DD204494A5 - Verfahren zum schneiden doppelstraengiger dns - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schneiden doppelstraengiger DNS. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle a) die doppelstraengige DNS in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzelstraengige DNS umgewandelt wird; b) an die in Schritt a) gebildete Einzelstrangregion ein komplementaeres Primerstueck von einzelstraengiger DNS hybridisiert wird, wobei das 5'- Ende des Primers gegenueber demjenigen Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt; c) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3'-Richtung des Primers liegt, und zwar durch eine Reaktion mit DNS-Polymerase in Anwesenheit von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-enthaltenden Desoxynukleotidtriphosphaten; und d) das verbleibende DNS-Einzelstrangstueck, das ueber die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird.

Description

Verfahren sum Schneiden doppelsträngiger DHS Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DHS.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Mit dem Aufkommen der DUS-Rekombinations-Teehnologie ist die kontrollierte bakterielle Produktion einer enormen Vielfalt nützlicher Polypeptide möglich geworden« Man hat bereits Bakterien in der Hand, die durch diese Technologie verändert wurden, um die Produktion derartiger.Polypeptid-Produkte zu ermöglichen, z. B. Somatostatin (K. Itakura, et al., Science 198, 1056 (1977)), die jeweils einzelnen A-> und B-Ketten des menschlichen Insulins (D..7· Goeddel, et al., Proc. Hat«l Acad. Sei., USA 76, 106 (1979)), and menschliches Wachstumshormon (D, V« Goeddel, et al., lature 281, 544 (1979))· Kürzlich wurde die DHS-Rekombinations-Technik dazu verwendet, um die bakterielle Herstellung von Thymosin aC 1 zu ermöglichen, einer immunverstärkenden Substanz, die in der Thvmusdrüse gebildet wird (US-Patentanmeldung von Eoberto Grea und Ronald Wetzel vom 28. Februar 1980, übertragen auf die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung). Die Möglichkeiten dieser Technologie sind derartig durchschlagend, daß so gut wie jedes, nützliche Polypeptid bakteriell hergestellt werden kann und die kontrollierte Herstellung von Hormonen, Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen gegen eine große Vielfalt von Krankheiten in Reichweite gebracht wird* Die zitierten Veröffentlichungen, die im Detail die oben genannten repräsentativen Beispiele beschreiben, sowie weitere, im folgenden genannte Veröffentlichungen, welche den Hintergrund der Erfindung bilden, sind durch

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Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.

Das Arbeitspferd der DHS-Rekombinations-Technologie ist das Plasmid, ein nichtchromosomaler Ring doppelsträngiger DHS, der in Bakterien gefunden wird und oft in vielfacher Kopie pro Bakterienzelle vorliegt. Die DlS des Plasmids enthält eine Information, die benötigt wird, um das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren Cd. h» ein "Replikon") und normalerweise ein oder mehr Selektions-Charakteristika, wie z« B, Resistenz gegen Antibiotika, die es erlauben, diejenigen Clone der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und bevorzugt in selektivem Medium wachsen zu lassen· Der Hutζen der bakteriellen Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder andere Sestriktionsendonuklease oder ⁿRestriktionsenzym^H spezifisch geschnitten werden können, von denen jedes eine andere Stelle auf der Plasmid-DITS erkennt» Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingefügt werden, wobei entweder die Enden der Schnittstellen oder unmittelbar an die Schnittstellen angefügte Enden miteinander verbunden werden· Im folgenden wird der Terminus "heterolog" für ein Gen verwendet, das normalerweise nicht in E. coil gefunden wird oder eine Polypeptidsequenz, die normalerweise nicht durch E. coli hergestellt wird· Der Terminus "homolog" wird für ein Gen oder Polypeptid verwendet,, das in Wildtyp E, coli hergestellt wird». Die DIS-Rekombination wird außerhalb der Bakterie durchgeführt* Das resultierende "rekombinante" Plasmid kann durch ein Verfahren, das als Transformation bekannt ist, in Bakterien eingeführt werden, und man erhält große Mengen des rekombinanten Plasmids, das das heterologe Gen enthält, indem man die Transformanten wachsen läßt. Wenn das Gen im Hinblick auf Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der codierten DHS-Information regeln, richtig eingefügt

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ist, kann der resultierende .Expressionsvektor dazu verendet werden, tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das inserierte Gen codiert, ein Prozeß, der Expression genannt wird.

Die Expression wird in einer Gegend initiiert, die als Promoter bekannt, ist, der von der RHA-Polymerase erkannt wird und an den diese bindet. In einigen fällen, wie z* B„ beim trp-Operon,.das im nachfolgenden noch ausführlich diskutiert werden wird, werden Promoterregionen von "Operator»-Hegionen überlappt, wodurch ein kombinierter Promoter-Operator gebildet wird· Operatoren sind DUS-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Häufigkeit der Initiation der Iranskription an einem speziellen Promoter zu regulieren· Die Polymerase arbeitet sich an der DUS entlang, wobei sie die. in dem codierenden Strang enthaltene Information vom 5'- zum 3'-Ende in Messenger-RUA (mRUA) transkribiert, die ihrerseits wieder in ein Polypeptid translatiert wird, das die Aminosäuresequenz aufweist, für die die DUS codiert. Jede Aminosäure wird durch ein einziges Uukleotidtriplet oder "Codon¹* codiert, das innerhalb eines "Strukturgens" liegt, wie man es für die vorliegenden Zwecke nennen mag, d· h· in dem Teil, der für die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts codiert. Uach dem Binden an den Promoter transkribiert die EUA-Polymerase vorerst Uukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle codieren, sodann.ein Initiations- oder "Start"-signal (normalerweise ATG, das in der resultierenden mRUA zu AUG wird) und schließlich die lukleotidcodons innerhalb des Strukturgens selbst» Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, wonach die,Polymeras.e eine zusätzliche Sequenz, von mEUA bilden kann, die, aufgrund der Anwesenheit des Stopsignals, von

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den Ribosomen nicht mehr translatiert wird« Ribosomen binden an die auf der aRBA zur Verfügung gestellten Bindestelle, bei Bakterien normalerweise wenn, die mRHA gebildet wird, und stellen selbst das codierte Polypeptid her, wobei sie am Translations-Startsignal beginnen und an dem oben erwähnten Stopsignal enden· Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die für die Hibosomen-Bindesteile codieren, im Hinblick auf das AUG-Initiatorcodon richtig liegen und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen· Das resultierende Produkt kann erhalten werden, indem man die Wirtszelle lysiert und das Produkt durch geeignete Reinigungsschritte von anderen bakteriellen Proteinen trennt.

Die durch die Anwendung der DliS-Rekombinations-Technik esprimierten Polypeptide können Tollkommen heterolog sein, wie im Falle der direktion Expression des menschlichen Wachstumshormons, können aber auch andererseits ein heterologes Polypeptid enthalten, das zumindest mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Peptids verbunden ist, wie im.Fall der Herstellung von Zwischenprodukten für Somatostatin und die Bestandteile des menschlichen Insulins. Im letzteren Fall enthält beispielsweise das angefügte homologe Polypeptid einen Teil der Aminosäuresequenz für ß-Galactosidase. In diesen Fällen ist das angestrebte bioaktive Produkt durch das angefügte homologe Polypeptid so lange bioinaktiv, bis dieses durch extrazelluläre Maßnahmen abgeschnitten wird« Die ebengenannten "Fusionsproteine" können so hergestellt werden, daß ein hochspezifisches Schneiden des "Vorlauf erproteins von dem. -angsstrabten Produkt, ermöglicht ist,, beispielsweise durch die Einwirkung von Bromcyan auf Methionin oder aber durch ensymatisches Schneiden; siehe auch GB-PS Nr. 2 007 676 A.

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Wenn die DHS-iiekombinations-Technologie ihr Versprechen voll halten soll, müssen Systeme erdacht werden, die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das angestrebte Polypeptid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann· Die ß-lactamase- und Lactose-Promoter-Operator-Systeme, die in der Vergangenheit üblicherweise verwendet wurden, haben, obwohl sie gut zu verwenden sind, vom Standpunkt der Menge her die Kapazität der (Technologie nicht voll ausgenutzt» Es besteht ein Bedürfnis für einen bakteriellen Expressionsvektor, der fähig ist, das gewünschte Polypeptid-produkt in größerer Menge kontrolliert zu exprimieren·

Tryptophan ist eine Aminosäure, die von Bakterien als Bestandteil eines homologen Polypeptide verwendet wird und in einem Biosyntheaeweg hergestellt wird, der folgende Schritte enthält; Chorisminsäure 5> Anthranilsäure —^ Phosphoribosy 1-

anthranilsäure ?ÖDRP (Enoi-1-(o-Carbosyphenylamino)-1-

desosy-D-Hibulose-5-Phosphat) > Indol-3-Glycerinphosphat

und letztlich Tryptophan selbst« Die enzymatischen Reaktionen dieses Synthesewegs werden durch Produkte des Tryptophan- oder "trp^M-0perons katalysiert, einem polycistronischen DHS-Segment,. das unter der Kontrolle des trp-ProiaoterOpera tor-Sy st ems transkribiert wird.. Die resultierende ρ ο Iycistronische mRHA codiert die sogenannte trp-Pührer- (im folgenden "Leaderⁿ- genannte) Sequenz und dann, der Reihe nach, die Polypeptide, genannt trpS, trpD, trpC, trpB und trpA» Diese Polypeptide katalysieren und kontrollieren auf verschiedene Weise einzelne Schritte des Synthesewegs ausgehend Ton der Chorismimsäure bis -ztm. lir

fS-Idtyp. E, coli ist da.s_: iT^tophan-^ trolle mindestens dreier, deutlich zu unterscheidender Arten*

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Im ersten-Pall, einer Promoter-Operator-Repression, handelt das (Tryptophan als Corepressor und bindet an seinen Aporepressor, um einen aktiven Repressorkomplex zu bilden, der seinerseits an den Operator bindet, wodurch das Tryptophan seinen eigenen Syntheseweg vollkommen verschließt. Zweitens bindet (Tryptophan in einem Prozeß von Rückkopplungshemmung an einen Komplex der trpE- und trpD-Polypeptide und verhindert dadurch deren Beteiligung an'dem·.Syntheseweg» Letztlich wird eine Kontrolle ausgeübt durch einen Prozeß, der als "Attenuierung" bekannt ist* Dieser Vorgang-laufΐ unter der Kontrolle einer "Attenuator-Region" des Gens ab,.einer Region, die innerhalb der trp-Leader-Sequenz liegt. Die Attenuierung ist ein Vorgang, der phänotypisch als eine Art Verdünnung des Tryptophane in der Zelle in Erscheinung tritt (siehe dazu allgemein 6· P· Miozzari et al., J, Bacteriology 133, 1457 (1978); The Operon 263-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978); Miller und Reznikoff, eds,· P. Lee et al,, Proc Hat'l Acad Sei, USA 74, 4365 (1977) und K. Bertrand et al., J. Mol, Biol. 103, 319 (1976)). Das Ausmaß der Attenuierung scheint durch die intrazelluläre Konzentration des Tryptophane geregelt zu werden, und in Wildtyp E. coli beendet der Attenuator die Expression in ungefähr neun von zehn Fällen, möglicherweise durch die Bildung einer Sekundärstruktxtr, eines "Terminationsrings" in der mRlA, welcher die RSA-Polymerase dazu veranlaßt, sich verfr&ht von der DUS zu lösen«

Andere Autoren haben das trp-Operon dazu verwendet, um bis zu einem gewissen Grad hsterologe Polypeptide zu ssprlinieren· Mit diesen Arbeiten hat man sich versuchsweise mit Problemen der Repression und Attenuierung befaßt, wobei . Indolacrylsäure zugegeben wird, ein Induktor und Analogon,

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das mit Tryptophan um das trp-Repressor-Molekül konkurriert, wobei durch kompetitive Hemmung auf Derepression abgezielt wurde. Gleichzeitig verringert der Induktor durch .Hemmung der ensymatisehen Umwandlung von Indo1 zu Tryptophan die Attenuierung und bewirkt dadurch, daß der Zelle Tryptophan entzogen wird· Als Ergebnis davon lesen mehr Polymerasen erfolgreich über den Attenuator hinweg. Tom Standpunkt der vollständig durchgehenden Translation und der angestrebten großen Mengen erscheint dieser Yersuch jedoch problematisch, da die Tryptophan-enthaltenden Proteinsequenzen während der Synthese infolge des Mangels von nutzbaren Tryptophan vorzeitig beendet werden· Tatsächlich ist bei diesem Yersuch eine wirkungsvolle Unterstützung der Attenuierung vollständig von einer strengen Tryptophan-Aushungerung abhängig·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zum Schneiden doppelsträngiger DUS·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Systeme aufzufinden»' die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das gewünschte Polypeptid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann» und insbesondere einen bakteriellen Expressionsvektor aufzufinden, der fähig ist, das gewünschte Polypeptid-Produkt in größerer Menge kontrolliert zu es:primieren.

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Es. wird ein Polypeptid-Produkt durch, die Expression in Bakterien eines für dieses codierenden Gens in der Weise hergestellt, daß

a) eine bakterielle Kultur geschaffen wird, die mit einem sicii replizierenden, von einem Plasmid abgeleiteten Expressionsvektor transformiert wurde, welcher eine Sequenz doppelsträngiger DUS enthält, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3'-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Elemente aufweist:

(i) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-System, (ii) Sukleotide,- die für eine Ribosomen-Bindestelle.

für die Translation des Elements (iv) codieren, (iii) lukleotide, die für ein Translations-Startsignal

für die Translation des Elements (iv) codieren, und (iv) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz

eines heterologen Polypeptids codiert, wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Fähigkeit noch, lukleotide aufweist, die für die trpE-Ribosomen—Bindestelle codieren;

b) die transformierte Bakterienkultur in ein Pormentationsgefäß überführt und diese Kultur bis zu einer vorgegebenen Dichte in einem geeigneten Sährmedium gezüchtet wird, welches zusätzliches Tryptophan enthält, und zwar in ausreichender Menge, um das genannte Promoter-Operator-System zu reprimieren; und

c) den genannten Bakterien das zusätzliche Tryptophan entzogen wird, um das genannte System zu dereprimieren und die Expression des Produkts, für welches das genannte Strukturgen codiert, anlaufen zu lassen.

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Das Verfahren kann dabei in der Weise durchgeführt werden, daß das durch das genannte Strukturgen exprimierte Polypeptid vollständig heterolog ist;

das. exprimierte Polypeptid ein Fusionsprotein ist, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist; der genannte Heil ein !eil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Choriominsäure zum Tryptophan beteiligt ist; .

das heterologe Polypeptid ein bioaktives Polypeptid und das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist;

das homologe Polypeptid dem trpE-Polypeptid ist und die genannte Ribosomen-Bindesteile diejenige für das trp-Leader-Polypeptid ist oder daß das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist·

Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das homologe Polypeptid selbst eine !Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Aminosäuren des trp-Leader-Polypep« tids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird»

Der Trypthophan-Entzug wird dadurch bewirkt, daß die Zugabe des zusätzlichen Tryptophans beendet und das Formentationsmedium, in dem die Bakterienkultur zuerst gewachsen ist, verdünnt wird·

In dem Verfahren wird als Wirtsbakterium E. coli angewendet.

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Beschrieben wird weiterhin ein von einem Piasmid abgeleiteter E:xpressionsvektor zum Herstellen.eines heterologen PoIypeptid-Produkts in E„ coli-Bakterien. Der Vektor enthälteine Sequenz doppeIsträngiger DlS, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3*-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Element aufweist:

a) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-Systemj

b) Hukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation des Elements (iv) codieren;

c) Hukleotide, die für ein Translations-Startsignal für die Translation des Elements (iv) codieren; und

d) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptide codiert,

wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Fähigkeit noch Sukleotide aufweist, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren.

Dabei ist das durch das genannte Strukturgen exprimierte Polypeptid vollständig heterolog oder das exprimierte Polypeptid ist ein Pusionsprotein, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der .Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist, wobei der genannte Teil ein Teil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Chroiaminsäure zum Tryptophan beteiligt ist»

Weiterhin ist es möglich,: daß das heterologe Polypeptid ein bioaktives Polypeptid und das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist.

Insbesondere ist der Yektor derart zusammengesetzt, daß das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist und die genannte

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R ibo so men-Bind estelle diejenige für das trp-Leader-Polypeptid istj .......

das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist; das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das homologe Polypeptid selbst eine Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Amino-· säuren des trp-Leader-Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird·

Weiterhin wird ein Yerfahren zur Schaffung eines Expressionsplasmids für die Expression eines heterologen Gens beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß in Phase die folgenden Elemente gleichzeitig verknüpft werden:

a) ein erstes lineares doppeIsträngiges DUS-Fragment, das ein Repliken enthält und ein Gen, das eine selektierbare Eigenschaft exprimiert, wenn es unter die Steuerung eines bakteriellen Promoters gestellt wird, wobei das Fragment keinen derartigen Promoter aufweist;

b) ein zweites lineares doppelsträngiges DHS-Fragment, das das genannte heterologe Gen aufweist; und

c) ein drittes doppelsträngiges DHS-Fragment, das einen bakteriellen Promoter aufweist,

wobei die verknüpfbaren Enden der genannten Fragmente so gestaltet sind, daß nach dem Verknüpfen zum Bilden eines sich replizierenden Plasmids sowohl das Gen für die selektierbare Eigenschaft, als auch das heterologe Gen unter die Steuerung des Promoters kommen, wodurch die Verwendung der selektierbaren Eigenschaft bei der Selektion von transformierten

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Bakterienkolonien möglich ist, welche zur Expression der heterologen Gene fähig sind.

Die selektierbare Eigenschaft kann eine Antibiotikumresistenz sein·

Die selektierbare Eigenschaft kann eine Tetracyclin-Resistenz sein und der bakterielle Promoter~der~trp-Promoter·

Das Verfahren wird in vorteilhafter Weise so ausgeführt, daß die Verknüpfung ebenso ein Operon für die Expression von »Amp ic ill in—Resistenz wiederherstellt.

Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DUS. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle

a) die doppelsträngige DlS in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzelsträngige DHS umgewandelt wird;

b) an die in Schritt a) gebildete Einzelstrangregion ein komplementäres Primerstück von einzelsträngiger DHS hybridisiert wird, wobei das 5'-Ende des Primers gegenüber demjenigen Hukleotid liegt, das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt;

c) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3'-Richtung des Primers liegt, und zwar durch eine Reaktion mit DUS-PoIymerase in .Anwesenheit von Adenin-, ühymin-, Guanin- und Gytosin-enthaltenden Desoxynokleotidtriphosphaten; und

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d) das verbleibende DliS-Einzelstrangstück, das über die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird.

Erfindungsgemäß werden die Schritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt durch Reaktion mit einer DHS-Polymerase, die in

5¹ >3^f-Richtung polymerisiert, die Exonukleasewirkung in

3' ——>5'-Richtung aufweist, jedoch keine Uukleasewirkung in 5» —-^3'-Richtung-ze igt.

Vorteilhaft ist die Polymerase, die Klenow-Polymerase I ist.

Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn das heterologe Polypeptid ein wiedergewinnbares Polypeptid ist, das aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt wird, die menschliches Wachstumshormon, menschliches Proinsulin, Somatostatin, Ihymosin «£1, die Α-Kette des menschlichen Insulins sowie die B-Kette des menschlichen Insulins enthält.

Ebenso ist der Vektor besonders vorteilhaft, wenn er ein . heterogenes Polypeptid der oben beschriebenen Art enthält«

Mit döÄ/vör^Iegeliden^Erf indung werden- für das -Herstellen* von* he terologen Polypeptid- Produkt en in Bakterien,, neue, von Pias-" miden abgeleitete Expressionsvektoren zur Verfugung gestellt« Die Vektoren haben eine Sequenz von doppelsträngiger DHS, die in Phase von einem ersten 5*- zu einem zweiten 3^f-Ende des codierenden Strangs folgende Bestandteile enthält: einen trp-Promoter-Operator, lukleotide,, die für die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle codieren und Uukleotide, die für die Translationsinitiation zur Expression eines Strukturgens codieren, welches £ür,_: die_:._: Am^0S,äur.ese.quenz. e.ine_;is, he.t-erjo.log^n. P^oi.y^ep^, tids codiert. Diese beschriebene· ⁽DH%Seqü€nzr enthält weder·

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eine trp-Attenuator-Kegion noch lukleotide, die für die trpE-Eibosomen-Bindestelle codieren. Stattdessen wird die trp-Leader-Hibosomen-Bindestelle wirkungsvoll dazu verwendet, die Expression von Information zu bewirken, die durch inserierte Gene codiert wird·

Mit einem, einen trp-Promoter-Operator enthaltenden, erfindungsgemäßen Plasmid, das keinen Attenuator aufweist, werden Zellen transformiert und in Gegenwart von zugegebenem Tryptophan kultiviert. Mit der Verwendung von Tryptophan-reichem Medium steht ausreichend Tryptophan zur Verfügung, um im wesentlichen vollständig den tro-Promoter-Operator durch trp-Repressorinteraktionen zu reprimieren, so daß das Zellwachstum, ungehemmt durch vorzeitige Expression großer Mengen von heterologen Polypeptiden, fortschreiten kann, wobei dieses Polypeptid durch eine Insertion codiert wird, die ansonsten unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems steht. Sobald einerseits die.Kultur der Rekombinanten zu einer Dichte angewachsen ist, die für eine industrielle Herstellung des Polypeptide geeignet ist und andererseits das von außen zugeführte Tryptophan entfernt wurde, läßt man die Zellen lediglich mit dem Tryptophan wachsen, das sie selbst produzieren· Das Ergebnis ist eine schwache Tryptophanlimitierung, wodurch folglich der Syntheseweg dereprimiert wird und eine überaus wirksame Expression der heterologen Insertion auftritt, unbehindert durch Attenuierung, da die Attenuator-Region aus dem System entfernt wurde« Auf diese Weise wird den Zellen niemals ernstlich Tryptophan entzogen, und alle Proteine, ob sie Tryptophan enthalten oder nicht, können in einem ausreichendem Umfang produziert werden.

Es worden'Mittel zur Verfügung gestellt, um; doppeIsträngige DHS an jeder beliebigen, gewünschten Stelle zu schneiden,

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auch wenn eine Erkennungsstelle für ein Restruktionsenzym fehlt, eine Technik, die unter anderem für das Herstellen eines trp-Operons brauchbar ist, welches Attenuator-Deletionen aufweist, die sich von denjenigen unterscheiden, die man früher durch Selektion von Mutanten erhalten hat.

Schließlich werden eine Vielzahl von brauchbaren Zwischenprodukten und Endprodukten.zur Verfügung gestellt, einschließlich spezifisch spaltbarer, heterolog-homologer Fusionsproteine, die unter Expressionsbedingungen gegen Abbau stabil sind.

Auaführungsbe isp iel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. In der beiliegenden Zeichnung zeigen:

Fig. 1 und 2: das Schema einer bevorzugten Ausführung der

Bildung eines Plasmids, das fähig ist, heterolöge Gene als Fusionen mit einem Teil des trpD-Polypeptide zu. esprimieren, von dem sie später abgespalten werden können;

Fig« 3: das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homologCtrpD¹)-heteroIoge (Somatostatin oder Thymosin <*fi) Fusionsproteine enthält;

Fig« 4 bis 6: aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Schema für die Herstellung eines Plasmids, das fähig ist, direkt unter der Kontrolle eines trp-Promoter-Operator-Systems ein heterologes Gen (menschliches Wachstumshormon) zu. exprimieren;

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Pig. 7: das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das menschliches Wachstumshormon enthält, welches direkt unter der Kontrolle des trp-Promoter-Opera tor- Syst ems exprimier-t wurde;

Fig. 8, 9a, 9b

und Pig. 10: aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Schema für die Herstellung eines Plasmids, das fähig ist» heterologe Gene !in dem dargestellten Pail für Somatostatin) fusioniert mit einem Teil des trpE-Polypeptids zu exprimieren, wobei die Fusion später gespalten werden kann;

Pig« 11: das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homolog(trpE)-heterologe Ptisionsproteine zum Herstellen von Somatostatin bzw· Thymosin ^ 1, menschlichem Pro insulin und der A- und B-Ketten des menschlichen Insulins enthält;

Fig. 12 und 13: aufeinanderfolgende Stufen der Art und

Weise, auf welche das Plasmid, das durch . die Schemata der Pig. 8 bis einschließlich 10 konstruiert wurde, manipuliert wird, um ein System zu bilden, in dem andere heterologe Gene als Fusion mit trpE-Polypeptidsequenzen austauschbar exprimiert werden können«

In den Fig. werden aus Gründen der Klarheit der Darstellung in den meisten Fällen nur der codierende Strang des doppel-

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strängigen Plasmids und lineare DHS-Stränge gezeichnet, Gene, die für die Resistenz gegen ein Antibiotikum codieren, wer-

E R

den als ap (Ampicillin-Eesistenz) und te (Tetracyclin-

Eesistenz) bezeichnet. Die Bezeichnung te bedeutet ein Gen für Tetracyclin-Sesistenz, das nicht unter der Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems steht, so daß Plasmide, die dieses Gen enthalten, dennoch Tetracyclin-sensitiv sind»

S Die Bezeichnung ap bezeichnet eine Ampicillin-Sensitivität, die durch die Deletion eines Teils des Gens entstanden ist, das für Ampicillin-Sensitivität codiert. Promotoren und Operatoren des Plasmids werden mit ρ und ο bezeichnet. Die Buchstaben A, T, G bzw. C bezeichnen die Sukleotide, die die Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin enthalten· Weitere Legenden der Piguren werden aus dem Test ersichtlich«

Eine im folgenden beschriebene, bevorzugte Ausführungsform der Erfindung schließt die Verwendung einer Anzahl allgemein erhältlicher Sestriktionsendonukleasen ein, die im folgenden bezeichnet und mit ihrer zugehörigen Erkennungssequenz sowie dem Schneidemuster (angezeigt durch Pfeile) beschrieben sind.

Xbal:

EcoRI:

BgIII PvuII BamHI

TCTAGA	Taql:	TCGA
AGATCT Λ		AGCT A
Γ I GAATTC	Hindlll?	I Fagott
CTTAAG		TTCGAA
icJATCT	Hp al:	GTTAAC
TCTAGA T		CAA7TTG
I GAG^CTG	Pstl:	CTGCAG
GTCGAC f		GACGTC
G^ATCC
CCTAGG f

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2*7.82

Wo die Schnittpunkte auf den entsprechenden Strängen voneinander entfernt sind, werden die geschnittenen Enden "sticky", d. iu überstehend, und insofern in der lage sein, sich wieder neu. zu verbinden, bzw» diese "sticky-ends" können mit einer anderen, komplementären ⁿsticky-endⁿ-DUS durch Watson-Crick-Basenpaarung (A mit T und G- mit C) korrekt miteinander verzapft werden» Einige Restriktionsenzyme, beispielsweise die oben beschriebenen Hpal und PvuII, hinterlassen nach dem Schnitt stumpfe Enden» Die oben gezeigtenUukleotidsequenzen sind gemäß einer diesbezüglichen Übereinkunft in der folgenden Weise dargestellt; Der obere Strang ist der Protein-codierende Strang, und man bewegt sich fortschreitend von links nach rechts vom 5^f- zum 3*-^Ende dieses Strangs, d· iu in Sichtung der Transkription von einem prosimalen zu einem distalen Punkt· Schließlich bezeichnet, im Hinblick auf die Übereinkunft, das Symbol ^H A " eine.Deletion· Daher bezeichnet eine Benennung eines Plasmids, wie beispielsweise "A EcoRIJ-XbaI^tt, dasjenige Plasmid, aus welchem die Uukleotidsequenz zwischen den EcoRI- und Xbal-Erkennungsstellen der entsprechenden Hestriktionsenzyme durch Verdauung durch diese Enzyme entfernt wurde* Der Einfachheit halber wurden verschiedene Deletionen durch Zahlen bezeichnet· Die Bezeichnung "^ 1" bedeutet daher, beginnend vom ersten Basenpaar (Bp) der EcoRI-Erkennungsstelle, die auf das Gen für fetraeyclin-Resistenz in dem Elternplasmid pBS322 folgt, eine Deletion vom Bp 1-30 (d· h· Λ EcoRI-Hindlll) und daraus folgend ein Ausschalten des Tetracyclin-Promoter-Operator-Systems« Als ^H Δ 2" wird eine Deletion der Bp 1-375 verstanden (d. h· Λ EcoRI-BamHI) und infolgedessen ein Entfernen sowohl des Tetracyclin-Promoter-Operators und der Strukturgene, die für Tetracyclin-Resistenz codieren. Die Bezeichnung ⁿ Δ 3" bedeutet eine Deletion der Bp 3611-4359 (d. h· Δ Pstl-EcoRI) und die Eliminierung der Ampicillin-ResistenZo » A4" wird verwendet, um das Entfernen der

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2.7.82

Bp <v900- λΊ500 vom trp-Operon-Pragment 5 (Fig. 1) zu bezeichnen, in dem die Strukturgene für das trpD-Polypeptid eliminiert sind.

Die trp-Leader-Sequenz ist aus den Basenpaaren (Bp) 1—162 aufgebaut, angefangen vom Startpunkt für die trp-mRSA. Sin auf 14 Aminosäuren geschätztes. trp-Leader-Polypeptid wird. . durch die Bp 27-71 codiert, die den ATG-Bukleotiden folgen, die für das Translations-Startsignal codieren· Die trp-Attenuator-Region enthält aufeinanderfolgend GC-reiche und AT-reiche Sequenzen, die zwischen den Bp 114 und 156 liegen. Die Attenuierung wird offensichtlich durch mRHA-Hukleotide bewirkt, die. durch die Bp /v^134-141 der Lea der-Se quenz codiert werden« Um heterologe Polypeptide unter dem Einfluß der trp-Ieader-Ribosomen-Bindestelle zu esprimieren und gleichzeitig die Attenuierung zu verhindern, müssen die folgenden Kriterien beachtet werden:

1. Die Basenpaare 134-141 oder noch mehr über das Bp 141 hinaus müssen deletiert werden;

2· das ATG-Codon des inserierten Gens muß, wie bekannt, in der richtigen Lage zu.einer Ribosomen-Bindesteile ausgerichtet sein (siehe z. B« J. A. Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger ESA» in Biological Regulationand Control (ed· R. Goldberger) Plenum Press, I. I· (1978));

3· wo ein homolog-heterologes Pusionsprotein produziert werden soll, sollte das Translations-Startsignal einer homologen. Po lyp.ep t id se quenz verfügbar bleiben, und die Codons für den homologen Teil des: Pusionsproteins müssen in Phase ohne dazwischenliegende Translations-Stopsignale

09 1 - ²⁰ - 61 OOG 18

2·7·82

inseriert werden»

Wenn beispielsweise alle Basenpaare innerhalb der Leader-Sequenz. distal vom Bp 70 deletiert werden, wird die Attenuator-Hegion entfernt, die ATG-Sequenz, die für das Translations-Star tsignal codiert, verbleibt und der dazwischenliegende Translations-Stop, codiert durch TCA (Bp 69-71), wird entfernt durch Eliminieren von A und die darauffolgenden B"ukleotide. Eine derartige Deletion hätte als Ergebnis die Expression eines Pusionsproteins, das mit dem Leader-Polypeptid beginnt und mit demjenigen Polypeptid endet, das durch irgendeine heterologe Insertion codiert wird. Von diesen Polypeptiden wird eine distale Region eines an die Leader-Sequenz anschließenden trp-Operon-Polypeptids eingeschlossen, die durch das Ausmaß der Deletion in der 3'-Richtung bestimmt wird. Eine in das Gen E hineinreichende Deletion würde daher zur Expression eines homologen Vorlaufers führen, der die L-Sequenz und die distale Region des Gens E(jenseits des Endpunkts der Deletion) enthält, verbunden mit der Sequenz, die durch irgendeine folgende Insertion codiert wird, usw.

Zwei besonders brauchbare Plasmide, «aus. denen .die,, -^ttenuator- Region entfernt wurde, sind die Plasmide pGM1 und pGM3 (G. SV Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978)). Diese Plasmide tragen die Deletionen trp Δ LE 1413 und trp -d LE 1417 und exprimieren (unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators) ein Polypeptid, das ungefähr die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leäders und distale Regionen des E-Polypeptids enthält, In dem besonders bevorzugten Fall des Plasmids pGM1 wird lediglich etwa das letzte Drittel des E-Polypeptids exprimiert, wohingegen pGM3 nahezu die gesamte distale Hälfte des E-Polypeptid-Codons exprimiert. Der Stamm

24 3 4 09 1 -²¹ - 61000

2.7.82

E. coli K-12 W31-10 tna 2~trp/" j\ 102, der pGM1 enthält, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hummer 31622 hinterlegt, Das Plasmid pGM1 kann auf herkömmliche Weise aus dem genannten Stamm zur Verwendung in den unten beschriebenen Verfahren entfernt werden.

Eine Möglichkeit, um mit den durch die Erfindung bereitgestellten Mitteln Del'etionen einzuführen, ist das spezifische Schneiden von doppeisträngiger DUS an jeder gewünschten Stelle. Ein Beispiel dieser Sehneidetechnik ist unten im Teil IV der Beschreibung, der Experimente dargelegt. Dabei wird doppelsträngige DHS in einem den beabsichtigten Schneidepunkt umgebenden Bereich durch Reaktion mit /t-Exonuklease in einzeIsträngige DHS umgewandelt» Daraufhin wird ein synthetischer oder anderer Einzelstrang-DHS-Primer an das vorher gebildete Einzelstrangstück durch Watson-Crick-Basenpaarung hybridisiert. Dabei muß sichergestellt sein, daß das 5^f-Ende der Primer-Sequenz exakt gegenüber demjenigen Hukleotid auf dem ersten Strang endet, das genau vor dem beabsichtigten Schneidepunkt liegt. Als nächstes wird der Primer durch Reaktion mit DHS-Polymerasein 3'-Richtung verlängert, wodurch ,derjenige Teil^de^urspru^

der vor dem beabsichtigten Schnittpunkt liegt, wieder hergestellt wird, der im ersten Schritt verlorgengegangen war» Gleichzeitig oder danach wird derjenige Teil des ersten Stranges, der jenseits des beabsichtigten Schnittpunkts liegt, wegverdaut. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Vorgang noch einmal, wobei "v" den beabsichtigten Schnittpunkt kennzeichnet:

243409 1

61.000 18

2.7.82

a; ......	V
b)	V
c)	V
d) ......	V
	V

beabsichtigter Schnittpunkt "ν"

Bilden eines Einzelstranges im Bereich von "v"

Primer-Hybridisierung

Verlängerung des Primers

linz eistrangverdauung

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte d) und e) gleichzeitig ausgeführt, wobei eine PoIymerase verwendet wird, die gleichzeitig die vorstehenden Einzelstrangenden in der 3' —> 5^f-Eichtung verdaut und den Primer (in Anwesenheit von dATP, dGTP, dTTP und dCTP) in der 5*—> 3'-Sichtung verlängert. Besonders geeignet für diese Zwecke ist die Klenow-Polymerase I, d. h. dasjenige Fragment, das durch proteolytisches Spalten der DITS-Polymerase I erhalten wird und die 5¹—>3'-Polymerisierungsaktivität sowie die 3*——^'-Exonukleaseaktivität des Elternenzyms aufweist, dagegen seine 5¹—?3'-Exonukleaseaktivität verloren hat (A. Kornberg, DIS Synthesis, 98, W. H„ Freeman und Co., SFO (1974))·

Bei Verwendung des eben beschriebenen Verfahrens können Attenuator-Deletionen in einem ein trp-Operon enthaltenden Plasmid auf jede nur gewünschte Weise eingeführt werden· Das Plasmid wurde vorher in die lineare Form überführt, beispiels-

24 3 4 09 1 *²³ * 61 ooo

2.7.82

weise durch einen Schnitt an einer Bestriktionserkennungsstelle stromabwärts von dem beabsichtigten Schnittpunkt, an dem das Molekül stumpfendig sein soll (siehe Bereich "v" im oben gezeigten Schema)· Haeh dem Deletieren der Attenuator-Region wird das Plasmid wieder in die Ringform gebracht· Dies kann beispielsweise durch Verbinden der stumpfen Enden oder auch durch andere Methoden geschehen, die dem Fachmann V- bekannt sind.

Obwohl die Erfindung die direkte Expression heterologer Polypeptide unter der Kontrolle des trp-Prοmoter-Operators umfaßt, ist der bevorzugte Pail die Expression von fusionierten Proteinen, die sowohl homologe als auch heterologe Sequenzen enthalten, wobei letztere vorzugsweise durch extrazelluläre Maßnahmen spezifisch von den homologen Proteinen abspaltbar sind. Ganz besonders bevorzugt sind Fusionen, in denen der homologe Teil eine oder mehrere Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids enthält und etwa ein Drittel oder mehr der trpE-Aminosäuresequenz (distales Ende). So erhalte-

s~- ne Fusionsproteine scheinen unter Expressionsbedingungen ^%" bemerkenswert stabil gegen Abbau zu sein.

Das Bakterium E. coli K-12, Stamm ¥3110 tna 2"trp"yl 102 (pGM1), ATGC Hummer 31622, kann dazu verwendet werden, den Vorrat des Plasmids pGM1 zu vervielfachen, das bevorzugt für die Konstruktion des Attenuator-freien trp-Promoter-Operator-Systems der Erfindung verwendet wird* Dieser Stamm ist in Gegenwart von Anthranilat phänotypisch trp⁺ und kann in Minimalmedium, beispielsweise IB, das mit 50 /ug/ml Anthranilat supplementiert wurde, wachsen.

24 3 4 09 1 -²⁴ - ei ooo

2.7+82

Alle Bakterienstämme, die im Zusammenhang mit der Erfindung für die trp-Promoter-Operator dirigierte Expression verwendet werden, sind trp Repressor* (trp R⁺) wie im Fall des Wildtyp E, coli, so daß die Repression sichergestellt ist, bis die heterologe Expression angestrebt wird·

In einer, bevorzugten.Ausführungsform wird die DHS-Rekombination in E, coli K-12, Stamm 294 (end A, thi", hsr"Y hsm£), ATCG lummer 31446, durchgeführt, einem Bakterien stamm, dessen Membraneigenschaften die Transformation erleichtern, Plasmide, die heterologe Polypeptide produzieren und im Stamm 294 gewachsen sind, werden auf die übliche Weise - extrahiert und in lösung gehalten (beispielsweise 10 ml Tris, 1 ml EDTA, pH 8,0) bei Temperaturen von etwa -20 ⁰C bis 4 ⁰C, Für die Expression unter industriellen Bedingungen wird andererseits jedoch bevorzugt ein widerstandsfähigerer Stamm verwendet, nämlich E. coli K-12 Äy~F~RY 308 strf, gal 308", ATCC Uummer 316Ο8. RY 308.ist ernährungsmäßig Wildtyp und wächst gut in Minimalmedium, in dem alle nötigen Macromoleküle aus einer üblichen Mischung von Ammonium-, Phosphat- und Magnesiumsalzen, Spurenelementen und Glukose synthetisiert werden« Hach der Transformation einer RV 308-Kultür mit dem aus dem Stamm 294 abgeleiteten Plasmid wird die Kultur auf einem Medium plattiert, das für einen Marker selektiv ist (beispielsweise Resistenz gegen ein Antibiotikum), den das Plasmid trägt· Eine Transformantenkolonie wird abgeimpft und in einer Flaschenkultur gezüchtet· Aliquots dieser Flaschenkultur werden in 10 % DMSO oder GlycerinlÖsung (in sterilen Wheaton-Fläschchen) in einem Äthanol-Trockeneisbad schockgefroren und auf -80 ⁰C tiefgefroren· Um das codierte heterologe Polypeptid zu produzieren, werden Proben der Kultur in einem Medium gezüchtet, das Tryptophan enthält, um den trp-Promo-

24 3 4 09 1 - 25 - ei ooo ₁₈

2.7.82

ter-Operator zu reprimieren.- Anschließend wird dem System ' das zugegebene Tryptophan entzogen, um die Expression zu ermöglicheno

Für die erste Wachsturnsstufe kann beispielsweise LB-Medium verwendet werden (J· H. Miller, Experiments in,Molecular Genetics, 433» Cold Spring Harbor laboratory.(1972)), das pro liter wäßriger lösung 10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt und 10 g IaGl enthält. Vorzugsweise läßt man . die beimpfte Kultur bis zu einer optischen Dichte (o. D.). von 10 oder mehr (bei 550 mn), insbesondere zu einer o. D. von 20 oder mehr, besonders bevorzugt jedoch zu einer o. D. von 30 oder mehr wachsen, ,jedoch nicht bis zur stationären Phase.

Für die Derepression und Expression wird.die beimpfte Kultur als nächstes unter Bedingungen gezüchtet, unter denen der Zelle das zugegebene Tryptophan entzogen wird. Ein geeignetes Medium für ein derartiges Wachstum ist M9 (J. H. Miller, Seite 431» a.a.O.), das wie folgt hergestellt wird (pro Liter):

3 g 6g

HaCi 0,5 g

1 g

Uach dem Autoklavieren wird dieser Mischung zugegeben:

10 ml 0,01 M CaCl₂ 1 ml 1 M MgSO₄ 10 ml 20 % Glukose

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2*7.82

Vitamin B1 1 /Ug/ml

«Humko Hycas« Amino"

oder DIPCO Kasein-Aminosäuren 40 /Ug/ml.

Das Aminosäuresupplement ist ein Hydrolysat von Kasein, dem Tryptophan fehlt·

Un die Expression des heterologen Polypeptide zu starten, kann man beispielsweise die in einem Tryptophan-reichen Medium gewachsene.Impfkultür in einem größeren Volumen eines Mediums verdünnen, das kein zusätzliches Tryptophan enthält (beispielsweise in einer 2- bis 10-fachen Verdünnung). Man läßt die Kultur dann bis zu einer gewünschten Dichte wachsen (vorzugsweise bis kurz vor die stationäre Wachstumsphase) und erhält das angestrebte Produkt auf übliche Weise durch Iyse, Zentrifugieren und Reinigen· In dem Wachsturnsstadium des Tryptophanentzugs läßt man die Zellen vorzugsweise bis zu einer o. D* von mehr als 10, insbesondere von mehr als 20 und besonders bevorzugt bis zu oder über eine o· D· von 30 (jeweils bei 550,mn) wachsen, ehe das angestrebte Produkt isoliert wird.

Alle DNS-Rekombinations-Experimente, die in dem folgenden experimentie11en Teil beschrieben werden, wurden bei Genentech Inc in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) bezüglich der Forschung mit rekombinanter DNS durchgeführt.

I. Expression des D-Polypeptid-Fusionsproteins

Mit Bezug auf die Pig« 1 bis. 3 wird ein bevorzugtes.Verfahren zur Expression von Fusionsproteinen.beschrieben, die das gewünschte Polypeptid enthalten und, daran angebunden,

243409 1 - 27 - 61 000 18

2.7.82

einen Teil der Aminosäuresequenz des trpD-Polypeptids, das in vitro mittels einer Aminosäure Methionin, die spezifisch für ein CHBr-Spalten sensitiv ist, abgetrennt werden kann,

A) Konstruktion von pBEHtrp

Das Plasmid pGM1 (1, Pig· 1) trägt das E. coli-Tryptophanf Operon, das die. Deletion Δ EE 1413 enthält (G. P. Miozzari et al., (1978), J, Bacteriology 1457-1466) und exprimiert somit ein Pusionsprotein, das die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd das letzte Drittel des trpE-Polypeptids (im nachfolgenden als die Verbindung I)E* bezeichnet), ebenso wie das vollständige trpD-Polypeptid, enthält, alle unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems, 20 /Ug des Plasmids werden mit dem Kestriktionsenzym PvuII verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen schneidet· Das Genfragment 2 (Pig· 1) wird als nächstes mit einer EcoEI-Verbindungssteile, einem sogenannten linker (bestehend aus einem in sich selbst komplementären Oligonukleotid 3 (Pig· 1) der Sequenz: PCATGAATTGATG) kombiniert,' wodurch eine EcoBI- \J Schnittstelle für ein späteres Clonon in ein Plasmid 20 (Pig, 6), das eine EcoBI-Srkennungsstelle enthält, zur Verfügung gestellt wird. Die durch das Plasmid pGM1 erhaltenen 20 /Ug des Dl^-S-Pragments 2 (Pig. 1) werden mit 10 Einheiten Τ,-DNS-Ligase in Anwesenheit von 200 Pisenolen des 5'-phosphorylierten, synthetischen Oligunukleotids 3 (Pig· 1) mit der Sequenz pCATGAATTCATG und in 20 yul T.-DUS-Ligase-Puffer (20 mM Tris, pH 7,6; 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 5 ml Dithiothreit bei 4 ⁰C über lacht behandelt· Die lösung wird daraufhin 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 70 ⁰C erhitzt, um die Ligasebindung zu stoppen· Die Linker werden durch EcoRI-Terdauung geschnitten, und die Pragmente, die

24 3 4 09 1 -²⁸ - ⁶¹ °°°¹⁸

2.7.82

nun EcoRI-Enden enthalten, werden mittels 5 %iger Polyaerylamid-Gel-Elektrcphorase (im folgenden PAGE genannt) voneinander getrennt. Die drei größten Fragmente werden sodann aus dem. Gel isoliert, indem sie zuerst mit Äthidiumbromid markiert, danach die Fragmente mit Ultraviolett-Licht lokalisiert und schließlich die interessierenden Teile aus dem Gel herausgeschnitten werden· Jedes Gelfragment wird mit 300 Mikrolitern.0,1 χ TBE in einem Dialyseschlauch überführt und in einem 0,1 χ TBE-Puffer bei 100 Y eine Stunde lang einer Elektrophorase unterworfen (der TBE-Puffer enthält: 10,6 g Tris, 5,5 g Borsäure, 0,09 g MaJSDTA in 1 IH₂O), . Die wäßrige Lösung wird aus dem Dialyseschlauch gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, und 0,2 · latriumehlorid-molar gemacht und die DHS in Wasser überführt, nachdem.sie mit Äthanol gefällt wurde. (Sämtliche DHS-Fragment-Isolierungen, die im folgenden beschrieben werden, wurden unter Verwendung von PAGE, gefolgt von der eben beschriebenen Methode des Elektroeluierens durchgeführt,) Das Gen 5 (Fig. 1), das den trp-Promoter-Operator enthält sowie überstehende EcoRI-Enden aufweist, wird in einem Verfahren identifiziert, das als nächstes beschrieben werden wird, welches das Einfügen von Fragmenten in ein Tetracyclinsensitives Plasmid 6 (Fig_e,1) zur Folge hat, das, infolge, der Promoter-Operator-Insertion, Tetracyclin-resistent wird.

B) Herstellen des Plasmids pBRHtrp, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators Tetracyclin-Resistenz exprimiert sowie Identifizieren und Vervielfältigen des im obigen Abschnitt A) isolierten DIS-Fragments 5 (Fig. 1), das den trp-Promoter-Operator enthält

Das Plasmid 6 (Fig. 1) mit der Bezeichnung pBEH1.(R. I. Rodriguez,· et al., Hue le ic Acids Research 6, 3267-32Ö7 (1979)) exprimiert Ampicillin-Resistenz, welches allerdings,

24 3 4 09 1 -²⁹- ,^δ1 ₇°°°¹⁸

da.kein dazugehöriger.Promoter vorhanden ist, diese Resistenz nicht exprimiert«. Dementsprechend ist das Plasmid Tetracyclinsensitiv. Durch Einführen eines Promoter-Operator-Systems in die EcoRI-Erkennungsstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden· Das Plasmid pBBH1 wird mit EvoEI verdaut, worauf das Enzym durch Phenol-Extraktion entfernt wird, gefolgt durch eine Chloroform-Extraktion und Wiederaufnahme in Wasser nach,einer Äthanolfällung. Das entstandene DHS-Molekül 7 (Mg. 1) wird, in getrennten Reaktionsmischungen, mit jedem der drei DHS-Fragmente, die im oben geschilderten Teil A) erhalten wurden, kombiniert und mit T.-DNS-Ligase, wie vorstehend beschrieben, verbunden. Die in der Reaktionsmischung vorhandene DHS wird durch Standardtechniken (Y. Hershfield et al·, Proc Hat ¹I Acad ' Sei USA 71» 3455-3459 (1974)) dazu verwendet, um einen kompetenten E. coli K-12, Stamm. 294 (K. Backman et al., Proc Hat»! Acad Sei USA 73, 4174-4198 (1976)) (ATGG Hummer 31448) zu transformieren, worauf die Bakterien auf LB-Platten, die 20 yug/ml Ampicillin und 5 yug/ml Tetracyclin enthalten, plattiert werden. Es werden einige Tetracyclinresistente Kolonien selektiert, die Plasmid-DHS isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch eine Restriktionsenzym-Analyse sichergestellt. Das resultierende Plasmid 8 (Pig. 1), mit der Bezeichnung pBRHtrp, exprimiert ß-Lactamase, verleiht Amp icillin-Resistenz, und es enthält ein DSTS-Pragment, das den trp-Promoter-Operator einschließt und für ein erstes Protein codiert, das aus einer Fusion der ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd des letzten Drittels des trpE-Polypeptids (dieses Polypeptid. wird LE» genannt) besteht, sowie für ein zweites Protein, entsprechend der ungefähr ersten Hälfte des trpD-Polypeptids (dieses Polypeptid wird D' genannt) und weiterhin für ein

24 3 4 09 t -30- 61.000 18

2.7.82

drittes Protein, für das das Gen für Tetracyclin-Resist'enz codiert,

0) Cionierende Gene für verschiedene Endprodukt-Polypeptide und die Expression dieser Gene als Fusionsproteine, die das Endprodukt und einen spezifisch spaltbaren trpD-Polypeptid-Yorläufer enthalten (Pig. 2)

Aus dem Plasmid pBRHtrp 8 erhält man ein, den trp-Promoter-Operator und Codons.für die I₁E¹- und D^f-Polypeptide aufweisendes DUS-Fragment, das in Plasmide inseriert wird, die Strukturgene für verschiedene gewünschte -Polypeptide enthalten, im folgenden beispielhaft dargestellt für den Pall des Somatostatin (Pig· 2).

Das Plasmid pBHHtrp 8 wird mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und das so entstandene Fragment 5 (Fig· 2) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Das EcoRI-verdaute Plasmid pSom11 (K. Itakura et al«, Science 198, 1056 (1977)); GE-PS 2 007 676 A) wird mit Fragment 5 (Fig. 2) vereint. Die Mischung wird, wie oben beschrieben, mit S.-DUS-Ligase . verbunden, und mit der resultierenden Dl¹S wird E,.coli K-12, Stamm 294, wie bereits geschildert,.transformiert. Transformierte Bakterien werden auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert. So erhaltene Ampicillin-resistente Kolonien werden durch Hybridisieren der Kolonien geprüft (M. Gruenstein et al., Proc JTat'l Acad Sei USA 72, 3951-3965 (1975)), wobei als Vergleich das aus dem Plasmid pBRHtrp 8 isolierte, den trp-Promoter-Operator enthaltende Fragment 5 (Fig. 2) verwendet wird, das mit Έ radioaktiv markiert wurde. Verschiedene Kolonien, die sich bei der Hybridisierung der Kolonien als positiv herausgestellt haben, werden selektiert,

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2.^.82

die Plasmid-DITS wird isoliert und die Orientierung des inserierten Fragments durch. Restriktionsanalyse bestimmt, wobei die Restriktionsenzyme BgIII und BamHI in einer Doppelverdauung verwendet werden* Der Stamm E. coli 294, der das Plasmid 11. (Pig. 2), mit der Bezeichnung pSom7,d 2, enthält, welches das trp-Promoter-Operator-Fragment in der gewünsch- (''' ten Orientierung aufweist, wird in'IB-Medium gezüchtet, das 10 yug/ml Ampicillin enthält« Man läßt die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 wachsen (bei 550 nm), sammelt sie durch Zentrifugieren und resuspendiert sie in M9-Medium in zehnfacher Verdünnung. Man läßt die Zellen daraufhin zwei bis drei Stunden lang wachsen, bis sie wieder eine optische Dichte von 1 aufweisen, lysiert sie und analysiert das vollständige zelluläre Protein mit SDS (Natriumdodecylsulfat), Harnstoff (15 %) und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (J. V. Maizel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 (1971)).

In Fig.- 3 ist eine Protein-Gel-Analyse dargestellt, bei der sämtliches Protein von verschiedenen Kulturen der Größe nach iQ getrennt wurde. Die Dichte der einzelnen Banden gibt die Menge wieder, in der die entsprechenden Proteine vorliegen. In der Abbildung der Fig. 3 sind die Spalten 1 und 7 Kontrollen, die eine Vielzahl von Proteinen enthalten, deren Größe vorher bestimmt wurde und die als Referenz dienen. In den Spalten 2 und 3 ist zelluläres Protein von Kolonien des Stammes E. coli 294 gewandert, der mit dem Plasmid pSom7A2 11 transformiert wurde und entweder in LB-Medium (Spalte 2) oder in M9-Medium (Spalte 3) gezüchtet wurde. Die Spalten 4 und 5 enthalten zelluläres Protein, das aus ähnlichen Zellen erhalten wurde, die mit dem Plasmid pThdJA transformiert., wurden. Hierbei handelt es sich' um ein- Thymosin-exprimierendes Plasmid, das durch ein im wesentlichen

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2.7.82

mit dem bereits beschriebenen identischen Verfahren erhalten wird, wobei von dem Plasmid pThe£i ausgegangen wird (siehe die gemeinsam von Roberto Crea und Ronald B. Wetzel auf die Anmelderin übergegangene US-Patentanmeldung, eingereicht am 28. Pebruar 1980 bezüglich der Thymosin <L 1-Produktion\ durch dieses Zitat ist die Patentanmeldung in die Offenbarung mit einbezogen)..Die Spalte 4 enthält zelluläres Protein von E. coli 294/pTho£7Zl2, das in ΠΒ-Medium gewachsen ist, wohingegen die Spalte 5 Zellprotein aus derselben Transformanten enthält, die jedoch in M9-Medium gewachsen ist₀ Spalte 6, eine weitere Kontrolle, ist das. Proteinmuster von E. coli 294/pBR322, gewachsen in LB-Medium·

Ein Vergleich mit den Kontrollen zeigt, daß die oberste der beiden am stärksten hervortretenden Banden in den Spalten 3 und 5 Proteine derjenigen Größe enthalten, die im Pail der Expression eines "Fusionsproteins erwartet wird, das das D*-Polypeptid und Somatostatin bzw· Thymosin enthält (die andere ausgeprägte Bande enthält das LE'-Polypeptid als Ergebnis der Deletion des Attenuators), Pig. 3 bestätigt, daß die Expression in Tryptophan—reichem Medium reprimiert ist, jedoch unter Tryptophan-Mange!bedingungen dereprimiert ist.

D) Bromcyan-Spaltung und Radio immunoassay des Hormonprodukts

Sowohl im lall des Thymosins als auch des.Somatostatins wird das vollständige zelluläre Protein mit Bromcyan gespalten, das Spaltprodukt wiedergewonnen und, nach dem Trocknen, in Puffer resuspendiert und durch Radioimmunoassay analysiert, wodurch sichergestellt wird, daß das Espressionsprodukt immunologisch identisch ist mit Somatostatin bzw» Thymosin. Das Spalte'h m£t Broincyän ist' beschrieben bei D. Y. Goeddel et al., Proc Uat'l Acad Sei USA 76, 106-110 (1979)).

24 3 4 09 1 - 33 - 61 000 18

2.7,82

II. Konstruktion von Plasmiden für die direkte Expression heterologer Gene unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems

Die Strategie für eine direkte Expression hat die Schaffung eines Plasmids zur PoIge, das distal von allen Kontrollelementen des trp-Operons eine einzige Restriktionserkennungsstelle aufweist, in welche heterologe Gene anstelle der trp-Leader-Sequenz und in richtigem, räumlichem Verhältnis zu der trp-Leader-Ribosomen-Bindesteile des Polypeptide geclont werden können« Die Durchführung der direkten Expression wird im folgenden für den Fall der Expression des menschlichen Wachstumshormons beispielhaft beschrieben.

10 /Ug des Plasmids ipSpmlA 2 11 werden mit EcoRI geschnitten und das DUS-Fragment 5 (Fig. 4), das die genetischen Bestandteile für Tryptophan enthält, wird durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. 2 /Ug dieses Fragments werden mit zwei Einheiten der Restriktionsendonuklease Taql verdaut, und zwar 10 Minuten bei 37 ⁰O,' so daß im Durchschnitt nur eine der vermutlich fünf Taql-Erkennungsstellen in jedem Molekül geschnitten wird. Diese teilweise verdaute Fragmentmischung wird durch PAGE getrennt und ein annährend 300 Basenpaare langes DITS-Fragment 12 (Fig. 4), das ein Ec ö RI-Ende und ein Taql-Ende enthält, wird durch Elektroeluierung isoliert. Die korrespondierende Taql-Erkennungsstelle ist zwischen den Startstellen für die Transkription und die Translation angeordnet und liegt 5 Bukleotide stromaufwärts vom ATG-Codon des trp-Ieader-Peptids. Die DHS-Sequenz dieses Bereichs ist in Figo 4 gezeigt. Wenn man wie beschrieben verfährt, kann ein Fragment isoliert werden, das alle Kontrollelemente des trp-Operons enthält, d, h. das Promoter--Operator-System, das Transkriptions-Initiationssignal und die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle.

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2.7.82

Als nächstes wird der, dem Translations-Startsignal für die trp-Leader-Sequenz benachbarte Taql-Rest am 3'-Ende des erhaltenen Fragments in eine Xbal-Erkennungssteile umgewandelt, wie fig· 5 zeigt. Dies erfolgt durch Anknüpfen des oben erhaltenen Fragments 12 an ein Plasmid, das nur eine einzige EcoRI- und eine einzige. Xbal-Erkennungsstelle enthält. Für diese Zwecke kann man im wesentlichen jedes Plasmid verwenden, das aufeinanderfolgend ein Replikon, einen selektierbaren Marker, beispielsweise, eine Antibiotikum-Resistenz, und EcoRI-, Xbal- und BamHI-Erkennungsstellen enthält. Hierzu kann beispielsweise eine Xbal-Erkennungsstelle zwischen die EcoRI- und BamHI-Erkennungssteile auf dem Plasmid pBR322 eingefügt werden (F, Bolivar et al,, Gene 2, 95-119 (1977)), und zwar beispielsweise in der Weise, daß an der einzigen Hindlll-Erkennungsstelle des Plasmids mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnitten wird, gefolgt von einer Einzelstrang-spezifischen Nukleaseverdauung der so entstandenen überstehenden Enden und Verknüpfen der stumpfen Enden eines sich selbst fest verbindenden doppeisträngigen, synthetischen Hukleotids, das beispielsweise eine Erkennungsstelle CCTCTAGAGG enthält* Andererseits können auf natürliche Weise erhaltene DHS-Fragmente verwendet werden, wie im vorliegenden Fall, die eine einzelne Xbal-Erkennungsstelle zwischen EcoRI- und BamHI-Sehneideresten enthalten. Mit üblichen Mitteln wurde somit ein EcoRI- und BamHI-Verdauungsprodukt des G-enoms des Hepatitis B-Virus hergestellt und zwischen die EcoRI- und BamTTI-Erkennungsstellen des Plasmids pGH§ eingefügt (D. T. Goeddel et al., Hature 281, 544 (1979)), wodurch das Plasmid pHS32 gebildet wird. Das Plasmid pHS32 wird mit Xbal geschnitten und aufeinanderfolgend mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Es wird dann mit 1 /ul E_e coIi-Polymerase I, Klenow-Fragment

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2.7.82

in 30 /ul Poiymerase-Puffer (50 nM Calciumphosphat pE 7,4, 7 ml. MgClp» 1 al ß-Mercaptoäthanol), enthaltend 0,1 mlcLf^p und 0,1 ml dCTP, vorerst 30 Minuten lang bei 0 ⁰C land dann 2 Stunden bei 37 ⁰C behandelt. Diese Behandlung hat zur Folge, daß zwei der vier, zu der am 5'-Ende überstehenden Xbal-Schneidestelle komplementären Uukleotiden aufgefüllt werden,

5^f CTAGA 5* GTlGA

V T 3

Zwei Hukleotide, dC und df, werden auf diese Weise eingebaut, wodurch ein Ende mit zwei 5'-überstehenden Hukleotiden entsteht. Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32i3 wird (nach Phenol- und Chloroformexfcraktion und Wiederaufnahme in Wasser nach Äthanolfällung) mit EcoEI geschnitten. Das große Plasmidfragment 13 (Pig. 5) wird von dem kleineren EcoRI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroeluierung isoliert. Dieses DHS-Pragment 13 von pHS32 (A/0,2>ug) wird, unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben, an das EcoRI-Taql-Pragment des Tryptophan-Operons (0,01 /Ug) angeknüpft, wie in Pig. 5 dargestellt. Bei diesem .-Verfahren-" wird' das überstehende Taql-Ende mit dem verbleibenden überstehenden Xbal-Ende verknüpft, wobei sogar vermutet wird, daß nicht überall Watson-Crick-Basenpaarung vorliegt:

T GO!AGA— —TCTAGA

AGC TCT -—AGCTCT

24 3 4 09 1 -^3β- ^610Q018

2.7.82

Ein Teil dieser Verknüpfungs-Reaktionsmischung wird in E. coli 294-Zellen transformiert,.wie oben in Abschnitt I beschrieben, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthalten, plattiert, 24 Kolonien werden selektiert, in 3 ml LB-läedium gezüchtet und das Plasmid isoliert. Sechs dieser Plasmide zeigten via E. coli katalysierter DHS-Reparatur und -Replikation eine völlig wiederhergestellte Xbal-Erkennungsstelle:

TGIAGA- TCTAGA

—AGCTCT — —AGATCT

Diese Plasmide wurden auch sowohl durch EcoEI als auch Hpal geschnitten und ergaben die erwarteten Restriktionsfragmente,, Ein Plasmid 14 (5¹IgO 5), genannt ρTrp 14, wurde, für die Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie im folgenden diskutiert werden wird.

Das Plasmid pHGH107, mit dem Bezugszeichen.18 in Fig* 6 (D. Ύ, Goeddel et al., Hature, 281, 544 (1979)) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon, bestehend aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DHS-Pragmenten und weiteren 163 Amino säurecodons,. erhalten aus komplementärer DlS, die mittels reverser Transkription der m-RELA. des menschlichen Wachstumshormons erhalten wurde.. Dieses Gen 21 (Pig* 6) enthält, obwohl ihm die ⁿp3?e"-Sequenz des menschlichen Wachstumshormons fehlt, ein ATG-Translations-Initiationscodon· Das Gen wird auf 10 /Ug pHGH107 nach Behandlung mit EcoRI und nachfolgend mit E. coli-Polymerase-I-Klenow-Pragment und dTTP und dATP, wie beschrieben, isoliert, nach einer Phenol- und Chlorpformestraktion und Äthanolfällung wird das Plasmid mit BamHI behandelt, siehe dazu

3 4 09 1 - 37 - 61 OQO 18

2.7o82

Pig. 6. Das Fragment 21, welches das Gen für menschliches Wachstumshormon (HGH) enthält, wird durch PAGE, gefolgt durch Elektroeluierung, isoliert, Das erhaltene DHS-Fragment enthält weiterhin die ersten 350 Bukleotide des Strukturgens für Tetracyclin-Resistenz, nicht dagegen das Tetracyclin-Promoter-Oper a tor- Sys tem, so daß, wenn es anschließend in einem Expressionsplasmid geclont wird, Plasmide, die die Insertion tragen, dadurch gefunden werden können, daß die Tetrycyclin-Sesistenz wieder hergestellt ist. Da das EeoRI-Ende des Fragments 21 (Fig. 6) durch die Behandlung mit der Klenow-Polymerase-I aufgefüllt wurde, weist das Fragment ein stumpfes und ein überstehendes Ende auf, wodurch beim späteren Einfügen in ein Expressionsplasmid die korrekte Orientierung sichergestellt ist, siehe dazu Fig, 6.

Als nächstes wird das Expressionsplasmid pTrp14 .14 vorbereitet, um das vorstehend hergestellte, das HGH-Gen enthaltende Fragment aufzunehmen· Dazu wird das Plasmid pfrp14 14 Xbal-verdaut, und die erhaltenen überstehenden Enden werden mit dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt, !fach Phenol- und Ohloroiorniextraktion und Äthanolfällung wird die resultierende DFS 16 (Fig, 6) mit BamHI behandelt und das so erhaltene große Plasmidfragment 17 (Fig. 6) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert« Das von pTrp14 abgeleitete Fragment 17 (Fig. 6) hat ein stumpfes und ein überstehendes Ende, wodurch Rekombination mit dem das HGH-Gen 21 enthaltenden Fragment, das oben beschrieben wurde, in korrekter Orientierung sichergestellt ist.

Das HGH-Genfragment 21 (Fig.. 6) und das pTrpH Iba-BamHI-Fragmenir 17 '('Flg.' 6) werden unter ähnlichen Bedingungen wie

09 1 - 38 - 61 000 18

2.7.82

oben beschrieben zusammengefügt und miteinander verknüpft. Die aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden werden durch stumpfendige Verknüpfung miteinander verbunden, wodurch sowohl die Xbal- als auch die EcoRI-Erkennungsstellen wieder hergestellt werden:

Xbal, EcoRI, HGH-Gen-

aufgefüllt aufgefüllt Initiation

TCTAG AATTCTATG T(CTAg(AATTCTATG-

AGATC TTAAGATAC— —AGATC|TTAA jGATAC—

Xbal EcoRI

Diese Konstruktion stellt auch das Gen für Tetracyclin-Resistenz wieder her. Da das Plasmid pHGH1O7 die' TetracyelinResistenz von einem Promoter aus exprimiert, der stromaufwärts vom HGH-Gen 21 liegt (dem lac-Promoter), erlaubt diese Konstruktion 22 (Pig* 6), genannt pHGH2O7, die Expression des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. Dazu wird E. coli 294 mit der Verknüpfungsmischung transformiert und die Kolonien auf LB-Platten, die 5 ,ug/ml Tetracyclin enthalten, selektiert,

Um die direkte Expression des menschlichen Wachstumshormons vom Plasmid pHGH2O7 22 nachzuweisen, wird das gesamte zelluläre Protein aus der Kultur E. coli 294/pHGH2O7 gewonnen, nachdem die Kultur bis zu einer optischen Dichte von 1 in LB-Medium mit 10 /Ug/ml Ampicillin gezüchtet, danach in M9-Medium 1 : 10 verdünnt und wieder bis zu einer optischen Dichte von 1 gezüchtet wurde. Das gesamte zelluläre Protein wird einer SDS-GeI-Elektrophorese, wie im obigen Abschnitt I

24 3 4 09 1 "³⁹" ei ooo is

2.7.82

geschildert, unterworfen und mit ahnlichen Elektrophoresedaten für menschliches Wachstumshormon verglichen die früher von anderen gefunden wurden (D. V. Goedäel et al«, Sattire, 281, 544 (1979)). Pig. 7 ist eine Fotografie des so erhaltenen, gefärbten Gels· Die Spalten 1 und 7 enthalten Vergleichsproteine.verschiedener bekannter.Größenj die Spalte 2 ist eine Kontrolle mit dem gesamten zellulären Protein des Stammes E. coli 294/pBR322; die Spalte 3 enthält Protein von E. coli 294/pHGH1O7, gewachsen in IB-Hediuxn; die Spalte 4 enthält Protein von E. coli 294/pHGH107, gewachsen in M9-Medium; die Spalte 5 enthält Protein von E. coli 294/ pHGH2O7, gewachsen in L3-Medium; und Spalte 6 enthält Protein E_e coli 294/pHGH2O7, gewachsen in I9-Medium. Die dichte Bande in Spalte 6 ist menschliches Wachstumshormon, wie durch den Vergleich zu den ähnlichen Banden in den Spalten 2 bis 4 gezeigt ist« Wie durch die Erfindung vorausgesagt, produziert der Organismus S« coli 294/pHGH2O7, wenn er in Tryptophan-reichem IB-Medium wächst, weniger Wachstumshormon aufgrund der Tryptophan-ReiDressor-Operatcsr-Interaktion, und, gezogen in M9-Medium, beträchtlich mehr HGH als E. coli 294/pHGH1O7, bedingt durch die Induktion des im Gegensatz zum lac-Promoter-Operator-Systems in pHGHIO7 stärkeren Tryptophan-Promoter-Operator-Systems.

Ill, Herstellen eines allgemeinen Expressionsplasmids für

die direkte Expression heterologer Gene unter der; ¹ Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators

Das im vorstehenden Abschnitt hergestellte Plasmid pHGH207 22 wird als nächstes dazu verwendet, um ein DHS-lragaaent, zu erhalten, das. die Kontrplleleme^te., de.s^Tr^ptophan-Operons enthält (mit Ausnahme des Attenuators) und

243409 1

- 40 - 61 000 18

. 2.7.82

einen Plasmid-Expressions-Vektor herzustellen, der für die direkte Expression verschiedener, inserierter Strukturgene geeignet ist. Zur Strategie des Hersteilens des allgemeinen Expressionsplasmids gehört das Entfernen der Tryptophan-Kontrollregion Ton pHGH207 durch EcoRI-Yerdauung und Inserieren in das EcoRI-verdaute Plasmid pBRH1, das oben in Abschnitt I verwendet wurde. pBRH1 ist, wieJbereits erwähnt, ein Ampicillinfesistentes Plasmid, das die Gene, für Tetraeyclin-Resistenz enthält, jedoch Tetracyclin-sensitiv ist, da ein geeignetes Promoter-Operator-System fehlt. Das so erhaltene Plasmid, pHKY1 24, dessen Konstruktion unten detailliert besehrieben wird und in Pig. 8 dargestellt ist,, ist sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-resistent, enthält das Tryptophan-Promoter-Operator-System, enthält nicht den Tryptophan-Attenuator und enthält eine einzige Xbal-Erkennungsstelle, die distal vom Tryptophan-Promoter-Operator liegt. Der Tryptophan-Promoter-Operator und die einzige Xbal-Erkennungsstelle sind von EcoRI-Erkennungsstellen eingefaßt, so daß das Fragment, das den Tryptophan-Promoter-Operator und die Xbal-Erkennungsstelle enthält, zum Zwecke des Einfügens in andere Strukturgene enthaltende Plasmide entfernt werden kann.

Andererseits können heterologe Strukturgene entweder in die Xbal-Erkennungsstelle oder (nach teilweiser EcoRI-Verdauung) in die EcoEI-Erkennungsstelle distal von der Tryptophan-Kontrollregion eingefügt werden, in jedem Fall mit dem Ziel, die Strukturgene der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems zu unterwerfen.

Das Plasmid pHGH207 22 wird EcoRI-verdaut und das den trp-Promoter enthaltende EcoRI-Fragment 23 (Fig. 8) wird durch

24 3 4 09 1 -⁴¹- " ₂%⁰°°¹⁸

*d· ( »ad

PAGE, gefolgt von Elektroeluierung wiedergewonnen·

Das Plasmid pBBH1 6 wird EcoRI-verdaut und die geschnittenen Enden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt (1 /Ug; in 50 al Tris pH 8 und TO mM MgCl₂, 30 Minuten lang bei 65 ⁰O), um die Phosphatgruppen an den überstehenden EcoRI-Enden zu entfernen· Der Überschuß an bakterieller alkalischer Phosphatase wird durch Phenolestraktion, Chloroforsextraktion und Äthanolfällung entfernt· Die resultierende lineare DHS 7a (Fig· 8) wird, da an ihren, überstehenden Enden Phosphate fehlen, bei einer Verknüpfung nur Insertionen annehmen, deren komplementäre überstehende Enden phosphoryliert sind und wird nicht in sich selbst rezirkularisieren, wodurch das Aussieben nach Plasmiden, die die Insertion tragen, erleichtert wird. Das τοη Plasmid pHGH2O7" 22 abgeleitete EcoSI-Fragment und die vom Plasmid pBRH1 6 erhaltene lineare DUS werden in Anwesenheit von T,-Ligase, wie bereits beschrieben, vermischt und verknüpft. Mit einem Teil der so erhaltenen Mischung wird der Stamm .E* coli 294» wie bereits beschrieben, transformiert, auf LB-Medium, enthaltend 5 /Ug/ml Tetracyclin, plattiert, und es werden zwölf Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert· Aus jeder Kolonie wird das Plasmid isoliert und auf die Anwesenheit einer DUS-Insertion durch Sestriktionsendonuklease-Analyse unter Verwendung von ScoEI und Xbal überprüft· Ein Plasmid»24,' das die Insertion enthielt, wurde pHKY1 genannt.

IV. Herstellen eines Plasmids, das das Tryptophan-Operon enthält, fähig zur Expression eines spezifisch spaltbaren Pusionsproteins, das aus sechs Aminosäuren des trp-Leader-Peptids, dem letzten Drittel des trpE-Polypeptids (genannt IiI') sowie einim" heterologen^ Stfükfurgen-Produkt besteht

24 3 4 09 1 -42- 61000 18

2.7.82

Die Strategie für das..Herstellen eines Plasmids, das ein LE¹-Fusionsprotein exprimiert, beinhaltet folgende Schritte:

a) Bereitstellen eines Genfragments, das aus Codons für die distale Region des LE¹-Polypeptide besteht und überstehende Enden einer Bglll-Erkennungsstelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Erkennungssteile am 3^f-Ende des codierenden Strangs aufweist;

b) Eliminieren der Codons von der distalen Region des LE¹-Genfragments und derjenigen für die trpD-Gene aus dem .. Plasmid Som7A2 und Inserieren des .in Stufe 1 gebildeten Fragments, wodurch die LE*-Codonsequenz unmittelbar stromaufwärts von der für das heterologe Gen für Somatostatin codierenden Codonsequenz wiederhergestellt wird.

Pig·' 9a zeigt die Hindlll-Verdauung des Plasmids pSom7A2 11, gefolgt von einer %-Exonuklease-^erdauung (einer 5^f—7 3^f-E3Contiklease) unter Bedingungen, die so gewählt werden, daß jenseits der Bglll-Restriktionserkennungsstelle innerhalb der LE- codierenden Region verdaut wird. 20 ,ug des Hindlll-verdauten pSom7^ 2 werden in Puffer gelöst (20 mM Glycinpuffer pH 9,6, 1 mM MgCl₂» -1 BaM ß-lercaptoäthanol). Das erhaltene Gemisch wird mit 5 Einheiten ^-Esonuklease 60 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt« Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann Phenol-estrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt,

Vm letztlich einen EcoRI-Rest am distalen Ende des LE¹-Genfragments herzustellen, wird mittels der bewährten Phosphotriester-Methode (R. Crea et al«, Proc Hat^fl Acad Sei USi, 75, 5765 (1978)) ein Primer ³²pCCTG5GCATGAT synthetisiert

243 4 09 1 - 43. - 61 000 18

2.7.82

und an ein Einselstr äugende des LE'-Genfragments hybridi- siert, das durch %> -Exonuklease-Verdauung erhalten vrarde, Die Hybridisierung wird im folgenden beschrieben·

20 /ng des %-Exonuklease behandelt en Hindlll-Verdauungsprodukts des Plasmids pSom7^\2 11 wird in 20 /Ul H₂O gelöst ^-„ und mit 6 /til einer lösung vereint, die. etwa 80 Picomole ^- der 5^f-phosphorylierten Oligonukleotide", wie oben beschrieben, enthält* Das synthetische fragment wird an das 3'-Ende < der LE¹ codierenden Sequenz hybridisiert, und der verbleibende Einzelstrangteil des LE»-Fragments wird durch das Klenow-Polymerase-I-7erfahren, wie oben beschrieben, aufgefüllt, wobei dATP, dTQiP, dGIP und dGTP verwendet werden·

Die Reaktionsmischung wird auf 50 ⁰C erhitzt und langsam auf 10 ⁰O abgekühlt, wonach 4 /Ul ELenow-Enzym zugegeben werden« lach 15 minütiger Inkubation bei Saumtemperatur, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei. 37 ⁰C, wird die Reaktion durch Zugabe von 5 /ul 0,25 molarem EDTl gestoppt. Die Reak-/" ' tionsmischung wird Phenol-estrahiert, Chloroform-estrahiert ^ und mit Äthanol gefällt« Anschließend wird die DITS mit dem Restriktionsenzym-Bglll geschnitten· Die Fragmente werden durch PAGE getrennt. Ein aus dem Gel erhaltenes Autoradiogramm zeigt ein ^J P-markiertes Fragment der erwarteten länge von annähernd 470 Bp, das durch Slektroeluierung rückgewonnen wird» Wie bereits hervorgehoben, hat das Fragment IiS* (d) ein BgIII- und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Primers übereinstimmt·

Das Plasmid pTho£i 30, das oben im Abschnitt I (C) beschrieben wurde, enthält ein Strukturgen für Thymosino^ri, das an seinem 5^f-Ende des codierenden Strangs in eine^ EcoRI-Erken-

24 3 4 09 j - 44 - 61 000 18

"2.7.82

nungsstelle und an.seinem 3'-Ende in eine BamHI-Erkennungsstelle geclont ist. Wie in Pig. 9b gezeigt, enthält das Gen für !Ehymosin eine zusätzliche Bglll-Erkennungsstelle.

Das Plasmid pThc£i enthält weiterhin ein Gen für Ampicillin-Resistenz. Um ein Plasmid herzustellen, das in der lage ist, das, wie oben geschildert, hergestellte LE¹(d)-Fragment aufzunehmen, wird das Plasmid pThoTi mit EcoEI verdaut, gefolgt von einer Klenow-Polymerase-I-Reaktion mit dTIP und dATP» um die EeoRI-Reste stumpfendig zu machen. Durch Bglll-Verdauung des so erhaltenen Produkts wird ein lineares DHS-Pragment 33 (Fig· 9b) hergestellt, das die Gene für Ampicillin-Resistenz und, jeweils an den entgegengesetzten Enden, einen überstehenden Bglll-Rest und ein stumpfes Ende enthält. Das so erhaltene Produkt kann durch Reaktion mit dem LS-(d)-Pragment, das ein überstehendes BgIII-Ende und ein stumpfes Ende enthält,' in der Gegenwart von T.-Ligase rezirkularisiert werden, um das Plasmid ρϊτρ24 34 (Pig. 9b) zu bilden. Während dieses Torgangs wird eine EcoRI-Erkennungssteile an der Position wiederhergestellt, wo die Yerknüpfung der stumpfen Enden erfolgte.

Im weiteren Yerlauf wird, wie in Pig. 10 gezeigt, nacheinander das Plasmid pfrp24 34 mit BgIII und EcoSI verdaut,, danach PAGE behandelt und elektroeluiert, wodurch ein Pragment entsteht, das die Godons für das LE¹(d)-Polypeptid mit einem überstehenden "Bglll-Ende und einem überstehenden EcoRI-Ende, angrenzend an seinen 3'Terminus des codierenden Strangs aufweist· Das UE*(d)-Pragment 38 (Pig. 10) kann in die BgIII-Erkennungsstelle des Plasmids pSom7A2 11 geclont werden, um ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Pusionsprotein zu bilden, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators

2 4- 3 4 O 9 1 ~ 45 - 61 000 18

2.7.82

exprimiert wird, wie in Fig, 10 gezeigt· Ein solches Verfahren erfordert erstens eine partielle EcoRI-Verdarning des Plasmids pSom7,d 2 11,um die EcoRI-Erkennungsstelle distal· vom Tryptophan-Promoter-Operator zu schneiden, wie. in Pig. 10 gezeigt, und zweitens-eine korrekte Wahl der Primer-Sequenz (Pig. 9)» um den korrekten Codon-Ieseraster zu erhalten und eine EcoRI-Schneidestelle wiederherzustellen.

Dazu werden 16 /Ug des Plasmids pSom7A2 11 in 200 yul Puffer, bestehend.aus 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,02 % SP40 Detergens, 100 mM ITaCl verdünnt und mit 0,5 Einheiten EgoRI behandelt, lach 15 minütiger Behandlungszeit bei 37 ⁰C wird die Reaktionsmischung Phenol-exfcrahiert, Chloroformextrahiert und mit Äthanol gefällt und anschließend mit BgIII verdaut. Das größere, so erhaltene !Fragment 36 (Pig. 10) wird durch die PAGE-Behandlung isoliert, ,gefolgt von Elektroeluierung, Dieses Fragment 36 enthält die Codon3 LE*(p) für das proximale Ende des IE'-Polypeptids, d» h·, diejenigen Codons, die stromaufwärts von.der Bglll-Erkennungsstelle liegen* Das Pragment 36 (Pig. 10) wird als nächstes an das Pragment 38 (Pig. 10) in Anwesenheit von T.-Ligase verknüpft, um das Plasmid pSom7Z^.2A4 39 zu bilden, das, nach !Transformation in den Stamm E, coIi 294, wie bereits beschrieben, wirksam unter die Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators ein Pusionsprotein produziert, das aus dem vollständig rekonstituierten IiE'-Polypeptid und Somatostatin besteht. Das Pusionsprotein, von dem das Somatostatin dank der Anwesenheit eines Methionins am 5^f-Ende der Somatostatinsequenz spezifisch gespalten werden kann, wird durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie bereits beschrieben, segregiert. Das Fusionsprotein-Produkt stellt die am deutlichsten sichtbare Bande in der Spalte 6 der

61000 18 2·7·82

Fig· 11 dar, wie im Detail im noch folgenden Abschnitt 71 beschrieben werden wird.

7. Herstellen eines E:spressionssystems für trp-LE'-Polypeptid-Fusionsprodukte, wobei die Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des^: Tryptophan-Promoter-Operators steht

Die Strategie für das Herstellen eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, eine große Anzahl verschiedener heterologer Gene für Polypeptide als trp-LE'-Fusionsproteine unter der Kontrolle des Tryptophan-Operons zu exprimieren, erfordert die Konstruktion eines Plasmids, das die folgenden Charakteristika aufweist:

1· eine Tetracyclin-Resistenz, die im.Falle des Herausschneidens des Promo-ter-Operator-Systems, das die Gene für diese Resistenz kontrolliert, verlorengehen würde.

2* Durch Wiedereinfügen des Promoter-Operator-Systems, das die Tetracyclin-Resistenz kontrolliert, und Rezirkularisieren durch dessen Verknüpfen mit einem heterologen Gen sowie einem Tryptophan-Promoter-Operator-System in richtiger Lesephase wird Tetracyclin-Resistenz wieder hergestellt und entsprechend die Identifizierung von. Plasmiden, die den heterologen Geneinschluß enthalten, ermöglicht.

In Kürze gesagt und in Übereinstimmung mit der Hatur der beabsichtigten Insertionen» soll ein lineares Stück DHS hergestellt werden, das einen Pst-Rest an seinem 3'-Ende und einen Bglll-Rest an seinem 5'-Ende aufweist, die an ein

24 3 4 09 1 -⁴⁷ - ⁶¹⁰⁰°¹⁸

/ 2.7*82

Gen angrenzen', das fähig ist, Tetracyclin-Resistenz zu spezifizieren, wenn es unter die Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems gebracht wird«

Dazu wird, wie in Fig. 12 dargestellt, das Plasmid pBR322 43 mit Hindlll verdaut und das überstehende Hindlll-lnde daraufhin mit Si-Üuklease verdaut« Die SI-Uuklease-Yerdauung besteht aus der Behandlung von 10 /Ug eines HindIII-geschnittenen Plasmids pBR322 in 30 yul S1-Puffer (0,3 I IaCl, 1 mM ZnGl₂, 25 mM Uatriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten S1-Huklease 30 Minuten lang bei 15 ⁰G. Die Reaktion wird durch Zugeben von 1 /Ul von 30 Σ S1-Huklease-Stoplösung (0,8 M Tris, 50 mM EDTA) gestoppt. Die Mischung wird Phenolesctrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt, dann EcοRI-verdaut, wie bereits beschrieben, und das große Fragment 46 (Fig. 12) durch PAGE-Behandlung erhalten, worauf eine Elektroeluierung folgt. Das erhaltene»Fragment hat ein erstes überstehendes EcoRI-Ende und ein zweites stumpfes Ende, dessen codierender Strang mit dem lukleotid Thymidin beginnt. Wie im folgenden gezeigt wird, kann der S1-verdaute Hindlll-Rest, der mit Thymidin beginnt, mit einem Klenow-Polymerase-I-behandelten Bglll-Rest verbunden werden, so daß nach der Verknüpfung die Bglll-Restriktionserkennungsstelle wieder hergestellt ist_a

Das Plasmid pSom7.d 2 1, das im obigen Abschnitt I vorbereitet wurde, wird Bglll-verdaut und die so entstandenen überstehenden Bglll-Enden mit dem Klenöw-Polymerase-I-Yerfahren doppeIsträngig gemacht, wobei alle vier Desosynukleotidtriphosphate verwendet werden. Das EcοRI-Sehneiden des resultierenden Produkts, gefolgt durch PAGE und Elektroeluierung des kleinen ..fragments 4,2. (Fig. 1.3), stellt ein line_rares. Stück DHS zur Verfügung, das den Tryptophan-Promoter-Opera-

24 3 4 09 1 - 48 - 61 000 18

2.7.82

tor und Colons der proximalen Sequenz des IiE'-Proteins stromaufwärts der Bglll-Erkezmungssteile (LE*(p)). enthält· Das DIB-Stück hat ein EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende als Ergebnis des Auffüllens der Bglll-Erkennungsstelle. Die BgIII-Erkennungsstelle kann jedoch durch Anknüpfen des stumpfen Endes des Fragments 42 (Pig. 13) an das stumpfe Ende des Fragments 46 (Fig. 13) wieder hergestellt werden» Dazu werden die beiden Fragmente in Anwesenheit von T,-DUS-Mgase verknüpft, um das rezirkularisierte Plasmid pHKYIO 47 (siehe Fig. 12) zu bilden, das durch Transformation.in kompetente Zellen des Stammes E. coli 294 vermehrt wird. Tetracyclinresistente Zellen, die das rekombinante Plasmid pEKYIO 47 tragen, werden gezüchtet, die Plasmid-DUS extrahiert und nacheinander mit BgIII und Pst verdaut, daraufhin durch das PAGE-Verfahren isoliert und das große Fragment elektroeluiert, das-als lineares Stück DHS vorliegt und überstehende Pst- und Bglll-Enden aufweist* Dieses DHS-Fragment 49 (Fig. 13) enthält den Origin (die Anfangssteile) der Replikation und hat sich infolgedessen als erster Bestandteil bei der Konstruktion eines Plasmids als nützlich erwiesen, bei dem sowohl die Gene, die für das trp-EE*-Polypeptid-Fusionsprotein codieren, als auch die Tetracyclin-Resistenz-Gene durch den trp-Promoter-Operator kontrolliert werden»

Das Plasmid pSom7<d 2Δ4 39, das auf die in Abschnitt IY beschriebene Weise hergestellt werden kann, kann so manipuliert werden, daß es als zweite Komponente des Systems dient, das in der Lage sein soll, eine große Anzahl verschiedener heterologer Strukturgene aufzunehmen. Wie in Fig. 13 gezeigt, wird das Plasmid einer Teil-EcoBI-Verdauung unterworfen (siehe Abschnitt IT), gefolgt von einer Pst-Verdauung. Das so erhaltene Fragment 51 (Fig. 12) enthält den trp-Promoter-Operator und wird durch das PAGE-?erfahren isoliert, gefolgt

24 3 4 09 1 - ⁴⁹ - ⁶¹⁰⁰°¹⁸

2.7.82

von Elektroeluierung· Die TeiL-EcoRI-Verdauung ist nötig, um ein Fragment zu erhalten, das unmittelbar anschließend an das 5'-Ende des Somatostatingens geschnitten wird, jedoch nicht an der EcoRI-Erkennungsstelle geschnitten wird, die zwischen dem Gen für Ampicillin-Resistenz und dem trp-Promoter-Operator liegt» Die durch den Pstl-Schnitt im Gen für Ampicillin-Resistenz verlorengegangene Ampicillin-Resistenz kann durch Verknüpfung mit Fragment 51 (Pig· 12) wieder hergestellt werden»

In einer ersten Ausführungsform kann der dritte Bestandteil, ein Strukturgen für Tfiymosino^i durch EcoRI- und BamHI-Verdauung des Plasmids ρThoCi erhalten werden· Das so hergestellte Fragment 52 (Pig· 12) wird durch PAGE gereinigt und elektroeluiert«.

Die drei Genfragmente 49_S 51 und 52 können nun, wie in Pig. 12 dargestellt, in richtiger Orientierung miteinander verknüpft werden, um das Plasmid pTh.oC7A^J\A4, 53, zu "bilden, das aufgrund der Wiederherstellung der Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz selektiert werden kann* Wenn mit diesem Plasmid 53 der Stamm E* coli 294 transformiert wird und der Stamm unter Bedingungen gezüchtet wird, wie sie im Abschnitt I beschrieben wurden, wird ein trp-LE^}-Polypeptid-Pusionsprotein esprimiert, von dem Thymosin of1 durch Bromcyan-Behandlung spezifisch gespalten werden kann· ?/enn andere heteroIoge. Strukturgene, die EcoRI- und BamHI-Enden aufweisen, auf ähnliche Weise mit von pHKYIO, 47, und pSom7^2il4, 39, abgeleiteten Bestandteilen verknüpft werden, können ähnlich wirksame trp-IE'-Polypeptid-Fusionsproteine erhalten werden, die jeweils diejenigen Polypeptide enthalten, für welche die heterologen Gene codieren. Fig.

243409 1 "⁵⁰ * ^β100°¹⁸

2.7.82

zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-iTrennung des totalen zellulären Proteins von E, coli 294-5ransformanten, wobei die dunkelsten Banden in federn Pall das Fusionsprotein repräsentieren, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems produziert wurde. Die Spalte 1 in Fig. 11 ist eine Kontrolle, die das vollständige zelluläre Protein des Stammes E. coli 294/pBR322 enthält. Die Spalte 2 enthält das Somatostatin-Fusionsprodukt des Plasmids pSom7.<d2A4> dessen Herstellung in Abschnitt 17 beschrieben wurde. Spalte 3 ist das Somatostatin-enthaltende Expressionsprodukt des Plasmids pSom7AiA4« Spalte 4 enthält das Expressionsprodukt des Plasmids ρϋ5ι<£7Α1Δ4> wohingegen Spalte 5 <äas Produkt enthält, das durch ein Plasmid exprimiert wird, das erhalten wird, wenn die pHKYIO-abgeleiteten und pSom7A 2A4-abgeleiteten Fragmente, wie oben erörtert, mit einem EcoBI/BamHI-terminierten Strukturgen verknüpft werden, das für menschliches Proinsulin codiert, das teilweise bei der Anmelderin hergestellt wurde. Die Spalten 6 bzw. 7 enthalten, als dunkelste Banden, ein trp-LS^f-Polypeptid-Fusionsprotein, von dem in dem einen Fall die B-Kette und in dem anderen Fall die Α-Kette des menschlichen Insulins gespalten werden kann. Die B- und A-Strukturgene des Insulins werden durch EcoRI- und BamHI-Yerdauung des Plasmids pIBI bzw. pIAH erhalten, deren Herstellung bei D. Y. Goeddel et al., Proc Iat«l Acad Sei USA 76, 106 (1979)) beschrieben ist* Die Spalte 8 enthält Größenmarker, wie bereits beschrieben»

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist unter Verwendung von E. coli beschrieben. Es können jedoch wahlweise andere Enterobacteriaceen als Wirtszellen für die

24 3 4 09 1 -⁵¹ - ⁶¹⁰⁰°¹⁸

2.7,82

Expression und als Quelle für die trp-Operons dienen, von denen beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcesans zu erwähnen sind« Somit ist die Erfindung nicht auf die. geschilderten Ausführungsbeispiele beschränkt»

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren neu zu konstruierenden Plasmide sind neue, in ihrer Struktur eindeutig definierbare chemische Substanzen·

Claims (3)

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1. Verfahren zum Schneiden doppeisträngiger DWS, gekennzeichnet dadurch, daß zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle

a) die doppeIsträngige DHS in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzeisträngige DlS umgewandelt wird;

b) an die in Schritt a) gebildete Einzelstrangregion ein komplementäres Primerstück von einzelsträngiger DlS hybridisiert wird, wobei das 5'-Ende des Primers gegenüber demjenigen lukleotid liegt,' "das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt;

e) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3'-Richtung des Primers liegt, und zwar durch eine Reaktion mit DlS-Polymerase in Anwesenheit von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-enthaltenden Desorsynukleotidtriphosphaten; und

d) das verbleibende DlS-Einzeistrangstück, das über die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt werden, durch Reaktion mit einer DlS-Polymerase, die in 5^f—>3'-Richtung polymerisiert, die Exonukleasewirkung in 3'-^-> 5'-Richtung aufweist, jedoch keine lukleasewirkung in 5^%'-—>3'^f-Richtung zeigt.

2.7.82

Erfindungeanspruch

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Polymerase die Klenow-Polymerase I ist»

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