DD212267A5 - Verfahren zur herstellung einer fuer rinderwachstumshormon kodierenden desoxynucleotid-sequenz - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer fuer Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz fuer den Einsatz bei der Synthetisierung von Rinderwachstumshormon, gekennzeichnet durch Spalten einer cDNS, die fuer Rinderpraewachstumshormon kodiert, das durch Umsetzen einer fuer Rinder-Praewachstumshormon kodierenden Desoxynukleotidsequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erhaltenen DNS-Molekuel erhalten und repliziert wurde, mit dem Restriktionsenzym Hae II, und Inkubieren des gespaltenen Produktes mit einem Enzym aus der Gruppe, die aus dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, T4-DNS und 3'-5'-Exonuklease besteht.

Description

Berlin, den 6.7.1983

I* Ausscheidung aus 59 677/18

AP C 12 U/232 811/2

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Verfahren zur Herstellung einer für Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer für Rinderwachstumshonnon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz für den Einsatz bei der Synthetisierung von Rinderwachstumshormon«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Wachstumshormon ist ein Polypetid-Hormon, welches in der ^

Adenohypophyse (Hypophysen-Vorderlappen) synthetisiert und durch die Adenohypophyse sekretiert wird· Das Wachstumshormon wird als ein Vorläuferprotein (Prä-Wachstumshormon) mit einem Ii-terminalen Signalpeptid und der 7/achstumshormon-Sequenz synthetisiert.

Die Aminosäuresequenz für bovines Wachstumshormon ist er-(nittelt worden (Dayhoff, M, D. et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 3d. 5, iiachtr· 3» 245 - 352* National Siomedical Research Foundation, Washington, D, G, (1978)).

Normalerweise wird Wachstumshorni während des gesamten Lebens produziert, wenngleich die Produktion der größten Mengen während der Periode vor dem Brwachsenenstadium erfolgt. Das Hormon wird für das Wachstum in dieser Periode benötigt. Obwohl sein Mechanismus noch nicht bis ins Detail geklärt ist, so ist doch bekannt, daß Wachstumshormon das Skelettwachsturn, die Stickstoffretention und die Proteinsynthese fördert sowie den Glukose- und Lipidmetabolismus beeinflußt. Mit anderen Wortenj Wachst umshormon ist ein

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allgemein anabolisch wirkendes Agens·

Die Verwendungen von bovinem Wachstumshormon basieren auf seiner oben beschriebenen bekannten biologischen Aktivität. Bovines Wachstumshormon kann Jungrindern zwecks Steigerung ihrer Wachstumsgeschwindigkeit und ihres Massezuwachses verabreicht werden, wodurch die zwischen Geburt und Rindfleischvermarktung liegende Zeitspanne verkürzt wird· Der daraus resultierende Anstieg der Fleischproduktion könnte beträchtlich sein* Des v/eiteren unterscheidet sich bovines Wachstumshormon von ovinem Wachstumshormon durch lediglich einige wenige Aminosäuren, Polglich kann bovines Wachstumshormon an Schafe verabreicht werden, um dort die gleichen Ziele wie beim Rind, also steigende Wachstunisrate, steigenden Zuwachs und damit steigende Fleischproduktion zu erreichen» Bs ist darüber hinaus möglich, in Verfolgung der eben genannten Zwecke bovines Wachstumshormon auch an Schweine und andere Tierarten zu verabfolgen.

Inzwischen sind grundsätzliche Techniken zur Klonung von DlTS-Se quenz en bekannt. So beschreiben beispielsweise Seeburg, P. A· et al., Hature, 270, 486 (1977) das Klonen des Hatten-Wachstumshortnön-Gensj"Shine, J. 'etal., Fat ure , 270* 494 (1977) beschreiben das Klonen des humanen Somatomammotropin-Gens; Derynck, R. et al., nature« 285, 542 (1980) schließlich beschreiben das Klonen des humanen Fibroblast-Jnt erferon-Gens·

Methoden zur Darstellung heterologer DHS in einem Mikroorganismus sind nunmehr ebenfalls bekannt. Im Prinzip wird die die heterologe DlTS codierende Sequenz an einem Punkt innerhalb eines darstellbaren Operons in einen DUS-übertragungsvektor inseriert. Für die Produktion eines Hybridproteins

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muß sich die inserierte Sequenz mit der codierenden Sequenz des Operons in der Ableserahmen-Phase befinden und hinsichtlich der Translation gleichartig ausgerichtet sein« Sind diese Bedingungen gegeben, dann resultiert die Translation des Qperons in einem "Durchlesen" zur inserierten codierenden Sequenz dergestalt, daß es sich bei dem so erzeugten Protein um ein Fusionsprotein handelt, welches eine durch das expressible Operon codierte fif-terminale Amino säur e'sequenz enthält, der sich v/iederum eine durch die Einlagerung codierte Aminosäuresequenz anschließt. Siehe hierzu Polis— Icy, B. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA ₄ 73, 3900 (1976) sowie Itakura, X. et al., Science, 198, 1056 (1979). Verschiedene expressible Operons sind bereits verwendet worden, darunter jene für ß-Galaktosidase, ß-Laktamase und Tryptophan,»

Die im vorliegenden Test verwendeten Abkürzungen werden allgemein anerkannt und von kompetenten Fachleuten benutzt· So sind beispielsweise diese Abkürzungen durch das J. 3iol« Chem.» ohne weitere Erläuterung angenommen worden·

Ziel der ffrfindun^

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine Desoxynucleotid-Sequenz zur Verfügung, die bei der Synthetisierung von Rinderwachstumshormon eingesetzt wird·

Darlegung des Wesens der 5rfLadung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer für Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz für den Einsatz bei der Synthetisierung von Rinderwachatumshormon zur Verfugung zu stellen«

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In einer der vorliegenden Verkörperungen ist das Verfahren aar Herstellung eines die Rinderpräwachstumshormon-Sequenz enthaltenden DSB-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß eine das Rinderpräwachstumshoriaon codierende Desoxynukleotidsequenz niit einem DlIS-Molekül reagiert, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors Biit einem Restriktionsens^m hergestellt wurde,

Jn einer anderen Verkörperung ist die Methode weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Rinderpräwachstumshortnon codierende Desoxynukleotidsequenz einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

5' - ATG ATG GCT GGA GGC CCC CGG ACC TCC CTG

CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC GGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC. CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG GAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATG TCA CTG CTC CTC ATC GAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGI GTC 'TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCC CTG CTC AAG AAC TAC GGS CS?G CTC TCC TGG TTC CGG AAG.GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3^!,

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A = Desoxysdenyl,

G = Desosyguanyl,

C = Desoxyzytosyl und

T = Thymidyl ist.

In einer zusätzlichen Verkörperung wird eine Methode zur Herstellung einer bovines Rinderwachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß eine bovines Rinderpräwachstumshormon codierende cDUS-Desoxynukleotidsequenz mit dem Restrictionsenzym Hae II gespalten und das gespaltene Produkt mit einem Enzym inkubiert wird, daa aus der das Klenow-Fragment von DUS-Polymerase I, T4-MS-Polymerase oder 3^I..»5^t-Sxonuklease enthaltenden Gruppe ausgewählt wurde.

In einer v/ieder anderen Verkörperung ist die Methode der Herstellung der bovinen Wachstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genannten Slenow-!Fragment in Anwesenheit von dATP durchgeführt und das daraus resultierende Produkt mit S1-I\fuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäure 2,,.191 von bovinem Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

5« - TTG CGA GGC ATG TCC TTG TCC GGC GTG TTT GCC AAC GCT GTG GTC CGG GCT CAG CAC CTG CAG CAG CTG GGT GGT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG GGT ACC TAC ATC GCG GAG GGA GAG AGA TAG TCC ATC CAG AiIC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCG GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GGC

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GAG GAG AAA TGA .GAG TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTO TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG COC CTG ATG GGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CaG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT CAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC GGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG CAG ACO PAC CTG AGG CTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GOC AGC TGT GCC TTC TAG - 3^f

A = Desoxya&enyl,

G = Desoz^guan^l, C = Desox^zytosyl und T = Thymidyl ist,.

In noch einer anderen Verkörperung ist die Methode aar Herstellang der bovinen ϊ/achstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit.dem genannten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP durchgeführt wird und das daraus entstehende Produkt in Anwesenheit von dCTP mit einem Snz^m inkubiert wird, welches aus der aus dem genannten Klenow-Pragment, T4-DiiS-Polymerase oder 3'•»•5^f-Sxonuklease bestehenden Gruppe ausgeviählt wird und schließlich gekennzeichnet dadurch, daß das hieraus resultierende Produkt mit S1-Bndonuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäuren 1...191- des bovinen Wachstumshormons codierende Desocvnukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desox^nukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:

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5' - GCC TTC CCA GCC ATG ¹ICC TTG TCG GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC. CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC GAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC GAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG GAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG GTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATG CTC AAG CAG ACC TAT CAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3', wobei

A = Deso2cyadenyl,

G = Desoxyguanyl,

G = Desozyzytosyl und

T = Thymidyl ist ·

In einer zusätzlichen Verkörperung ist das die bovine Prä- tfachstumshormon-Sequenz enthaltende Plasmid pB?348 dadurch, gekennzeichnet, daß es sich bei dem durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restrikt ionsenzyai hergestellten MS-Molektil um pBR322 und bei dem Restriktionsenzym um Pst 1 handelt,

In einer ?/ieder anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines die bovine Wachstumshormon-Sequenz enthaltendes DUS-übertraguagsvektors dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellte, das bovine Wachstumshormon codierende

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Desoxynukleotid-Sequenz mit einem DUS-Molekiil zur Reaktion gebracht wird, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.

In einer noch anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Expressions-übertraguagsvektors dadurch gekennzeichnet, daß das durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym erzeugte DliS-Molekül an einem Punkt innerhalb einer expressiblen Kontrollregion gespalten wird·

In einer zusätzlichen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, welches die Aminosäuresequenz von bovinem Prä-Wachstumshormon oder die Aminosäuresequenz von bovinem Wachstumshormon als G-terminales Ende und einen leil eines prokaryοtischen Proteins als H-terminales Snde umfaßt, durch Inkubieren eines Mikroorganismus gekennzeichnet, welcher durch einen Expressions—Übertragungsvektor transformiert wurde, wobei dieser eine das genannte bovine Prä-Wachstumshormon oder das genannte bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz enthält.

In wieder einer anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Synthese von bovinem Wachstumshormon durch Inkubieren eines durch einen Expressions-Übertragungavektors transformierten Mikroorganismus sowie durch Herausreinigen des bovinen Wachstumshormons aus dem Lysat oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus gekennzeichnet, wobei der genannte Übertragungsvektor eine Desozvnukleotidsequenz enthält, welche das genannte bovine Wachstumshormon unter Bedingungen codiert, die für die Darstellung der genannten bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz geeignet sind«

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Die vorliegende Erfindung offenbart insbesondere das Klonen einer das bovine Prä-Wachstumshormon oder das bovine Wachstumshormon codierenden DiTS sowie die Darstellung der geklonten DUS in einem Mikroorganismus,

• ο ^-

Aus bovinen Hypophysen wird mRiTS isoliert, welche das bovine Prä-Wachstumshormon codiert. Eine umgekehrte Abschrift (eine cDIJS-Kopie) der mRxIS wird hergestellt und in einen Übertragungsvektor inseriert. Sine das bovine Wachstumshormon codierende Desosynukleotid-Sequenz wird durch Hydrolisieren der die Prä—Sequenz der cDMS für bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz zubereitet. Der Übertragungsvektor wird zur Transform!erung von Bakterien verwendet, mit deren Hilfe die geklonte cDNS dargestellt wird.

Durch Anwendung der cDIiS-Methode wird eine das bovine Wachstumshormon codierende Dl¹JS-Sequenz gewonnen. Die grundlegenden Techniken der cDNS-Methode sind bekannt und können den Darlegungen von Seeberg, P. H« et al« (siehe oben) sowie Derynck, R* et al« (siehe oben) entnommen werden». Die cDHS wird unter Verwendung einer RiTS-Präparat ion synthetisiert, welche aus bovinen Hypophysen - als Schablone - extrahiert wurde.

Die RUiS wird mittels herkömmlicher Techniken aus bovinen Hypophysen isoliert. Polyadenylierte HHS ¥/ird mitbeis Affinität s-Chromatograf ie isoliert. Die Reinheit der polyadenylierten RiTS wird durch Vornehmen einer zellfreien Translation der polyadenylierten RES gemäß Beschreibung von Miller, W. L. und McCarthy, 3. J., J. Eiol. Chem., 2j>4, 742 (1979) sowie Material, J. A. et al., Pro ο» flat. Acäd. Sei« USA, 74, 1816 (1977) und durch Analysieren der produzierten Proteine durch'SDS-Akrylamid-Blektrophorese gemäß Beschreibung

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von Laemmli, U. K., Sature, 227. 680 (1970) abgeschätzt. Bovines Wachstumshormon wird'des weiteren durch eine von Martial, J. A. et al«, ?roc. Hat. Acad. Sei, USA (siehe oben) beschriebene Immunpräzipitations-Reaktion identifiziert»

Die polyadenylierte R2IS wird als Schablone unter Anwendung herkömmlicher Techniken aur Herstellung einer doppelständigen cDHS-Kopie verwendet. Der erste cDiTS-Strang wird mittels umgekehrter Transkriptase, mittels eines Oligo-dT-Primers und der polyadenylierten RNS gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Monahan, J. J. et al., Bio ehern«» 15, 223 (1976) synthetisiert. Die RIiS wird durch Alkaliverdauung entfernt, un die einstrangige cDNS wird zur Selbst-Primung der Synthese des zweiten Stranges durch umgekehrte Transkriptase verwendet. Die einst rangige Haarnadelschleife wird durch Verdauung mit S1-iTuklease (Leong, J. A, et al., J. Virol.„ %891 (1972) beseitigt, wie dies von Ullrich, A; et al., Science, 196, 1313 (1977) beschrieben wurde,

Die cDlTS ist nun zur Insertion in einen geeigneten Übertragungsvektor bereit. Zu den geeigneten Übertragungsvektoren gehören jene, welche in der Lage sind, Bakterien wie etwa . ascherichia coli und Bacillus subtilis, Hefe (Saccharose/ces cerevisiae), die inl-, csp- und esp-oiutanten Stämme von ITeuroapore crassa und tierische Zellen in Gewebekultur zu transformieren. Beispiele für ubertragungsvektoren, die zur Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind und B« coli transformieren können, umfassen die Plasmide pSC101, pMB9, pBR313, pBR315, p3R3i6 und pBR322 sowie die vom Bakteriophagen abgeleiteten Vektoren, d. h. Gharon

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und

gtWES·

In Tabelle 1 sind Quellen aufgeführt, in denen die Präparation und die kennzeichnenden Merkmale dieser Übertragungsvektoren beschrieben werden«

Tabelle

tfbertragungsvektor

Quelle/en

pSC1Q1

pBR 313 pBR 315 pBR 316 pBR 322

Charon 3A

Charon 4A Charon i6A gtWSS . B

Cohen, et al·, Proc. Ifatl. Acad« Sei. USA,

JO₉ 1293 und 3240 (1977). Boyer, et al·, Recombinant Molecules, Beers,

et al., Sds. Raven Press, HY, Seite

(1977).

Cohen et al., Recombinant Molecules, Seite Rodriguez et al., Molecular Mechanismus in

Control of Gene"Expression (ICN-UCLA Symposium on Mol. & Cell. Biol«"Bd* 5)» Uiealich et al., Eds., Academic Press, HY, Seite 471 (1976). 3olivar, et al*, Gene, 2, 75 (1977). Bolivar et al. (siehe oben) Rodriguez et al., (siehe oben) Rodriguez et al., (siehe oben) Bolivar et al., Gene, 2,95 (1977). Bolivar et al-, Gene, 4, 121 (1978). Sutcliffe, Gold Spring"Harbor Symp« on Quant. Biol.,43, 77 (1978).

Blattner et al., Science, 196, 161 (1977). 31attner et al.,, (siehe oben*). Blatsner et al., (siehe oben). Tremeier et al., Hat ure, 263* 526 (1976). Leder et al., Science, 196, 175 (1977).

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Andere zur Tranaformierung von Ξ. coli geeignete Vektoren sind bei Sinsheimer, R. L«, Ann. Rev, Biochem. 46, 4t5 (1977) beschrieben-, Zur Transformierung von B. aubtilia geeignete Übertragungsvektoren sind von Iordanescu, S., J, Bacteriol. 124, 597 (1964) und Ehrlich, S. D., Proc. Hatl. Acad. Sei. USA 24, I68O (1977) beachrieben worden» Sin derartiger Vektor iät als Plasmid pC194 identifiziert worden. Hybridplasmide mit Gehalt an Hefe-DHS — aowohl Plasmidala auch/oder chrotnoaomaler DIiS -- und bakterieller DIS — z« B. Plasmid — werden zur Transformierung von Hefe verwendet· Derartige Plasmide aind von Beggs, J. D», Hat ure, 275, 104 (1978); Aaiav, G. L. und Garbon, J.,. Proc,'latl _a Acäd, .Sei·; USA J6, 3829 (T979) sowie von Kingaman, A* K* et al«,_a Gene 2> 141 (1979) beachrieben worden. Zu den Übertragungsvektoren, die zur Tranaforaierung von Tierzellen in Gewebekultur verwendet werden können, gehören daa Adeno— defektive Virus, daa SV-defektive IZirus und das Polvonia-Virus.

Unter Anwendung konventioneller Techniken wird die cDIiS in einen Übertragungsvektor inseriert. Die cDlIS wird gewöhnlich in irgendeine im. Übertragungsvektor nur einmal existierende Restriktionsstelle inseriert* Charon 3A und 4A sowie auch gt WES , 3- enthalten keine solchen einmaligen Stellen; für diese Vektoren werden demzufolge Restriktionsstellen von begrenzter Anzahl herangezogen. Die einmaligen Restriktionasteilen in den verschiedenen Übertra—

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gungsvektoren and die nutzbaren Restriktionsstellen in den Vektoren Charon 3A und 4A sowie gt WES . B sind in Tabelle 2 aufgeführt»

Tabelle 2

Übertragung^ vektor Einmalige Restrikt ions st eilen

pSC1O1

pMB9 PBR313

pBR315, pBR322

pBR3i6 pC194

Charon 1βΑ Charon 3A Charon 4A gt WES ,

ScoRI, Hind . Ill, Sal I, Bam HI,

Hpa I₅ Sma I

ScORI, Hind III, Sal I, Bam HI, ScoRI« Hind III, ,Sal I, Bam HI,

"Hpa I,"Sma I, Xma I ScoRI, Hind'III, Sal I, Bam HI,

- Pst I "- -

Hind"III, Sal I, Barn HI, Pst I Hind III " ScoEI, Sst I ScoRI " ScoRI

ScoRI

Generell wird die cDIiS zur Erleichterung der Selektion in eine innerhalb eines phänotypischen Merkmals gelegene Restriktionsstelle inseriert. So befinden sich beispielsweise Hind III, Sal I, und Bam HI in pSC101, pMB9, pBR313, pBR315, pBR3i6 und pBR322 innerhalb des Gens für Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit oder dessen Kontrollregion, Die Sinlagerung an dieser Stelle resultiert in einem Verlust an Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeite Die cDIiS kann in den Übertragungsvektor durch Anwendung von Restriktionsstellen-Verbindern oder durch Desosynukleotid-Schwanzbildung inseriert werden. Bei der erstgenannten Methode kann ein synthetisches üiukleotid, welches eine Rekognitionsst eile für eine einzelne

^s -H- 6*7.1983

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Restrikt iona-Bndonuklease von der oben diskutierten Art enthält, am stumpfen Ende mit der cDitfS verbunden werden* Die cDHS und der Übertragungavektor werden separat mit der Restriktiona-Sndonuklease inkubiert und sodann gekühlt, um den die cDIiS enthaltenden übertragungsvektor zu formieren. Bei der letztgenannten Methode kann die cMS unter Verwendung eines Desosynukleotids und terminaler Transferase, wie. sie von Roychoudhurv, R. et al.»., Hucl. Acids Res«, 3, 8β3 (1976) beschrieben wurde, zur Schwanzbildung gebracht werden» In der gleichen Vorgehensweise kann der Übertragungsvektor nach. Verdauung mit einer Restriktions-Sndonuklease bei Verwendung des komplementären Desoxynukleotids zur Schwanzbildung gebracht werden* Der geschwänzte Übertragungsvektor und die geschwänzte cDUS werden dann gekühlt, um den eDUS-haltigen Übertragungsvektor zu formieren. So kann die cDETS beispielsweise dC-geschwänzt aein, und der Übertragungsvektor kann an der PaJb-I-Steile geöffnet und dG-ge- schwänzt sein,

Der cDlfS-haltige Übertragungsvektor wird nun zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet, Zu den für die verschiedenen Übertragungsvektoren geeigneten Wirten gehö— ^ren 3, coli, B. subtilia. Hefe,.H. erasaa und Tierzellen in Gewebekultur·'Die zur Transformierung jedes dieser Wirte befähigten Übertragungsvektoren sind bereits oben beschrieben worden, Herkömmlicherwei3e werden drei mutante Stämme ^von ^* coli verwendet. Es handelt sich hierbei um 1776, RRI und HB1O1 . 5, coli 1776 ist bei Curtis, R,, Ann, Rev, Microbiol, ^0, 507 (1976) und im US-PS Ur. 4 190 495 beschrieben worden, B,'coli RRl ist bei Dugaisz^k, A, et al,, Molecular Mechanismus in Control of Gene Sbcpressions^Seite 543 beschrieben worden; E, coli HB 101 schließlich ist bei Kedes, D, H, und Thomas, C, A,, Proc, Hatl, Acad, Sei,

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USA 73, 1537 (1976) beschrieben worden.

Die geeigneten Wirte werden vermittels herkömmlicher Techniken transformiert. Beispielsweise wird S. coli 1776 durch den yon Cooke, ϊί. E. et al«, J. Biol, ehern«, 255, 6502 (1980) beschriebenen cDIiS-halt igen Übertragungsvektor transformiert. Ebenfalls durch konventionelle Techniken werden Kolonien selektiert und/oder einem Screening unterworfen« So können Kolonien beispielsweise auf der Basis des Verlustes von einem phänotypischen Merkmal wie etwa der Tetrazvklin-7/iderstandsfähigkeit selektiert werden. Das Screening der Kolonien kann (1) durch Beseitigen der cDUS durch eine geeignete Restriktions-Sndonuklease sowie Analyse mittels Elektrophorese und Hybridisation (Southern, B. IvI,, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975) oder (2) Replika-Plattieren nach der Beschreibung von Grunstein, M, und Hogneas, p» S., Proc. jJat. Acad. Sei« USA, 72, 3961 (1975) und Hybridisieren mit'einer geeignet en"Sonde oder schließlich (3) durcda Prüfung der Kolonien direkt hinsichtlich ihrer Darstellung mittels Radioimmunoassay oder anderen Techniken vorgenommen werden.

Die bovines Wachstumshormon codierende DlJS kann aus jener Einlagerung gewonnen v/erden, welche bovines Prä-Wachstumshormon codiert, Die das Prä-Hormon codierende DIiS wird durch eine geeignete Restriktions-Sndonuklease beseitigt, 1st zum Beispiel die cDITS in die Pst-1-3teile des Plasmids pBR322 eingelagert, dann kann die cDiTS-Sinlagerung durch teilweise Verdauung mit Pst I entfernt werden, da die cDxTS für bovines /Zachst umshortnon zwei interne Pst-I-St eil en enthält. Andererseits kann das von pBR322 abgeleitete rekombinate Plasoiid mit Hae II verdaut werden, um einen Teil der cDHS-Sinlageruhg zu entfernen. Die Hae-II-Verdauung beseitigt die das 21-terminale Signalpeptid codierende DlTS sowie zwei der

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drei Basen, die das U-terminale AIa des Wachstumshormons codieren« Diese Baaen werden durch Inkubieren der Einlagerung mit dem Xlenow-Fragment der DltfS-Polymerase I und der Desoc^nukleotide ersetzte Andererseits können die AIa codierenden Basen durch Inkubieren der cDITS mit IQenow-fragment,. T4-DUS-Polymerase oder V ·..-5'-S£onuklease in Anwesenheit von dATP ausgestrichen werden. Das IQenow-Fragment ist von Klenow, H. und Henningsen, I«, Proc« Fatl. Acad. Sei« USA, 65, 168 (1970) beschrieben worden. Die Wachstumshormon, codierende cDNS wird nun in der oben beschriebenen V/eise in einen geeigneten Übertragungsvektor inseriert*

Die geklonte DHS wird in Bakterien dargestellt, um entweder ein Pusionsprotein su erbringen, welches das durch die in-, serierte Sequenz codierte bovine Wachaturnshormon enthält, oder aber um das Wachstumshormon selbst zu erbringen. Verschiedene mögliche Techniken stehen zur Wahl, sie können beinhalten (a) die Modifikation der codierenden Sequenzen zwecks Srlahgung eines genau erwünschten Übertragenden Startpunktes; (b) die Selektion oder Konstruktion eines optimalen Expressionsvektors und (c) die nach der übertragung erfolgende Bearbeitung entweder durch Ausnutzung der in-vivo-Bearbeitungsaktivität des Wirtes oder in vitro durch chemische Mittel und (d) die direkte Darstellung.

Wo ein Pusionsprotein hervorgebracht wird, wird die Modifikation der geklonten iJukleotidsequens im allgemeinen solange unnötig sein, solange die resultierende Sequenz die. Translation der Sinfiigung ii_ richtigen Ableserahmen ermöglicht und keine Stop-Kodone vor dem Anfangskodon der inserierten Sequenz intervenieren. Wachstums—Prähormon oder Wachstumshormon werden als ein Pusionsprotein durch Insertion der cDxiS in geeignete Stellen innerhalb ausgeprägter

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Operons (Expressionsvektoren) dargestellt, ao etwa unter Einbeziehung der Pst-I-Steile im.ß-Laktamase-Gen von pBR322 (Yilla-Komäroff, L. et al·, Proc. Hat, Acad. Sei.. USA, 75, 3727 (1978); Serburg, P. et al., !Tature 274, 795 (1978)), der BcoRI-Stelle von pBR322, die die lac-Ivontrollregion und ß-Galaktosidase codierende Sequenz trägt (Itakura,. K., siehe oben) oder unter Einbeziehung der Hind-III-Steile des trpD-Gens von Plasmid ptr_DED5O (Martial, J. et al·, Science, 205, 602 (1979)).

Modifikation der Sequenzlänge durch ein oder zwei Nucleotide zwecks Erreichung der korrekten Ablesungsphase sind im Fachgebiet weithin bekannt. Einfügungen an der Pst-I-Stelle von pBR322 mit dem Ziel der Schwanzbildung kommen'mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 : 6 in korrektem Phasenzustand und Ableserahmen vor. Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden aus Fusionsproteinen hergestellt, die einer spezifischen Spaltung in vitro zugänglich sind. Die geklonte ITukleotidsequenz wird"modifiziert, um jene Aminosäuresequenzen zu codieren, welche die Spezifität für ein proteolytisches Enzym erbringen. Sine dafür geeignete Sequenz ist AspAspA'sp AspLys, die vorzugsweise durch das Bnzym Enterokinase gespalten wird· Hierzu liegt die Beschreibung in der Anmeldungsschrift der Serien-Ur. 125 878, eingereicht am 29. Februar 1980, vor. Wie dort ausgeführt, wird eine, die oben genannte Aminosäuresequenz codierende koppelnde liukleotidsequenz nächst der den erwünschten Aminoterminus von Wachstums -Prähormon codierenden Uukleotidsequens inseriert.

Eine derartige Insertion erfordert beim Wachstums-Prähormon die Modifikation der originalen cDiiS-Sinlagerung durch Beseitigen der Nucleotide auf dem 5'-Ende der das Wachstums-Prähormon codierenden Sequenz. Die cDiJS-Sinlagerung für

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Wachstumshormon - oben beschrieben - bedarf keiner Modifikation, Die Modifikation der Einlagerung 'für Wachstums-Prähormon erfolgt entweder durch kontrollierte Verdauung des 3'-Endes der Einfügung mitsels 3^!-Endonuklease oder T4-DNS-Polymerase, oder aber durch die Kombination von Restriktions-Bndonukleasespaltung an einem Punkt an der 5'-Seite des gewünschten Startpunktes gemeinsam mit chemischer Synthese zum Zweck der Wiederherstellung jenes so entfernten Teiles der gewünschten Sequenz«, «eitere Einzelheiten dieser Vorgehensweisen sind der U.S.-Patentanmeldung der Serien-STr. 125 878 zu entnehmen« Bei Anwendung dieser Methodik vorzugsweise unter Einsatz von T4-D!TS-?olymerase und 31-luklease - wird die das Wachstum-Prähornion codierende cDiTS-Sequenz ohne die nichtübersetzte 5'-Hegion gewonnen« Die die vorangehende Aminosäuresequenz cordierende Verbinder-Uukleotidsequenz wird.durch DHS-Ligase gemäß Beschreibung von Valenzuela et al., Hature, 280, 815 (1979) jener cDNS-stumpfendig verbunden, welche entweder Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon codiert» Die modifizierte cDliS-Sequenz wird in der oben beschriebenen Weise in einen Pusionsprotein -Sxpressionsvektor inseriert. Wirtabakterien wie etwa -g« coli H31Q1, RHI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen« Transformanten werden hinsichtlich Ampizillin-Resistenz selektiert« Die Transformanten werden sodann unter Bedingungen angebaut, die für die Darstellung des Pusionsproteins günstig sind· Hach der Darstellung des Fusionsproteins wird das Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon durch enzymatisch^ Hydrolyse mittels Enterokinase herausgespalten»

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Durch Verwendung geeigneter Expressions-Übertragungsvektoren wird das Wachstums-Prähormon der vorliegenden Erfindung auch direkt dargestellt, d. h. nicht an irgendein prokaryotisches Protein angeschmolzen. Das der direkten Darstellung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß das inserierte DiTS-Segment vollständig jenes codierende Segment ersetzt, welches normalerweise durch die bakterielle Kontrollregion transkribiert und übersetzt wird« Die zu bewahrende essentielle Komponente der Kontrollregion wird als Expressionseinheit bezeichnet» Die Expressionseinheit umfaßt einen Promotor und eine zum Wirken im Wirtsorganismus befähigte ribosociale Bindungsstelle. Es ist nicht erforderlich,, die den Wirtsanteil des Pusionsproteins codierenden lukleotide in ihrer Gesamtheit zu beseitigen. Die Beziehung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startkodon (AUG) ist solcherart, daß der Startkodon irgendwo innerhalb der 3 bis 11 Uukleotide der ribosomalen Bindungsstelle angesiedelt werden kann (Shine, J. et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA_? 11, 1342 (1974) und Steitz, J._t..~Proc. lato Acad. Sei« USA, 72, 4734 (1975). In dieser 3.*»11-Hukleotidregion setzt das zuerst angetroffene AUG den Ableserahmen für die 'Transkat ion» Im Falle des vom oben beschriebenen ptrpED5O abgeleiteten ptrp£3O» das den Operator, Promotor, Attenuator und die Ribosom-Binduagssequenzen des Tr^ptophan-Operons gemeinsam mit der Uukleotidsequenz enthält, welche sieben Aminosäuren des trpE-Proteins mit anschließender Hind-III-Steile codiert, schafft die Beseitigung eines Minimums, von 23·..29 Hukleotiden von der Hind-III-Steile einen Platz für die Insertion in eine Sxpressionseinheit unter Tryptophan-Operonkontrolle.

Pur die direkte Darstellung von Wachstums-Prähormon wird die orginale cDUS-Einfügung in oben beschriebener Weise

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modifiziert, um die unübersetzte 5'-Segion zu entfernen· Sin Vektor für die direkte Darstellung kann durch Modifikation von ptrpE30 konstruiert werden, indem die 23.»»29-. IJukleotide unter= Verwendung von T4-DETS-Polymerase und 31-Uuklease in der oben beschriebenen Weise entfernt werden* Sine die Restrikt ionssequenz fur 3am-HI-Endonuklease enthaltende Verbinder-Nukleotidsequenz"wird stumpfendig durch die von Valenzuela et al· (siehe oben)·beschriebene Vorgehensweise sowohl mit der modifizierten cDl\fS-Einfügung als auch mit dem modifizierten ptrpE3Q verbunden. Dies erfolgt zur Erleichterung der Insertion, welche im wesentlichen in der von. Ullrich, A, et al., Scienae, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise vorgenommen wird. Geeignete Wirte wie etwa S« coli KBTQ1, RHI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch"jene rekombinaten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen* Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin ausgewählt und dann unter Bedingungen angezogen, -die für die Darstellung von ?/achst ums-Prähormon günstig sind·

Wachstumshormon kann direkt mit der von Goeddel D. V. et. al·, Hat ure+ 281, 544 (1979) beschriebenen Methode dargestellt y/erdeh. Andererseits kann eine die Bam-HI-Stelle und den Startkodon (AUG) enthaltende Verbinder-Mukleotidsequenz stumpfendig'mit der Wachstumshormon codierenden cDEiS verbunden werden. Diese modifizierte cDUS wird dann in der oben beschriebenen Vieise in das modifizierte ptrpE30 inseriert.

.Wachstums-Prähormon wird durch Entfernen der 33-terminalen Sequenz der signalpeptidhaltigen hydrophoben Aminosäuren 2SU Wachstumshormon umgewandelt. Die in-vitro-Bese it igung

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des Signalpeptids könnte durch Behandlung des aus transformierten, induzierten-Zellen extrahierten Proteins mit einer Präparation-von "rohen'^Tikrosomen ausgeführt v/erden, wie dies von Jackson, R. C. und Blobel, G., Proc. Mat. Acad. Sei. USA« 74, 5598 (1977) beschrieben wurde. Die in-vivo-Beseitigung des Signalpeptids kann während der direkten bakteriellen Ausbildung der Wachstums-Prähormon codierenden Sequenz vorkommen. Bakterielle und von Säugern stammende Signalpeptide weisen Sequenzähnlichkeiten auf. Proteine mit Säuger-Signalpe pt i den können durch bakterielle Zellen bearbeitet werden; dies resultiert in einer JEbckretion ύοω. Wachstumshormon¹ in den periplasmatischen Raum oder in das Medium»

Wachstums-Prähormon und Wachstumshormon, in der beschriebenen Weise synthetisiert, werden durch bekannte Techniken wie beispielsweise Gel-Piltrat ion, Ionen-Austauschchromatografie, Affinitäts-Ghromatografie und Differential-Löslichkeit st echnik en gereinigt.

Die Sinzelheiten der vorliegenden Erfindung sollen weiter durch die folgenden Ausführungsbeispiele beschrieben werden. In diesen Ausführungsbeispielen wurden die Verdauungen mit Restriktions-Sndonukleasen unter Bedingungen ausgeführt, die für jedes Enzym optimiert worden waren. Restriktions-Indonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellen-Spezifitat sind im einzelnen von Roberts, R·, Crit. Rev₀ Biochem., jl·, 123 (1976) beschrieben worden. Die"Enzyme wurde auf kommerziellem Wege bezogen und - sofern nicht anders angegeben unter optimalen Bedingungen gemäß den Empfehlungen der Hersteller eingesetzt. Umgekehrte Transkriptase wurde ebenfalls kommerziell bezogen· Die Verwendung. von unigekehrter Transkriptase sowie geeignete Reaktionsbedingungen aind vor dem bereits von Seeburg, P. H. et al., Mature« 276, 795 (1978),

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Seeburg, P. H. et al. (siehe oben) sowie Shine, J. et al» (siehe oben) beschrieben worden, Weiteriiin wurde 14-DIiS-Polymerase kommerziell bezogen. Die Verwendung von ¹T 4-DHS-Polymerase sowie geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits in der Anmeldung der Serien-Hr. 125 878 .beschrieben worden,. Einsatz von 31-lTuklease, welche ebenfalls auf kommerziellem Wege bezogen wurde, und geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits von Ullrich, A, (siehe oben) beschrieben worden. Weiterhin wurde tersninale Desoxynukleotid-Transferase auf handelsüblichen Wege bezogen» Die Anwendung dieses Endzyms sowie die hierfür passenden Reaktionsbedingungen sind von Rovchoudhury et al,, (aiehe oben) mitgeteilt worden. Auch das Klenow-Pragment von DxiS-Polymerase I Yiurde handelsüblich bezogen*.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert,

Ausführungsbei3piel 1 ' .

Synthese von boviner Wachstums—Prahormon-cDITS

7/eibliche bovine Hypophysen wurden hurz nach Schlachtung der Spendertiere gesammelt und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Gesamt-RUS wurde durch Homogenisieren der Hypophysen in einer Guanidin-Thiozyanat-Lösung hergestellt (Chirgwin, J, M, et al,, Bio ehern,,. 18, 5294 (1979)). Die RlTS wurde entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A, et al. (siehe oben) durch 5,7M GsGl zentrifugiert. Sodann wurde "die RiIS mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Polyadenvlierte RIiS wurde unter Anwendung

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der Qligo-dT-Zellulose-Affinitätschromatografie gereinigt (Miller.und McCarthy - siehe oben - sowie Aviv, H. and Leder, P., Proc. Hat, Acad. Sei. USA, 69, 1408 (1972)). "

Die polyadenylierte RIiS wurde gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Martial, J.. Α« et al. (siehe oben - 1977) unter Verwendung von Xaninchen-Retikulozyten in ein zellfreies System umgesetzt. Das in diesem System synthetisierte bovine Wachstums-Prähormon wurde mittels eines heterologen antiovinen Wachstumshormon-Antiserums immunpräzipitiert und durch Adsorption an formal infixiert en Staphylococcus aureus Cowan Stamm I gemäß Beschreibung von Martial, J. A. et al« (siehe oben - 1977) präpariert, Die 35 S-Proteine wurden.gemäß Beschreibung von Laemmli (siehe oben) der Elektrophorese auf plattenartigen 1 2,5-7^r-SDS-Polyakrylamid-Gelen untersogen. Diese Analyse zeigte, daß die bovines Wachstums-Prähormon codierende polyadenylierte RIiS etwa 12,6 fo der gesamten pituitären polyadenylierten RIiS ausmachte.

Polyadenylierte RxJS wurde unter Einsatz von Umkehrtranskriptiase nach der von Miller und McCarthy (siehe oben) beschriebenen Methode sowie nach der von Monahan et al, (siehe oben) beschriebenen Methode in einzelstrangige cDiiS umgekehrt transkribiert. RxTS wurde durch alkalische Hydrolyse beseitigt. Die einzelstrangige cMS wurde mit Phenol extrahiert, über G-50 Sephadex (Handelsmarke) chromatografiert und einer Sthanolpräzipitation untersogen. Die einzelstrangige cDHS wurde dazu benutzt, die Synthese des aweiten cDItfS-Stranges mittels Umkehrtranskriptase in oben beschriebener Weise selbst in Gens zu setzen. Die einzelstrangige "Haarnadelschleife" am 3'-Snde des-ersten cDiJS-Stranges wurde entsprechend"der Beschreibung von Leong et al., (siehe

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oben) und UlIrich, A. et al. (siehe oben) durch Verdauung mit S1-3$uklease beseitigt,-Die do ρ pel st rangige cDjJS wurde mittels Phenolextraktion, Chromatografie über G-50 Sephadex und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die doppelstrangige cDUS wurde laut Beschreibung von Roychoudiiury et al. (siehe oben) unter Verwendung von dCTP und terminaler Transferase 3'dCMP-geschwänzt.

Das Plasmid pBR322 wurde durch Pst-i-Endonuklease gespalten und mit dGMP vermittels der oben beschriebenen Schwanzbildungsprozedur geschwänzt, wobei allerdings anstelle von dCTP d-GTP eingesetzt wurde« 50 ng des dG-geschwanzten, Pst-I-gespaltenen Plasmids pBR322 sowie 20 ng'der dC-geschwänsten doppelstrangigen cDlfS wurden in einer 50- yul-Reaktion gemäß Cook et al« (siehe oben) gekühlt«

Die Transformation von E« coli 1776 mit der Plasmid-Prä paration wurde folgendermaßen ausgeführt: B. coli 1776 wurde durch 20minütige Inkubation bei 4 ⁰G in 75 mM CaGl₂, 5 ml/l MgCIp und 10 mM Tr is (pH 7,5) für DITS permeabel gemacht« Plasmid und Bakterien wurden 60 min bei 4 ⁰C und daran anschließend 2 min bei 41 ⁰G inkubiert. Die transformierten Kolonien wurden hinsichtlich Tetrazvklin-Resistenz selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DNS wurde durch

32 Kolonie-Hybridisierung an frisch präparierte P-aarkiarte bovine Hypophysen-cDHS gemäß Beschreibung von Grunstein und Hogenss (siehe oben) nachgewiesen« Aus selektierten Kolonien wurde Plasmid-DUS präpariert, mit Pst 1 zerschnitten, auf 1%iger Agarose-einer Elektrophorese unterzogen, mit Bthidiumbromid gefärbt, fotografiert und schließlich nach der Methode von Southern (siehe oben) auf Hitrozellulosefilter übertragen. Das Vorhandensein von Wachstumshormonsequenzen in der übertragenen DHS wurde durch H^bridisa-

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tion an geklonte Rattenhormon-DNS voller Länge abgeschätzt (Seebarg, ?♦ H. et al* - siehe oben), welche durch Einschnitt-Translation markiert worden war (Maniatis, R, et al«, Proc. 'Hat· Acad. Sei. USA 72, 1184 (1975))* Sin Klon wurde gewonnen, welcher mit der durch Einschnitt-Translation markierten DMS hybridisierte. Dieser Klon erhielt die Bezeichnung pB348* Die Einlagerung enthält 831 Basenpaare.

Aus führung sb ei a pi el 2

Sequenzanalyse der cDSTS. Plasmid pBP348 wurde mit Pst I zerschnitten, das"Phosphat an den 5'-3nden des DNS-Fragments wurde mit alkalischer Phosphatase entfernt und unter 7er-

32

Wendung von Polynukleotid-Künase durch P-Phosphat ersetzt« Weiteres Zerschneiden mit einer Reihe anderer Restriktions-Bndonukleasen, Polyakrylamidgel-Elektrqphorese sowie färben und autoradiografische Untersuchung der DiTS-Banden ergeben eine Restriktionskarte der geklonten DiJS, Ifun wurde eine große Charge pBP348 präpariert und mit Pst I, Pvu II oder

32 —— Sau 3A zerschnitten sowie mit P ATP und Pölynukleotid-

Xinase markiert und dann mit anderen Enzymen, zerschnitten, um DUS-Pragmente zu erbringen, die an einem einzelnen Ende markiert sind« Diese Fragmente wurden durch Slut ion aus Polyakrylamidgel präpariert und nach der Beschreibung von Cooke et al. (siehe oben) sowie Maxam, A. M. und Gilbert, 7/., Proc. Hat. Acad_a Sei. Ü5A„ 74, 1560 (1977) in ihrer Sequenz'dargestellt. Die Sequenz für die'inserierte cDUS ist in Abbildung 1 gemeinsam mit der entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenz dargestellt, welche durch den Empfindungsstrang, d. h. den sequentiell der jeweiligen mRUS entsprechenden Strang codiert wird.

Der korrekte Ableserahmen wird an einem Fehlen von Terinina-

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tionskodonen über einen beträchtlichen Anteil der Einlagerung hinweg wiedererkannt. Die Homerierung der Aminosäurepositionen erfolgt mit der amino-terminalen.Aminosäure von bovinem Wachstumshormon beginnend und in der positiven Richtung fortsetzend bis zum Karboxy-terminalen Endej in der negativen Richtung läuft-die Numerierung bis zum ersten AUG-Kodon, vorausgesetzt, daß es sich dabei um den Punkt der Translationsinitiation handelt.

Unsere Befunde deuten darauf hin, daß - gemeinsam mit vielen anderen Hormonen - die Synthese von Wachstumshormon eine nach, der Translation erfolgende Umsetzung mit einschloß· Die Translation von Wachst umshormon-mPJiS erbringt einen Vorläufer (Wachstums-Prähormon), welcher ein Signalpeptid enthält, das während des Transits in das endoplasmatische Retikulum freigesetzt werden kann.

Ausführungabeispiel ß

(A) Ausführungsbeispiel 1 wird, wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR315 verwendet wird. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion der rekombinanten iilone entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung. Die Einlagerung wird entfernt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Als Ausbeute wird eine DIiS von etwa 831 Basenpaaren mit der iii Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen,

(B) Ausführuhgsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei ansteile von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i6 verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen identisch. Die Beseitigung und Analyse der Einlagerung gemäß Ausführungsbeispiel 2 erbringt eine DNS mit der

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in Abbildung 1 gezeigten Sequenz«

AusführungsbeisOiel 4

Pur dieses Ausführungsbeispiel wird die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende cDiiS in der im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen W_eise hergestellt. Alle in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktionsstellen-Verbinder werden nach der von Scheller R» H, et al,, Sciense 196, 177 (1977) beschriebenen Methode zubereitet,. Die in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktions-Bndonukleasen sind im Handel zu beziehen; die gewählten optischen Bedingungen richten sich nach den Empfehlungen der Hersteller. Die Transformation von S, coli 1776 erfolgt in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise,

(A) Hiiid-III-Verbinder mit der Sequenz 5^f - CGAAGGTGG - 3' werden der in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten cDUS durch atumpfendige Ligation unter Einsatz von 14-DlTS-Ligase verbunden, wie dies von Valenzuela, P. et al,, Nature, 230, 815 (1979) beschrieben worden ist» liach der ligation wird das Produkt mit Hind IU oder Hsu I-entsprechend der von Ullrich, A, et al, Science 196, 1313 (1977) beschriebenen Vorgehensweise verdaut, Ebenfalls nach der von Ullrich, A« et al, (siehe oben) beschriebenen .Vorgehensweise wird Plas-ELid p3R322 an der H_ind-III-Restrikt ionssteile entv/eder mit Hind III oder Hsu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt, Hach der Ethanolausfällung wird das phosphatasebehandelte gespaltene pBR322 der kohäsive Hind-III-Termini enthaltenden cDIiS gemäß Beschreibung . von Ullrich, A. et al (siehe oben) verbunden, Ξ, Coli 1776 wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und die trans-

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formierten Kolonien werden hinsichtlich ihrer Tetrazole!InResistenz selektiert.. Das Vorhandensein von geklönter DHS wird entsprechend der Beschreibung in Ausführungsbeispiel Λ bestimmt. Gewonnen wird eine Kolonie, welche eine Einlagerung enthält, die mit der durch Einschnitt-Translation markierten DiTS hybridisierte. Die Einlagerung wird durch Verdauung mit Hind III oder Hsu I beseitigt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Die Einlagerung enthält etwa 830 Basenpaare und weist die in Abbildung 1 dargestellte Sequenz auf»

(B) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei anstelle von pBH322 verschiedene Vektoren verwendet werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die Flasmide pSCIO-1, pMB9, pBS313, pBR315 und pBR3i6 anstelle von pBR322 verwendet. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten klonen entsprechen der in (A) gegebenen Beschreibung, Für alle Plasmide werden indent ische Ergebnisse' erzielt, d, h,, in jedem Falle wird ein rekombinantes Plasmid gewonnen, welche eine Einlagerung mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz aufweist,

(G) Ausführungsbeispiel 4(A) v/ird wiederholt, wobei verschiedene andere Restriktionsstellen-Verbinder und Restriktions-Sndonukleasen verwendet werden. In diesem Ausführungsbeispiel werden anstelle der Verbinder für Hind III die Verbinder für Sal I und Bam HI verwendet. Die Sequenz dieser Verbindung-sind 5' -"GGTGGAGG - Y und 5^: - GGGGATCCGG 3', Werden SaI-I-Verbinder eingesetzt, dann werden die verbinderbehandelte.cDUS und pBR322 mit Restriktions-Endonuklease Sal I gespalten, und werden Bam-HI-Verbinder eingesetzt, dann ist^:die Restriktions-Sndonuklease Bam HI, Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten

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Klonen entsprechen der in Ausfuhrungsbeispiel 4(A) gegebenen Beschreibung. Pur beide Verbinder und Hestriktions-Bndonukleasen werden identische Ergebnisse gewonnen♦

(D) Ausführungsbeispiel 4(C) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Pläsmide pSC1O1, pMB9, pBR313', pBR315 und. pBR3i6 verwendet werden« Alle Bedingungen entsprechen den in Ausführungsbeispiel 4(C) beschriebenen; es werden identische Resultate eraielt, d« η« , in jedem Falle wird eine Einlagerung gewonnen, welche in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist«

(E) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Eco-Rl-Restriktionaverbinder mit der Sequenz 5^! - CCGAAITGGG-3'"anstelle des Hind-III-7erbInders sowie ScoRI anstelle von Hind III (Hsu I)"verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den bereits beschriebenen identisch, mit Ausnahme dessen, daß die transformierten Kolonien nicht hinsichtlich Tetrazyklin-Sensitivität selektiert werden. Das Vorhandensein von geklönter DIiS wird in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise erreicht» Gewonnen wird ein rekombinanter Klon, welcher eine Einlagerung enthält, die die in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist»

(P) Ausführungsbeispiel 4(3) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasniide pSC1O1, pMB9, pBR313 und pBR315 verwendet werden« Beibehalten werden die in Ausführungsbeispiel 4(E) beschriebenen Bedingungen; für jedes Plasmid werden identische Resultate erzielt.

(G) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Pst-I-RestriktionsverbInder mit der Sequenz 5' - GCTGCAGC 3'"und Pst I anstelle des Hind-HI-Verb Inders bzw. Hind-III

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(Hau I) eingesetzt werden« Die gleiche Bedingungen werden beibehalten,, mit der Ausnahme, daß die Selektion rekombinanter Klone in der in Ausführungsbeiapiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen wird« Gewonnen wird ein recombinant er Klon mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz·

(H) Äusführungsbeispiel 4(G) wird wiederholt, wobei anstelle von pBR322 die Plasmide pBR315 und pBR3i6 verwendet werden« Ss werden die gleichen Bedingungen wie in Ausführungs— beispiel 4(G) beibehalten und identische Resultate erzielt*

(I) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(3) und 4(A).*.(K) werden wiederholt, wobei B.coli RRl oder S.coli HB101 anstelle von -Ξ. coli 177& verwendet werden« Alle Bedingungen entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung; es werden identische Srgebnisse erzielt.

Ausführungsbeiapiel 5

Bei diesem Äusführungsbeispiel wird die cDHS wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt, Eco-RI-Restriktionsstellenverbinder werden gemäß der von Valenzuela, ?. et al. (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise stumpfendig an die cDH3 angelagert und entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A«. et al. (siehe oben) mit Sco RI gespalten.

(A) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Charon-16-DNS wird als Übertragungsvektor verwendet. Die kohäsiven Enden werden durch GOminütige Inkubation bei 42 ⁰C in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM MgGIp gekühlt. Der Vektor wird an der Bdo-RI-Restriktionssteile mit Sco-RI-Sndonuklease gespalten und dann in der

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von Ullrich., A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise mit alkalischer Phosphatase behandelt· lach der Ethanolausfällung wird die phosphatasebehandelte Vektor-DIS zu cDHS hinzugegeben, welche kohäsive Bco-RX-Terraini in einem molaren Verhältnis von 2 Mol Vektor zu 1 Mol cDffS enthält. Das Gemisch wird gemäß Beschreibung von Ullrich, A, et al. (siehe oben) mit T4-DiJS-Ligase verbunden. Das Ligationsgemisch wird direkt einer Suspension von S. coli- 1776-Zellen zugesetzt, welche entsprechend Ausflihrungsbeiapiel 1 für die Transformation vorbereitet wurden« Ebenfalls nach der im Ausführungsbeispiel . 1 beschriebenen Weise wird die Transformation vorgenommen. Die rekombinanten Phagen werden zurückge- Wonnen und auf Lac"* auf Platten angelegt, welche 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-ß-D-Galaktosid (X6), (8Ö g/ml) enthalten«, Pur die Herstellung von farblosen Belägen werden rekombinante Phagen selektiert, welche die in die Sco-RI-Steile von Charon 16A inserierte cDIJS enthalten. Ein ausgewählter Rekombinant wird isoliert und mit einem Überschuß an Sco-RI-Endonuklease verdaut; das Aufschloßprodukt wird in der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise analysiert. Zurückgewonnen wird eine DNS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz. Anderenfalls wird die Ligationsmischung dazu benutzt, rekombinante Phagen durch in-vitro-Verpacken gemäß der Beschreibung von Sternberg, H. et "al., Gene 2.: ²55 (1977) ^zu bilden« Rekombinante Phagen können darüber hinaus durch Anwendung der von Benton, W. D. und Davis, R. W., Science 196« 180 (1977) berichteten in-situ-Plaqae-Hybridisatiönstechnik ausgelesen werden«

(3) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Gharon-3A-DiIS oder Charon-4A-DHS wird . anstelle der im vorangegangenen Ausführungsbeispiel genann- · ten Gharon-16A-DIiS als Übertragungsvektor verwendet. Alle

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Bedingungen sind mit den für Charon-16A-DNS beschriebenen identisch« Die. Selektion recombinanter Phagen erfolgt durch (a) Plattieren der Phagen auf Lac⁺-Bakterien auf X6-haltigen Platten und Isolieren farbloser Plaques sowie darauffolgend entweder Hybridisation an eine geeignete Sonde oder Restriktions-oBndonuklease-Verdauung in der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise. Die Einlagerung wird nachder bereits dargestellten Methode entfernt; als Ausbeute wird eine DlJS. von etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen«

(G)-AIs Übertragungsvektor wird anstelle der-weiter oben verwendeten Gharon-16A die nach Beschreibung von Timier et al« (siehe oben) hergestellte gt WSS · B-DHS genutzt.. Alle "Bedingungen entsprechen den für Charon 16A beschriebenen«. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt nach der Hybridisationsmethode von, Benton und Davis (siehe oben). Die Einlagerung wird in der oben beschriebenen Wei3e entfernt und erbringt eine DiJS von etwa 830 Basenpaaren Länge siit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz«

(D) Die Ausfuhrungsbeispiele 5(A)...(C) werden wiederholt, wobei S. coli RRIj₁ R. coli HB101, S. coli DP50 oder B.coli DP50SupJ? anstelle von Ξ. coli. 1 776 " verwendet werden« Alle Bedingungen sind identisch;'es werden identische Ergebnisse erzielt.

Ausführungsbeiapiel 6

Pur dieses Ausführungsbeispiel wird die bovines Prä-Wachstumshormon codierende DHS in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet. Ss werden Hind—III-Reatriktionsstellenverbinder zugesetzt, und die cDNS wird mit

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Hind III oder Hsu I in der in Ausführungsbeispiel 4(A) beschriebenen Weise verdaut.

Als Übertragungsvektor wird das Plasmid pC194 verwendet, das - wie von Ehrlich, S₀ D. (siehe oben) beschrieben - aus £>♦ aureus isoliert worden war. pG194 wird, an der Hind-III-Stelle mit Hind III oder Hsu I gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase in der'von Ullrich, A. et al· (siehe oben) beschriebenen Weise behandelt. Ebenfalls in der von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise wird die cDHS mit Hind-III-kohäsiven Termini mit dem gespaltenen pC194 verbunden« Entsprechend der Beschreibung von Sgaramella, V. et al., J. Mol. Blol«« 105, 587 (1976) sowie Borenstein, 3.. und Sphrati-Elizüe, E., J. Mol. Biol«·« £5, (1969) erfolgt eine Kompetenz-Induktion von B« subtilis HUB331. Die Transformation von B. subtilis RUB331 erfolgt unter Verwendung der ebenfalls von"Sgaramella et al. und Borenstein et al« beschriebenen Ligationsmischung. Die Zeil— suspension wird direkt auf L-Platten angelegt, welche 3 g Chloramphenikol enthalten, Ein selektierter Rekombinant wird isoliert und mit Hind III verdaut} das Aufschlußprodukt wird gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Zurückgewonnen wird eine DITS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.

AusführungsbeisTjisl 7 Synthese der bovineses Wachstumshormon codierenden cDHS

(A) Plasmid pBH348 wird mit Hae-II-Sndonuklease verdaut, woraus ein Fragment mit 1-600 Basenpaaren entsteht.- Bine Hae-II-Stelle befindet sich innerhalb der das Wachstums-Prähormon codierenden cDKS-Sinlagerung, die sweite Stelle

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befindet sich innerhalb des. pBR322-Anteils des Plasmids. Die Verdauung erbringt

+ 1 +2 S' — C TTG 3'

V - G GGG AAG .... 5¹ .

Bovines Wachstumshormon kann entweder mit dem +1-als- oder dem "+2-phe-Reat am NIL-terminalen Ende beginnen (Dayhoff et al» siehe oben),, so daß der eine versuchen könnte, den als-Kodon zu komplettieren, wahrend ein anderer versuchen könnte, den als Kodon auszulöschen* Der Versuch des Auslöschens erfolgt durch Inkubieren der DlTS mit dATP und dem Slenow-Fragment von DITS-Polymerase I, da die erste Base des +2-phe-Kodons (auf dem 3' —— 5'-Strang) A ist. Diese Reaktion ergibt .

+1 +2

5' - G TTC .... 3'

• · ·. j

Die D1T8. wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt, überschüssiges dATP und die verdauten Basen werden durch Chromatografie auf G-50 Sephadex beseitigt. Das verbleibende 5^f überstehende C des +1-ala-Kondons wird sodann gemäß Beschreibung von Shine et al., lature 285, 456 (1980) mit S1-3uklease entfernt. Diese Verdauung erbringt

	+ 2	.· V
5' -	TTG ♦.	.o 5'
3' -	AAG .,

(B) Ausführungsbeispiel 7(A) wird wiederholt, wobei die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Desoxvnukleotidsequena durch Verdauung derjenigen ijbertragungsvektoren entfernt

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wird, die in den Ausführungsbeispielen 3, 4, 5 und 6 durch das geeignete Restrikt ionsenzym vor der Verdauung mit Hae II hergestellt worden waren. Die verwendeten Übertragungsvektoren und Restriktionsenzyme sind in Tabelle 3 zusammengestellt,

Nach Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym wird die bovine Prä-Wachstumshormon-Sequenz mittels Gel-Elektrophorese isoliert und dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) we iterbehandelt. Ss werden identische Resultate erzielt.

Tabelle 3 Restriktion3enz:/m Übertragungsvektor (Ausführungsbeispiel)

Pst I 3A_t 3B, 4G, 4H '

Hind III 4A, 4B, 6

Sal I 4G, 4D

Bam HI 4C, 4D

Sco RI 43, 4?, 5A, 5B, 5C

(G) Die Ausführungsbeiapiele 7(A) und 7(B) werden wiederholt, wobei anstelle des IQenow-Fragments von DliS-Polymerase I T4-DiiS-Polymerase oder 3¹•••5^f-3xonoklease verwendet, wird». Alle anderen Bedingungen sind identisch; in jedem Falle wird die identische Sequenz de3 Fragments von bovinem Wachstumshormon gewonnen.

AusfUhrungsbeispiel 8

(A) Das bovine Wachstumshormon-Fragment

+ 1+2 5' - G TTC ,·... V

3^f - G GGG AAG.... 5'

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wird durch Hae-II-Yerdauung gemäß Beschreibung in Ausführiingsbeispiel"7(A)"oder 7(B) hergestellt. Der Komplettierungsversuch wird folgendermaßen durchgeführt: Die DIiS wird mit dATP, dCTP, dTTP und dem Klenow-Fragment von DiIS-PoIymerase I inkubiert·. .

Diese Reaktion erbringt

+ 1+2

5^f - G- GCC TTC .... 3¹ 3» - G CGG AAG .... 5' .

Die DHS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt. Die Sequenz wird sodann in Anwesenheit von dCTP mit dem Klenow-Fragment von DHS-Polymerase I inkubiert« Danach, wird die Sequenz laut Beschreibung von Shine et al.,. Hat ure, 285« (1980) mit S1-l\fuklease verdaut5 dies erbringt die Sequenz

5^f - GCC TTC .... 3' V - CGG AAG ...... 5¹ .-

(B) Ausführungsbeispiel 8 (A) wird wiederholt, wobei im zweiten Inkubationsschritt, d. h. unter Anwesenheit von dCTP T4-D1TS-Poljmerase oder 3'·..S'-Sxonuklease anstelle des Klenow-Fragments verwendet wird. Die anderen Bedingungen sind indentisch} in jedem Falle wird die identische bovine Wachst umshormonse quenz erlangt,

Ausführungsbeispiel 9

Die das bovine Wachstumshormon codierende Desocvnukleotid— Sequenz wird in Übertragungsvektoren inseriert, wie dies im vorangegangenen Text für die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Sequenz beschrieben wurde.

(A) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I),

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(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DH3 jene DIiS verwendet wird, die in den Ausführu^gsbeispielen 7(A), 7(B) oder 7(C) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DIiS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. In jedem Falle wird eine DNS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Phe-Kodon auf Position 2 beginnt und sich sum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortgesetzt.

(B) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I), 5(A) ...(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DNS jene DNS verwendet wird, die in den Ausführuagsbeispielen 8(A) oder 8(B) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DNS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. In federn Palle wird eine DNS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Ala-Kondon auf Position 1 beginnt und sich zum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt.

Ausführungsbeispiel 10 Darstellung des bovinen Wachstumshormons

Bovines Wachstumshormon kann durch jedwede der oben beschriebenen Methoden dargestellt werden,

(A) Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon als ein Pu-

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sionsprotein wurde mittels eines Radioimmunoassay-Versuches und eines Minizeil-Versuches demonstriert. Im Radioimmunoassa-y-Versuch wurden pBP348-haltige Ξ« coli 1776 oder pBR322-haltige E, coli als KontrollVariante in Nährbouillon angebaut und mittels"Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden resuspendiert und lysiert, sodann wurden strahlenmarkiertes ovines Wachstumshormon sowie oviner (oder boviner) Wachst umshormon-Antilcörper hinzugegeben. Der Immunkomplex wurde ausgefällt und hinsichtlich Radioaktivität gemessen· Dieser Versuch zeigt, daß das Fusionsprotein einen Teil der bovinen Wachstumshormon-Immunoaktivität zurückhält. Um darüber hinaus die Produktion eines Fusionsproteins zu veranschaulichen, wurde ein-. Minizeil-Versuch nach der von Meagher,. R. -B; et al,, Gell, I₁O,-521 (1977) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die aus E.-coli- 1776-Minizellen resultierenden Gelelektrophorese-Banden* Bande (a) wurde von E.» coli. 1776 gewonnen, das mit pBP348 transformiert worden"war. Bande.(b) wurde von E, coli 1776 gewonnen, das mit pBR322 transformiert worden war."Bande (c) sind Molekülmasse-Marker, (A) zeigt das Fusionsprodukt von ß-Laktamase und bovinem Wachstums-Prähormon,, (3) zeigt Prä-Laktamase, und (¹C). zeigt ß—Laktamase, Dieser Versuch zeigt,, daß pBP348 ein Pusionsprotein erzeugt, welches aus 183 Minosäuren von ß-Laktamase, 217 Aminosäuren von bovinem Wachstums-Prähormon und einigen durch die normalerweise nichtübersetzte 5'-Region codierten verbindenden Aminosäuren besteht. Die ermittelte gesamte relative Molekülmasse — annähernd 45 000 - stimmt mit der vorausberechneten relativen Molekülmasse des Hybridproteins überein*

(B) Zur direkten Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon wird die Einlagerungs-DHS zunächst durch teilweise Pst-I-Sndonukleaseverdauung von pBP348 separiert und mittels

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präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt. Sodann wird eine 15- g-Probe der gereinigten Sinlagerungs-DIYS modifiziert, indem die DlTS in V/asser suspendiert wird, welchem eine konzentrierte Salzlösung zugesetzt wird, so daß die endgültige Zusammensetzung 70 mM Tria (pH, 8,8), 70 mM MgGl₂, 10 dM Dithiothreitol und 13,75 Einheiten T4-DHB-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 250 1 enthält. Das Heaktionsgemisch wird für einige Minuten bei 37 ⁰C inkubiert, sodann wird dATP bis zu einer Konzentration von 50 mM zugesetzt, um die endonukleolytische Verdauung am nächstgelegenen Adenin-Hest zu beenden* Nach 30 a zusätzlicher Inkubation wird das Enzym durch Sminütige Wärmebehandlung bei 65 ⁰C inaktiviert· Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt, wobei einmal dCTP anstelle von dAT? und beim zweitenmal erneut dTTP verwendet wird· Die behandelte Di¹IS wird mittels Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Die Verdauung mit -S1-iluklease zur Erlangung von stumpfen Enden wird in der von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise ausgeführt. Dieses Vorgehen dient dazu, ein DHS-Molekül zu erzeugen, das am Startkodon auf Position ITr. -26 abschließt. Derartige Moleküle werden übersetzt, wenn sie in einen Express ionsvekt or inseriert werden, dessen Insert ionssteile sich etwa 3..-«11 STukleotide von der Ribosoni-Bindungsstellensequenz einer Expressionseinheit entfernt befindet·.

Ein Vektor für die direkte Darstellung wird durch Modifikation des Plasmids ptrnS30 vermittels Beseitigen von 23·.«29 Itfukleotiden unter Einsatz von T4-DHS-Polymerase und S1-iiuislease gemäß obiger Beschreibung konstruiert.

Sowohl die modifizierte cDIiS als auch der modifizierte Expressionsvektor werden mit einem spezifischen Verbinder . _...„_..._ mit der Sequenz 5^f-CCGGAICCGG-O' £^ einem Strang und seiner

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komplementären Sequenz am anderen Strang versorgt; dies erfolgt durch stumpf endige Ligation unter Verwendung von DiJS-Ligase, wie dies von Valenzuela (siehe oben) beschrieben wurde. Die Verbinder liefern gegenüber Bam-HI-Sndonuklease sensitive Restriktionsstellen -, letztere wird zur Erleichterung der Insertion verwendet. Die Insertionsreaktion wird in der von Ullrich, A« et al. (siehe oben) beschriebenen Weise durchgeführt. Die Wirtsbakterien S, coli HB1O1, RHI oder 1776 werden durch die die inserierte modifizierte Wachst ums-Prähorraon codierende Region tragenden rekombinanten. Vektoren transformiert, und die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin selektiert» Sin einseiner, für. die weitere Analyse ausgewählter Tranaformatit wird als ptrpl33O/bGH bezeichnet·

Durch ptrpE3Q/bGH transformierte Bakterienzellen, werden bei 37 ⁰C in einem mit Leuzin, Prolin, Vitamin B1 und Ampizillin angereichertem Standard-Minimalmedium (MS) angebaut. In der frühen log-Phase 'wird das trp-Operon durch Zusetzen von ß-Indolylakrylaäure (30 g/ml Medium) induaiert. Die iControllkulturen bleiben uninduziert. Fach drei weiteren Stunden Wachstum werden 1,5 ml Zellen durch Hinzugeben·von 20 Ci. S-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert» Die Zellen werden sodann durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 250 yul Pufferlösung - 10 % (V/V) Glykol, 5 fo (V/V) ß-Merk apt ©ethanol und 2,3 % (M/V) SDS in 0,0625ivI Tr is (pH 6,8) - resuspendiert. Die Suspension wird 5 min gekocht, dann einem 10-%-(M/V)-SDS-Polyakrylamid-GeI appliziert und elektrophoretisch fraktioniert. Die Proteinbanden werden autoradiografisch sichtbar gemacht. Die Ergebnisse lassen, das Vorhandensein einer neuen Proteinbande von etwa 24 000 Dalton ericennen, 'welche in nicht induzierten oder nicht transformierten Kulturen nicht beobachtet

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Bas bovine Wachstums-Prähormon wird durch herkömmliche Techniken einschließlich beispielsweise Gelfiltration, lonenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie und Differential-Löslichkeitstechniken gereinigt. Die Überführung von V/achst ums-Prähormon in Wachstumshormon erfolgt durch das von Jackson, R, C. et al. (siehe oben) beschriebene Verfahren·

(G) Ein spezifischer Verbinder mit der Sequenz 5'-CCGGA-TCCG GATG-3' auf einem Strang und seiner komplementären Sequenz auf dem anderen wird der das bovine Wachstumshormon codierenden DlTS, wie sie in den Ausführungsbeispielen 7(A)*..(G) und 8(A),*. .(3) hergestellt wurde, stumpf endig verbunden· ' Diese modifizierte DlTS wird dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 1Q(B) in das modifizierte Plasmid ptrpS3O inseriert» Wirtsbakterien werden laut Ausführungsbeispiel 10(3) transformiert, kultiviert, und das resultierende bovine Wachstumshormon wird gereinigt»

auch die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, so versteht es sich von selbst, daß sie weiterer Modifikationen fähig ist. Mit der vorliegenden Anmeldung sollen einige Variationen, Anwendungen oder Bearbeitungen der Erfindung bezüglich ihrer Grundsätze geschützt werden; dies schließt auch solche Abweichungen von der hier dargestellten Offenlegung ein, die sich aus der bekannten und üblichen Praxis in jenem Fachgebiet ergeben, auf das sich die Erfindung besieht«

Claims (4)

1. -42- 6.7.1983

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   Brfindungsanspruch ^

   1. Verfahren zur Herstellung einer für Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz für den Einsatz bei der Synthetisierung von Rinderwachstumshormon, gekennzeichnet durch Spalten einer cDlTS, die für Rinderpräwachstumshormon kodiert, das durch Umsetzen einer für Rinder-Präwachstumshormon kodierenden Desoxynukleotidsequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Re striktionsenzym erhaltenen DUS-MoIekül erhalten und repliziert wurde, mit dem Restrikt ionsenzym Hae II, und Inkubieren des gespaltenen Produktes mit einem Enzym aus der Gruppe, die aus dem Klenow-Fragment von DliS-Polymerase I, T4-BliS und 3^f-5'-2&:onuklease besteht»
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubation mit dem IQenow-Fragment in Gegenwart von dATP durchgeführt wird und das resultierende Produkt mit SI-Huclease digeriert wird, wodurch, eine für die Aminosäuren 2-191 von Rinderwachstumshormon kodierende Desosynucleotid-Sequenz gewonnen wird·
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die für Rinderwachstumshormon kodierende Desosynucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz aufweist:

   .5« - TTG GCA GGC ATG TGG TTG TCG GGG CTG TTT GGG AAC GGT GTG GTG GGG GGT CAG CAG GTG GAC CAG CTG. GGT GGT GAG ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAG ATC CGG GAG GGA CAG AGA TAG TGC ATG GAG AAG ACC CAG GTT GCG TTG TGG TTG TGG GAA ACC ATG CCG GGG CCC AGG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TGA GAC TTG GAG CTG GTT CGG ATG TCA GTG CTG CTC ATC GAG TGG TGG GTT GGG CCG GTG GAG TTT GTG AGG AGA GTG TTG AGC AAG AGG TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTG

   -43- 6.7.1933

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   TAT GAG AAG GTG AAG G-AC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTG AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACC- PAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3', worin

   A Desoxyadenyl ist

   G Desoxvguanyl ist

   C Desoxy cy t ο syl ist und

   T Thymidyl ist,
4. 4. Verfahren nach. Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubation mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dATP, dGTP, dCTP und dTTP durchgeführt wird, das resultierende Produkt mit einem aus der das IQenow-Pragment, T4 DiJS-Polymerase oder 3' -S'-Sxonuclease umfassenden

   Gruppe ausgewählten Enzvm in Gegenwart von dCTP inkubiert wird und das resultierende Produkt mit S1-Huclease digeriert wird, wodurch eine für Aminosäuren .1-191 von Rinderwachstumshormon kodierende Desoxynucleotid-Sequenz gewonnen wird·

   5· Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die für Rinderwachst uinshormon kodierende Desoxvnucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz aufweist:

   5^f - GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT GAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT G-AG CGT ACC TAG ATC CCG GAG G-GA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCC GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC GAG CAG AAA TCA GAC TTC GAG CTG CTT GGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA

   -44- 6.7.1983

   62 584/18

   GTC TTG AGC AAC AGC Tl¹G GTG TTT GGC AGC TGG GAG CGT GTG TAT GAG AAG CTG AAG GAC GTG GAG GAA GGC ATC TTG GGC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGG AGT GAC GAC GCG CTG GTG AAG AAC TAC GGT CTG CTG TCC TGG TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC GTG AGG GTC ATG AAG TGG CGG CGC TTC GGG GAG GGC AGC TGT GCC TTG TAG - 3^r,

   worin

   A Desoxyadenyl ist
   G Desoxyguanyl ist
   C Desocxycytosyl ist
   T Thymidyl ist«

   Hierzu 2 Blatt Zeichnungen