses Plasmid einen Promotor enthält, der, ohne weiteres.-'-anpaSbar i^t-,_:£ü.r die Insertion' irgendeines der verschiedensten Gene^ welche die Bildung brauchbarer Produkte codieren.

Zurweiteren; beispielsmSßifen Belegung und ©emonstration der breiten Anwendbarkeit der Erfindung werden auch die Plasmide pPRl und pPR3 hergestellt. Zur Konstruktion des Plasmids pPRl inseriert man das Fragment 2,5 Kb Bglll des Bakteriophags λο1857 in die einmalige Restriktionsstelle BamHI des plasmids ρΙΑ7Δ4Δ1. Die Restriktionsstelle und der Funktionsplan von ρΐΑ7Δ4Δ1 gehen aus der Fig. 3 der Zeichnung hervor. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 enthält' demnach den Escherichia cöli-Tryptöphanpromotpr, die Präger für eine antibiotische Resistenz und ein Gen, das ein verschmolzenes Genprodukt auspreßt/ welches einen Teil des Proteins trp E enthält, das mit der Pplypeptidkette^A von Humaninsulih verschmolzen: ist. : '^:il-^:"'-\]''-'\^: ' ' ' .^:-':\'' , !.. ;; . >''-·^·'^:..;'' ^:^ '/ -V^'- ^:' . ' " '' '

Nach dem in Beispiel 13A-I näher beschriebenen Verfahren wird ausgehend von Plasmid pBR322 auch das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 konstruiert. Nach der hierfür üblichen Schreibweise beinhaltet das Symbol "Δ" eine Auslöschung. Demnach beschreibt beispielsweise eine Bezugnahme auf ein Plasmid unter nachfolgender Angabe "ßEcöRI-Xbal" das Plasmid, von welchem die Nucleotidsequenz zwischen den Restriktibhsenzymstellen EcoRI-durch Verdauung durch diese Enzyme entfernt worden ist. Bestinpte Auslöschungen werden der Einfachheit halber einfach airch eine Zahl bezeichnet. Beginnend vom ersten Basispaar ("bp") der Erkennungslage EcoRI, welche dem Gen für die Tetracyclinresistenz im Stammplasmid pBR322 vorangeht, bezeichnet das Symbol "ΔΙ" daher eine Auslöschung von bp 1-30 (nämlich EcoRI-Hindlll), und somit ein Außeffunktionsetzen des Tetracyclin-Promotor/Operator-Systems. Das Symbol "Δ2" beinhaltet eine Auslöschung von bp 1-375 (näm-

lieh AEcoRI-BamHI), und somit eine Entfernung von sowohl dem Tetracyclin-Promotor/Operator als auch einem Teil des

Strukturgens, welches den Code für eine Tetracyclinresi- k

stenz trägt. Bas Symbol "Δ4¹· beinhaltet eine Auslöschung 3

von bp ~900 bis ~1500 des Operator-Fragments trp, welches ^;

das Strukturgen für das Polypeptid trp D eliminiert. ,

Die Klonung des Repressorgens λcI857 des Bakteriöphags λ auf :'

das Plasmid ΡΙΑ7Δ4Δ1 führt zu einem neuen Plasmid, welches .'S₁

als Plasmid pPRl bezeichnet wird, das die lytische Entwick- }

lung des Bakteriöphags λ blockiert und gleichzeitig die 1

Bildung des oben erwähnten verschmolzenen Genprodukts co- |

diert. Die Restriktionsstelle und der Funktionsplan für ' das Plasmid pPRl gehen aus Fig. 4 der Zeichnung hervor.

In dieser Figur sind die Verbindungsstellen Bglll-BamHI .;;:

durch das Symbol "/B/B/" bezeichnet. 5

Das neue Rekombinationsplasmid pPRl läßt sich entsprechend φ transformieren, beispielsweise zu Escherichia coli Kl2 RV308, Escherichia coli K12 C600 (Bacteriöl, Rev. 36, 526 bis 557, (1972) und Escherichia coli K12 CeOOR^-Mj₁- (Proc. Nat. Acad. Sei. 71, 1030 bis 1034 (1974)V und die hierdurch erhaltenen Stämme kann man mit Bakteriophag XcI90 lysogenisieren. Das Bakteriophag XcI90 bildet keinen funktionellen Repressor el, so daß die konstruierten Stämme Escherichia coli KI2 RV308A,cl90/pPR1, Escherichia coli K12

CöOOXcigO/pPRl und Escherichia coli Kl2 C600R_k-M_k-Xcl90/ : pPRl eine Retention des Plasmids pPRl erfordern, während die konstruierten Stämme Escherichia coli Kl2 RV308/pPRl, Escherichia coli Kl2 C600/pPRl und Escherichia coli Kl2 C600R_k-Mj.-/pPRl genau so gut ohne das Plasmid überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stämmen macht deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in den erfin- -dungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid haben. Darüber hinaus behalten auch alle Stämme Escherichia coli Kl2 RV308\cl90/pPRl, Escherichia coli K12 CöOOXcigO/pPRl und

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Escherichia coli K12 C600R_k-"M_k"Xcl90/pPRl das Plasmid pPRl und bilden das gewünschte verschmolzene Genprodukjt, wie sich durch Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel feststellen läßt.

Das Plasmid pPR3 wird konstruiert cturph Insertion des Fragments 2,5 Kb BgIII des Bakteriophagen Xel8f>7 in die einmalige Restriktionsstelle BamHI des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ. Die RestriktionsstelIe und der Funktionsplan des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δ1 gehen aus Fig. 5 der Zeichnung hervor. Das Plasmid pIB7 4 1 enthält demnach ein Gen, welches ein verschmolzenes Genprodukt ausdrückt, das aus einem Teil des Proteins trp E besteht, welches mit der Polypeptidkette B von Humaninsulin verschmolzen ist.

In analoger Weise wie das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 wird auch das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ausgehend von dem Plasmid pBR322 gebildet. Der spezielle Aufbau dieses Plasmids geht aus Beispiel 21 ; hervor. . . ; ,··... -; ..^ χ.·-.· .' :./': \ ·' " ^Λ:-:_;: ". '

Die Klonung· des Repressorgens XcI857 des Bakteriophagen X auf das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 rführt zu dem neuen Plasmid pPR3. Dieses Plasmid blockiert die lytische Entwicklung des Bakteriophagen λ und codiert gleichzeitig die Bildung des oben erwähnten verschmolzenen Genprodukts. Die Restriktionsstelle und der F-unktionsp.lan des Plasmids pPR3 gehen aus Fig. 6 der Zeichnung hervor. In dieser Figur sind die Verbindungsstellen Bglll-Bamfil durch das Symbol "{[b/b]" bezeichnet.

Das neue Rekombinationsplasmid pPR3 läßt sich entsprechend transformieren, beispielsweise zu Escherichia coil K12 RV308, Escherichia coli K12 C600 und Escherichia coli K12 C600R.-M.-, und die hierdurch erhaltenen Stämme kann man dann mit Bak^- teriophag XcI90 lysogenisieren. Wie bereits oben für die

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Stämme beschrieben, welche lysogenisiertes pPRl enthalten, erfordern die,konstruierten Stämme Escherichia coli Kl2 RV308XcI9o/pPR3, Escherichia coli K12 ceOOXcISO/pPRS und Escherischia coli K12 ceOOR^fM^-Xciao/pPRS eine jRetention des Plasmids pPR3, während die konstruierten Stämme Escher iri.chia coli Kii2 RV3«öe/pPRi, Escherdchia coil K12 C60Ö/ pPR3 und Escherichia coil K12CöOOR^-'-M^^/pPRS keine solche Retention erfordern und ohne das Plasmid genau so gut überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stämmen macht deutlich^ daß praktisch alle lebenden Zellen in den erfindungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid haben. Die Stamme Escherischia coli K12 RV308XcI90/pPR3, Escherichia coil K12 C600Xcl9o/pPR3 und Escherichia coli K12 C600R.-M.-XcI9O/pPR3 behalten ferner auch ihre Plasmide und bilden das gewünschte verschmolzene Genprodukt, wie sich durch Elektrophoresejmittels PolyacrylamidgeI zeigen läßt.

Das erfindungsgemäß verwendete Repressorgen λel857 ist temperaturempfindlich und: wird bei Temperaturen von 38 Ms 44⁰C oder darüberinaktiviert. Eine Temperaturverschiebung auf 38 bis 44⁰C führt daher zu einer Lyse der Zellen durch Einleitung des lytischen Kreislaufs des λ Prophagen, welches erfindungsgemäß in den Wirtszellenstamm eingeführt worden ist. Bei Verwendung eines temperaturempfindlichen Repressors/ der einen letalen oder möglicherweise letalen Präger ausdrückt, -welcher eine Wirtszellenlyse hervorruft, und bei Züchtung der Wirtszellen bei einer Temperatür» die den Represser inaktiviert, und, im Falle eines möglicherweise letalen Prägers, bei einer Temperatur, die nicht innerhalb des Temperaturbereichs für eine zulässige Kultur der Wirtszellen liegt, ermöglicht die Erfindung selbstverständlich auch eine einfache, bequeme und wohlfeile Methode zur Lyse von Zellen für eine Reinigung intrazellularer Produkte.

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Eine weitere beispielsmäßige Ausführungsform der oben erwähnten Methode zur Lyse rekonibinierender DNA, die Wirts- ·.·' zellen enthält, besteht in einer Lysogenisierung der Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der einen koriditionell letalen Präger enthält,, welcher eine Wirtszellenlyse verursacht, und in einer Züchtung 4er' Wirtsseilen unter restriktiven Bedingungen. Wiederum ein anderes Beispiel für diese Methode zur Lyse von Wirtszellen besteht in einer Transformierung der Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Kl-ohieruhgsvektor, der «einen konditioneil letalen Prä-, ger enthält, welcher eine Lyse von Wirtszellen verursacht, und in einer Züchtung der transformierten Wirtszellen unter restriktiven Bedingungen-.-'Die Züchtung der Wirtszellen unter restriktiven Bedingungen läßt sich während des Züchtungsverfahrens ohne weiteres zu irgendeiner Zeit durchführen, zu der man eine Lyse von Wirtszellen haben möchte.

Eine bevorzugte Ausführüngsform der Erfindung macht Gebrauch von einem von einem Plasmid getragenen Gen, zur Repression eines letalen chromosomalen Prägers. Die Selektion der Zellen ist unabhängig vom Replikon und ferner auch den anderen Genen am Plasmid. Bei der vorliegenden beschriebenen Ausführungsform wird zwar vom bakteriophagen Gen XcI857 Gebrauch gemacht, es kann statt dessen jedoch auch irgendein anderes Gen XcI Verwendet werden, das einen funktioneilen Repressor bildet. Ferner kann man auch sonstige Repressorgene, beispielsweise das Gen Xcro einsetzen, da dieses Gen obigen Ausführungen zufolge einen Repressor bildet, der die Funktion des .-Repressers el übernehmen kann. Das zur Erläuterung der Erfindung verwendete Prophag trägt eine Mutation Xcl90 und bildet daher keine funktionellen Repressor XcI. Es können auch andere Mutanten des Bakteriophagen X verwendet werden, falls sie ebenfalls kein funktionelles Gen el oder keinen Repressor enthalten. Selbstverständlich braucht man bei Verwendung solcher Mutanten dann eine an-

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dere Repressorquelle, um den lysogenen Zustand beizubehalten.

Das erfindungsgemäße selektive System kann auf Wirtszellen angewandt werden, die Plasmide mit Genen enthalten, welche M für eine Expression der verschiedensten brauchbaren Produk- ^] te sorgen. Das von einem Plasmid getragene Gen kann bei- t spielsweise ein natürlich vorkommendes Gen, ein nichtna- | türlieh vorkommendes Gen Oder ein Gen sein, das teilweise <) natürlich und teilweise synthetisch oder nichtnatürlich f. vorkommt. Von der Erfindung kann insbesondere Gebrauch ge- _Λί macht werden zur Auswahl und Haltung von Zellen, die ein | von einem Plasmid getragenes Geh enthalten, welches den | Code bildet für HUmanpräproinöulin, Huaanproinsulin. Human- | insulin-A-Kette, Humaninsulin^B-Kette, Humanwachstumshormon, Nichthumanwachstumshormon, Nichthumaninsulin, Human- \ interferons Nichthumaninterferoh, Viraläntigen, Urokinase, ί irgendein Peptidhorinoni,,irgendein Enzym, irgendein Pol ypeptid oder praktisch jedes sonstige Gen, das in der Forschung und Technik von Bedeutung ist.

Bei den hierin beschriebenen speziellen Ausfuhrungsformen der Erfindung ist die Plasmidreplikation oder die Expres sion des Genprodukts bestimmt vom Replikon aus pMBl (Life Sei:. 25, 807 bis 818 (1979)) und entweder vom lac-Promotor oder vom trprPromotor. Andere Replikone und Promotoren können ebenfalls verwendet werden, sofern sie in Escherichia coli K12 funktionell und gegenüber dem jeweils verwendeten Repressor nicht empfindlich sind. Die Auswahl der Replikone und Promotoren, die in Escherichia coli Kl2 funktionell und gegenüber einem bestimmten Repressor nicht empfindlich sind, ist ohne weiteres möglich und liegt im Rahmen des fachmännischen Könnens. Zu Beispielen für andere Replikone gehören die Replikone von CoIEl, NRl, RK2, RK6, pSClOl, RPl, RP4, P und dergleichenunter Einschluß

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von Bakteriophag, das in Escherichia coli K12 repliziert. Zu Beispielen für andere Promotoren gehören der Bakteriophage λΡτ'"Promötor, Lipoproteinpromotor> Ribosomalprotein oder RNA-Promotoren und praktisch auch alle sonstigen Promotoren. Selbstverständlich lassen sich auch noch andere Replfkone und Promotoren konstruieren, was für den Fachmann keinerlei Probleme bereitet.

Die obigen Ausführungen zeigen, daß durch Verwendung eines letalen chromosomalen Prägers, den man durch Repression von einem plasmidgetragenenGen erhält, ein Verfahren zur Selektierung und Aufrechterhaltung einer plasmidhaltigen Bakterienpopulatiöh bereitgestellt wird. Es sind die verschiedensten Ausführungsformen dieses Verfahrens möglich. Anstelle des Bakteriophagen λ kann man beispielsweise auch verschiedene andere Bakteriophagen verwenden, und es können auch andere Klassen an letalen Mutationen angewandt werden, sofern sich hierdurch eine Repression durch ein plasmidgetragenes Gen ergibt. Zu Beispielen für letale Mutationen, die erfindurtgsgemäß bräuchbar sind, gehören beispielsweise folgende: Chrombspmale pNA-Replikation, Zellwandsynthese, Ribosomfunktion, RNA-Polymerase, tRNA-Synthese und -Modifikation, Aminoacyl-tRNA-synthetase, DNA-Restriktionund -Modifikation-sowie Zellteilungsmutationen. Andere letale Mutationen bieten sich dem Fachmann von selbst an.

Manche Klassen an letalen Mutationen, die als konditionel-Ie letale Mutationen bezeichnet werden, erhält man lediglich durch Expression unter restriktiven Bedingungen, beispielsweise bei erhöhter Temperatur. Solche Mutationen lassen sich isolieren und sind bei Expression gegenüber Zellen letal, während sie unter bestimmten zulässigen Züchtungsbedingungen keine Expression oder Letalität ergeben. Der erfindungsgemäße Zellsuicid läßt sich unter restrikti-

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ven Bedingungen auf jede konditionelle letale Mutation an- $ wenden, solang ein Plasmid oder ein sonstiger rekombinierender DNA-Klonierungsvektor einen geeigneten Repressor trägt, der unter restriktiven Bedingungen funktionell ist. Eine solche Mutation wird nicht wiederum konditionell letal, sofern 4as Plasmid_voder der sonstige rekombinierende DNA-Klonierungsvektor nicht verlorengeht.

Widersinnige Mutationen oder Repressor en stellen eine spezielle Klasse von Genen dar, die zur Erläuterung der erfindungsgemäß erzielbaren Stabilisierung und Selektierung herangezogen werden kann. Unter einer widersinnigen Mutation wird eine Grundsubstitution oder eine Rahmenverschiebungsmutation verstanden, die zu einer Umwandlung eines eine Aminosäure spezifizierenden Codons in ein kettenendständiges Codon fuhrt, widersinnige Mutationen haben demzufolge einen vorzeitigen Abschluß einer Polypeptidkette an einer Stelle zur Folge, an der das widersinnige Codon in der als Bote dienenden Ribonuclexrisäure (mRNÄJ auftritt. Ein widersinniger Repressor ist ein Gen, das die Insertion einer Aminosäure in die wachsende Polypeptidkette in Antwort auf ein widersinniges Codon ermöglicht. In Abwesenheit eines solchen widersinnigen Repressors kommt es durch eine widersinnige Mutation zu einem Abschluß des Polypeptide. Zur weiteren Erläuterung der Erfindung kann man eine letale widersinnige Mutation in ein Chromosom einer transformierten Wirtszelle einführen, wenn ein geeigneter widersinniger Repressor auf den rekombinierenden PNA-Klonierungsvektor innerhalb der Wirtszelle geklont wirdü Autf ; diese Weise wird ein genetisches Gleichgewicht aufrechterhalten* sofern der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor nicht verlorengeht/ da die Wirtszelle dann abstirbt und sich selbst zerstört. /

Die Fülle an genetischer und biochemischer Information

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über Escherichia coli K12 macht diesen Organismus erfindungsgemäß als Wirtszelle besonders geeignet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf irgendeinen Genus, eine Spezies oder einen Stamm beschränkt, sondern sie läßt sich auf alle Organismen anwenden, wo letale Mutationen und Repressoren verfügbar sind oder isoliert oder konstruiert werden können. Die Erfindung läßt sich daher beispielsweise anwenden auf Prokaryotes, einer Züchtung zugängliche freilebende Eukaryotes und insbesondere Bakterien, wie beispielsweise Bacillus, Bacillus subtilis, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomycetes, Streptomyees , Serratia, Agrobacterium oder Pseudomonas, Pilze, wie beispielsweise Neurospora, Cephalosporium, Aspergillus oder Penicillium, Hefen und Zellen, die einer Züchtung zugänglich sind, welche abgeleitet sind von Gewebe multizellularer Organismen unter Einschluß von Chordata, Mammalia, Aves, Amphibia oder Reptilia, oder von Pflanzen. :

Alle Ausführungsformen der Erfindung haben das gemeinsame Merkmal, daß sie gegenüber der Zusammensetzung der Medien unempfindlich sind. Die Erfindung ermöglicht zur Verbesserung der Produktivität daher einen breiten Bereich an Fermentationsmanipulation.

Ausfuhrungsbeispiele

Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele, welche bevorzugte Ausführungsformen zeigen, weiter erläutert. Gegebenenfalls wird darin sowohl eine Erklärung als auch eine tatsächliche Beschreibung der angewandten Maßnahmen angegeben.

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Β e is pi e 1 1 ^-^: [: : -,,' . ..'.- '^; '.,.;// Aufbau von Rekombinationsplasmid pAR2

Die verschiedenen Restriktionsstellen BgIII im Bakteriophagen Acl857 und die einzige Restriktionsstelle BamHI im Plasmid pIA2 erlauben die Klonierung Von Bakteriophagfragmenten zumKlonierungsvektor pIA2. Das Bakteriophag XcI857 enthält sechs Stellen,die gegenüber BgIII empfindlich sind. Eines der Fragmente BgIII enthält 2,5 Kb unter Einschluß des Gens XcI und ferner auch des Gens Xrex (Gene, 217 bis 280 (1979) und Genetic Mapsy Band 1 (1980) NIH). Die Fragmente BgIII enthalten Extensionen 5* mit der Sequenz GATC, die identisch und komplementär sind zu den Extensionen 5* an den Fragmenten BamHI. DasHumaninsulinplasmid pIA2 enthält 11,0 Kb unter Einschluß einer einzigen Steller die durch BamHI gespalten wird. Eine Klonierung an der Stelle BamHI inaktiviert das Resistenzgen Tc, das am pIA2 getragen wird. Durch Ligation der Fragmente BgIII und der Fragmente BamHI entstehen Rekombinanten mit den Sequenzen

TCTAGG ^oder bCTAGA ^{an den} Verbindungsstellen. Diese Sequenzen werden durch BgIIΓ oder BamHI nicht gespalten. Eine Restriktion mit beiden Enzymen führt daher zu einer Eliminierung aller Ligätionsprodukte mit Ausnahme derjenigen» die an der Stelle BamHI von plA2 ein Fragment: ABgIII legiert enthalten. ^; .'".' · ·' ".^; · · : ' " , ' : '-. '/'' :.' /. .i· "· ·· ..:

Bei den verwendeten Restritkionsenzymen handelt es sich um im Handel erhältliche Materialien, die nach den Beschreibungen der jeweiligen Hersteller angewandt werden. Diese Restriktionsenzyme und die hierzu erforderlichen Beschreibungen sind über folgende Quellen zugänglich:

Bethesda Research Laboratories Inc.,Box 6010, Rockville, Maryland 20850

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Bpehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250 Research Products, Miles Laboratories Inc.,Elkhart, Indiana 46515.

RefkömblnierendetONA-Mo!%küle werden mit· Ligase T4 DNA in 0,10 ml eines Reaktionsgemisches gebildet, das 3,0 χ 10 MOl an restriktiertem Vektor und 6,0 χ 10 Mol an Restriktiojisfraginenten von Bakteriophag λ enthält. Weitere und vollständigerei Reaktiönsbedingungengehenaus J.Bäcteriöl. 121, 354 bis 362 (1975) hervor.

Bei spie 1 .2 '....' '' · .' '/: . ,- ^:. ' _: ,' '·.' - .

Transformation von Rekombihationsplasmid pAR2 zu Escherichia coli Kl2 C600R _K-M_K -

Frische, über Nacht gewachsene Kulturen von EScherichia coli K12 ceOOBj-btjf (Proc. Nat. Acad. Sei. 71, 1030 bis 1034 (1974) unterteilt man in Subkultüren in einem Verhältnis von 1:10 in frischer L-Brühe (Miller, Ejqperiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972) und läßt das Ganze dann 1,0 Std.

bei 37⁰C wachsen. Es werden insgesamt 660 Klett-Einheiten an Zellen geerntet, die man mit 2,5 ml 100 mmolarer Natriumchloridlösung wäscht, in 150 mmolarer Calciumchloridlösung mit 10,0 % Glycerin suspendiert und 20 Minuten bei Räumtemperatur bebrütet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, wieder in 0,5 ml Calciumchlorid-glycerin suspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis abgekühlt und eingefroren. Die Zeilsuspensionen werden bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Durch diese Konservierung und Aufbewahrung kommt es zu keiner Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit oder der Häufigkeit der Transformation durch die kovalent geschlossene zirkuläre DNA. Die Zellen werden in -einem Eisbad aufgetaut und in einem Verhältnis

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von 0,1ml Zellen auf 0,05 ml DNA (hergestellt gemäß Beispiel 1) mit einer Konzentration von 2,0 μ5/πι1 vermischt. Die auf diese Weise gebildeten Proben werden 10,0 Minuten auf Eis gekühlt, worauf man sie mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 2,0 Stunden bei 32°C bebrütet, auf L-Agar (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972)) mit 5 χ ΙΟ⁹ mol Ab2 ausbreitet und bei 32⁰C bebrütet. Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber dem Bakteriophagen bei 32°C selektierib. iJie Rekombinanten werden zum Nachweis ihrer Ap^r, Tc^s und λb2-Immunität bei 32°C und ihrer Ab2-Sensitivität bei 42⁰C untersucht. Ein Transformant wird ausgewählt und als Escherichia coli K12 C60QR..-M_K-/pAR2 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Isolierung und Amplifizierung des aufgebauten rekombinanten Plasmids pAR2 verwendet.

Beispiel 3 Amplifizierung und Isolierung von Rekombinationsplasmid pAR2

Das Plasmid DNA von Escherichia coli Kl2 C600,Rj₅-M^- wird mit Chloramphenicol amplifiziert und isoliert durch das geklärte Lysatverfahren (J. Mol. Biol. 36, 185 bis 194 (1968)). Die erhaltene kovalent geschlossene zirkuläre DNA wird durch Xquilibrierungsultrazentrifugierung in CsClund Propidiumdiiodid gereinigt. Das Propidiumdiiodid wird mit 2-Propanol extrahiert und die DNA in CsCl bei -20 ⁰C aufbewahrt... Entsprechende Arbeits lösungen von DNA werden in SSC/10-Puffer (0,015 molar an NaCl, 0,0015 molar an Natriumeitrat, pH-Wert 7,0) durch Chromatographieüber Sephadex-Säulen (PDlQ*) ausgetauscht.

* Pharmacia, 800 Centennial Ave, Piscataway, New Jersey 08851

233 8 48 5 B ei s ρ i e 1

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Transformation von Rekombinationsplasmid pAR2 zu Escherichia coil K12 RV308

Die Transformation von Rekonitoinationsplasmid pAR2 zu Escherichia^&bli Kl? KVSOIIf witd nach dem in Beispiel 2 be·" sehriebenenverfahren.durchgeführty mit der Ausnahme, daß man 300 mmölares Calciumchlorid verwendet. Entsprechende Proben werden mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 2,0 Stunden bei 32⁰C bebrütet, auf t-Agar mit 5 χ 10⁹ Mol Xb2 ausgebreitet und bei 32 ⁰C bebrütet. Die überlebenen Kolonien werden bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und besiiehen in den gewünschten Transformanten von Escherichia cöii K12 RV3Ö8/pAR2.

;B:,^;e.'i:-^:s'^;'p '.i.e. 1 5 ' ~ '

Aufbau von Escherichia coli K12 RV308\cI90/pAR2 durch Lyso genisierung mit

Man läßt Escherichia coli K12RV3Ö8/pAR2 (hergestellt nach Beispiel 4) so lange bei 32°C wachsen, bis 35 Klett-Einheiten produziert sind, worauf man das Ganze 60,0 Minuten bei 45°C weiterbehandelt. Man infiziert die Zellen mit XcI90 in einem Moe von 20 und bebrütet das Ganze dann 40 Minuten bei 45°C. Sodann läßt man Kolonien bei 32⁰C auf L-Agar wachsen, der 10 μg/ml Ampicillin enthält. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coli Kl2 RV308Xcl9O/pAR2 werden entsprechend untersucht, um das Wachstum; bei 32⁰C und die Empfindlichkeit bei 42°C. zu ermitteln.

233848 5 -"-

Be is pi el 6

Aufbau von Rekombinationsplasmid pARl

Die Restriktionsstellen EcoRl und BamHI im Bakteriophagen Ad 85 7 und im Plasmid pBR322 ermöglichen die Klonierung von Bakteriophägfragmenten auf den Klonierungsvektor pBR322. Man kauft entsprechende Restriktionsenzyme und setzt sie den Anweisungen des Herstellers entsprechend ein. Man entzieht daher Bakteriophag XcI857 und Plasmid pBR322 jeweils einer Doppelbehandlung:mit Restriktionsenzymen EcoRl. und BamHI. Etwa 528 ug der auf diese Weise erzeugten und restriktierten λοΙ857 DNA in 10 mM TrIs-HCl mit einem pH-Wert von 8 inkubiert man mit 10000 Einheiten pro mj. bakterieller alkalischer Phosphatase 30 Minuten bei 65^eC. Die bakterielle alkalische Phosphatase fuhrt zu einer Entfernung der endständigen Phosphatgruppen von den Restriktionsfragmenten des Bakteriophagen λ und verhindert hierdurch ihre gegenseitige Aneinanäerbindung. Die Enzymbehandlung verhindert jedoch keine Iilgation an nichtbehandelte DNA# wie beispielsweise an restriktiertes Plasmid pBR322.

Die mit Bakteriophag XcI857 behandelte und restriktierte DNA wird durch Gleichgewichtsultrazentrifugierung in CsCl und Propidiumdiiodid gereinigt. Das Propidiumdiiodid wird mit 2-Propanol extrahiert, und die DNA in CsCl bei minus 20⁰C aufbewahrt. Entsprechende Arbeitslösungen von DNA werden in SSC/10-Puffer (0,015 M NaCl, 0,0015 M Natriumcitrat, pH 7) durch Chromatographie über Sephadex-Säulen (PD 10) ausgetauscht.

Es werden entsprechende rekombinierende DNA-Moleküle mit T4-DNA-Ligase in 0,10 ml eines Reaktionsgemisches gebildet, das 2,2 Mg restriktiertem pBR322-Vektor und 3,8 \ig Restriktionsfragmente von Bakteriophag λ enthält. Weitere

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und vollständigere Reaktiönsbedingungen gehen aus J. Bacter^l. 121, 354-362 (1975) herv<M>:7, ,,

Transformation von Rekombinati.onsplasmid pARl zu Escherichia coli K12 C600R_]c -M_k -·

Die Transformation von Plasmid ρARl zu Escherichia coli K12 C600R,-M^- wird nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Represser Aero ist nicht temperaturempfindlich, so daß die Transformanten bezüglich ihrer Iitimunität gegenüber Bakteriophag Ab2 sowohl bei 32 ⁰C als auch bei 42⁰C selektiert werden. Die Rekombinanten werden zum Nachweis von Ap^r und Tc weiter untersucht, wobei einer der Transformanten!ausgewählt und als Escherichia coli Kl2 060011.-M^-ZpARl bezeichnet wird. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich d^er erwarteten Phehotypen untersucht und zur Isolierung und Amplifizierung des Rekombinationsplasmids pARl verwendet; Die Stufen der Isolierung und Amplifizierung werden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren durchgeführt; ;

Beispiel 8

Aufbau von Escherichia coil «12 RV308f.cI90/pARl durch Lysogenisierung mit AcI90

Man läßt Escherichia coli K12 RV308/pARl.(die Transformation des Plasmids pARl zu Escherichia cpli Kl2 RV308 wird nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt) so länge bei 32⁰G wachsen, bis 35 Klett-Einheiten gebildet sind, worauf man das Ganze 30,0 Minuten oder 60,0 Minuten bei 45⁰C überträgt. Sodann werden die Zellen mit AcI90 unter einem Moe-Wert von 20 infiziert und hier-

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auf 40 Minuten bei 45°C bebrütet. Man läßt entsprechende Kolonien bei 32?C auf L-Agar wachsen, der 10 pg/ml Ampicillin enthält. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coil Kl 2 RV308AcI90/pARl untersucht man dann bezüglich des erwarteten Phenotype, wodurch der Genotyp des aufgebauten Stamms bestätigt wird*

B el s pi el 9 '·..- / . : ".. '. . ;. > ' . , '' -

Aufbau von Escherichia coli Kl2 CeOOR^^M^^cieST/pARl durch Transformation mit PARI

Man macht Escherichia coll KI2 CeOORj₆-Mj₅-Xcl857 (aufgebaut nach der eingangs bereits beschriebenen Arbeit von Miller, 1972) leistungsfähig und transformiert das Ganze dann nach dem aus Beispiel 2 hervorgehenden Verfahren, mit der Ausnahme, daß man die Zellen statt bei 37^eC bei 32^C wachsen läßt. Man läßt entsprechende Kolonien auf L-Agar wachsen, der 10 pg/ml Ampicillin enthält, und untersucht die hierdurch erhaltenen Kolonien von Escherichia coli Kl2 CeOORj₅-M, -Aci857/pARl dann bezüglich des erwarteten Phenotyps, wodurch sich eine Bestätigung des Genotyps des gewünschten Stamms ergibt. ;

Beispiel 10 Aufbau von Escherichia coli K12 C600XcI90/pAR2

Der gewünschte Stamm wird praktisch nach den Angaben der Beispiele 1, 2 und 5 aufgebaut, mit der Ausnahme, daß man statt Escherichia coli K12 RV308 als Wirtsstamm Escherichia coli K12 C600 verwendet. ·

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Bei s ρ i e 1 11 Aufbau von Escherichia coli K12 C6QQXcI857/pARl

Der gewünschte Stamm wird praktisch nach den Angaben der Beispiele 6/7 und 9 aufgebaut, mit der Ausnahme,daß man anstelle von Escherichia coli K12 C600R--M^- als Wirtsstamm Escherichia coli Kl2 C600 verwendet.

B' e i s ρ i e 1 · 12 . ' .:..,; · ·· - ..; . ; _{: ;}

Verfahren zur Bestimmung der Stabilitäten von Wirtszellen, die Rekombinationsplasmide enthalten, und zwar mit oder ohne Selektion ] '. ' _:

Zur Ermittlung der Häufigkeit von Zellen, die die Plasmide enthalten, verwendet man das Gen Ap^r auf den Rekombinationsplasmiden. Reihenverdünnungen der jeweiligen Kultur verteilt man auf L-Agar und läßt sie darauf bei 32⁰C mit oder ohne 10 pg/ml Ampicillin wachsen; Die Häufigkeit der Zellen von Plasmid wird als Verhältnis aus den ampicillinresistenten Kolonien: und der Gesamtanzahl an Kolonien, die auf L-Agar ohne Ampicillin wachsen, bestimmt. Wahlweise trägt man die Kolonien auf dem L-Agar auch doppelt auf L-Agar mit 10 pg/ ml Ampicillin auf und läßt das Ganze bei 32°C wachsen. Die Häufigkeit der Zellen von Plasmid wird in diesem Fall als das Verhältnis aus den ampicillinresistenten Kolonien zu der Gesamtanzahl an Kolonien, die auf L-Agar ohne Ampicil-1in wachsen,angesehen.

B.e i.s pi -e''l -13 '; ^; . --V^- = .:'/ '.' · . ' ' [^ :< " · , / V'' 'Aufbau von Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1

A. Aufbau von Plasmid pBRHtrp

Das Plasmid pGMl trägt den Escherichia coli Tryptophan-

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operon, der die Auslöschung ALE1413 (J. Bacteriology 1457 bis 1466 (1978)) enthält und somit eine Expression eines Fusionsproteins ergibt, das die ersten sechs Aminosäuren der trp-Leitstruktur und etwa das letzte Drittel des Polypeptide trp E(welches in Verbindung als LE' bezeichnet wird) sowie ferner auch das Polypeptid trp D in seiner Gesamtheit enthält, und zwar alles unter der Kontrolle des trp-Promptor-Operator-Systems. Escherichia cö-Ii K12 W3110tna2trpA102/pGMl ist bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 31622) hinterlegt worden, und pGMl läßt sich in herkömmlicher Heise von dem Stamm entfernen und dann bei den im folgenden beschriebenen Verfahren verwenden.

Es werden etwa 20 μ$ des Plasmids von dem Restriktionsenzym PvuII verbraucht, das das Plasmid ah fünf Stellen spaltet. Sodann kombiniert man die Genfragmente mit EcoRI-Verknüpf ern (die aus einem selbstkomplementären Öligonucleotid der Sequenz pCATGAATTCATG bestehen), wodurch sich eine EeoRI-Spalts^telle für eine spätere Klonierung zu einem Plasmid ergibt, das eine Stelle EcoRI enthält. Die aus pGMl erhaltenen 20 Mg DNA-Fragmente behandelt man mit 10 Einheiten T.-DNA-tigase in Gegenwart von 200 Picomol des in Stellung 5* phosphory 1 ierten synthetischen Oligonucleor· tids pCATGÄATTCATG und In 20 μΐ T₄-DNA-Ligasepuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol) über Nacht bei 4⁰C. Sodann erhitzt man die Lösung zum Anhalten der Ligation 10 Minuten auf 70⁰C. Die Verknüpf er werden durch Verbrauch von EcoRI gespalten lind die Fragmente, welche jetzt Enden von EcoRI aufweisen, werden durch Elektrophorese mittels 5 %-igem Polyacrylamidgel (die im folgenden einfach als PAGE bezeichnet wird) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente werden vom Gel isoliert, indem man dieses zuerst mit Ethidiumbromid anfärbt und die Stellung der Fragmente mit Ultraviolett-

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licht sichtbar macht und die interessanten Teile vom Gel ausschneidet. Jedes Gelfragment wird dann zusammen mit 300 μΐ 0,1 x TBE in einen Dialyseschlauch gegeben und einer Elektrophorese bei 100 V über eine Zeitdauer von 1 Stunde in 0,1 X TBE-Puffer unterzogen (der TBE-Puffer enthält 10,8 g Trisbase, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na₃EDTA in 1 Liter H₂O)". Die wäßrige Losung wird aus dem Dialyseschlauch entnommen, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und auf eine Natriumehloridmolarität von 0,2 eingestellt. Nach Ausfällung in Ethanol wird die DNA in Wasser gewonnen. Das trp-Promotor/Operator enthaltende Gen mit EcoRI-Enden wird nach folgendem Verfahren identifiziert, das die Insertion von Fragmenten in ein tetracyclinempfindliches Plasmid beinhaltet, welches nach Promotor/Operator-Insertion tetracyclinresistent wird. Alle im folgenden beschriebenen DNA-Fragmentisolierungen werden unter Verwendung von PAGE nach der oben beschriebenen Elektroeluierungsmethode durchgeführt. i

B. Aufbau von Plasmid pBRH trp Expressionstetracyclinresistenz unter der Kontrolle des trp-Promotors/Operators und Identifizierung sowie Amplifizierung des trp-Promotor/ Operator enthaltenden DNA-Fragments, welches nach obiger Stufe A. isoliert worden ist

Plasmid pBRHl (Nucleic Acids Research 6, 3267 bis 3287 (1979)) ergibt eine Expression von Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, führt jedoch zu keiner Expression dieser Resistenz, weil mit ihm kein Promotor verbunden ist, Das Plasmid ist demnach tetracycl insensitiv. Durch Einführung eines Promotor/Operator-Systems in die Stelle EcoRI kann dieses Plasmid tetracyclinresistent gemacht werden.

Plasmid pBRHl wird von EcoRI verdaut. Das Enzym wird durch Phenolextraktion und anschließende Cfrloroformextrak-

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tion entfernt, worauf man die DNA in Wasser nach Ethanolfällung gewinnt. Das erhaltene DNA-Molekül wird in getrennten Reaktionsgemischen mit jeweils den drei DNA-Fragmenten vereinigt, die man nach obigem Beispiel 13 A. erhält, und in der beschriebenen Weise mit T.-DNA-Ligase verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vorhandene DNA wird zur Umwandlung von leistungsfähigem Escherichia coli K12 Stamm 294 {Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73, 4147 bis 4198 (1976), ATCC Nr. 31448> unter Anwendung üblicher Techniken (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 bis 3459 (1974) verwendet, und die Bakterien werden dann auf LB-Platten (Miller, 1972) aufgezogen, die 20^g/ml Ampicillin und 5 μg/ml Tetracyclin enthalten. . \v ' :" '.\ ' „. '.- ) ' " .·;

Es werden mehrere tetracyclinresistente Kolonien selektiert, und das Plasmid DNA wird isoliert und als Plasmid pBRHtrp bestimmt. Die Anwesenheit des gewünschten Fragments wird durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das Plasmid pBRHtrp ergibt eine Expression von ß-Lactamase, verleiht Ampicillin Resistenz und enthält ein DNA-Fragment, welches 3eri trp-Promotor/OperatorentthaIt. Das DNA-Fragment codiert ferner ein erstes Protein (welches als LE' bezeichnet wird), das aus einer Verschmelzung der ersten sechs Aminosäuren des trp-Leiters und etwa dem letzten Drittel des Polypeptide trp E besteht, und es ergibt auch eine Codierung für ein zweites Protein (welches als D¹ bezeichnet wird), das etwa der ersten Hälfte des Polypeptide trp D entspricht, sowie eine Codierung eines dritten Proteins, das durch das tetracyclinresistente Gen codiert ist. '

C. Aufbau von Plasmid pSGM7A2

Das Plasmid pBRHtrp wird durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut, und das hierdurch erhaltene Fragment vereinigt man nach Isolierung durch PAGE und Elektroelution mit EcoRI-ver-

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dautem Plasmid pSOMll (Sei. 198, 1056 (1977),GB-OS 2 0Φ7 676A). Das Gemisch wird mit T^-DNA-Ligase verknüpft, und die erhaltene DNA in der oben beschriebenen Weise zu Escherichia coli K12 Stamm 294 transformiert„ Auf ampicil-1inhaltigen Platten werden Transformationsbakterien selektiert, und die erhaltenen ampicillinresist^iiten Kolonien werden durch Koloniehybridisierung einem Screening unterzögen (Pröc. Nat. Aead. SeiV USA 72, 3951 bis 3965 (1975). Das trp-Promotor/Operator enthaltende Fragment wird nach Isolierung aus pBRH trp und anschließender radioaktiver

Markierung mittels ρ als Probe bei obigem Verfahren verwendet. In der Koloniehybridisxerung erweisen sich mehrere Kolonien als positiv, und diese werden daher ausgewählt. Das Plasmid DNA wird isoliert, und die Orientierung der inserierten Fragmente bestimmt man durch Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und BamHI bei der sogenannten Doppelverdauung. Kolonien, die das gewünschte Plasmid mit dem trp-Promotor/Operator-Fragment in der geeigneten Orientierung enthalten, läßt man in LB-Medium (Miller, 1972) wachsen, weiches 1Ö Mg/ml Ampicillin enthält. Das gewünschte Plasmid wird als pSOM7A2 bezeichnet und für den im folgenden beschriebenen Aufbau verwendet.

D. Aufbau von Plasmid pTrp24

1. Aufbau eines Genfragments, welches Codone für die Distalbereiche des LE'-Polypeptide mit Restriktionsstellen BgIII oder EcoRI an den Enden 5* oder 3' des Codierungsstrangs enthalten "

Das Plasmid pSOM7A2 wird unter solchen Bedingungen zuerst durch HindiII und dann durch λ-Exonuclease (eine 5'- bis S'-Exonuclease) unter solchen Bedingungen verdaut, daß sich eine Verdauung ergibt, welche bis hinter die Restfiktionsstelle BgIII innerhalbder LE'-Codierungsregion reicht. Man

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löst etwa 20 Mg HindiII-verdautes ρ8ΟΜ7Δ2in einem Puffer {20 mM Glycinpuffer, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM fi^Mercaptoethanol). Das erhaltene Gemisch wird 60 Minuten bei Raumtemperatur mit: fünf Einheiten λ-Exonuclease behandelt. Sodann extrahiert man das Gemisch mit Phenol sowie mit Chloroform und fällt das Ganze darin mittels Ethanol.

Zur Bildung eines Rests EcoRI am distalen Ende des LE'-Genfragments synthetisiert man einen Primer 'pCCTGTGCATGAT nach der verbesserten Phosphotriestermethode (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 57€5 (1978)) und hybridisiert das Ganze dann zum eihstrangigen Ende des LE'-Gehfragments, das man durch λ-Exonucleaseverdauung erhält. Die Hybridisierung wird durchgeführt, indem man 20 pg des mit λ-Εχο-nucl ease behände 1 ten .Verdauungsprodukts Hindi 11 von Pl asmid PSOM7A2 in 20 μΐ H₂O löst und die Lösung mit 6 μΐ einer Lösung vereinigt, die etwa 80 Picomol des oben beschriebenen und in Stellung 5' phösphorylierten 01igonucleotids enthält. Das synthetische Fragment wird zum 3'-Ende der LE¹-Codierungssequenz hybridisiert, und der zurückbleibende einstrangige Anteil des LE*-Fragments wird durch Klenow-Polymerase I unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP u,nd dGTP eingefüllt. Bei der Klinow-Polymerase I handelt es sich um das Fragment, das man durch proteolytische Spaltung von DNA-Polymerase I erhält. Es enthält die Polymerisierungsaktivität 5' —> 3¹, die exohucleolytische Aktivität 3· ~> 5¹, jedoch nicht die exonucleolytische Aktivität 5'' —♦ 3' des Stammenzyms (Kornberg, 1974, W.H. Freeman and Co., SFO, 98).

Man erwärmt das Reaktionsgemisch auf 50° C, läßt es dann langsam auf 10⁰C abkühlen und gibt anschließend 4 μΐ des Klenow-Enzyms zu. Nach 15 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur und 30 Minuten langer Inkubation bei 37⁰C wird die Reaktion durch Zugabe von 5 μΐ 0,25 molarer EDTA unterbrochen. Das Reaktiönsgemisch wird mit Phenol extra-

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hiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Sodann wird die DNA mit dem Restriktionsenzym BgIII gespalten, worauf man die Fragmente mittels PAGE abtrennt. Ein unter Verwendung des Gels erhaltenes Autoradiogramm ergibt

32

ein mit P markiertes Fragment der erwarteten Länge von etwa 470 bP, welches man durch Elektroelujbion gewinnt. Dieses Fragment LE* (d) hat ein Endstück BgIII sowie ein blankes Ende, das mit dem Beginn des Primers zusammenfällt.

2. Aufbau von Plasmid pThal

Der Aufbau von Plasmid pThal erfolgt durch Insertion eines synthetisierten Gens für Thymosinal in Plasmid pBR322. Die Synthese des DNA-codierenden Thymosinfc 1 besteht in einer Synthese und anschließenden Ligation der 16 Oligonucleotide (T, bis T₁₆), die durch die doppelköpfigen Pfeile in Fig. 7 der Zeichnung angegeben sind. Am N-termirialen Ende wird ein Met-Codon ATG inseriert, und die Enden 5*-sind mit einsträngigeh köhäsiven Endstücken versehen, um auf diese Weise eine Bindung an Plasmide zu erleichtern, die mit EcoRl und BamHl gespalten werden. Die Stelle BgIII im Zentrum des Gens trägt zur Analyse der Rekombinationsplasmide bei.

Die Oligodesoxyribonucleotide T, bis T,_g werden unter Verwendung der modifizierten Phosphotriestermethode unter Einsatz vollständig, geschützter Aufbaublöcke für Tridesoxyribonucleotide synthetisiert (Science 198, 105€ (1977). Die verschiedenen Oligodesoxyribonucleotide gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

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TABELLE I Synthetische Oligonucleotide für Thymosinoc 1-Gene

Verbindung	; Sequenz ,:'.· ... .· · .-· -'.Λ..·-.-. . . ', ... ..·.. -.'. -i : -':- '.-' ' · · ν · . ·' . . · ' . ' "'	Länge	Verweilzeit in der HPLC-Analy- se (min) *
Tl	A-A-T-T-C-A-T-G-C-C	10	17,4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24,3
T3	T-A-C-T^T-C-T-TOC-T-G-A	12	20,3
T4	G-A-T-T-A-C-T^-C-T-A-A-A	13	22,0
T5	G-C-A-G-C-A^T^C-A-O-A-C-A-T-G	15	24,8
T6	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A	12	20,1
T7	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	22,6
T8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20,2
T9	G-A^T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
Tl0	A-A-G-A^A-G-Gr A^AH3rTLT ' ·	12	21,1
Tll	G-T-C-G-Ä-Ä-G-A-G-G-C-T	12	20/5
T12	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
T13	C^T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
T14	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	20,5
T15	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
T 16	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10	17,2

* Bei Umgebungstemperatur

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— 35 -

Ein Beispiel für die obige Synthese ist das folgende Verfahren zur Herstellung des Fragments T₁₅, welches in Fig. 8 der Zeichnung zusammengefaßt ist. Verschiedene Nucleo-. _ftidfr.agmente, die zur Synthese des Fragments T,- verwendet werden, sind in dieser Fig. 8 numerisch bezeichnet. Die darin enthaltenen Abkürzungen haben folgende Bedeutung: TPSTe = 2,4,6-Triisopropy!benzolsulfonyltetrazol BSA = Benzolsulfonsäure J |

TLC :-.,= pünnschichtchromatographie | HPLC sHochleistüngsflüssigkeitschromatographie DMT = 4,4 -Dimethoxytrityl | ί

CE = 2-Cyanoethyl ! \

R = p-Chlorphenyl ' '

Bz = Benzoyl .. .-. - ." . ' . " - 1 ^[ . ' ". "'_: " / · An = Anisoyl iBu = Isobutyl I

Py = Pyridin

..- . . 1 · .' . . · ·: ' \/ . :

AcOH -*s. Essigsäure und j

Et₃N = Triethylamin.

Die vollständig geschützten Tridesoxyribonucleotide 4 (85 mg, 0,05 mMol) und 2 (180 mg, 0,1 mMol) werden an ihren Hydroxygruppen in Stellung 5' von den Schutzgruppen befreit, indem man sie 10 flinuten bei 0⁰C mit 2 % BSA in 7:3 (V/V) ChloroT form/Methanol (10 und 20 ml) behandelt. Die Reaktionen werden durch Zugabe von gesättigtem wäßrigem Ammoniumbicarbonat (2 ml) unterbrochen, worauf man das Ganze mit Chloroform (25 ml) extrahiert und mit Wasser (2 χ 10 ml) wäscht. Die organischen Schichten werden getrocknet (Magnesiumsulfat), auf geringe Volumina (etwa 5 ml) eingeengt und durch Zugabe von Petrol ether (Siedebereich 35 bis 6O⁰C) gefällt. Die farblosen Niederschläge werden abzentrifugiert und unter Vakuum in einerii Exsiccator getrocknet, wodurch man zu den Produkten 6od0r8 gelangt, und zwar in Form homogener Substanzen nach dünnschichtchromatographischer Aufarbei-

23 3 8 48 5

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tung mittels Silicagel (Merck 60 F254, ChloroformZMethanöl, 9:1), ' /\ ..;/.:". ' ' ' ' ' ' ; ' ; ... ' '..-.: .' .' ' - . ' '.' . .. . - ;

Die Trimeren 1 und 3 (270 mg, 0,15 mMol oder 145 mg, 0,075 mMol) werden in die entsprechenden Phosphodiester (5 und 7) überführt, indem man sie 25 Minuten bei umgebungstemperatur mit Trie'thylamih/Pyridin/Wasser (1:3:1, VZV, 10 ml) behandelt. Die Reagenzien werden auf einem Rotationsverdampfer entfernt und die Rückstände durch wiederholte Verdampfung mit wasserfreiem Pyridin (3 χ 10 ml) getrocknet. Man vereinigt das Trimere 8 (0,05 mMol) und das Trimere 7 mit TPSTe (50 mg, 0,15 mMol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml) und läßt das Reaktionsgemisch unter Vakuum 2 Stunden bei Umgebungstemperatur stehen. Eine entsprechende dühnschichtchromatographisehe Analyse zeigt, daß 95 % des Trimeren 8 zum hexameren Produkt umgewandelt worden sind (was durch Detektion der DMT-Gruppe durch Besprühen mit 10 %-iger wäßriger Schwefelsäure und Erwärmen auf 60⁰C sichtbar gemacht wird). Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser (1,0 ml) unterbrochen und das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Nach Entfernung des Pyridine durch gleichzeitige Verdampfung mit Toluol spaltet man die Schutzgruppe des Hexamers in Stellung 5' mit 2 % BSA (8 ml) iin der oben für die Trimeren 4 und 2₄beschriebenen Weise ab. Das hierdurch erhaltene Produkt (10) wird auf einer mit Sijlicagel gefüllten Säule (Merck 60 H, 3,5 χ 5 cm) durch stufenweise Gradientenelution mit ChloroformZMethanöl (98:2 bis 95:5, VZv) gereinigt. Die das Produkt 10 enthaltenden Fraktionen werden zur Trockne eingedampft. '

In ähnlicher Weise kuppelt man auch das Trimere 5 zum Trimeren 6 und reinigt das vollständig geschützte Produkt direkt über Silicagel. Diese Verbindung wird dann in der oben beschriebenen Weise in Stellung 3* durch Behandeln mit TriethylaminZPyridinZWasser von der Schutzgruppe be-

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freit, wodurch man zürn Fragment 9 gelangt.

Schließlich kuppelt man die Hexameren 9 und 10 in wasserfreiem Pyridini 2 ml) mit TPSTe (75 mg, 0,225 mMol) als Kondensationsmittel. Nach Beendigung (4 Stunden bei Umgebungstemperatur) wird das Gemiscji auf einem Rotationsverdämpfer verdampft und der Rückstand über Silicagel chromatographiert. Das durch Fällung mit Petrolether erhaltene Produkt 11 (160 mg) erscheint im Dünnschichtchromatogramm homogen. Ein Teil der Verbindung 11 (20 mg) in Pyridin (0,5 ml) wird durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (.7 ml, 8 Stunden, 60⁰C) und nachfolgende Behandlung in 80 %-iger Essigsäure (15 Minuten, Umgebungstemperatur) vollständig von den Schutzgruppen befreit. Der nach Verdampfen der Essigsäure erhaltene feste Rückstand wird in 4 %igem wäßrigem Ammoniumhydroxid (V/V, 4 ml) gelöst und die Lösung mit Ethylether (3 χ 2 ml) extrahiert. Die wäßrige Schicht wird auf 1 bis 2 ml eingeengt, und einen Teil dieses Konzentrats unterzieht man dann zur Reinigung der erhaltenen Verbindung 12 einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die dem überwiegenden Maximum entsprechenden.. Fraktionen werden zusammengefaßt (etwa 2,0 Einheiten mit einem Außendurchmesser von 254) und auf etwa 5 ml eingeengt. Das erhaltene Endprodukt 12 wird unter Verwendung von Biogel P2 (1,5 χ 100 cm) unter Elution mit 20 %-igem wäßrigem Ethanol von Salz befreit, worauf man das Eluat zur Trockne eindampft und den Rückstand wieder in Wasser (200 μΐ) eluiert, wodurch man zu einer Lösung von A₃₅₄ = 10 gelangt. Die Sequenz der Verbindung 12 wird durch zweidimensionale Sequenzanalyse bestätigt.

.'. ' . i . : '

Das vollständige Gen Thymosinα. 1 wird von den 16 synthetischen Oligonucleotiden unter Anwendung der Methoden gesammelt, wie sie vorher im einzelnen für Somatostatin

ο 17 i\::'·::3

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(Sei. 198, 1056 (1977)), Insulin

(Proc. Nat. Äcad. Sei. 76_rl06 bis 110 (1979)) und Wachstumshormon (Nature, 281, 544 (1979)) im einzelnen beschrieben worden sind. Jeweils 10 ^g der Oligonucleotide T₁- bis Y-PJ-ATP (New

England Nuclear) in Gegenwart von T.-PolynucleotÄökinase (Proc. Nat. Acad. Sei. 76, 106 bis 110 (1979)), wodurch man zu spezifischen Aktivitäten von etwa 1 Ci/mMol gelangt. Radioaktiv markierte Fragmente werden durch Elektrophorese mittels eines Gels aus 20 % Polyacrylamid und 7 Mol Harnstoff gereinigt, und die Sequenzen der eluierten Fragmente bestimmt man durch zweidimensionale Elektrophorese und Homochromatographie (Nucleic Acids Res. 1, 331 (1974)) von Partialschneckenvenomverdauungsprodukten. Die Fragmente T, und Τ,, werden unphosphoryliert belassen, um eine unerwünschte Polymerisation während nachfolgender Ligationsreaktiohen minimal zu halten. Diese Oligonucleotide (jeweils^ μg) werden in vier Gruppen aus vier Fragmenten (siehe Fig. 9 der Zeichnung) durch T.-DNA-Ligase unter Anwendung bekannter Methoden (Proc. Nat. Acad. Sei. 76, bis 110 (1979)) zusammengefaßt. Die Reaktionsprodukte werden durch Gelelektrbphorese auf einem 15 %-igen Polyacrylamidgel, das 7 Mol Harnstoff enthält ( Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1977)..), gereinigt. Die vier isolierten Produkte werden miteinander verbunden, und das Reaktionsgemisch wird durch Elektrophorese mittels 10 %-igem Polyacryl amidgel aufgetrennt. Die DNA im Größenbereich des Gens Thymosin-a 1 (90 bis 105 Gründpaare) wird elektroelu- iert. " .' ' · . .''. ' '

Das Plasmid pBR322 (0,5 μg) wird mit den Restriktionsendo-> nucleasen BamHI und EcoRI behandelt, und die Fragmente werden durch Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das große Fragment wird vom Gel durch Elektroelution gewonnen und dann ah die synthetische DNA (Nature

I i S 8 4 ö 5

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.281, 544 (1979)) gebunden. Diese Gemisch verwendet man dann zur Transformierung von Escherichia coli K12 Stamm 294, ATCC Nr. 31446. 5 % des Transformationsgemisches trägt man auf LB-Platten auf, die 20 pg /ml Ampicillin enthalten. Die vier erhaltenen und ampicillinresistenten Kolonien sind gegenüber Tetracyclin empfindlich, was auf eine Insertion in das tetracyclinresistente Gen hinweist. Eine Analyse der Plasmide aus diesen vier Kolonien zeigt, daß jeweils das Plasmid, welches als pThöcl bezeichnet wird, einmal (a) eine Stelle BgIII enthält, die im pBR322 selbst nicht zu finden ist, was auf das Vorhandensein des Gens Thymosin- CL\ gemäß Fig. 7 hindeutet,' und (b) zum anderen Mal ein Fragment mit etwa 105 Grundpaaren 'enthält, welches durch Spaltung BamHI/EcoRI gebildet wurde. Der Aufbauweg für das Plasmid pThal (welches nicht schematisch gezeigt ist) geht aus Fig. 9 der Zeichnung hervor, in der die starken Punkte für die Phosphatgruppen in Stellung 5' stehen.

3. Beaktion von behandeltem pThal und LE¹(d)-Fragment

Das Plasmid pThal enthält eine Gen spezifizierende Ampicillinresistenz und ein Strukturgen spezifizierendes Thymosin-OCl, welches am Codierungsstrangende 5' in eine Stelle 5 und am Ende 3' in eine Stelle BamHI geklont ist. Das Thymosingen enthält auch eine Stelle BgIII. Zur Bildung eines Plasmids, das zur Aufnahme des in obiger Weise hergestellten LE'(d)-Fragments befähigt ist, wird das pTh#l durch EcoRI verdaut und dann durch Reaktion mit Klenow-Polymerase I mit dTTP und dATP umgesetzt, um hierdurch die Reste EcoRI stumpf zu machen. Durch Bglll-Verdauung des erhaltenen Produkts ergibt sich ein lineares DNA-Fragment, welches das Gen für eine Ampicillinresistenz enthält und an seinen entgegengesetzten Enden einen klebrigen Rest BgIII und ein stumpfes Ende aufweist. Das erhaltene Produkt läßt sich durch Umsetzung mit demLE'(d)-Fragment, welches ein

-inn ^nP, ^ * «ι? r-;ff*?.r

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klebriges Ende BgIII und ein stumpfes Ende aufweist, in Gegenwart von T^-Ligase rezirkulieren, wodurch man zu Plasmid pTrp24 gelangt. Durch diese Maßnahme wird wiederum eine Stelle EcoRI an der Stellung gebildet, an der es zu einer Ligation des stumpfen Endes kommt.

E. Aufbau von Plasmid ρέΟΜ7Δ2Δ4

Durch aufeinanderfolgende Verdauung von pTrp24 mit BgIII und EcoRI und anschließende PAGE sowie Elektroelution gelangt man zu einem Fragment, welches Codone für das LE'(d)-Polypeptid aufweist und über ein klebriges Ende BgIII sowie ein klebriges Ende EcoRI anschließend an das Codierungsende in Stellung 3* verfügt. Das LE¹(d)-Fragment kann in die Stelle BgIII des Plasmids pSom7A2 geklont werden, wodurch sich ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein ergibt, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotors/ Operators ausgedruckt wird. Hierzu braucht man (1) eine, teilweise EcoRI-Verdauung von pSom7A2 zur Abspaltung der EcoRI-Stelle, die distal zum Tryptophan-Promotor/Operator angeordnet ist, und (2) eine geeignete Auswahl der Primersequenz für eine saubere Beibehaltung des Codonleserahmens und zur Wiederbildung einer Spaltstelle EcoRI.

Zu diesem Zweck verdünnt man 16 pg Plasmid pSom7A2 in 200 μΐ eines Puffers aus 20 mMol Tris,pH 7,5, 5 mMol MgCl₂, 0,02 NP40 Detergens und 100 mMol NaCl und behandelt das Ganze mit 0,5 Einheiten EcoRI. Nach 15 Minuten langer Umsetzung bei 37°C wird das Reaktionsgemisch mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann mit BgIII verdaut. Das erhaltene größere Fragment wird durch das PAGE-Verfahren und durch anschließende Elektroelution isoliert. Dieses Fragment enthält die Codone "LE¹(p)" für das proxima-Ie Ende des LE'-Polypeptids, nämlich für die Bausteine, die nach der Stelle BgIII folgen.Das Fragment wird dann an das

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obige LE'(d)-Fragment in Gegenwart von T₄-DNA-Ligase gebunden, wodurch man das Plasmid ρ3οΐη7Δ2Δ4 erhält, dessen Transformation zu Escherichia coli Stamm 294 eine wirksame Bildung eines Fusionsproteins aus dem völlig rekonstituierten LE-Polypeptid und Somatostatin unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotors/Operators ergibt.

F. Aufbau von linearer DNA mit einem Rest Pstl am Ende 3¹ und einem Rest BgIII am Ende 5' und einer Gen spezifizierenden Tetracyclinresistenz

Das Plasmid pBR322 wird mit Hindlll verdaut, und die herausragenden Enden Hindlll werden mit Sl-Nuclease verdaut. Die Verdauung mit Sl-Nuclease besteht in einer Behandlung von 10 ^g mit Hindlll gespaltenem pBR322 in 30 μΐ Sl-Puffer (0,3 M NaCl, 1 mMol ZnCl₂, 25 mMol Natriumacetat, pH 4,5) mittels 300 Einheiten Sl-Nuclease über eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 15°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 μΐ 30 χ Sl-Nuclease-Stopplösung (0,8 M Trisbase, 50 mMol EDTA) unterbrochen. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in der oben beschriebenen Weise mit EcoRI verdaut. Das erhaltene Fragment, zu dem man nach dem oben beschriebenen PAGE-Verfahren unter anschließender Elektroelution gelangt, enthält ein klebriges Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, dessen Codierungsstrang mit dem Nucleotid Thymidin beginnt. Der durch Sl verdaute Rest Hindlll, welcher mit Thymidin beginnt, kann an einen mit Klenow-Polymerase I behandelten Rest BgIII gebunden werden, um hierdurch nach erfolgter Ligation die Restriktionsstelle BgIXI wieder zu bilden.

Das nach Beispiel 13 C. hergestellte Plasmid pSOM7A2 wird daher mit BgIlI verdaut, und die erhaltenen klebrigen Enden BgIII werden durch Behandlung mit Klenow-Polymerase I Unter Verwendung aller vier Desoxynucleotidtriphosphate

23 3 8 4-8 5

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doppe!stranging gemacht. Die Spaltung des erhaltenen Produkts mittels EcoRI unter anschließender PAGE und Elektroelution des kleinen Fragments ergibt ein lineares Stück von DNA_r das den Tryptophan-Promotor/Operator enthält und die LE'-Proximalsequenz aufwärts von der Stelle BgIII ("LE¹(p)") codiert. Das Produkt hat ein Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, das von einer Füllung an der Stelle Bglll herrührt. Die Stelle Bglll wird jedoch durch Ligation des stumpfen Endes an das stumpfe Ende des obigen und mit Sl verdauten Fragments Hindlll wieder hergestellt. Auf diese Weise werden die beiden Fragmente in Gegenwart von T.-DNA-Ligase unter Bildung des rezirkularisierten Plasmids pHKYlO aneinander gebunden, das durch Transformation zu Zellstämmen 294 von Escherichia coli propagiert wird. Die tetracyclinresistenten Zellen, die das Rekombinätionsplasmid pHKYlO aufweisen, werden selektiert, und das Plasmid DNA wird extrahiert. Durch Verdauung mit Bglll und Pstl und anschließende Isolierung nach dem PAGE-Verfahren sowie Elektroelution des großen Fragments gelängt man zum gewünschten linearen Stück der DNA, welches klebrige Enden Pstl und Bglll aufweist. Das auf diese Weise aus pHKYlO gebildete DNA-Fragment enthält den Ursprung an Replikation und eignet sich daher als Komponente beim Aufbau von Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1,bei welchem sowohl die für das trp LE'-Polypeptidfusionsprotein codierenden Gene als auch die Tetracyclinresistenz vom trp-Promotor/Operator gesteuert werden.

G. Aufbau von linearer DNA mit dem trp-Promotor/Operator

Das nach Beispiel 13E. hergestellte Plasmid pSOM7A2A4 unterzieht man einer teilweisen Verdauung durch EcoRI und einer anschließenden Verdauung durch Pstl. Das entstehende Fragment enthält den trp-Promotor/Operator und wird durch das PAGE-Verfahren unter anschließender Elektroelu-

23 3 8 48 5

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tion isoliert. Eine teilweise Verdauung durch EcoRI ist zur Bildung eines Fragments erforderlich, das am Ende in Stellung 5' des Somatostatingens gespalten wird, jedoch nicht gespalten wird an der Stelle EcoRI zwischen dem ampicillinresistenten Gen und dem trp-Promotor/Operator. Die durch das Pstl, welches in das ampicillinresistente Gen aufgeschnitten worden ist, verlorengegangene Ampicillinresistenz läßt sich wieder herstellen, indem man mit dem fertigen pHKYlO lineares DNA-Derivat, welches nach obigem Beispiel 13 F.gebildet worden ist, bindet.

H. Isolierung des Strukturgens für die Insulin-A-Kette

bas Strukturgen für die Insulin-A-Kette erhält man durch die EcoRI und BamHI-Verdauung von Plasmid pIAl, dessen Aufbau in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979) beschrieben ist. Das gewünschte Fragment wird durch das PAGE-Verfahren sowie durch Elektroelution gereinigt und verfügt über die Enden EcoRI und BamHI.

I. Ligation des Strukturgens für die Insulin-A-Kette durch den trp-Promotor/Operator und des pHKYlO linearen DNA-Fragments mit den Enden Pstl und BgIlI.

Das Strukturgen für die Insulin-A-Kette, nämlich das lineare DNA-Fragment, welches den trp-Promotor/Operator enthält (hergestellt gemäß Beispiel 13G.) und das pHKYlO lineare DNA-Fragment (hergestellt nach Beispiel 13F.) bindet man in geeigneter Orientierung, wie dies aus Fig. 3 hervorgeht, aneinander, wodurch sich das gewünschte Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ ergibt. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ kann infolge der Wiederherstellung der Ampicillinresistenz und der Tetracyclinresistenz ohne weiteres selektiert werden.

233 8 48 5

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Beispiel 14

Aufbau von Rekombinationsplasmid pPRl

Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ enthält eine einzige Restriktionsstelle BamHI, die die Insertion des das XcI und λrex enthaltenden 2,5 Kb BgIII-Fragments des Bakteriophagen λ enthält. Dies läßt sich praktisch nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erreichen. Das gewünschte Plasmid pPRl wird daher durch Ligation des Fragments XBglll in die Stelle BamHI von ρΙΑ7Δ4Δ1 gebildet.

B e i s ρ i e 1 15

Transformation von Rekombinationsplasmid pPRl zu Escherichiä coli K12 CeOOR _1--M₁,- '

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man die Zellen von Escherichiä coli mit der nach Beispiel 14 hergestellen DNA transformiert, und nicht mit der nach Beispiel 1 erhaltenen DNA. Die Transformanten werden als Escherichiä coli Kl2 C600Rj-M.-/pPRl bezeichnet, entsprechend selektiert und gezüchtet. Die erhaltenen Kolonien werden bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Isolierung und Amplifizierurig des Plasmids pPRl verwendet. Durch Restriktionsenzymanalyse des Plasmids pPRl ergibt sich,daß nicht das Gen XcI, sondern das Gen Xrex am nächsten liegt zum Gen der trp E-Insulin-A-Kette. Plasmide mit der umgekehrten Orientierung lassen sich bei den oben produzierten Transformanten nicht finden.

233 8

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Beispie 116

Amplifizierung* Isolierung und nachfolgende Transformierung von Plasmid pPRl zu Escherichia coli K12 RV3Q8

Die Amplifizierung und Isolierung des Plasmids DNA von Escherichia coli K12 C600 R^-M^/pPR! wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die nachfolgende Transformierung des Plasmids pPRl zu Escherichia coli K12 RV308 wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wodurch man zu dem gewünschten Transformanten Escherichia coli K12 RV308/pPRl gelangt.

Beispiel 17

Aufbau von Escherichia coli K12 RV308\cl90/pPRl durch Lysogenisierung mit XcI90

Der gewünschte Aufbau wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Durch entsprechende Untersuchung der erhaltenen Kolonien von Escherichia coli K12 RV308XcI90/pPRl kann man das Wachstum bei 32⁰C und die Sensitivität bei 42°C veranschaulichen.

B e i s ρ i e 1 18

Transformierung von Rekombinationsplasmid pPRl zu Escherichia coli K12 C600

Der gewünschte Aufbau wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die überlebenden Kolonien lassen sich hinsichtlich der erwarteten Phenotypen untersuchen und bilden die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600/pPRl.

23 3 8 48 5 Beispiel 19

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Aufbau von Escherichia coil K12 C600Xcl9Ö/pPRl durch Lysogenisierung mit Xcl90 -.· .'

Der gewünschte Aufbau wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coli Kl2 C600XcI90/pPRl lassen sich untersuchen, um auf diese Weise das Wachstum bei 32⁰C und die Sensitivität bei 42⁰C zu verfolgen.

B e i s ρ i e 1 20

Aufbau von Escherichia coli K12 C6Ö0Rj-M_k-XcI90/pPRl durch Lysogenisierung mit XcI90

Der gewünschte Aufbau wird durch Herstellung von Escherichia coli K12 C600R_k-Mj-/pPRl nach dem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei man die erhaltenen Transformanten dann mit Bakteriophag XcI90 praktisch nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren lysogenisiert. Die überlebenden Kolonien werden bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und bilden den gewünschten Stamm.

Beispiel 21 Aufbau von Plasmid ΡΙΒ7Δ4Δ1

Das gewünschte Plasmid wird nach dem in Beispiel 13A.-I. beschriebenen Verfahren aufgebaut, mit der Ausnahme, daß bei der abschließenden Ligation das Strukturgen verwendet wird, welches die Insulin-B-Kette kennzeichnet, und nicht das Strukturgen für die Insulin-A-Kette. Das Strukturgen für die Insulin-B-Kette erhält man durch EcoRI-und BamHI-

23 3 8 48.. 5

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Verdauung von Plasmid pIBl, dessen Aufbau in Proc. Nat. Acad, Sei. 76, 106 bis 110 (1979) beschrieben wird. Das die Insulin-B-Kette codierende DNA-Fragment wird nach dem PAGE-Verfahren sowie durch Elektroelution gereinigt und verfügt über die Enden EcoRI und BamHI.

Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ist in Fig. 5 dargestellt und läßt sich infolge der Wiederherstellung der Ampicillinresistenz und der Tetracyclinresistenz ohne weiteres selektieren.

™ Beispiel 22

Aufbau von Rekombinationsplasmid pPR3

Die einmalige BamHI-RestriktionsstelIe im Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ erlaubt die Klonung des XcI- und Xrex-Gens, welches das 2,5 Kb BgI11-Fragment des Bakteriophagen λ enthält-, an das ρΙΒ7Δ4Δ1. Dies läßt sich im wesentlichen nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erreichen. Durch Ligation des XBglll-Fragments in die BamHI-Stelle von ρΙΑ7Δ4Δΐ gelangt man hierdurch zum gewünschten Plasmid pPR3.

Beispiel 23

Transformierung von Rekombinationsplasmid pPR3 zu Escherichia coli K12

Die Transformierung wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zellen von Escherichia coli mit der nach Beispiel 22 hergestellten DNA transformiert werden, und nicht mit der gemäß Beispiel 1 erzeugten DNA.

Die Transformanten werden als Escherichia coli Kl2 C600R,-M. -/pPR3 bezeichnet und entsprechend selektiert sowie gezüchtet. Die erhaltenen Kolonien werden bezüglich der. er-

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23 3 8 48 5

-48 -

warteten Phenotypen untersucht und zur Isolierung sowie Arnplifizsierung des Plasmids pPR3 verwendet. Durch Restriktionsenzymanalyse von Plasmid pPR3 ergibt sich, daß nicht das Gen XcI, sondern das Gen Xrex zum Gen trp E der Insulin-B-Kette am nächsten liegt. Plasmide mit umgekehrter Orientierung werden unter den obengebildeten Transformanten nicht gefunden.

B e i s ρ i e 1 24

Amplifizierung, Isolierung und anschließende Transformierung von Rekombinationsplasmid pPR3 zu Escherichia coli K12 RV308 '

Das Plasmid DNA von Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pPR3 wird im wesentlichen nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren amplifiziert und isoliert. Die nachfolgende Transformierung von Plasmid pPR3 zu Escherichia coli Kl2 RV308 unter Bildung von Escherichia coli ΚΓ2 RV308/pPR3 wird praktisch nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Be i s ρ i e 1 25

Transformation des Rekombinationsplasmids pPR3 zu Escherichia coli Kl2 C600 '.' : .

Die Transformation von pPR3 zu Escherichia coli K12 C600 unter Bildung von Escherichia coli K12 C600/pPR3 wird praktisch nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die überlebenden Kolonien lassen sich bezüglich der erwarteten Phenotypen untersuchen und bilden die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600/pPR3.

2338U 5 -«.

B e i s ρ i e 1 26

Aufbau von Escherichia coli K12 RV308äcl90/pPR3 durch Lysogenisierung mit Xcl90

Der gewünschte Aufbau wird durch Lysogenisierung von Escherichia coli Kl2 RV308/pPR3 mit Bakteriophag λel90 nach praktisch dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coli K12 RV308\cI90/pPR3 können entsprechend untersucht werden, um hierdurch das Wachstum bei 32⁰C und die Sensitivität bei 42⁰C zu verfolgen.

Beispiel 27

Aufbau von Escherichia coli K12 C600XcI90/pPR3 durch Lysogenisierung mit XcI90 .·....'- ,.;..· ' , ;

Der gewünschte Aufbau wird durch Lysogenisierung von Escherichia coli K12 C600/pPR3 mit Bakteriophag Xcl90 nach praktisch dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coli K12 C600XcI90/pPR3 lassen sich entsprechend untersuchen, um hierdurch das Wachstum bei 32⁰C und die Sensitivität bei 42⁰C zu verfolgen.

Beispiel 28

Aufbau von Escherichia coli Kl2 C600R_k-M_k~Xcl90/pPR3 durch Lysogenisierung mit XcI90

Der gewünschte Aufbau wird durch Herstellung von Escherichia coli K12 C600R_k-Mj-/pPR3 nach dem in Beispiel 21 beschriebenen Verfahren und durch anschließende Lysogenisierung der Transformanten mit Bakteriophag XcI90 praktisch

-IQP. Λ

233 8 48

- 50 -

nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Kolonien von Escherichia coli K12 C600R.-M,-

K K

XcI90/pPR3 werden entsprechend untersucht, um hierdurch das Wachstum bei 32⁰C und die Sensitivität bei 42°C zu verfolgen. · ..:.^:;^: " ; ν V '-, '. ' V '

Bei spie 1 29

Verfahren zur Bestimmung der Stabilitäten von Wirtszellen, die das Rekqmbinatiohsplasmid pPR3 enthalten, und zwar mit oder ohne Selektion :' ,

Die bezüglich der Plasmidretention zu untersuchenden Stämme hält man in logarithmischem Wachstum in nichtselektiven Medien (L-Brühe) durch periodische Subzüchtung in frischen Medien. Das Ausmaß der Plasmidretention wird nach dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren ermittelt.

Zu Beispielen für andere Stämme, die sich nach, den oben beschriebenen Verfahren aufbauen lassen, gehören folgende:

Beispiel-Nr. Name

30 Escherichia coli K12 RV308XcI857/pARl

31 Escherichia coil K12 C€00Xcl90/pARl

32 Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-Xcl90/pARl

33 Escherichia coli K12 C600/pARl

34 Escherichia coil K12 C600/pAR2

Die Stabilitäten der Rekombinationsplasmide werden nach den oben beschriebenen Beispielen 12 und 29 gemessen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse gehen in Prozentwerten für die Stämme Escherichia coli Kl2 RV308\cI90/pAR2 und Escherichia coli K12 RV308/pIA2 aus der folgenden Tabelle II und für die Stämme Escherichia coli K12 C600Rj-M,-XcI90/pPR3 und Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pPR3 aus der sich daran anschließenden Tabelle I'XI hervor.

TABELLE II

Stabilitäten von Rekombinationsplasmiden

Anzahl der Kultur doppelungen	Prozentuale Plasmidreten Escherichia coli K12 RV308XcI90/pAR2	tion Escherichia	coli Rl2 RV308/pIA2
9	100		100
14	100		36
23	100		22
32	83		13
40	82		9

Anzahl der Kulturdoppelungen

TABELLE III

Stabilitäten von Rekombxnationsplasmiden

Prozentuale Plasmidretention

Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-\cI90/pPR3

100 100 Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pPR3

100 0

23:3 8 4.8 5

- 53 -

Die in den Tabellen Ii und III angegebenen Ergebnisse zei¹-gen deutlich die Überlegenheit des selektiven Systems, ι " .

durch welches sich Rekombinationsplasmide in Bakterienpopulationen halten lassen. Etwa 78 % der Zellen in der Kultur von Escherichia coli K12 RV308/pIA2 sind plasmidminus nach 23 KuIturdoppeiungen-, während etwa 100 % der Kellen in der Kultur von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pPR3 plasmidminus sind nach 34 Kulturdoppelungen. Darüber hinaus ist nach 23 Kulturdoppelungen oder nach 34 Kulturdoppelungen keine der Zellen in den Kulturen von Escherichia coli K12 RV308XcI90/pAR2 und Escherichia coli K12 C600 R,-M,-XcI90/pPR3,deren selektives System sich an Ort und Stelle befand, plasmidminus. Nach weiterem extensivem Wachstum läßt sich eine geringe Plasmidsegregation sehen. Diese Ergebnisse reflektieren möglicherweise jedoch eine Rekombination zwischen dem Prophagen und dem Plasmid.

Die Plasmidstabilität im aufgebauten Stamm Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-Xcl857/pARl wird bestimmt, indem man den Stamm über Nacht in L-Brühe getrennt bei 42°C (restriktive Bedingungen) und bei-.32⁰C (zulässige Bedingungen) züchtet. Die Häufigkeit der Frequenz der Zellen von Plasmid ergibt sich aus dem Verhältnis der Kolonien bei 42⁰C und der Gesamtanzahl an Kolonien, die bei 32⁰C wachsen. Dieses Verhältnis wird in Form eines Prozentwerts ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigen, daß etwa 46 % der in der Kultur unter zulässigen Bedingungen gewachsenen Zellen, und somit unter nicht erfindungsgemäßen Bedingungen, plasmidminus sind, während keine der in der Kultur unter restriktiven und somit erfindungsgemäßen Bedingungen gewachsenen Zellen in diesem Züchtungsstadium plasmidminus sind. Dies zeigt klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine brauchbare und wirksame Möglichkeit bietet, um Rekombinationsplasmide in Bakterienpopulationen zu halten.

Claims (25)

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Stabilisierung und Selektierung von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man

a.) die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor transformiert, der sowohl ein Repressorgen als auch ein Gen enthält, welches ein funktionelles Poplypeptid ausdrückt, und

b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Präger enthält, welcher in den Wirtszellen letal oder konditionell letal ist, der aber in den transformierten Wirtszellen durch das in dem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthaltene Repressorgen repressiert wird,

mit der Maßgabe, daß der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Repliken und einen Promotor enthält, welche für den Repressor nicht sensitiv sind, und mit der weiteren Maßgabe, daß bei Lysogenisierung der transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der ein Gen enthält, welches konditionell letal ist, die erhaltenen Wirtszellen unter restriktiven Bedingungen kultiviert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1,dadurch gekennzeichnet, daß man als Gen, das ein funktionelles Polypeptid auspreßt, ein natürlich vorkommendes Gen, ein nicht natürlich vorkommendes Gen oder ein Gen verwendet, welches teilweise natürlich und teilweise synthetisch oder nichtnatürlich vorkommt.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, d a d u r c h gekennzeichnet , daß man als Gen, welches ein funktionelles Polypeptid ausdrückt, ein Gen verwendet, das codiert für Humaninsulin, Humanpräproinsulin, Humanproin-

233 84 8 5 -

55 -

sulin-A-Kette, Humaninsulin-B-Kette„ Nichthumaninsulin, Humanwachstumshormon, Nichthumanwachstumshormon, Humaninterferon/ Nichthumaninterferon, Viralantigen, Urokinase, irgendein Polypeptid oder irgendein Peptidhormon oder Enzym. ·. ' ' '. '" . · . ' · ' ' ' . ": ' '.:· '

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3,dadurch gekennze i c h η e t ., daß man als Repressorgen einen chromosomalen DNA-Replikationsmutationsrepressor, ZeIlwandsynthesemutationsrepressor, Ribosommutationsrepressor, RNA-PoJ. ymerasemutationsrepressor, tRNA-Mutationsrepressor, Aminoacyl-tRNA-Synthetasemutationsrepressdr, Zeilteilungsmutationsrepressor oder einen widersinnigen Mutationsrepressor verwendet.

5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, d a du rc h g e k e η nz eic hn e t , daß man als Repressorgen CI das Gen cI857 verwendet.

6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein temperaturempfindliches Repressorgen verwendet, welches bei oder oberhalb einer Temperatur innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs inaktiviert wird.

7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Temperaturbereich zwischen 38 und 44⁰C liegt.

8.4

- 56 -

durch ge ken η ζ e i c h η et , daß man als Repressorgen das Gen Xcro von Bakteriophag λ verwendet.

8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Repressorgen ein Repressorgen el von Bakteriophag λ verwendet.

9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, da-

10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als rekombinierenden DNA-Klönierungsvektor ein Plasmid verwendet.

11. Verfahren nach Punkt 10, d a d u r c h g e -

k e η η ζ e i c h net ,daß man als Plasmid pAR2 verwendet.

12. Verfahren nach Punkt 10, d ä d u r c h g e -

k en η zeich η e t , daß man als Plasmid pARl verwendet.

13. Verfahren nach Punkt 10, d a d u r c h ge -

k en η ζ e ic h η e t , daß man als rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor Plasmid pPRl verwendet.

14. Verfahren nach Punkt 10, dadurch ge-

k e η η ζ e i c h η e t > daß man als rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor Plasmid pPR3 verwendet.

15. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man einen lysogenen Organismus verwendet, der ein bakteriophages Gen XcI enthält.

16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch ge-

k en η ζ e i c h η e t _r daß man als lysogenen Organismus das Bakteriophag XcI90 verwendet.

17. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als lysogenen Organismus das Bakteriophag Xcl857 verwendet.

r. nci 40 P Ί * i-V7 Λ Ö 3 Li

233 8Λ8 5-

57 -

18. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man Wirtszellen von Prokaryotes verwendet.

19. Verfahren nach Puntk 18,, d a d u r c h gekennzeichnet, daß man Wirtszellen von Bakterien verwendet.

20. Verfahren nach Punkt 19, d a d u r c h g e -

k en η ζ e i c h η e t , daß man als Bakterien Escherichia coli, Escherichia coli K12, Escherichia coli K12 RV308, Escherichia coli K12 C600, Escherichia coli K12 C600R.-M.-, Bacillus,Bacillus subtilis, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomycetes, Streptomyces, Serratia, Pseudomonas oder Agrobacterium verwendet.

21. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 17, dadurch ge k e η η zeichne t , daß man als Wirtszellen freilebende Eukaryotes verwendet, die einer Züchtung zugänglich sind.

22. Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e -

k e η η ze i c h η e t ,daß man als Wirtszellen Pilze verwendet.

23.38.48 5 -se-

23. Verfahren nach Punkt 22, dadurch gekennzeichnet , daß man als Pilze Neurospora, Cephalosporium, Aspergillus, Penicillium oder Hefe verwen-

24. Verfahren nach Punkt 21, dadurch gekennzeichnet , daß man Wirtszellen verwendet, die vom Gewebe eines multizellularen Organismus stammen und einer Züchtung zugänglich sind.

f. n Π

25, Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e ken η ζ e i c h η et, daß man als rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor ein Bakteriophag verwendet.

Hierzu_3_Seiten Zeichnungen