DD216734A1 - Verfahren zur herstellung von jasmonsaeureanaloga - Google Patents
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Abstract
Um Jasmonsaeureanaloga der Formel I als Pflanzenwachstumsregulatoren sowie in Form ihrer niederen Ester als Parfuemstoffe zur Verfuegung zu stellen, wurde ein fermentatives Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen erarbeitet. Dabei kommen die Staemme Botryodiplodia theobromae D 7/2, A 82/168-2 und A 82/260, ihre Mutanten oder Varianten zum Einsatz. In aerober Submers- oder Emerskultur unter Verwendung fluessiger Naehrmedien, welche eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, werden die Pilze bei 20-35 Grad C und pH-Werten von 4-6,5 kultiviert. Die Staemme bilden je nach Naehrloesung in 4-10 Tagen ein Substanzgemisch von ca. 1 mg/ml Kulturfiltrat.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Analog ga der Jasmonsäure durch Kultivation von Stämmen der Art Botryodiplbdia theobromae·
Nach Applikation von Jasmonsäureanaloga der allgemeinen Formel I sind diese in Pflanzen bei Wachstums-, Entwicklungs- und Stoff» wechselprozessen regulatorisch «irksam· Die niederen Ester dieser Verbindungen sind als leichflüchtige, wohlriechende Substanzen für die Parfümindustrie von Interesse.
Säuren der allgemeinen Formel I wurden in der Natur bisher nicht aufgefunden. Lediglich 2-epi-Jasmonsäuremethylester (= 2-iso-Jasmonsäuremethylester), ein Ester der Säure der Formel Ib, wurde als Bestandteil eines Pherombngemisches der orientalischen Fruchtmotte Grapholitha molesta (Nishida, E., et al·, J. of Chemical Ecology 8, 947-59 (1982)) nachgewiesen. 2-iso-Jasmonsäure (Verbindung Ib) und 2-iso-Dihydrοjasmonsäure (Verbindung Ic) sind jedoch als Zwischenprodukte der Synthesen von Jasmonsäure und Dihydrojasmonsäure bzw. ihrer Methylester (Tanaka, H., Torli, S., J. Org. Chem. 40, 462-65 (1975)I Stevens, E.V., Hrib, H., Tetrahedron Lett. 22, 4791-94 (1981)) bekannt, die als Duftstoffe in der Parfümindustrie verwendet werden. Jasmonsäure und Dihydrojasmonsäure sind Stereoisomere der Verbindungen Ib und Ic.
Bereits 1968 ist ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von Jasmonsäure vorgeschlagen worden (Broadbent, D., et al.,
GB-Patent 1 286 266), dazu wurde ein Stamm der Pilzes Laslo«.' ,'4i^h^^^^^0m;§is^ß eingesetzt^Es ist je&oe,!! bisher, nicht möglich, auf chemischem Wege Jasmonsäure in 2-iso-Jasmonsäure umzuwandeln.
Es ist das Ziel der Erfindung, Verbindungen der allgemeinen Formel I nach einem einfachen Verfahren ökonomisch vorteilhaft zu produzieren und sie der Landwirtschaft als Basis für Wirkstoffe zur Beeinflussung von Wachstum, Entwicklung ijnd Stoffwechsel von Pflanzen und der Parfümindustrie zur Herstellung von Duftstoffen zur Verfügung zu stellen.
Darlegung dee Wesens der Erfindung .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, Substanzen der allgemeinen Formel I durch !Cultivation eines Pilzstammes herzustellen. Erfindungsgemäß werden zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I mit E =s 2,4-Pentadienyl, 2-Pentenyl oder n-Pentyl die Stämme Botryodiplodia theobromae D 7/2, A 82/168-2 oder A 82/260 oder deren Varianten bzw. Mutanten verwendet. Die Stämme Botryodiplodia theobromae D 7/2, A 82/168-2 und A 82/260 sind beim ZentralinstitUt für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDE in Jena unter den Bezeichnungen ZIMET ,ZIMET und
ZIMET hinterlegt/Es handelt sich um sehr widerstandsfähige Stämme, die sich durch gute Fermentationseigenschaften, äußerst vorteilhaftes, schnelles Myzelwachstum und stabile Produktion der oben genannten Verbindungen bei günstiger Zeit*- ausbeute auszeichnen.
Die Kültivation zur Charakterisierung der Stämme Botryodiplodia theobromae p 7/2, A 82/168-2 und A 82/260 erfolgte auf Agarmedium mit nachfolgender emerser oder submerser Kultur in verschiedenen Nährmedien (siehe Tab. 1). Die Stämme besitzen folgendes makroskopisches Aussehen:
Stamm P 7/2
Alter der Agarkultur: 4 Wochen Agarmedium: Nährboden NL 4
Weißes Luftmyzel mit Gutationströpfchen, Kulturen älter als / 4 Wochen schwarz werdend
Haupt ku It ua?: NL 2, 280C, emerse Kultur
2-4 Tage: Anfangs äußerst schnell wachsendes weißes Myzel, das sich rasenartig verdichtet
15 Tage:, als Myzel rosa-schwarz werdend Hauptkultur: NL 1, 280O, submerse Kultur, 2 Tage: feinfaseriges weißes Myzel, schleimbildend 10 Tage: feinfaseriges weißes Myzel mit dunklen Myzelinseln, schleimt ildenci ,
Stamm A 82/168-^2
Alter der Agarkultur: 4 Woohen
Agarmedium: Nährboden NL 4
Anfangs weißes Myzel, nachfolgend schwarzer Rasen mit grauem Luftmyzel, Agar durchwachsen, hügelige Kolonien.
Hauptkuitur: NL 2, 280O, emerse Kultur 2 Tage: feinfaseriges weißes, schnellwüchsiges Myzel 10 Tage: feinfaseriges schwarzes Myzel, Basen.
Stamm A 82/26,0 '
Alter der Agarkultur: 4 Wochen
Agarmediöm: Nährboden NL 4
Anfangs weißes Myzel, !nachfolgend schwarzer Basen mit grauem Luftmyzel, Agar durchwachsen, korallenartige Auswüchse auf der Oberfläche
fauptkultur: NL 3, 280O, submerse Kultur I Tage: feinfaserige?Weißes Myzel, sphleimig 10 Tage: feinfaseriges schwarzes Myzel, schleimig
Für alle drei Stämme ist die geringe Sporenbildung nach mehrfachem Überimpf en charakteristisch. Sie lassen sich jedoch sehr leicht mit-'ßilfe *pj|^||p|Jbyuj3h:|^C;ken 'vfriiw^en.· Dl^-: EJppre^--; j bildung in Pykniden^Mli durofc ZwjLS<?hjniip$eii a»f Ajc^elsine ^ ^ '-werden.; $§$'? ; '' < ·" ' ;' .'' ; ' 'y^ ': '. - ·;· "'v;·':
Die aerobe Fermentation des Pilzes zur Produktion der. Verbindungen Ia, Ib und Ic erfolgt wahlweise in submerser oder emerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie z.B. Glucose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Glyzerin, Zitronensäure, eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Glyzin, Ammoniumsalze, sowie Mineralsalze. Besonders vorteilhaft sind komplexe organische Medien in wäßriger Mischung, wie z.B. Sojamehl, Zitruspreßrückstände, Maisquellwasser oder Milch. Die Temperatur ist zwischen 20 und 350C und der pH-Wert1 von 4,0 bis 6,5 bei einer Kulturdauer von 4-15 Tagen variierbar. Vorzugsweise arbeitet man jedoch bei Temperaturen von 25-3O0O, pH-Werten zwischen 5»0 und 6,0 und einer Kulturdauer von 5-10 Tagen.
Das Fermentationsprodukt setzt sich aus den Verbindungen Ia, Ib und Io zusammen, von denen die 2-iso-?Dehydro jasmonsäure (Verbindung Ia) neu ist.
In emerser, aerober Kultur werden um 1 mg Substanzgemisch/ml Kulturmedium erhalten, darunter ca. 90 % 2-iso-Jasmonsäure (Verbindung Ib) und 0,03-0,1 mg 2-iso-Dihydrojasmonsäure (Verbindung Ic) und 2-iso-Dehydrojasmonsäure (Verbindung Ia) in etwa gleichen Anteilen. In submerser Kultur produzieren die Stämme um 0,8 mg Substanzgemisch /ml Kulturlösung, das die gleiche prozentuale Zusammensetzung aufweist.
Die Isolierung des Substanzgemisches erfolgt durch Extraktion mittels organischer Lösungsmittel, wie z.B. Ether, Chloroform, Essigester, und nachfolgende Abtrennung der Säuren z.B. mit schwachen alkalischen Basen. Oft kann das Substanzgemisch ohne Auf trennung in die «ärei Komponenten verwendet werden, z.B. zur Beeinflussung von Wachstum, Entwicklung und Stoffwechsel von Pflanzen in der Land-, Garten- oder Forstwirtschaft. Für diesen Verwendungszweck brauchen die Substanzen ggf. nicht einmal aus dem Kulturmedium isoliert zu werden. Sollen jedoch die Einzelsubstanzen gewonnen werden, ist das mit den gängigen Methoden der Verteilungschromatographie möglich; besonders geeignet ist die umgekehrte Chromatographie an silylierten Adsorbentien.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein einfaches und infolge seiner günstigen Zeitausbeute ökonomisch vorteilhaftes Fermentationsverfahren«
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährmedien sind der Tabelle 1 zu entnehmen*
Ausführ tmp; sbei spiele Beisgiel^
2 ml einer Suspension des Myzels des Stammes Botryodiplodia theobromae D 7/2 in Wasser wird in Stehrundkolben (Fassungsvermögen 500 ml) mit je" 100'ml Kulturmedium NL 1 verteilt Und bei 3O0C auf einer Bundsohwingschüttelmasohine (4i90 U/min) geschüttelt· Nach 5 Vagen enthalten die Kolben ca. 0,8 mg/ml Gemisch aus den Verbindungen der Formeln Ia, Xb und Ic.
2 ml einer Suspension des Myzels des Stammes Botryodiplodia theobromae D 7/2 in Wasser wird auf 500-ml-Pernbachkolben, gefüllt mit je 100 ml Kulturmedium NL 2, verteilt und bei 280C in Oberflächenkultur 10 Tage inkubiert. Pro ml Nährlösung kön·* nen danach um 1 mg Substanzgemisch aus den Verbindungen der Formeln la, Ib und Ic isoliert werden.
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Je 2 ml einer Suspension des Myzels des Stammes Botryodiplodia theobromae A 82/260 in Wasser werden in Stehrundkolben (Fassungsvermögen 500 ml) in je 100 ml Kulturmedium NL 3 verteilt und bei 3O0C auf einer Bundsohwingschüttelaaschine (19Q Ü/min) geschüttelt. Nach 4 Tagen enthalten die Kolben ca. 0,8 mg/ml Substanzgemisch aus den Verbindungen der Formeln Ia, Ib und Ic.
Je 2 ml einer Suspension des Myzels des Stammes Botryodiplodia theobromae A 82/168-2 in Wasser werden auf 500-ml-Ferribaohkolben, gefüllt mit je 100 ml Kulturmedium NL 2, verteilt und die Kolben bei 280C in Oberflächenkultur 10 Tage inkubiert· Pro ml Nährlösung sind 1 mg Substanzgemisch (Verbindungen der Formeln Ia, Ib und Ic) isolierbar, darunter 0,9 mg Substanz nach Formel Ib (R. 2-Pentenyl).
Zur Isolierung des Substanzgemisch.es wird das Myzel durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt, das Kulturfiltrat mit HCl auf pH 3 angesäuert, mit Chloroform extrahiert und mittels Natriumhydrogencarbonatlösung alle organischen Säuren abge-, trennt. Durch Ansäuern mit Salzsäure und Extraktion mit Chloroform wird ein Bohsubstanzgemisch erhalten, das 60 % der hergestellten Verbindungen der Formeln Ia, Tb und Ic enthält. Eine Mengenbestimmung kann durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit dem Laufmittelsystem n-Hexan:Essigester:Eisessig= 60:40j1 gegen Testsubstanz Jasmonsäure im Konzentrationsbereich 0,2-1/Ug nach Sichtbarmachung der Verbindungen mittels Anisaldehyd-Schwefelsäurereagens bei 11O0C erfolgen. Zur Isolierung der Einze!substanzen kann das Verbindungsgemisch über silyliertes Kieselgel säulenchromatographisch mittels des Laufmittelsystems MethanoliWasserjEisessig = 50s50*5 aufgetrennt werden. Die Substanzen werden in folgender !Reihenfolge eluiert:
a) j~3-0xo-2-(2,4-pentadienyl)-cyclopentyl]-1-essigsäure
b) |"3-Oxo-2-(2-pentenyl)-oyclopentyl']-1-esßigsäure und
c) [2-pentyl-eycloperitylj-1-essigsäure.
Die Identifizierung erfolgt mittels GC-MS als Methylester. - =
a) 222 (M+), 204, 193, 191, 167, 149 (100 %), 130, 107, Ö3, 79 (100 %)
b) 224 (M+), 206, 195, 193, 156, 151, 135, 133,, 121, 109, 83 (100 %)
c) 226 (M+), 194, 156, 153, 137, 109, 83 (100 %), 82
HL 1
NL2
NL3
NIA
| Saccharose | 50g | 30g | 50g | 20g |
| Sojamehl | 5g | 5g | 5g | .-. . . · ' . |
| Maisquellwasser | -' | 15ml | - | - |
| Zitrusextrakt1' | 200ml | - | 100ml | 500ml |
| Glyzin | i | - | 10g | - |
| KH2PO4 | 0,005g | 0,5g | 0,005g | - |
| MgSO4 ν 7 H2O | 0,003g | 0,3g | 0,003g | - '' - ' |
| PeSO4 · 7 H2O | otoöpig | 10ng | 0,0001g | |
| ZnSO4 . 7 H2O | O9000088g | 8,8mg | 0,000088g | .- |
| Agar-Agar | -' | 10g | ||
| Aqua dest ad. | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| pH vor dem | ||||
| Sterilisieren | 5Λ | 5,4 | 5,4 | 6,0 |
| pH-Einstellung mit | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
| Autoklavieren | jeweils | einheitlich bei 120 | 0C für 20 min |
1) Zitrusextrakt: Filtrat einer wäßrigen Aufschlämmtuig von Preßrüokständen von geschälten Zitrusfrüohten, besonders vorteilhaft von einer wäßrigen Aufschlämmung von Zitrusalbedo·
H2C
H2CH R
COOH
Formel I α) R=CH2-CH=CH-CH=CH2
b) R=CH2-CH=CH-CH2-CH3
C J
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Jasmonsäureanaloga der allgemeine! Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Stämme Botryodiplodia theobromae D 7/2, A 82/168-2, A 82/260 oder deren Mutanten bzw. Varianten verwendet werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnetf daß ein Gemisch aus Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt wird, das die Verbindungen Ia (E s 2,4-Pentadienyl), Ib (E β 2-Pentenyl) und to (B s n-Pentyl) enthält.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Stämme Botryodiplodia theobromae D 7/2, A 82/ 168-2 oder A 82/260, ZIMET V.3>13 , ZIMET*/?^ oder ZIMET <ϊ3Ί-Ί2\.η aerober Fermentation unter Verwendung eines Nährmediums, welches eine assimilierbare C-Quelle, eine assimilierbare N-Quelle und Mineralsalze enthält, in submerser oder emerser Kultur bei einer Temperatur von 20-350O und einem pH-Wert von 4,0-6,5 während eines Zeitraumes, von 4-15 Tagen kultiviert und aus dem Nährmedium die Verbindungen der allgemeinen Formel I isoliert.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium ein komplexes organisches Medium enthält. '
5·. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die F<
wird.
wird.
die Fermentation bei 25-3O0O und pH 5,0-6,0 durchgeführt
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25150083A DD216734A1 (de) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Verfahren zur herstellung von jasmonsaeureanaloga |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25150083A DD216734A1 (de) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Verfahren zur herstellung von jasmonsaeureanaloga |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD216734A1 true DD216734A1 (de) | 1984-12-19 |
Family
ID=5547776
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| DD25150083A DD216734A1 (de) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Verfahren zur herstellung von jasmonsaeureanaloga |
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD216734A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996018742A1 (fr) * | 1994-12-12 | 1996-06-20 | Firmenich S.A. | Procede pour la preparation de cetones cycliques |
-
1983
- 1983-05-31 DD DD25150083A patent/DD216734A1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996018742A1 (fr) * | 1994-12-12 | 1996-06-20 | Firmenich S.A. | Procede pour la preparation de cetones cycliques |
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