DD214627A1 - Verfahren zur herstellung von a-faktor - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von A- Faktor, 2- (6'- Methylheptanoyl)- 3- hydroxymethyl-gamma- butyrolacton, eines Biostimulators, der industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrem Biosynthesevermoegen fuer Antibiotika, wie beispielsweise Streptomycin und Anthracycline, zu stimulieren vermag und daher in der mikrobiologischen Industrie bei der Produktion von Wirkstoffen von potentiellem Nutzen ist. Der in diesem Verfahren bevorzugt eingesetzte Mikroorganismus ist der anthracyclin- und sporenbildende Stamm ZIMET 43689 der Art S. griseus oder wahlweise die hinsichtlich der Anthracyclinbiosynthese geblockte Mutante ZIMET 43688. Die Aufgabe der Herstellung des A- Faktors wird in der bevorzugten Ausfuehrungsform dadurch geloest, dass durch aerobe submerse Fermentation des Stammes/ZIMET 43689 bei einer hohen Phosphatkonzentration oder wahlweise der Mutante ZIMET 43688 auf ueblichen phosphat- limitierten Medien mit geeigneten C-, N- Quellen und Mineralsalzen der Biostimulator (A- Faktor) gebildet und mit Hilfe extraktiver Verfahren aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatographische Verfahren gereinigt wird.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von A-Faktor

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer autoregulatorisch wirksamen Substanz, die als endogener Regulator die Differenzierung und Antibiotikumbildung von Streptomyceten zu induzieren und zu stimulieren vermag, und die daher sowohl in der pharmazeutischen Industrie bei der fermentativen Herstellung von Wirkstoffen als auch selbst als Pharmakon von potentiellem Nutzen ist«,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Streptomycin-bildende Stämme von Streptomyoes griseus den autoregulatorisoh wirksamen Α-Faktor, d. h. 2-(6^l«Methylheptanoyl)-3-ⁱ"hytroxymethyl«.>'-butyrolacton bilden können (KHOKHLOV et al., Z . AlIg* Mikrobiol», J£, 647-655 ϊ HARA u, BEPPU, J. Antibiot· 21» 349-358, 1982). Diese Substanz ist in der Lage, in geblockten Mutanten sowohl die Streptomyoin-biosynthese als auch die Produktion von Luftmycelien und Sporen wiederherzustellen (KLEINER et al·, Bioorg* Khinu, ^, 1142-1147; KLEINER et al·, Bioorg. Khim. 2> 424-426, 1977; MORI Tetrahedron Lett. 22, 3431-3432, 1981; HARA u, BEPPÜ, J. Antibiotics 22,, 349-358, 1982)·

Racemischer A-*Faktor der in Abb· 1 gezeigten Konstitution i, ist ferner als Induktor der Anthracyclinbiosynthese und Luftmycelbildung in geblockten Mutanten von Streptomyoes griseus wirksam (GRÄPE et al·, J₉ Antibiot« 21t 57-62, 1982). Diese Substanz ist demnach ein hochaktiver biologischer Wirkstoff, mit dessen Hilfe die Produktbildung degenerierter Klone

einer Streptomyceten-Population wiederhergestellt werden kann, und der daher bei der Stabilisation von Fermentetiönaläufen von potentiellem Nutzen ist. Ihre Interferenz mit lebenden Zellen macht sie selbst als potentielles Pharmakon geeignet·

Bisher wuide Α-Fakt or auf fermentativem Wege aus Streptomycinbildenden Stämmen der Art Streptomyoes griseus isoliert· Angaben über die Effektivität der biologischen Bildung des A-Faktora und der chemischen Isolationsprozedur aus dem Kultur fiItrat erfolgten bisher ausschließlich in Relativdaten; sie lassen daher keine Aussagen über die pro Fermentationsansatz in Reinstform erhaltene Menge £ zu (EIEiNBE et al·» Bioorg. Khim, Z₉ 1142-1147, 1976; PIIlJER et al,,Bioorg. Khim. 1, 7-76, 1975)·

Α-Faktor wurde ferner durch chemische Synthese als Raoeraat (KLEINER et al., Bioorg. Khim. 2» 424-426, 1977) oder als optisch einheitliche Stereoisomere (MORI, K,,Tetrahedron Lett. 22, 3431^3432, 1981; MORJ u. YAMANA, Tetrahedron<";I*tt· 2§j 2919-2920, 1982) hergestellt. Das chemische Verfahren der Herstellung hat gegenüber dem biologiechen den Naohteil, daß es entweder 1_ in racemischer Form mit verminderter spezifischer Aktivität liefert, oder aber daß die Herstellung des optimal wirksamen 2S,3S-Isomeren einen hohen Aufwand erfordert*

Ziel der¹ Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung von Α-Faktor, d. h. von 2-(6 ^l-Methylheptanoyl)-3-hydroxymethyl- ^-butyrolaoton, einem bekannten Stimulatpr der Zytodifferenzierung und Antibiotikumrbildung bei Streptomyoeten, der sowohl morphologische als auch chemische Veränderungen in Kulturen Anthracyolin- und Streptomycinbildender Streptomyceten einisusohalten vermag, die mit einer hohen Effektivität der Produktbildung gekoppelt sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe iugrunde, ein effektiveres und dabei technologisch einfaches Verfahren zu erarbeiten, mit des^ sen Hilfe 2-(6·-Methylheptanoyl)-3-hydroxymethyl- T -butyrolac-

ton (Α-Faktor, 1_) auf fermentativem Wege unter Verwendung eines leicht zugängliche η Mediums, bestehend aus billigen Einsatzstoffen, hergestellt werden kann»

Es wurde Überraschend gefunden, daß der Α-Faktor J[ nicht nur von Streptomycin-bildenden Stämmen der Art Streptomyces ^rise us, sondern auch von Anthracyolin-bildenden Stämmen von £>«, grisems wie von den hinsichtlich ihrer Anthraoyolinprodmktion geblockten Mutanten dieser Stämme gebildet wird· Ausgehend von diesem Befund wird die Aufgabe, den A-Paktpr 1/ auf fermentativem Wege herzustellen, dadurch gelöst, daß man einen Anthracyclinbildenden Mikroorganismus der Art Strepjbomyoes griseus oder wahlweise hinsichtlich ihrer Anthracyclin-Biosynthese geblockte Mutanten unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten bei einer Temperatur von 25 ⁰C bis 37 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, kultiviert· Nach Beendigung der Fermentation wird der Wirkstoff A-Faktor aus dem Kulturfiltrat bei einer Azidität von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise pH 6, mittels üblicher lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat, extrahiert, nachfolgend mit an sich bekannten Methoden konzentriert und mit Hilfe üblicher chromatografie eher Methoden bis zur dünnsohiehtohromatografischen und massenspektrometrischen Identität mit einer authentischen Probe des A-Faktors gereinigt»

In der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der Anthraoyclin-bildende und Luftmyce!-bildende Stamm der Art Streptomyoes griseus oder wahlweise seine hinsichtlich Anthra»- Gyolin-Bildung geblockte, Luftmyce1-bildende Mutante eingesetzt. Diese Stämme sind unter den Registriernummerη Streptomyces griseus ZIMKT 43689 (Anthraeyolin-bildender Stamm) und ZIMBT 43688 (geblockte Mutante) in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDE, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden· Der Anthracyelin-bildende Stamm der Art Streptomyoes griseus mit der Registriernummer ZIMET 43689 ist bei-W.B¹. FIJSCK u. D*STSAÜSS (Z· AlIg/Mikrobiol.

4 455-505, 1975) ausführlich beschrieben«

Die Kultivierung der Stämme ZIKBT 43689 und ZIMiST 43688 erfolgt unter aeroben sterilen Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw«, an Glucose/Gelatine (5 #ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf geeignete Agarnährmedien und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft» und das entstehende Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 ^PC und 37 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsvjreise 4 Tagen, bei einer Azidität kultiviert, die zu Beginn des Permentationsprozesses zwischen pH 6,0 und pH 7,0, und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,5 liegt,/Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff— und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen· Als Kohlenstoffe und Stickst off quellen können die in der Antibiotikafermentation üblichen Eineatzstoffe verwendet werden (Glucose, Stärke, Sojamehl)»

Die die Isolation von reinem A-Paktor störende Produktion von Anthraoyolinpigmenten beim Stamm ZIMET 43689 wird durch Zugabe hoher Phosphatkonzentrationen zum Medium .(<·· 0,25 # KH₂PO₄, pH 6,5) unterdrückt·

Die durch genetische Manipulation erhaltene Mutante ZIMET 43688 weist dagegen keine die Aufarbeitung störende Bildung von Anthracyolinen auf·

Die Fermentation der Stämme ZiMBT 43689 und ZIMET 43688 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentern sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden·

Die Isolierung des A»-Paktors wird in der Weise durchgeführt, daß er aus dem Kulturfiltrat durch organische Lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat oder Chloroform, extrahiert wird· Ein durohi Einengen des Butylacetatextraktes der Kulturlösung erhaltenes !Rohprodukt wird an Cellulosepulver adsorbiert und mit Wasser eluiert. Die wäßrige Phase wird mit Ether extrahiert und der Rückstand des Etherextraktes durch präparative DünnschichtChromatographie unter Verwendung gepufferter Kieselgelschichten (pH 7,0) sowie abwechselnd der Lösungsmittelsysteme Benzen/Ether

(lsi, v/v) und Chloroform/Methanol (95s5y ν/ν) aufgetrennt· Die aktiven Fraktionen, kenntlich durch ihren Effekt auf die Zytodifferenzierung des Indikatorstammes ZIMBT 43682 (BRITT et al·, Z. AlIg, Mikrobiol., g£, 91-95, 1982), werden verei* nigt und erneut der präjparativen IXinns chi cht chromatografie unter Wechsel des Solvens nach 3ader Reinigungsstufe unterworfen· Auf diese Weise wird 1 mg chromatografisoh einheitlicher A-ffaktor aus jeweils 100 1 Kulturlösung der Stämme ZIBiIET 43689 und ZIIffiT 43688 erhalten· Das Präparat entspricht in seinem chromatografischen Verhalten und in seiner biologischen Aktivität einer authentischen Vergleichsprobe (KLEINER et al»» Bioorg. Khim., 2, 424-426, 1977)·

Im Massenspektrum entsprechender Präparationen des A-l^aktors ^aus S, ftriseus ZIIiET 43689 und ZIMET 43688 (JEOL JMS-D-100, 100 ⁰C, direct inlet, 75 eV) sind das Molekülion sowie sämtliche für den A-Paktor 1. charakteristischen Fragmente enthalten (PLHSfER et al·, Bioorg· Khira., 1., 70-76, 1975): M⁺: m/e 242*1524 (»1518 ber· für C₁₃H₂₂O₄), m/e 211.1325 (.1334 ber, für C₁^₉0₃), m/e 171.0670 (»0657 ber. für CgH_{1 χ} O₄), m/e 158; m/e 143·0346 (·0344 ber· für C₆H₇O₄), m/e 127, m/e 109 und m/e 85·

Das 25.16 MHz ¹³C Nßffi-Spektrum (Varian XL 100-15) zeigt die für den 2,3-disubstituierten Butyrolactonring des ^-(ö'-Methylheptanoyl)-ff3«-'hydroxymethyl- "f -feutyrolacton (A-Paktor, 1_) charakte ^CDC1

ristischen Signale (<y ^CDC13 ppm: 55.09 (C2); 42.45 (C3); 68.81 (C4), das 05 zuzuordnende Signal bei 61*58 ppm, sowie die Signale der aliphatischen Methylen- und Methylgruppen. Diese Angaben bestätigen die Konstitution von 1^, lassen Jedoch keine Rückschlüsse auf die Stereochemie der Verbindung zu.

Die Herstellung des A-Faktors I_- bietet den Vorteil, daß fliese Substanz sowohl die morphologische als auch die chemische Differenzierung für die industrielle Wirkstoffproduktion bedeutsamer Mikroorganismen einzuschalten und zu stimulieren vermag. Dieser Wirkstoff ist daher für die Optimierung der fermentativem Produktion von Sekundärmetaboliten von potentiellem Nutzen.

Auf Grund seiner Wechselwirkung mit der lebenden Zelle nach einem bisher noch nicht aufgeklärten Mechanismus stellt 1 selbst ein potentielles Pharmakon dar, dasfür einen Einsatz in der Therapie geeignet ist.

Aus diesen Gründen erscheint es zweckmäßig, nach hinreichend effektiven fermentativen Verfahren zur Herstellung von 1. zu suchen.λ ..... ·. " ;.. . '. . . ." ' ,' · Der Vorteil des in der Erfindung beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Α-Faktor (l) ist darin zu sehen, daß nicht ein Streptomycin-bildender Stamm, sondern ein Anthraoyclin-bildender Stamm der Art Streptomyoea griaeus zur Produktion einge-

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setzt wird»

Ausfuhrungsbeispiele

Dia Erfindung soll durch nachfolgende Ausführungsbeispiele näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt werden,

1,7 Tage alte Kulturen von Streptomyoea griseus ZIMET 43689, die auf Hafermehlagar (ERITT et al«, Z. AlIg« Mikrobiol, ^2, 91~95, 1982) emers angezogen wurden, werden in einem Submersmedium folgender Zusammensetzung 48 h bei 28 ⁰C in 100 ml Steilbrustflaschen (20 ml Inhalt) geschüttelt (Rotationsschüttler, 240 U.p.M·): 0·6 % Bacto-Pepton} 0.3 % Hefeextrakt, 0.05 # CaCOo (Leitungswasser ad 100 #, pH 7»2; Sterilisation 120 C, 30 min). Die Anzucht der Vorkultur vä rd auf einem Medium folgender Zusammensetzung durchgeführt: 3 % aiucose, 1 % Sodamehl, 0.3 * NaCl, 0y3 % CaCO^, pH 6»5* Sterilisation 120 ⁰C, 30 Min. Mr die Hauptkultur wird das gleiche Medium mit einem Zusatz von 0.25- 0.-5 % KH₂PO^ (pH 6,5). vorzugsweise 0.3 % EHgPO^, verwendet. Durch Zusatz von Phosphat wird die Biosynthese der Anthracyclinpigmente reprimierte Nach 96 stund. Fermentation bei 28 ⁰C in gerührten und belüfteten lermentern wird die Kulturlösung (100 1) auf pH 5 bis pH 7, vorzugsweise pH 6, eingestellt und über einen Separator vom Myzel befreit. 1 ml der Kulturlösung enthält etwa 1 /Ug I_-entsprechend Testung nach ERITT et al» (Z. AlIg, Mikrobiol. 22, 91-95, 1982).Sie wird mit Butylacetat extrahiert, und nach Entfernung des Lösungsmittels

im Vakuum verbleiben ca· 80 g eines Rohproduktes, das an 200 g trockenes Cellulosepulver adsorbiert und mit 5 1 Wasser eluiert wird· Der wäßrige Extrakt wird mit 3 1 Ether extrahiert und die lösung über Ua₂SO. getrocknet. Der Bückstand des eingeengten Extraktes (10 g) wird auf 30 präparative DUnnsohichtplatten, beschichtet mit Kieselgel G (Schichtdicke 1 mm, 20 χ 20 cm, hergestellt mit 0_t1 M KHpPO₄ pH 7*0), aufgetragen und durch zweimaligen Lauf im System Benzen/ Sther (1:1, v/v) entwickelt· Die aktive Zone, nachgewiesen durch ihren Effekt auf den Indikatorstamm S> griseus ZIMET 43682 (ERITT et al·, Z, AlIg, Mikrobiol· 22, 91-95, 1982), wird mit B-fcher eluiert und/Rückstand des Eluates (0,5 g) ist eine Minimalmenge von 2 #-ug im üblichen Papierblattehentest (ERITT et al» s,o#) zur Induktion von Zytodifferenzierung erforderlich, entsprechend einem Gehalt von ca· 12 mg 1_ bei Verwendung von A-Faktor (KLEIWEl et al., Bioorg;. Khim_e 2, 424^426, 1977), der auf synthetischem Wege hergestellt wurde, als Standard in der bei EßlTT et al* (Z, AlIg* Mikrobiol. 2£, 91-"9S, 1982) beschriebenen Testmethode. Dieses Hohprodukt wird auf Silufol-iOlien (Kieselgel) aufgetragen und im System GHClo/Methanol (95/5, v/v) durch zweimaligen Lauf des Chromatogrammes entwickelt. Die aktive Zone (R~ ca» 0.6, 50 mg) wird mit Ether eluiert. Pur die Induktion der Luftraycelbildung ist eine Minimalmenge von 0,1 /Ug im Papierblättchentest (ERITT et al», s.o.) erforderlich, entsprechend einem Gehalt von 2*5 mg 1· Dieses Produkt wird erneut auf Silufol-IOlien aufgetragen; die Entwicklung erfolgt im System Benzen/Ether (1:1, v/v) durch viermaligen Lauf des Ohromatogramms« Die aktiven Fraktionen (Ra ca· 0*7) werden mit Ether eluiert, der Bückstand des Etherextraktes (8 mg) enthält nach seiner spezifischen Aktivität ca· 1,5 mg 1. Dünnschichtohromatografisch reiner, von Resten aliphätischer Verunreinigungen "befreiter A-Paktor 1_ (R^ 0«2, Eenzen/Ether, 1:1, v/v, bzw· R^ 0_#4 CHClo/Methanol, 1:1, v/v) wird durch erneutes Auftragen der Probe auf Silufol-Polien (Kieselgel) und Entwicklung des Chroastogrammes in CHCl^/Bäethanol (95:5, v/v, zweimaliger Lauf des Chromatogrammes und Extraktion der

aktiven Fraktion mit Ether erhalten· Ausbeute 1 mg jl·. Die minimale Menge dieser Substanzprobe, ausreichend zur Induktion sichtbarer Zeichen der Luft my ce !bildung und Leukaeiaomycinproduktion in der Inditeatormutante ZIMET 43682 (SRITT et al«j Zy AlIg. Mikrobiol. 22,, 91-95, 1982), beträgt 10 ng»

2» Zur Fermentation wird der Stamm Streptomyces griseus ZIBDST 43688 eingesetzt» Vorkulturen und Hauptkulturen dieses Stammes werden wie unter 1_# beschrieben angezogen. FUr die Hauptkultur wirddae beschriebene Fermentationsmedium ohne Zusatz von KH₀PO,, verwendet,, Bei den unter 1· beschriebenen Fermen-

".<· 4 . ' ' ^,1

^,1

tationsbedingungen werden ca. 1 /Ug ^«ml erhalten· Die Aufarbeitung des Fermentationaansatzes führt zu Präparation von 1_ mit unterschiedlichen Reinheitsgrad¹, wie unter 1« beschrieben«

Claims (2)

Erfindungsanspruch

1, Verfahren zur Herstellung von A-Paktor (2~(6'-Methylheptanoyl)-3-hydroxymethyl-Γ/ -butyrolacton) auf fermentativem Y/ege, gekennzeichnet dadurch, daß man

- einen Anthraoyclin-bildenden Stamm der Art Streptomyces grjseus oder eine hinsichtlich ihrer Anthracy-» olin-Biosynthese geblockte Mutante eines solchen Stammes unter aeroben Bedingungen in flüssigen Uährrnedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 ⁰C bis 37 ⁰G während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen bei einer Phosphatkonzentration von 0,05 % bis 0,5 & kultiviert und

— den gebildeten A-Paktor aus dem Plulturfiltrat bei einer Azidität von pH 4 bis pH 7 mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit den an sich bekannten Methoden konzentriert und chromatografisch bis zur dünnschichtchromatografischen Homogenität reinigt*

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Fermentation den Anthraoyclin-^Bildner Streptomyces griseus ZIMET 43689 einsetzt und ihn in Gegenwart hoher Phosphatkon-* zentrationen (^-0,25 & KH₂PO.) bei 28 ⁰C und pH 6 kultiviert» Verfahren nach Punkt 1 u^d 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Fermentation die hinsichtlich ihrer Anthraoyclin~Produktion geblockte Mutante Streptomyoes griseus ZIMET 43688 einsetzt und bei den in der Antibiotikafermentation üblichen Phosphatkonzeatrationen kultiviert»