DD214627A1 - PROCESS FOR PREPARING A-FACTOR - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von A- Faktor, 2- (6'- Methylheptanoyl)- 3- hydroxymethyl-gamma- butyrolacton, eines Biostimulators, der industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrem Biosynthesevermoegen fuer Antibiotika, wie beispielsweise Streptomycin und Anthracycline, zu stimulieren vermag und daher in der mikrobiologischen Industrie bei der Produktion von Wirkstoffen von potentiellem Nutzen ist. Der in diesem Verfahren bevorzugt eingesetzte Mikroorganismus ist der anthracyclin- und sporenbildende Stamm ZIMET 43689 der Art S. griseus oder wahlweise die hinsichtlich der Anthracyclinbiosynthese geblockte Mutante ZIMET 43688. Die Aufgabe der Herstellung des A- Faktors wird in der bevorzugten Ausfuehrungsform dadurch geloest, dass durch aerobe submerse Fermentation des Stammes/ZIMET 43689 bei einer hohen Phosphatkonzentration oder wahlweise der Mutante ZIMET 43688 auf ueblichen phosphat- limitierten Medien mit geeigneten C-, N- Quellen und Mineralsalzen der Biostimulator (A- Faktor) gebildet und mit Hilfe extraktiver Verfahren aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatographische Verfahren gereinigt wird.The invention relates to a microbiological process for the production of A-factor, 2- (6'-methylheptanoyl) -3-hydroxymethyl-gamma-butyrolactone, a biostimulator of industrially important microorganisms both in their differentiation and in their biosynthetic capacity for antibiotics , such as streptomycin and anthracyclines, and thus is of potential use in the microbiological industry in the production of drugs. The preferred microorganism used in this process is the anthracycline and spore-forming strain ZIMET 43689 of the species S. griseus or optionally the anthracycline biosynthesis blocked mutant ZIMET 43688. The object of preparing the A-factor is achieved in the preferred embodiment by aerobic submerse fermentation of the strain / ZIMET 43689 at a high phosphate concentration or optionally the mutant ZIMET 43688 on conventional phosphate-limited media with suitable C, N sources and mineral salts of the biostimulator (A-factor) and by means of extractive methods from the culture filtrate isolated and subsequently purified by chromatographic methods.
Description
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Titel der ErfindungTitle of the invention
Verfahren zur Herstellung von A-FaktorProcess for the production of A-factor
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer autoregulatorisch wirksamen Substanz, die als endogener Regulator die Differenzierung und Antibiotikumbildung von Streptomyceten zu induzieren und zu stimulieren vermag, und die daher sowohl in der pharmazeutischen Industrie bei der fermentativen Herstellung von Wirkstoffen als auch selbst als Pharmakon von potentiellem Nutzen ist«,The invention relates to a process for the production of an autoregulatory active substance which is capable of inducing and stimulating the differentiation and antibiotic formation of streptomycetes as an endogenous regulator, and which is therefore useful both in the pharmaceutical industry in the fermentative production of active substances and as a drug of potential Benefit is, "
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Es ist bekannt, daß Streptomycin-bildende Stämme von Streptomyoes griseus den autoregulatorisoh wirksamen Α-Faktor, d. h. 2-(6l«Methylheptanoyl)-3-i"hytroxymethyl«.>'-butyrolacton bilden können (KHOKHLOV et al., Z . AlIg* Mikrobiol», J£, 647-655 ϊ HARA u, BEPPU, J. Antibiot· 21» 349-358, 1982). Diese Substanz ist in der Lage, in geblockten Mutanten sowohl die Streptomyoin-biosynthese als auch die Produktion von Luftmycelien und Sporen wiederherzustellen (KLEINER et al·, Bioorg* Khinu, ^, 1142-1147; KLEINER et al·, Bioorg. Khim. 2> 424-426, 1977; MORI Tetrahedron Lett. 22, 3431-3432, 1981; HARA u, BEPPÜ, J. Antibiotics 22,, 349-358, 1982)·It is known that streptomycin-producing strains of Streptomyoes griseus can form the autoregulator-active Α-factor, ie, 2- (6 L "methylheptanoyl) -3- i " hytroxymethyl "." - butyrolactone (KHOKHLOV et al., Z. AlIg * Mikrobiol, J, 647-655, HARA, BEPPU, J. Antibiot., 21, 349-358, 1982.) This substance is capable of inhibiting both streptomyoin biosynthesis and the production of blocked mutants KLEINER et al., Bioorg. Khinu, 1142-1147; KLEINER et al., Bioorg. Khim. 2: 424-426, 1977; MORI Tetrahedron Lett. 22, 3431-3432, 1981; HARA u, BEPPU, J. Antibiotics 22 ,, 349-358, 1982).
Racemischer A-*Faktor der in Abb· 1 gezeigten Konstitution i, ist ferner als Induktor der Anthracyclinbiosynthese und Luftmycelbildung in geblockten Mutanten von Streptomyoes griseus wirksam (GRÄPE et al·, J9 Antibiot« 21t 57-62, 1982). Diese Substanz ist demnach ein hochaktiver biologischer Wirkstoff, mit dessen Hilfe die Produktbildung degenerierter KloneRacemic A * factor of the constitution i shown in Fig. 1 is also effective as an inducer of anthracycline biosynthesis and aerial mycelia formation in blocked mutants of Streptomyoes griseus (GRÄPE et al., J 9 Antibiot. 21t 57-62, 1982). This substance is therefore a highly active biological agent, with the help of the product formation of degenerate clones
einer Streptomyceten-Population wiederhergestellt werden kann, und der daher bei der Stabilisation von Fermentetiönaläufen von potentiellem Nutzen ist. Ihre Interferenz mit lebenden Zellen macht sie selbst als potentielles Pharmakon geeignet·a Streptomyceten population can be restored, and therefore in the stabilization of Fermentetiönaläufen of potential use. Their interference with living cells makes them themselves suitable as a potential drug.
Bisher wuide Α-Fakt or auf fermentativem Wege aus Streptomycinbildenden Stämmen der Art Streptomyoes griseus isoliert· Angaben über die Effektivität der biologischen Bildung des A-Faktora und der chemischen Isolationsprozedur aus dem Kultur fiItrat erfolgten bisher ausschließlich in Relativdaten; sie lassen daher keine Aussagen über die pro Fermentationsansatz in Reinstform erhaltene Menge £ zu (EIEiNBE et al·» Bioorg. Khim, Z9 1142-1147, 1976; PIIlJER et al,,Bioorg. Khim. 1, 7-76, 1975)·So far, Α-factor or by fermentative route has been isolated from streptomycin-producing strains of the species Streptomyoes griseus . Information on the effectiveness of the biological formation of the A-factora and the chemical isolation procedure from the culture filtrate has hitherto been provided exclusively in relative data; Therefore, they do not allow any statements about the amount E obtained in pure form per fermentation batch (EIEiBE et al., Bioorg., Khim, Z 9 1142-1147, 1976, PIIlJER et al, Bioorg., Khim., 1, 7-76, 1975). ·
Α-Faktor wurde ferner durch chemische Synthese als Raoeraat (KLEINER et al., Bioorg. Khim. 2» 424-426, 1977) oder als optisch einheitliche Stereoisomere (MORI, K,,Tetrahedron Lett. 22, 3431^3432, 1981; MORJ u. YAMANA, Tetrahedron<";I*tt· 2§j 2919-2920, 1982) hergestellt. Das chemische Verfahren der Herstellung hat gegenüber dem biologiechen den Naohteil, daß es entweder 1_ in racemischer Form mit verminderter spezifischer Aktivität liefert, oder aber daß die Herstellung des optimal wirksamen 2S,3S-Isomeren einen hohen Aufwand erfordert*Α-Factor was further prepared by chemical synthesis as Raoeraat (KLEINER et al., Bioorg. Khim. 2: 424-426, 1977) or as optically uniform stereoisomers (MORI, K ,, Tetrahedron Lett. 22, 3431 ^ 3432, 1981; MORJ u YAMANA, Tetrahedron <";.. I * tt · 2§j 2919-2920, produced 1982) the chemical method of manufacture has over the biologiechen the Naohteil that it 1_ provides either in racemic form with reduced specific activity, or but that the preparation of the optimally effective 2S, 3S isomers requires a great effort *
Ziel der1 ErfindungThe aim of the invention 1
Die Erfindung dient der Herstellung von Α-Faktor, d. h. von 2-(6 l-Methylheptanoyl)-3-hydroxymethyl- ^-butyrolaoton, einem bekannten Stimulatpr der Zytodifferenzierung und Antibiotikumrbildung bei Streptomyoeten, der sowohl morphologische als auch chemische Veränderungen in Kulturen Anthracyolin- und Streptomycinbildender Streptomyceten einisusohalten vermag, die mit einer hohen Effektivität der Produktbildung gekoppelt sind.The invention is for the production of Α-factor, ie 2- (6 l -methylheptanoyl) -3-hydroxymethyl-butyrolaotone, a known stimulant of cytodifferentiation and antibiotic formation in streptomyoeten that has undergone both morphological and chemical changes in anthracycline cultures. and streptomycin-forming streptomycetes, which are coupled with high product-formation efficiency.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe iugrunde, ein effektiveres und dabei technologisch einfaches Verfahren zu erarbeiten, mit des^ sen Hilfe 2-(6·-Methylheptanoyl)-3-hydroxymethyl- T -butyrolac-The object of the invention is to develop a more effective and technologically simple process with the aid of 2- (6-methylheptanoyl) -3-hydroxymethyl- T- butyrolactone.
ton (Α-Faktor, 1_) auf fermentativem Wege unter Verwendung eines leicht zugängliche η Mediums, bestehend aus billigen Einsatzstoffen, hergestellt werden kann»clay (Α-factor, 1_) can be produced by fermentation using an easily accessible η medium consisting of cheap starting materials »
Es wurde Überraschend gefunden, daß der Α-Faktor J[ nicht nur von Streptomycin-bildenden Stämmen der Art Streptomyces ^rise us, sondern auch von Anthracyolin-bildenden Stämmen von £>«, grisems wie von den hinsichtlich ihrer Anthraoyolinprodmktion geblockten Mutanten dieser Stämme gebildet wird· Ausgehend von diesem Befund wird die Aufgabe, den A-Paktpr 1/ auf fermentativem Wege herzustellen, dadurch gelöst, daß man einen Anthracyclinbildenden Mikroorganismus der Art Strepjbomyoes griseus oder wahlweise hinsichtlich ihrer Anthracyclin-Biosynthese geblockte Mutanten unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten bei einer Temperatur von 25 0C bis 37 0C, vorzugsweise 28 0C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, kultiviert· Nach Beendigung der Fermentation wird der Wirkstoff A-Faktor aus dem Kulturfiltrat bei einer Azidität von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise pH 6, mittels üblicher lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat, extrahiert, nachfolgend mit an sich bekannten Methoden konzentriert und mit Hilfe üblicher chromatografie eher Methoden bis zur dünnsohiehtohromatografischen und massenspektrometrischen Identität mit einer authentischen Probe des A-Faktors gereinigt»It has surprisingly been found that the Α-factor J [not only of streptomycin-producing strains of the genus Streptomyces ^ ri se us, but also on Anthracyolin-forming strains of £>"grisems as of the blocked terms of their Anthraoyolinprodmktion mutants of these strains On the basis of this finding, the object of producing A-Pactpr 1 / by fermentation is solved by using an anthracycline-forming microorganism of the species Strepjbo myoes griseus or alternatively mutants blocked for their anthracycline biosynthesis under aerobic and sterile conditions liquid nutrient media containing a carbon and a nitrogen source and mineral salts at a temperature of 25 0 C to 37 0 C, preferably 28 0 C, for a period of 2 to 6 days, preferably 4 days, cultured after completion of the fermentation the active ingredient A-factor from the culture filtrate at an acidity of pH 4 to pH 7, vorzu Example 6, by means of conventional solvents, preferably butyl acetate, extracted, then concentrated by methods known per se and purified by conventional chromatography rather methods to thin-hosheromatografischen and mass spectrometric identity with an authentic sample of the A-factor »
In der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der Anthraoyclin-bildende und Luftmyce!-bildende Stamm der Art Streptomyoes griseus oder wahlweise seine hinsichtlich Anthra»- Gyolin-Bildung geblockte, Luftmyce1-bildende Mutante eingesetzt. Diese Stämme sind unter den Registriernummerη Streptomyces griseus ZIMKT 43689 (Anthraeyolin-bildender Stamm) und ZIMBT 43688 (geblockte Mutante) in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDE, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden· Der Anthracyelin-bildende Stamm der Art Streptomyoes griseus mit der Registriernummer ZIMET 43689 ist bei-W.B1. FIJSCK u. D*STSAÜSS (Z· AlIg/Mikrobiol.In the preferred embodiment of the method, the anthraxycin-producing and aerial mycelial strain of the species Streptomyoes griseus or alternatively its anthracycline-fused, airyce1-producing mutant is employed. These strains have been deposited under the registration number η Strepto myces griseus ZIMKT 43689 (anthraeyolin-forming strain) and ZIMBT 43688 (blocked mutant) in the depository of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of DDE, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11. The anthracyelin-forming strain of the species Streptomyoes griseus with the registration number ZIMET 43689 is at-WB 1 . FIJSCK u. D * STSAUSS (Z · alloy / microbiol.
4 455-505, 1975) ausführlich beschrieben«4 455-505, 1975).
Die Kultivierung der Stämme ZIKBT 43689 und ZIMiST 43688 erfolgt unter aeroben sterilen Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw«, an Glucose/Gelatine (5 #ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf geeignete Agarnährmedien und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft» und das entstehende Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 PC und 37 0C, vorzugsweise 28 0C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsvjreise 4 Tagen, bei einer Azidität kultiviert, die zu Beginn des Permentationsprozesses zwischen pH 6,0 und pH 7,0, und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,5 liegt,/Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff— und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen· Als Kohlenstoffe und Stickst off quellen können die in der Antibiotikafermentation üblichen Eineatzstoffe verwendet werden (Glucose, Stärke, Sojamehl)»The cultivation of the strains ZIKBT 43689 and ZIMiST 43688 is carried out under aerobic sterile conditions. Sporulated lyophilically dried spore material or mycelium fragments lyophilised on glucose / gelatin (5 #ig) are inoculated onto suitable agar media and subsequently into liquid, previously sterilized nutrient media and the resulting mycelium is incubated in a manner known per se at a temperature between 25 ° C. and 37 0 C, preferably 28 0 C, over a period of 2 to 6 days, preferably 4 days, cultured at an acidity at the beginning of the permentation process between pH 6.0 and pH 7.0, and at the end of the process between / The nutrient medium consists of carbon and nitrogen sources as well as mineral salts · The usual substances used in antibiotic fermentation (glucose, starch, soy flour) can be used as carbon and nitrogen sources. »
Die die Isolation von reinem A-Paktor störende Produktion von Anthraoyolinpigmenten beim Stamm ZIMET 43689 wird durch Zugabe hoher Phosphatkonzentrationen zum Medium .(<·· 0,25 # KH2PO4, pH 6,5) unterdrückt·The production of anthraoyolin pigments disturbing the isolation of pure A-factor in strain ZIMET 43689 is suppressed by addition of high phosphate concentrations to the medium (<·· 0.25 # KH 2 PO 4 , pH 6.5).
Die durch genetische Manipulation erhaltene Mutante ZIMET 43688 weist dagegen keine die Aufarbeitung störende Bildung von Anthracyolinen auf·In contrast, the mutant ZIMET 43688 obtained by genetic manipulation has no formation of anthracyolines that interferes with the work-up.
Die Fermentation der Stämme ZiMBT 43689 und ZIMET 43688 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentern sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden·The fermentation of the strains ZiMBT 43689 and ZIMET 43688 can be carried out in steep-breasted bottles and round-bottomed flasks of various contents, in glass fermenters and in V2A tanks.
Die Isolierung des A»-Paktors wird in der Weise durchgeführt, daß er aus dem Kulturfiltrat durch organische Lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat oder Chloroform, extrahiert wird· Ein durohi Einengen des Butylacetatextraktes der Kulturlösung erhaltenes !Rohprodukt wird an Cellulosepulver adsorbiert und mit Wasser eluiert. Die wäßrige Phase wird mit Ether extrahiert und der Rückstand des Etherextraktes durch präparative DünnschichtChromatographie unter Verwendung gepufferter Kieselgelschichten (pH 7,0) sowie abwechselnd der Lösungsmittelsysteme Benzen/EtherThe isolation of the A-factor is carried out by extracting it from the culture filtrate by organic solvents, preferably butyl acetate or chloroform. A crude product obtained by concentration of the butyl acetate extract of the culture solution is adsorbed on cellulose powder and eluted with water. The aqueous phase is extracted with ether and the residue of the ether extract by preparative thin layer chromatography using buffered silica gel layers (pH 7.0) and alternately the solvent systems benzene / ether
(lsi, v/v) und Chloroform/Methanol (95s5y ν/ν) aufgetrennt· Die aktiven Fraktionen, kenntlich durch ihren Effekt auf die Zytodifferenzierung des Indikatorstammes ZIMBT 43682 (BRITT et al·, Z. AlIg, Mikrobiol., g£, 91-95, 1982), werden verei* nigt und erneut der präjparativen IXinns chi cht chromatografie unter Wechsel des Solvens nach 3ader Reinigungsstufe unterworfen· Auf diese Weise wird 1 mg chromatografisoh einheitlicher A-ffaktor aus jeweils 100 1 Kulturlösung der Stämme ZIBiIET 43689 und ZIIffiT 43688 erhalten· Das Präparat entspricht in seinem chromatografischen Verhalten und in seiner biologischen Aktivität einer authentischen Vergleichsprobe (KLEINER et al»» Bioorg. Khim., 2, 424-426, 1977)·(lsi, v / v) and chloroform / methanol (95s5y ν / ν) separated · The active fractions, recognizable by their effect on the cytodifferentiation of the indicator strain ZIMBT 43682 (BRITT et al., Z. Alig, Mikrobiol., g £, 91-95, 1982) are combined and re-subjected to preparative chromatography with changing the solvent after the purification step. In this way, 1 mg chromatographically uniform A-factor is obtained from each 100 1 culture solution of strains ZIBiIET 43689 and ZIIffiT The preparation corresponds in its chromatographic behavior and in its biological activity to an authentic comparative sample (KLEINER et al., Bioorg. Khim., 2, 424-426, 1977).
Im Massenspektrum entsprechender Präparationen des A-l^aktors aus S, ftriseus ZIIiET 43689 und ZIMET 43688 (JEOL JMS-D-100, 100 0C, direct inlet, 75 eV) sind das Molekülion sowie sämtliche für den A-Paktor 1. charakteristischen Fragmente enthalten (PLHSfER et al·, Bioorg· Khira., 1., 70-76, 1975): M+: m/e 242*1524 (»1518 ber· für C13H22O4), m/e 211.1325 (.1334 ber, für C1^903), m/e 171.0670 (»0657 ber. für CgH1 χ O4), m/e 158; m/e 143·0346 (·0344 ber· für C6H7O4), m/e 127, m/e 109 und m/e 85·In the mass spectrum of corresponding preparations of Al ^ actor from S, triseus ZIIiET 43689 and ZIMET 43688 (JEOL JMS-D-100, 100 0 C, direct inlet, 75 eV), the molecule ion and all the fragments characteristic of the A-factor 1 are included (PLHSfER et al., Bioorg. Khira., 1, 70-76, 1975): M + : m / e 242 * 1524 (1518 for C 13 H 22 O 4 ), m / e 211.1325 (. 1334 ber, for C 1 ^ 9 0 3 ), m / e 171.0670 (»0657 calcd for CgH 1 χ O 4 ), m / e 158; m / e 143 · 0346 (· 0344 via · for C 6 H 7 O 4 ), m / e 127, m / e 109 and m / e 85 ·
Das 25.16 MHz 13C Nßffi-Spektrum (Varian XL 100-15) zeigt die für den 2,3-disubstituierten Butyrolactonring des ^-(ö'-Methylheptanoyl)-ff3«-'hydroxymethyl- "f -feutyrolacton (A-Paktor, 1_) charakte CDC1 The 25.16 MHz 13 C Nßffi spectrum (Varian XL 100-15) shows the for the 2,3-disubstituted-butyrolactone of ^ - (ö'-methylheptanoyl) -ff3 '-' hydroxymethyl- "f -feutyrolacton (A-Paktor, 1_) character CDC1
ristischen Signale (<y CDC13 ppm: 55.09 (C2); 42.45 (C3); 68.81 (C4), das 05 zuzuordnende Signal bei 61*58 ppm, sowie die Signale der aliphatischen Methylen- und Methylgruppen. Diese Angaben bestätigen die Konstitution von 1^, lassen Jedoch keine Rückschlüsse auf die Stereochemie der Verbindung zu.rythmic signals (<y CDC1 3 ppm: 55.09 (C2); 42.45 (C3); 68.81 (C4), the signal to be assigned to 05 at 58 * 58 ppm, as well as the signals of the aliphatic methylene and methyl groups 1 ^, but no conclusions can be drawn about the stereochemistry of the compound.
Die Herstellung des A-Faktors I- bietet den Vorteil, daß fliese Substanz sowohl die morphologische als auch die chemische Differenzierung für die industrielle Wirkstoffproduktion bedeutsamer Mikroorganismen einzuschalten und zu stimulieren vermag. Dieser Wirkstoff ist daher für die Optimierung der fermentativem Produktion von Sekundärmetaboliten von potentiellem Nutzen.The production of the A-factor I - has the advantage that tile substance is able to turn on and stimulate both the morphological and the chemical differentiation for the industrial active ingredient production of important microorganisms. This agent is therefore of potential use for optimizing the fermentative production of secondary metabolites.
Auf Grund seiner Wechselwirkung mit der lebenden Zelle nach einem bisher noch nicht aufgeklärten Mechanismus stellt 1 selbst ein potentielles Pharmakon dar, dasfür einen Einsatz in der Therapie geeignet ist.Due to its interaction with the living cell according to a hitherto unexplored mechanism, 1 itself represents a potential drug suitable for use in therapy.
Aus diesen Gründen erscheint es zweckmäßig, nach hinreichend effektiven fermentativen Verfahren zur Herstellung von 1. zu suchen.λ ..... ·. " ;.. . '. . . ." ' ,' · Der Vorteil des in der Erfindung beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Α-Faktor (l) ist darin zu sehen, daß nicht ein Streptomycin-bildender Stamm, sondern ein Anthraoyclin-bildender Stamm der Art Streptomyoea griaeus zur Produktion einge-For these reasons, it seems expedient to search for sufficiently effective fermentative processes for the production of 1. "...". The advantage of the method for producing Α factor (I) described in the invention is that it is not a streptomycin-producing strain but an anthraxycin-producing strain of the species Streptomyoea griaeus which is used for production.
· ' . . . f · '. , , f
setzt wird»is set »
AusfuhrungsbeispieleExemplary embodiments
Dia Erfindung soll durch nachfolgende Ausführungsbeispiele näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt werden,The invention is intended to be explained in more detail by the following exemplary embodiments, but not restricted,
1,7 Tage alte Kulturen von Streptomyoea griseus ZIMET 43689, die auf Hafermehlagar (ERITT et al«, Z. AlIg« Mikrobiol, ^2, 91~95, 1982) emers angezogen wurden, werden in einem Submersmedium folgender Zusammensetzung 48 h bei 28 0C in 100 ml Steilbrustflaschen (20 ml Inhalt) geschüttelt (Rotationsschüttler, 240 U.p.M·): 0·6 % Bacto-Pepton} 0.3 % Hefeextrakt, 0.05 # CaCOo (Leitungswasser ad 100 #, pH 7»2; Sterilisation 120 C, 30 min). Die Anzucht der Vorkultur vä rd auf einem Medium folgender Zusammensetzung durchgeführt: 3 % aiucose, 1 % Sodamehl, 0.3 * NaCl, 0y3 % CaCO^, pH 6»5* Sterilisation 120 0C, 30 Min. Mr die Hauptkultur wird das gleiche Medium mit einem Zusatz von 0.25- 0.-5 % KH2PO^ (pH 6,5). vorzugsweise 0.3 % EHgPO^, verwendet. Durch Zusatz von Phosphat wird die Biosynthese der Anthracyclinpigmente reprimierte Nach 96 stund. Fermentation bei 28 0C in gerührten und belüfteten lermentern wird die Kulturlösung (100 1) auf pH 5 bis pH 7, vorzugsweise pH 6, eingestellt und über einen Separator vom Myzel befreit. 1 ml der Kulturlösung enthält etwa 1 /Ug I-entsprechend Testung nach ERITT et al» (Z. AlIg, Mikrobiol. 22, 91-95, 1982).Sie wird mit Butylacetat extrahiert, und nach Entfernung des Lösungsmittels1.7 day-old cultures of Streptomyoea griseus ZIMET 43689 grown on oatmeal agar (ERITT et al., Z. Alig. Microbiol, 1981, 2, 91-95, 1982) are grown in a submanding medium of the following composition for 48 hours 0 C in 100 ml steep breast bottles (20 ml contents) shaken (rotary shaker, 240 rpm): 0 × 6 % bacto-peptone 0.3 % yeast extract, 0.05 × CaCO 2 (tap water ad 100 ×, pH 7 × 2, sterilization 120 ° C. 30 min). Culturing of the preculture va rd on a medium of the following composition performed: aiucose 3%, 1% Sodamehl, 0.3 * NaCl, 0y3% CaCO ^, pH 6 »5 * Sterilization 120 0 C, 30 min Mr is the main culture is the same medium. with an addition of 0.25-0.5% KH 2 PO 4 (pH 6.5). preferably 0.3 % EHgPO ^ used. By adding phosphate, the biosynthesis of the anthracycline pigments is repressed after 96 hours. Fermentation at 28 0 C in stirred and ventilated lermentern the culture solution (100 1) to pH 5 to pH 7, preferably pH 6, adjusted and freed from the mycelium via a separator. 1 ml of the culture solution contains about 1 / ug I - according to ERITT et al. "(Z. AlIg, Microbiol. 22, 91-95, 1982). It is extracted with butyl acetate, and after removal of the solvent
im Vakuum verbleiben ca· 80 g eines Rohproduktes, das an 200 g trockenes Cellulosepulver adsorbiert und mit 5 1 Wasser eluiert wird· Der wäßrige Extrakt wird mit 3 1 Ether extrahiert und die lösung über Ua2SO. getrocknet. Der Bückstand des eingeengten Extraktes (10 g) wird auf 30 präparative DUnnsohichtplatten, beschichtet mit Kieselgel G (Schichtdicke 1 mm, 20 χ 20 cm, hergestellt mit 0t1 M KHpPO4 pH 7*0), aufgetragen und durch zweimaligen Lauf im System Benzen/ Sther (1:1, v/v) entwickelt· Die aktive Zone, nachgewiesen durch ihren Effekt auf den Indikatorstamm S> griseus ZIMET 43682 (ERITT et al·, Z, AlIg, Mikrobiol· 22, 91-95, 1982), wird mit B-fcher eluiert und/Rückstand des Eluates (0,5 g) ist eine Minimalmenge von 2 #-ug im üblichen Papierblattehentest (ERITT et al» s,o#) zur Induktion von Zytodifferenzierung erforderlich, entsprechend einem Gehalt von ca· 12 mg 1_ bei Verwendung von A-Faktor (KLEIWEl et al., Bioorg;. Khime 2, 424^426, 1977), der auf synthetischem Wege hergestellt wurde, als Standard in der bei EßlTT et al* (Z, AlIg* Mikrobiol. 2£, 91-"9S, 1982) beschriebenen Testmethode. Dieses Hohprodukt wird auf Silufol-iOlien (Kieselgel) aufgetragen und im System GHClo/Methanol (95/5, v/v) durch zweimaligen Lauf des Chromatogrammes entwickelt. Die aktive Zone (R~ ca» 0.6, 50 mg) wird mit Ether eluiert. Pur die Induktion der Luftraycelbildung ist eine Minimalmenge von 0,1 /Ug im Papierblättchentest (ERITT et al», s.o.) erforderlich, entsprechend einem Gehalt von 2*5 mg 1· Dieses Produkt wird erneut auf Silufol-IOlien aufgetragen; die Entwicklung erfolgt im System Benzen/Ether (1:1, v/v) durch viermaligen Lauf des Ohromatogramms« Die aktiven Fraktionen (Ra ca· 0*7) werden mit Ether eluiert, der Bückstand des Etherextraktes (8 mg) enthält nach seiner spezifischen Aktivität ca· 1,5 mg 1. Dünnschichtohromatografisch reiner, von Resten aliphätischer Verunreinigungen "befreiter A-Paktor 1_ (R^ 0«2, Eenzen/Ether, 1:1, v/v, bzw· R^ 0#4 CHClo/Methanol, 1:1, v/v) wird durch erneutes Auftragen der Probe auf Silufol-Polien (Kieselgel) und Entwicklung des Chroastogrammes in CHCl^/Bäethanol (95:5, v/v, zweimaliger Lauf des Chromatogrammes und Extraktion derAbout 80 g of a crude product, which is adsorbed on 200 g of dry cellulose powder and eluted with 5 l of water, are left in vacuo. The aqueous extract is extracted with 3 l of ether and the solution is added via Ua 2 SO. dried. The residue from the concentrated extract (10 g) is applied to 30 preparative thin-film plates coated with silica gel G (layer thickness 1 mm, 20 × 20 cm, prepared with 0 t 1 M KHpPO 4 pH 7 × 0) and run twice in the system Benzen / Sther (1: 1, v / v) developed · The active zone, evidenced by its effect on the indicator strain S> griseus ZIMET 43682 (ERITT et al., Z, Al., Microbiol. 22, 91-95, 1982). is eluted with B-fcher and / / Residue of the eluate (0.5 g) is a minimum amount of 2 # -ug in the usual paper sheet test (ERITT et als, o #) required for the induction of cytodifferentiation, corresponding to a content of approx · 12 mg using A-Factor (KLEIWE et al., Bioorg, Khim e 2, 424-426, 1977), prepared synthetically, as standard in the method described in EßlTT et al * (Z, Al * Microbiol 2 l, 91- "9S, 1982. This crude product is applied to silufol oil (silica gel) and in the GHClo / methanol system (95/5, v / v) developed by running the chromatogram twice. The active zone (R ~ ca »0.6, 50 mg) is eluted with ether. For the induction of aerial racemization, a minimum amount of 0.1 μg in the paper flake test (ERITT et al., Supra) is required, corresponding to a content of 2 * 5 mg 1. This product is applied again to silufol oil; The development is carried out in the system Benzen / ether (1: 1, v / v) by four running of the earomatogram "The active fractions (Ra ca * 0 * 7) are eluted with ether, the residue of the ether extract (8 mg) contains after his specific activity approx · 1.5 mg 1. Dünnschichtohromatografisch pure aliphätischer of residues impurities "liberated A-Paktor 1_ (R ^ 0," 2 Eenzen / ether, 1: 1, v / v, or · R ^ 0 # 4 CHClo / Methanol, 1: 1, v / v) is determined by re-applying the sample to silufole polies (silica gel) and developing the chroastogram in CH 2 Cl 2 / bethanol (95: 5, v / v, running the chromatogram twice and extracting the chromatogram
aktiven Fraktion mit Ether erhalten· Ausbeute 1 mg jl·. Die minimale Menge dieser Substanzprobe, ausreichend zur Induktion sichtbarer Zeichen der Luft my ce !bildung und Leukaeiaomycinproduktion in der Inditeatormutante ZIMET 43682 (SRITT et al«j Zy AlIg. Mikrobiol. 22,, 91-95, 1982), beträgt 10 ng»active fraction obtained with ether. Yield 1 mg. The minimum amount of this substance sample, sufficient to induce visible signs of air myceliation and leukeaiaomycin production in the indimentate mutant ZIMET 43682 (SRITT et al., J. Zy Alig. Microbiol. 22, 91-95, 1982), is 10 ng »
2» Zur Fermentation wird der Stamm Streptomyces griseus ZIBDST 43688 eingesetzt» Vorkulturen und Hauptkulturen dieses Stammes werden wie unter 1# beschrieben angezogen. FUr die Hauptkultur wirddae beschriebene Fermentationsmedium ohne Zusatz von KH0PO,, verwendet,, Bei den unter 1· beschriebenen Fermen- 2 » The strain Streptomyces griseus ZIBDST 43688 is used for the fermentation» Precultures and main cultures of this strain are grown as described under 1 # . For the main culture, the fermentation medium described is used without the addition of KH 0 PO ,, in the case of the fermentation medium described under 1.
".<· 4 . ' ' ^,1". <· 4. '' ^, 1
^,1^ 1
tationsbedingungen werden ca. 1 /Ug ^«ml erhalten· Die Aufarbeitung des Fermentationaansatzes führt zu Präparation von 1_ mit unterschiedlichen Reinheitsgrad1, wie unter 1« beschrieben«The processing of the fermentation batch leads to preparation of 1_ with different purity grade 1 , as described under 1 ".
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD24950683A DD214627A1 (en) | 1983-04-04 | 1983-04-04 | PROCESS FOR PREPARING A-FACTOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD24950683A DD214627A1 (en) | 1983-04-04 | 1983-04-04 | PROCESS FOR PREPARING A-FACTOR |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD214627A1 true DD214627A1 (en) | 1984-10-17 |
Family
ID=5546178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD24950683A DD214627A1 (en) | 1983-04-04 | 1983-04-04 | PROCESS FOR PREPARING A-FACTOR |
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|---|---|
| DD (1) | DD214627A1 (en) |
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1983
- 1983-04-04 DD DD24950683A patent/DD214627A1/en not_active IP Right Cessation
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