DD218189A1 - Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen - Google Patents
Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen Download PDFInfo
- Publication number
- DD218189A1 DD218189A1 DD25384883A DD25384883A DD218189A1 DD 218189 A1 DD218189 A1 DD 218189A1 DD 25384883 A DD25384883 A DD 25384883A DD 25384883 A DD25384883 A DD 25384883A DD 218189 A1 DD218189 A1 DD 218189A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- immunoassay
- solid phase
- haptens
- item
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000465 moulding Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 9
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000005046 Chlorosilane Substances 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N chlorosilane Chemical class Cl[SiH3] KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 5
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 amino, carbonyl Chemical group 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 125000000018 nitroso group Chemical group N(=O)* 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004890 Hydrophobing Agent Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910008051 Si-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910006358 Si—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 102000053391 human F Human genes 0.000 description 1
- 108700031895 human F Proteins 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 150000001282 organosilanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen, Antikoerpern, Haptenen, Viren, Hormonen Pharmaka etc. Das Ziel der Erfindung ist es, billige Traegermaterialien zu verwenden, die wiederholt eingesetzt werden koennen. Aufgabe der Erfindung ist es, siliziumdioxidhaltige Materialien einzusetzen. Erfindungsgemaess erfolgt dies durch siliziumdioxidhaltige Formkoerper, deren Oberflaechen zwei- oder dreidimensional nutzbar sind. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.
Description
-1- 253 848
Festphasen — Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern an Glasoberflächen
Die Erfindung betrifft einen Feslphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, Haptenen etc. an silmumdioxidhaltigen Formkörpern, vorzugsweise aus Glas unter wiederholtem Einsatz im (Enzym)-Immunoassay. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.
Immunoassays sind Verfahren zur spezifischen und sensitiven qualitativen und quantitativen Analyse eines Stoffes in einer Flüssigkeit unter Anwendung der für diesen Stoff spezifischen Antikörper. Derartige Verfahren haben in den letzten Jahren in der medizinischen Praxis große Bedeutung erlangt.
Unter den zahlreichen beschriebenen Varianten hat die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht, eine weite Verbreitung gefunden. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyrol angewandt (Übersicht: J.E.Herrmann in: Methods in Enzymology 73 11981] S.239). Nachteile dieses Verfahrens sind:
— Die Beladungsdichte an den Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial und die zur Verfügung stehende Oberfläche limitiert.
— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann et al.J.CIin.Microbiol.10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z.med. Labordiagn.24 [1983] 3,177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.
— Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwändig zu präparierende Proteine verloren gehen.
— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probezahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.
In der Patentanmeldung (WP GOI N/249992) wurde ein Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen unter kovalenter Bindung des Proteins C1q an siliziumdioxidhaltige Materialien, vorzugsweise Glas, beschrieben.
Dieses Verfahren beruht auf der seit langem bekannten Tatsache, daß die OH-Gruppen auf SiO2-Oberflächen als Angriffspunkte für chemische Agenzien, insbesondere Organosilanen mit unterschiedlichen Funktionellen Gruppen, zur Verfügung stehen. Während die silikofunktionelle Gruppe mit dem Glas reagiert, steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter Verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen zur Verfügung, so daß diese Verbindungen als Brücke zwischen der anorganischen Matrix und der organischen/ biochemischen Verbindung fungieren.
In erwähnter Patentanmeldung (WP GO1 N/249992) konnte gezeigt werden, daß durch die kovalente Bindung des Proteins C1q an Glasoberflächen dieses durch Anwendung nicht denaturierender Medien wiederholt und reproduzierbar im Immunoassay eingesetzt werden kann. Allerdings wurde dieses Verfahren dadurch begünstigt, daß die Bindung zirkulierender Immunkomplexe oder von aggregiertem IgG an C1q vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen über den Fc-TeiI des Immunglobulins erfolgt und somit eine Abspaltung der gebundenen Immunreaktanden durch einfache Änderung der lonenstärke des Mediums erzielt werden konnte.
Wesentlich komplizierter stellen sich die Verhältnisse bei spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen dar, bei denen durch eine Vielzahl unterschiedlichster nichtkovalenter Wechselwirkungen beträchtliche Bindungsstärken erreicht werden. Derartige Antigen-Antikörper-Komplexe lassen sich oft nur unter Anwendung relativ drastischer Medien dissoziieren, wobei nicht selten einer oder beide Reaktionspartner denaturiert werden. So ist eine vollständige Dissoziation derartiger Komplexe nur im stark sauren (pH < 2,4) oder stark alkalischen (pH > 13) pH-Bereich zu erzielen, wobei die Dissoziationsgeschwindigkeit zwischen 1 h bis mehreren Tagen liegen kann. Es ist einleuchtend, daß derartige Dissoziationszeiten nicht nur die Gefahr von Proteindenaturierungen verstärken, sondern auch für eine Anwendung in der klinischen Praxis nicht praktikabel sind.
Es ist Ziel der Erfindung, allgemein zugänglich und billige Trägermaterialien unter Nutzung der kovalenten Bindung von Proteinen im Immunoassay einzusetzen, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.
Die Erfindung hat die Aufgabe, siliziumdioxidhaltige Trägermaterialien, vorzugsweise Glas, als feste Phase im Festphasen-Immunoassay einzusetzen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch siliziumdioxidhaltige Formkörper, deren Oberflächen /wi)i- odor dreidimensional nutzbar sind und die nach vorheriger an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaflmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit Antigenen oder Antikörpern beladen werden und nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden, gelöst. Die als feste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind kugelförmige, planere oder zylindrische Körper, aber auch würfelförmige oder kegelförmige lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 0,1 cm3 und sollte 15cm3 nicht überschreiten. Bei planeren Glaskörpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur Verfügung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm2 nicht unter- und 5cm2 nicht überschreiten. Die Formkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle Matrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete Vorrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. Das siliziumdioxidhaltige Material ist im wesentlichen Glas, wobei die Zusammensetzung unterschiedlich sein kann. Es muß nur gewährleistet sein, daß sich genügend Si-OH-Giuppen auf der Oberfläche befinden
-2- 253848 4
Die nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den verschiedensten Substanzen bestehen, die auf unterschiedliche Art und Weise die multifaktoriellen Bedingungen derartiger Antigen-Antikörper-Komplexe zu spalten in der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer wie HCI-Glyzin-Puffer pH - 2,2-2,8, chaotrophische Ionen, wie MgCI2, KSCN, NaJ sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen wie Dioxan und Äthylenglykol zu rechnen.
Die Oberflächenmodifizierung dient dem Zweck der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit dem jeweiligen Protein. Sie erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel der Struktur
-OR X-(CHj)n-Si1OR
wobei R Alkylreste und X reaktive Gruppen, wie Amino-. Diazo-, Carbonyl-, Carboxy-, tsocyano-, lsothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen u. ä. sind und dadurch hetero- oder homobifunktionelle Reagenzien wie Gluteraldehyd umgesetzt werden.
An die so aktivierte Glasoberfläche wird erfindungsgemäß der Antikörper bzw. das Antigen in der bekannten Art und Weise gebunden.
Wichtig für die praktische Durchführung das Assays ist hierbei, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Glaskörper leicht zu handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen. Die so mit dem Antikörper bzw. dem Antigen beladene Glasmatrix wird dann als feste Phase im (Enzymimmunoassay eingesetzt. Nach Ablauf der Immunreaktion werden die gebundenen Immunreaktanden durch die beschriebenen die Dissoziation herbeiführenden Agenzien abgeschalten, so daß das Kovalent gebundene Antigen bzw. der Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen. Besonders einfach gestaltet sich die Durchführung des Immunoassays auf planen Glasplatten, die analog kommerzieller Mikrotitrationsplatten ausreichend Platz für eine große Zahl von Proben liefern. Derartige Platten bieten sich besonders für Screening-Untersuchungen in der klinischen Routine an. Wichtig ist hierbei, daß die für die Antigen- oder Antikörper-Bindung zur Verfugung stehenden Flächen für alle Proben identisch ist, da nur dann ein quantitativer Vergleich derselben möglich ist. Von Bedeutung ist weiterhin, daß durch geeignete Maßnahmen ein Ineinanderlaufen der individuellen Proben ausgeschlossen wird. Beide Bedingungen werden auf einfache Art und Weise mit geeigneten Hydrophobierungsmitteln, wie Chlorsilane und Paraffine geschaffen, die die entsprechende Glasplatte in kleine, definierte Areale unterteilen und auf Grund ihrer Oberflächenspannung eine deutliche Abgrenzung der auf diese Areale aufzubringenden Flüssigkeiten bewirken. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:
— Durch die kovalente Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen. Diese führen ebenso wie die verbesserte sterische Zugänglichkeit des Proteins — bedingt durch den Spacer—zu einer höheren Empfindlichkeit im Immunoassay.
— Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.
— Die unspezifische Bindung an Glas-Formkörpern ist vernachlässigbar gering.
— Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, da die als Einweggefäße benutzten Plastematerialien abgelöst werden und zum anderen, da sich die auf diesem Verfahren beruhenden Immunoassays leicht automatisieren lassen. Besonders augenfällig wird dies bei Verwendung von planen Glasplatten, bei denen die notwendigen Trenn- und Waschvorgänge durch einfaches Abspülen erzielt werden können. Aber auch bei Einsatz von Glaskörpern kann eine erhebliche Zeitersparnis dieser Vorgänge erreicht werden (siehe Beispiel 2 und 3).
— Durch die kovalente Bindung der Antigene bzw. Antikörper an die Glasoberfläche können diese unter Anwendung von geeigneten Dissoziationsreagenzien wiederholt im Immunoassay eingesetzt werden. Dadurch werden die mitunter sehr wertvollen und teuren Proteine eingespart, was wiederum die Kosten des Assays günstig beeinflußt.
— Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper an Glasmatrices ergeben sich neue Aspekte der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller derartiger Kits.
in kommerzielle Glasröhrchen (5,5mm χ 45mm) werden je 250μΙ einer 1%igen Lösung des Silanhaftmittels NB 1114 (Aminopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in Äthanol/Wasser (1:1) gegeben und 4 Stunden bei höheren Temperaturen (370C bis 60"C) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH7,4, werden je 200 μΙ 2%iges Gluteraldehyd in PBS-Puffer zugegeben und 2 h bei 37 0C inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen werden die so aktivierten Röhrchen mit je 200μΙ humanem IgG in PBS-Puffer versetzt (50μΙ/ΓηΙ) und 4h bei Raumtemperatur bebrütet. Nach weiteren Waschvorgängen werden die eventuell noch freien Aldehydgruppen mit 0,2 m Lysinlösung blockiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer werden die Röhrchen mit 200μΙ eines Kaninchen-antihuman-lgG-Antiserums in einer Verdünnung von 1:100 für 4h bei 37"C inkubiert und anschließend wiederum mehrmals gewaschen. Anschließend werden die Röhrchen mit 200μΙ Konjugat (39ng/ml), bestehend auf einem Schaf-anti-Kaninchen-tgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und nach erneutem Waschen die Enzymaktivität mit 2,2 Azinodie (3-äthyl-benzthiazolin-sulfonat (6) (ABTS) und H2O2 und photometrische Messung bei 418nm bestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Röhrchen zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend in Mehrfachbesti'nmungen mit einer der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei Raumtemperatur versetzt; 1) PBS-Puffer, 2 m an NaCI 5% Dioxan enthaltend, 2) ImKSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4,5m MgCI,, 5} 1m NaJ, 6) HCI-Glyzin-Puffer pH 2,8. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem IgG beladenen Röhrchen erneut im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können
Zylinderförmige Formkörper aus Glas (Außei!durchmesser 6 mm, Innendurchmesser ca. 4mm, Höhe ca. 3mm) werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Silanhaftmitteln (NB 1115 (Glycidoxypropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) behandelt und anschließend mit Gluteraldehyd aktiviert und mit humanem Faktor VIII gebunden. Zur Ausführung des EIA werden diese
з 253 848
Formkörper in kommerzielle Mikrotitrationsplatten, die 96 Proben a 300μΙ aufnehmen, gegeben und im folgenden nach zwischenzeitlichem Waschen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-F Vlll-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, versetzt. Nach anschließendem Waschen wird die Enzymaktivität analog Beispiel 1 mit ABTS und H2O2 unter Verwendung einer Absaugküvette (Kombinat VEB Carl Zeiss JENA) bestimmt. Entsprechend Beispiel 1 wird das gebundene Konjugat mit einem der dort angeführten Oissoziationsreagenzien 1 )-6) abgespalten und ausgewaschen, so daß die mit F VIII beladenen Glas-Formkörper erneut in EIA eingesetzt werden können. Die Waschvorgänge erfolgen in dieser Variante durch Abdecken der Mikrotitrationsplatte mit einer geeigneten Vorrichtung, die die Glas-Formkörper in den Vertiefungen fixiert, und einfaches Umdrehen der Mikrotitrationsplatte. Dadurch vereinfacht sich der Waschprozeß im Vergleich zu Beispiel 1, bei dem jedes Röhrchen in der üblichen Art und Weise mittels Vakuum abgesaugt werden muß, erheblich, so daß größere Probenzahlen mit hoher Effektivität bestimmt werden können.
Glaskugeln von 5,5mm Durchmesser (mattiert F ~ 50 mm2) werden wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln, Gluteraldehyd und humanem F VIII aktiviert und beladen. Diese Glaskugeln werden in Polystyrol-Mikrotiter-Platten eingeführt und im folgenden der EIA zur Bestimmung von F Vlll-Antigen (W. Schößler et al. Acta biol. med. Germ.41 [1982] 263, W. Schößler et al. Acta biol. med.Germ.41 [1982] 695) in der beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Hierzu werden die Glaskugeln mit einom Inktibationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem in Überschuß vorhandenen Kaninchenanii human Faktor Vlll-Antikörper versetzt und 6h bei 37 C inkubiert. Nach erneutem Waschen analog dem Beispiel 2 werden 200/il eines Konjugates, bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, bestimmt. Die Abspaltung der gebundenen Antikörper erfolgte mit einem der in Beispiel 1 angeführten Dissoziationsreagenzien, so daß die mit F VIII beladenen Glaskugeln erneut im EIA eingesetzt werden können.
Plane Glasplatten werden durch Hydrophobierungsmittel wie Chlorsilane oder Paraffin in konstante Areale von ca. 1 cm2 Fläche unterteilt. Diese werden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln und Gluteraldehyd aktiviert und mit einem Anti-human-Faktor Vlll-Antikörper vom Kaninchen beladen. Nach Ausführung der erforderlichen Waschvorgänge, die durch einfaches Abspülen der Glasplatte realisiert werden, erfolgt eine Inkubation mit einem geeigneten Volumen (25 bis 50μΙ) Faktor-Vlll-Antigen enthaltendem Probenmaterial und nach erneutem Waschen die Zugabe eines Kaninchen-anti-human-F VIII-Antikörpers gekoppelt an das Enzym Meerrettichperoxydase und Bestimmung der Enzymaktivität analog Beispiel 3.
Claims (4)
- -4- 253 848Erfindungsansprüche:1. Feslphasen-Immunoassay zur immunologischen Bestimmung von Aniigenen, Anukörpern, Haptenen, Viren, Hormonen, Pharmaka etc. auf der Grundlage siliziumdioxidhaltiger Materialien als feste Phase, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase siliziumdioxidhaltige Formkörper, deren Oberflächen zwei- oder dreidimensional nutzbar sind, eingesetzt werden, die nach vorheriger an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit Antigenen wie Faktor Vlll-Antigen oder anderen Plasmaproteinen, Antikörpern wie anti-Faktor Vlll-Antikörpern oder Antikörpern gegen Antigene. Haptene, Viren, Bakterien etc., humanem Immunglobulin oder anderen Serumproteinen bzw. Haptenen beladen werden und nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien gespalten und die mit den oben genannten Antigenen, Antikörpern bzw. Haptenen beladenen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden.
- 2. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Immunoassay eingesetzten dreidimensional nutzbaren Formkörper halbkugelförmige, kugelförmige, zylinderförmige, würfelförmige oder kegelförmige Gestalt haben, daß sie sowohl Kompakt- als auch Hohlkörper sind, daß die Halbkörper offen oder geschlossen sind und daß das Volumen der Formkörper 0,1 bis 15cm3 beträgt.Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweidimensional nutzbaren Formkörper planare SiO2-haltige Körper sind, deren Oberfläche in regelmäßige sich einander abwechselnde hydrophobe und hydrophile Bezirke oimjoißilt ist, woboi die bydropbilon Bewirkt; oino Größi) von 0,001 bis bein7 besitzen.Ί \ ostphasen-lmmunoassay nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die hydrophoben Be/irko durch Hydrophobierungsmittel wie Chlorsilane oder Paraffine erzeugt werden.
- 5. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das geformte siliziumdioxidhaltige Material Glas ist.
- 6. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als die Dissoziation herbeiführende Reagenzien stark saure Puffer und Lösungen, alkalische Puffer und Lösungen, chaotrophische Ionen, depolarisierende Reagenzien, elektrostatische und Wasserstoffbrückenbindungen beeinflussende Substanzen sowie Haptene verwendet werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25384883A DD218189A1 (de) | 1983-09-10 | 1983-09-10 | Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25384883A DD218189A1 (de) | 1983-09-10 | 1983-09-10 | Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD218189A1 true DD218189A1 (de) | 1985-01-30 |
Family
ID=5549701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD25384883A DD218189A1 (de) | 1983-09-10 | 1983-09-10 | Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD218189A1 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4705628A (en) * | 1985-04-09 | 1987-11-10 | Terumo Kabushiki Kaisha | Immunoglobulin adsorbent and adsorption apparatus |
| EP0303229A3 (de) * | 1987-08-11 | 1991-05-02 | Eiji Ishikawa | Hoch empfindlicher Immunoassay |
| US5236849A (en) * | 1987-08-11 | 1993-08-17 | Eiji Ishikawa | Method of high sensitivity immunoassay |
| EP0881493A4 (de) * | 1996-09-27 | 2000-05-17 | Srl Inc | Immunoassayträger und immunoassayverfahren damit |
-
1983
- 1983-09-10 DD DD25384883A patent/DD218189A1/de unknown
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4705628A (en) * | 1985-04-09 | 1987-11-10 | Terumo Kabushiki Kaisha | Immunoglobulin adsorbent and adsorption apparatus |
| EP0303229A3 (de) * | 1987-08-11 | 1991-05-02 | Eiji Ishikawa | Hoch empfindlicher Immunoassay |
| US5236849A (en) * | 1987-08-11 | 1993-08-17 | Eiji Ishikawa | Method of high sensitivity immunoassay |
| EP0881493A4 (de) * | 1996-09-27 | 2000-05-17 | Srl Inc | Immunoassayträger und immunoassayverfahren damit |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2912173C2 (de) | Reaktor/Separator-Vorrichtung | |
| DE68927403T2 (de) | Derivatisierte glasträger zur sequenzierung von peptiden und proteinen | |
| DE3687589T2 (de) | Festkoerpersystem zur verwendung in ligand-rezeptoruntersuchungen. | |
| DE69122036T2 (de) | Säulenagglutinationsassay und Vorrichtung | |
| DE68911674T2 (de) | Testverfahren und reagenzsatz dazu. | |
| US6291249B1 (en) | Method using an apparatus for separation of biological fluids | |
| DE69122832T2 (de) | Vorrichtung zur Durchführung einer raschen einfachen Handprüfung | |
| WO2002085926A2 (de) | Verfahren zur herstellung stabiler, regenerierbarer antikörper-arrays | |
| JP2883845B2 (ja) | バイオロジカル・マテリアルを単離する方法 | |
| EP0849595B1 (de) | Synthetische Partikel als Agglutinationsreagenzien | |
| DE2930706A1 (de) | Verfahren zum nachweis von erregerspezifischen antikoerpern | |
| DE69106002T2 (de) | Testverfahren und reagenziensatz dafür. | |
| DE68917039T2 (de) | Mikroporöser Artikel mit stabilisiertem spezifischem Bindungsreagenz, Verfahren zur Anwendung und ein diagnostischer Testsatz. | |
| DE68919828T2 (de) | Nanoteilchen mit gebundenen enzym und ligand zur verwendung bei analysen. | |
| DE69809640T2 (de) | Methode zum Nachweis eines Analyten durch Immunchromatographie | |
| DD218189A1 (de) | Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen | |
| EP0572845B1 (de) | Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Analyten | |
| AT395076B (de) | Vorrichtung und verfahren fuer die diagnostische bestimmung klinischer parameter | |
| DE60017017T2 (de) | Immuntest unter verwendung von partikeln mit kaseinumhüllungen | |
| DE3715984A1 (de) | Enzym-immunoassay | |
| US5641689A (en) | Stable aqueous carbon sol composition for determining analyte | |
| EP3063525A1 (de) | Verbesserte vorrichtung und verfahren für reaktionen zwischen einer festen und einer flüssigen phase | |
| Matsuzawa et al. | A rapid dot-blot method for species identification of bloodstains | |
| DD225795A1 (de) | Festphasen-immunoassay an cellulosehaltigen materialien | |
| WO1995008770A1 (de) | Verfahren zur beschichtung von oberflächen mit biomolekülen und anderen rezeptormolekülen |