DD220334A5

DD220334A5 - Verfahren zur isolierung des carboxypeptidase b enzyms aus dem pankreas von saeugetieren

Info

Publication number: DD220334A5
Application number: DD84261731A
Authority: DD
Inventors: Laszlo Boross; Erzsebet Dala; Aranka Kiss; Bela Szajani; Arpad Tetzli
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-04-06
Publication date: 1985-03-27
Also published as: US4650762A; DE3412669A1; CS236184A2; CS252472B2; CU21674A3; HUT34234A; HU190129B; DD222632A5; SU1487817A3; RU1769763C; RO88619A

Abstract

ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DAS HOMOGENISIERTE PANKREAS AUTOLYSIERT, DAS ERHALTENE AUTOLYSAT MIT EINEM PUFFER MIT EIN PH-WERT VON 5,0-8,5 IN EINEM VERHAELTNIS VON 1:1 VERDUENNT UND BEI 50-75 GRAD CELSIUS 5-30 MINUTEN LANG EINER WAERMEBEHANDLUNG UNTERWORFEN. DAS SO ERHALTENE GEMISCH WIRD ZENTRIFUGIERT, UND DER SUPERNATIERENDEN LOESUNG WERDEN 200-320 G/I AMMONIUMSULFAT ZUGEGEBEN. DIE SUSPENSION WIRD ZENTRIFUGIERT, DER ERHALTENEN FLUESSIGKEIT WERDEN 10-80 G/I AMMONIUMSULFAT ZUGEGEBEN. DAS ERHALTENE AKTIVE CARBOXYPEPTIDASE ENZYM FAELLT AUS, DER NIEDERSCHLAG WIRD ZENTRIFUGIERT, DAS ERHALTENE ENZYM N WASSER ODER EINER PUFFERLOESUNG GELOEST UND GEGEN WASSER ODER EINE PUFFERLOESUNG DIALYSIERT. DAS ERHALTENE PRODUKT WIRD IN GEFRORENEM ZUSTAND GELAGERT.

Description

Verfahren zur Isolierung des Carboxypeptidase B Enzyms aus dem Pankreas von Säugetieren

Anwendungsgebiet der Erfindung: , . . ' ',.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung . des Carboxypeptidase B Enzyms aus dem Pankreas vonSäugetieren - insbesondere aus Schweinepankreas.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Das als Handelsprodukt zugängliche Carboxypeptidase B Enzym wird aus der Schweinebauchspeicheldrüse isoliert· Wach der Fachliteratur kann dieses Enzym jedoch auch aus dem Pankreas von anderen Säugetieren (z.B. Rind, Ziege) isoliert werden.

lach dem in J. Biol. Chem. £35, .2272 (1960) publizierten Artikel wird das Schweinepankreas aufgeschnitten und bei . Raumtemperatur autolysiert. Der Fettgehalt des Organs wird

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mit Aceton, einem Aceton-Äther Gemisch und schließlich Äther entfernt, das entfettete Organ wird getrocknet und pulverisiert« Das acetonische Pulver wird mit Y/asser extrahiert und das Extrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Das Produkt wird-· nacheinander einer Entsalzung, einem Ionenaustausch (aufDEAE-Cellulose, durch Säulenchromatographie) und einer Ausfällung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Der Niederschlag wird durch Dialyse oder Gelfiltrieren entsalzen. Das Enzym wird in gefrorenem Zustand gelagert, weil, die Liophylisierung die Aktivität um 25-45 % herabsetzt«

Die spezifische Aktivität des Produkts beträgt 184,2 Einheiten/mg (bei 25 C mit einem Hippuryl-L-arginin Substrat gemessen), was im Vergleich zum- aus dem autolysierten Gewebe erhaltenen. Extrakt einer 1f?-T7fachen Reinigung entspricht* . " > ' . .· ·. . .' ·.·^:. . - ' V· · ·.. ' .

In der Praxis wird die* obige Methode irPden meisten Fällen angewendet. . ' ^;> . , ' . . "

Gemäß Biochemistry A_, 1069 (1962) kann Carboxypeptidase B aus Rinderpankreas in kristalliner Form durch Aktivierung des gereinigten Zimogens - d.h. des Procarböxypeptidase B Enzyms - hergestellt werden. Fach diesem-Verfahren wird als Ausgangsstoff ebenfalls das wäßrige Extrakt des acetonischen Pankreaspulvers verwendet. Das wäßrige Extrakt enthält das Procarböxypeptidase B Enzym, welches einer, chrömatographischen Reinigung zuerst an DEAE-Cellulose und darauffolgend an DEAE-Sephadex unterworfen wird· Das Procarboxypeptidase-B-Enzym wird mit Tripsin in das aktive Garboxypeptidase B Enzym überführt, welches schließlich kristallisiert wird.

In dem in Biοehem. 163, 253 (1977) publizierten Artikel ' wird die Isolierung des Carboxypejptida.se B Enzyms aus humanem Pankreas beschrieben. Die Herstellung des acetonischen Pulvers, die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und die

DEAE-Cellulose-Chromatographie werden im wesentlichen wie in J. Biol. Chem. 235, 2272 (1960) offenbart, durchgeführt. Das für die Aufarbeitung von humanem Pankreas beschriebene Verfahren unterscheidet sich von der obigen Methode nur in den bei der DEAE-Cellulose-Chromatographie Verwendeten Pufferkonzentrationen und Eluentengradienten. Das so erhaltene Carboxypeptidase B wird durch an Whatman CM-Gellulose Ionenaustauscher durchgeführte Chromatographie auf zwei Fraktionen - und zwar B- und Bp- aufgetrennt. Die spezifische Aktivität der B-- und Bp-Fraktionen beträgt 1192 Einheiten/mg bzw. 862 Einheiten/mg (bei 37 C⁰ und an einem Hippuryl-L-Arginin Substrat gemessen),was zum wäßrigen Extrakt verglichen einer 108fachen bzw. 78fachen Reinigung entspricht. Carboxypeptidase B Enzym kann auch aus Ziegenpankreas isoliert werden. /"Indian J. Biochem. Biophys. JJ2, 24 (1975) bzw. 13, 106 (1976)^7. ;

Die wesentlichen Merkmale dieses Verfahrens sind folgende: Das Ziegenpankreas wird bei -2.0 C⁰ gefroren, in gefrorenem Zustand aufgeschnitten und die bei +4 C⁰ ausfließende ZeIlflüssigkeit gesammelt. Die gesammelte Flüssigkeit wird einer Autolyse unterworfen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4,6 eingestellt, die Lösung mit destilliertem Wasser auf das zehnfache Volumen verdünnt und die entstandene Suspension bei +4 C⁰ 2-3 Stunden lang stehengelassen. Der überwiegende Teil des aktiven Carboxypeptidase Enzyms fällt aus. Der Niederschlag wird mit 'Bariumhydroxyd bei einem pH-Wert zwischen 10,0 und 10,4 extrahiert. Aus dem Extrakt wird das Enzym bei einem pH-Wert von 6,5 kristallisiert und viermal umkristallisiert· Die weitere Reinigung des so erhaltenen Präparats wird in Indian J. Biochem. Biophys. V3_t 106 (1976) beschrieben. Nach dieser Methode wird das bei einem pH-Wert von 6,5 ausgefällte Produkt in einer 0,2molaren Bariumhydroxydlösung gelöst, der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,0 eingestellt und die Substanz durch mit Ammoniumsulfat durchgeführte Fraktionierung und wiederholten Ionenaustausch

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(auf DEAE-Cellulose) weitergereinigt„ Die entsalzte Enzym- , lösung wird bei -20 C gelagert. .^::.^: '"',

Die spezifische Aktivität des Produktes beträgt 102,66 Einheiten/mg (an einem Hippuryl^-L-Arginin-Substrat gemessen),. was einer 44fachen Reinigung entspricht. .

. lach dem in J. Mol. Catal. VO, 253 (1981) publizierten Artikel wird das wäßrige Extrakt des acetoni*schen Pulvers von Ziegenpankreas mit'Ammoniumsulfat fraktioniert und die bei einer 0,3-0jTfachen Sättigung erhaltene Fraktion einer Chromatographie auf CM-Sephadex CV50 und DEAE-Celluloae unterworfen« Die spezifische Aktivität des so hergestellten Produktes beträgt 82,9 Einheiten/mg (an einem Hipptiryl^L-

.. -Arginin-'Substrat gemessen), was einer 18,2f achten Reinigung '.entspricht. .', · ; ' ".', ... ·: . '_: . ''.. :. . '"·, :·''^ν.''',V '. '" 'V ';\ ..,'.;

Der gemeinsame Nachteil der obigen Methoden besteht darin, daß als Ausgangsstoff die Zellflüssigkeit von Pankreas oder das acetonische Pulver des Organs eingesetzt wird. Die Sammlung der Zellflüssigkeit ist schwierig und im Falle von Schweinepankreas wegen des hohen Fett- und Schleimgehaltes des Organs praktisch undurchführbar. Die Herstellung des - acetoiiisehen Pulvers erfordert die Anwendung von kostspieligen, feuer- und explosionsgefährlichen lösungsmitteln (Äther, Aceton). Die örtlichen Erwärmungen können das Enzym schädigen, die Ausbeute und die spezifische Aktivität herabsetzen» Ein weiterer Nachteil liegt darin, daß ein Produkt mit zufriedenstellender Reinheit nur mit Hilfe eines komplizierten, aus vielen Schritten ,bestehenden ArbeitsVorgänges herstellbar ist. ^! ·': ''./'

j · '. ' .. - 5 - _ -; .' · . - . ;,;Ziel der Erfindung: . ^; :

Ziel der Erfindung ist die Beseitigung'der obigen Nachteile der bekannten Methoden und die Schaffung eines Verfahrens, nach welchem Carboxypeptidase B Enzym mit einer geeigneten spezifischen Aktivität einfach, unter Beseitigung der Sammlung der Organflüssigkeit und der Herstellung des acetonischen Pulvers hergestellt werden kann. . .

Darlegung des Wesens der Erfindung; .,.': , '

Es wurde gefunden, daß wenn man das homogenisierte Schweinepankreas einer Autolyse und einer darauffolgenden Wärmebehandlung unterwirft, danach zentrifugiert oder filtriert, die supernatierende Flüssigkeit mit einem aus einem einwertigen Kation und einer anorganischen Säure gebildeten Salz in zwei Stufen sättigt, danach aus der bei der zweiten Sättigungsstufe erhaltenen Suspension den Niederschlag abtrennt und die Lösung des Niederschlages gegen Wasser

. .. ·. _/v .

dialysiert, eine Enzymlösung erhalten wird, welche bei 25 C⁰ an einem Hippuryl-L-Arginin Substrat gemessen eine spezifische Aktivität von mindestens 70 Einheiten/mg aufweist und zur Herstellung von immobilisiertem Carboxypeptidase B Enzym ohne weitere Reinigung unmittelbar verwendet werden kann. .

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Carboxypeptidase B Enzym aus ,dem Pankreas von Säugetieren, bei dem man erfindungsgemäß die Bauchspeichel-.drüse in an sich bekannter Weise homogenisiert, das Homogenisat bei 37 C⁰ eine Stunde lang oder bei 25 C⁰ 16 Stunden lang autolysiert, danach mit einem Puffer.mit einem pH-Wert von 5ι0-8,5 in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und 5-30 Minuten lang bei 50-75 C° einer Wärmebehandlung unterwirft, das so behandelte Gemisch zentrifugiert oder filtriert, der supernatierenden Flüssigkeit 200_r32Q g/l

Ammoniumsulfat zugibt, die erhaltene Suspension zentrifugiert, den Niederschlag verwirft, der supernatierenden : Flüssigkeit 10-50 g/l Ammoniumsulfat zugibt, die ausgefällte, das Carboxypeptidase B Enzym enthaltende aktive Fraktion durch Zentrifugieren abtrennt, dieses Enzym im Wasser oder in einer Pufferlösung löst, gegen Wasser oder eine Pufferlösung dialysiert und in gefrorenem Zustand lagert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das homogenisierte und autolysierte Pankreas ,mit einem Puffer, dessen pH-Wert 5,0-8,5$ zweckmäßig 6,0 beträgt, in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und danach bei 50-75 C 5-30 Minuten lang, zweckmäßig bei 60 C⁰ SO Minuten lang, einer Wärmebehandlung unterworfen« Bei dieser Wärmebehandlung, wird der überwiegende Teil der das zu isolierende Enzym begleitenden Proteine denatiriert. Das denaturierte Protein fällt aus der wäßrigen Lösung in Form eines Niederschlages mit großer Oberfläche aus und zieht infolge seiner klärenden Wirkung, einen großen Teil der in der Lösung zurückgebliebenen Verunreinigungen mit. Dadurch wird¹ die bisherige schwierige und kost^ spielige Herstellung des acetonischen Pankreäspulvers beseitigt. ' . · ;·. ".; . · ; '

Sin erheblicher Teil der Proteinverunreinigungen wird aus der nach Trennung der denaturierten Proteine erhaltenen Pufferlösung durch Zugabe von 200-320 g/l,vorzugsweise 310-320 g/l, Ammoniumsulfat ausgefällt» Der Niederschlag, weicher die Proteinverunreinigungen enthält, wird entfernt,' und aus der supernatierenden Flüssigkeit wird das enzymhaltige Produkt durch Zugabe von 10-80 g/l, vorzugsweise 30 g/l, Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Niederschlag wird in Wasser oder einer Pufferlösung gelöst und die Lösung in an sich bekannter W^ise gegen Wasser dialysiert. -Die bei 25, C° gemessene spezifische Aktivität des so erhaltenen' enzymhaltigen Produktes beträgt mindestens 70 Einheiten/mg,

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was einer etwa IOfachen Reinigung entspricht. Das. so erhaltene Produkt kann zur Herstellung von immobilisierten Enzympräparaten ohne weitere Reinigung unmittelbar eingesetzt werden. . ; ' ' _:

Die immobilisierten Carboxypeptidase B Enzym. Präparate können zur Bestimmung der COOH-terminalen Aminosäuren von Proteinen und Peptiden oder zur Trennung vonDL-Arginin oder DL-Lysin im betrieblichen Maßstab verwendet werden. Der letzteren prktischen Anwendung stehen die komplizierte Herstellung des Enzyms und die hohen Kosten dafür entgegen. Das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren des Enzyms beseitigt die obigen Schwierigkeiten und ermöglicht die betriebliche Anwendung des Enzyms. Dies fördert die Immobilisierung des Enzyms in aktiver Form und dadurch die Verbreitung des kontinuierlichen Verfahrens.

Auaführungsbeispiele: " '

Beispiel 1 . ...",. . ·

0,25 kg Schweine pankreas werden in einer Pleiscbinühle gemahlen, woraufhin 250 ml eines 0,05 molarenTris-HCl-Puffers (pH 7»0) zugegeben werden und das Gemisch über Nacht bei +4 C⁰ stehengelassen wird. Am nächsten Tag wird die Suspension auf 37 C⁰ erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende.Flüssigkeit auf 50 C° erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 30 Minuten lang inkubiert. Each.'Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten.Puffers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 42,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das Gemisch wird eine Nacht lang stehengelassen, die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der p'K-Wert, der .supernatierenden. Flüssigkeit wird auf 7,0-7,2 eingestellt. Nach Zugabe , von 36,1 g Ammoniumsulfat wird die Suspension eine Nacht

lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in einem leicht kaltem (+4C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und mit destilliertem Wasser salzfrei dialysiert, Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. ^:.

Ausbeute: 343 mg Carboxypeptidäse B.. ' .

Spezifische Aktivität; 17,5 /UMol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg protein« ,

Beispiel 2 ' '...'. ^: '.. '; '., ' ' . :'^:' ' ' . .. . ·

0,25 ,kg SchweinebauGhspeicheldruae werden in' einer Fleisch- . mühle gemahlen, woraufhin 250 ml eines 0,05 molaren Tris- -HCl-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden. Das Gemisch: wird eine Nacht lang bei +4 G stehengelassen· Am nächsten Morgen wird die Suspension auf #37 C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser temperatur stehengelassen.; Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 60 C⁰ .•'erwärmt-.und bei dieser Temperatur weitere 10 ,Minuten lang inkubiertο Nach Zugabe von 2 VoI, Teilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch zentrifugierte Der supernatierenden Flüssigkeit werden 92 g Ammoniumsulfat zugegeben» Weil nach dem Stehenlassen über eine Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 weitere 78,7 g Ammoniumsulfat zugegeben«.Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein. wenig kaltem (.+4 C^G); Tr is -HGl -Puff er CpPI 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser .salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und ' ^gefroren. ' \'· ; · " ' _;. ... ·' ' \ ; ' v" ^r':'^v:.' ..·;·.· ^;. '.'.··.. ' ' . .·

Ausbeute: 295 mg Cärboxypeptidase. ;":

Spezifische Aktivität; 53,1 /UMol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg: Proteini . . ^: .· . -. · ?'_: "·.; ''. .· . V .

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0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüso werden in.einer Fleisch-, mühle gemahlen, woraufhin 250 ml eines 0,05 molaren Tris- ~iiCl-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht lang bei +4 C⁰ stehengelassen wird·. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf -37 C⁰ erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen, pie Organauspension wird zentrifugiert, die supernatierehde Flüssigkeit auf 60 C erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 20 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 VoJLiTeilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden | Flüssigkeit v/erden 98,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach dem Stehenlassen über Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 weitere 86,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht läng stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 266 mg Carboxypeptidase.

Spezifische Aktivi-fcät: 63,2 yulfflol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein.

' ' ' ' I ' · '· -V ' \^; .: ·:· ,'- ' ' ':' .·'· . ^/-'·.. '. · ·. " ., : '^;'' Beispiel 4 ' . :

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleisch.-mühle gemahlen, woraufhin 250 ml eines 0,05 molaren Tris- -HCl-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht lang bei +4 C⁰ stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37 C⁰ erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspen-

sion wird zentrifugiert, die supernatierende .Flüssigkeit auf 75 G⁰ erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 5 Minuten lang inkubiert. Nach_:Zugabe von 2 Vol.Teilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch, zentrifugierte Der supernatierenden Flüssigkeit werden 66,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach dem Stehenlassen über Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach. Einstellung des pH-Wertes auf 7,0.-7»2 weitere 55»8 S Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine lacht lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 0°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert.. Tiach.der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

.-· ) ' .- - ' .' ' ·-.-' ' '. Ausbeute: 34 mg Carboxypeptidase.

Spezifische Aktivität:.. 21,6 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginih/Minute/mg Protein. '·"' '·',.'

Tabelle 1

Einfluß der Temperatur und der Zeitdauer der Wärmebehandlung eines S chwe ine pankr eashomogenisats auf die Aktivität νen Carboxypeptidase B

Temperatur Zeit (C⁰) (Min.)

Gesamtaktivität (Einheit/kg Pankreas)

Gesamtprotein (mg/kg Pankreas)

Spezifische Aktivität (Einheit/mg)

50	30	23968
60	10	. 62660
	20	67260
75 .	5	2932

1372

1180

1064

136

'17,5-

53,1 63,2 21,6

= 1 Einheit .entspricht einer Enzymmenge, die die Hydrolyse von 1,0 .

Hippuryl-L-Arginin⁷per Minute katalysiert (bei 25 C° und pH 7,65 gemessen)

··'' · ' ..' ' - 12 - ' ^; ' ' ^: '' ' · '· Beispiel 5 . ' · . ' ·.. ." : ' ; _; ; · · ·.' .: - : ;. ,-... .

0,25 kg SchweiriebaUchspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen und über lacht bei Raumtemperatur stehenge- ; lassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Acetatpuffers (pH 5,0) zügegeben. Die Suspension wird auf 60 C° erwärmt und 20 Minuten lang bei ^dieser !Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von ^2 YoI. /Peilen eiskalten Wassers¹ wird das Gemisch zentrifugiert« Der supernatierenden·." Flüssigkeit werden 27Λ»8 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Facht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 232,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und:zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7₉O) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysierte Nach der Dialjrse wird die Lösung filtriert und gefroren.. ^: ; ' . ' ;..·. _ '· ,·' - ;':/.. . \ ; ' '.^; · .. ' . ..:

Ausbeute: 36Ö mg Carboxypeptidase B. ^. ^v / ν

Spezifische Aktivität: 14,8 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl- -Ij-Arginin/Minute/mg Protein. . .. '^; -'.· ' .,'.- ''...,

Beispiel 6 . . '. . -^:. ·,' ' _; ; ;' ; ...

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen-und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Arn nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Acetatpuffers (pH 5,5) zugegeben. Die Suspension, wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur .stehengelassen» Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskälten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert* Der supernatierenden Flüssigkeit werden 261 ,2 g Ammoniumsulfat zugegeben«, Die

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Suspension \vird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen.. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 228 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C⁰) Oiris-HCl-Püffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung fi3/triert und gefroren.

Ausbeute: 317 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 20,3 /UM.ol hydrplysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg~Protein*

Beispiel 7 . . ;

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphat puffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert» Der supernatierenden Flüssigkeit werden 301 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit v/erden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 252,6g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 0°) Tris-HGl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert* , Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 517 mg Carboxypeptidase B. . \,

Spezifische Aktivität: 57./uMol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arßinin/Minute/mg Protein.

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0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer. Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60:G erwärmt und 20 Minuten lang auf dieser .Temperatur gehalten. Nach Zugabe von .2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit '.werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Macht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der liederschlag wird verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 275,5 g * .Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Ilächt stehengelassen und Zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Fach der Dialyse wird die Losung filtriert und gefroren* .

Ausbeute: 36I mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 43»S ,uMol' hydrolysiertes Hippuryl- -L-^Arginin/Miniite/mg Protein. , ; r

Beispiel 9 ..: , ' . . .'' ;..'. · ;./ '' ; · ^:, ':.' '..' .. .' .. .' · ;'

0,3 kg SchweinebaUGhspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 7,0) zugegeben. DieSuspension wird auf, 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Volt Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatieren-

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;.· -.. : · '. . - 15 - . :.._;; . :.;:/'. /. .:: ·:' :.:: .

den Flüssigkeit werden nach Einstelllang des pH-Wertes auf 7,0-7,2 272 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Y/asser salzfrei dialysiert, Nach · ;. der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 488 mg Carboxypeptidase B. '. '.·

Spezifische Aktivität: 39,9 /UMol hydrolysiertes Hippüryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein, · -·: -i. ' ^: ;

- ^ . '^: . .'·. · · ' ' Beispiel 10 \ ' . " " ' :": ' .' "" '. ^:. -y}'-^: ; . " ",.-.''[

0,25 kg Schv/einebauchspeicheldrüse werden in einer Pl ei sch-'.' mühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0_t 05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 7,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C° erwärmt und 20 Minuten lang bei.dieser/Temperatur stehengelassen. Wach. Zugabe von 2 VoIt. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werfen 247 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit v/erden nach Einstellung des pH-Wertes auf. 7,0-7,2 202 g ;_Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension v/ird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HÖl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 695 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität': 17,4 /UMol hydrolysiertes Hippurylr· -L-Arginin/Minute/mg Protein.: . ^; .'' '.'

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Beispiel 11 V -V ; ^; . VW'- - ·'' 'V"'VVV ,u -'W.

0,25 kg Schweinebauchspeicheidrüge· v/erden in einer Fleischmühle gemahlen und über nacht bei Raumtemperatur stehengelassen-. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines :0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) zugegeben.. Die Suspension wird auf βΟ C° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 iTol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert.Der'supernatierenden Flüssigkeit werden 255 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert· Der Niederschlag wird verworfen» Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 198 g Ammoniumsulfat zugegeben., Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7»0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 552 mg-Earboxypept.idase B. / ',', ,-' ", ν ^ /.,.

Spezifische Aktivität: 14,3 yUMol hydrolysiertes Hippuryl-

-L-Arginin/Minute/mg Protein. '' "' ' ; ' y ^ ^: -,. . - ;

Beispiel 12 .'· .: ^V . ' '". , ;. \. ' }, -.: r '.. ^/ '·. . ;,' ' '^' .' ' ' : , /.

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werdLen in feiner Fleisch'-mühle -gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 yol* Teilen; eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 247 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der· supernatierenden_:Flus-..

. ; · - -' ν '.. ".. : ' ' - . -'¹VVv^¹V-: : -17 -

'· ' · .-' ^ΛΊ- "'. '.' \^r. ' ; ' ' - , ' ! >

sigkeit werden nach₍, Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 197 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-Hd-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. . _:

Ausbeute: 1209 mg Carboxypeptidase B. ;

Spezifische Aktivität: 6,4 /Uliol hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/ing Protein. . : *\."

: ' -.. ' · -. ''Tabelle 2 : ' ':' ,. :'

Wirkung des pH-Wertes des bei der Wärmebehandlung (60. C⁰;, 20 Minuten) von homogenisiertem Schweinepankreas^verwendeten Puffers auf die Aktivität von Carboxypeptidase B

Spezifische Aktivität (Einheit/mg) ; .

14,8.

20,3'

-Wert	Gesamtaktivität (Einheit/kg Pankreas)	Gas amtpro te in (mg/kg Pankreas)
5,0	21348 .	1440 .,- ;
5,5	.25808	1268
6,0	98333 ;;'.' '..-;.	1724 : :
6,5	V : : · 52767..- ·	1204
7,0	64882 _Λ '	. -'.' ; 1625 :
7,5	\ 48400'	2780
8,0	. ' ·- 31&32 . :. : .. ^;--· " :	2210. : ^::
8,5	' 30753	, 4836 -

co.

57,0- γ

^:".17,^:4· .. _: .' ,. \ ' ' '

Beispiel 13 '. · ' _v '/^: ',. ; . .''V "''' '

0,25 kg SchweinepaÜteeas werden in einer Fleischmühie gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Ph'lsphatpuffers (pH .6',O)'-zugegeben.,Die. Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach -Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugierti Die supernätierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfät bis zu einer Konzentration von 340 g/l gesättigt (408 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernätierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (41»1 g)· Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in-,'.;, etwas kaltem (+4 G⁰) Tris-HGl-Puffer (pH 7,0) gelöst und Λ gegen destilliertes Wasser,salzfrei dialysiert·; Nach der Dialyse wird die lösung filtriert und gefroren* /

Ausbeute: 95 mg Garboxypeptidase B. -

Spezifische Aktivität: 56,2 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl-/-L-Arginin/mlnute/mg Protein. _; . \,. ' .. ' " ' ' ·.;

Beispiel 14 V .' '.-'· ^;> :. ".-. / : .' ,· .· V

0,2 kg Schweinepankreas werden in einer Fleisohmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60G° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüs-. sigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 330 g/l gesättigt (330 g). Die Suspension wird eine ;

ι ν.. . . . ... . * . ' ' '',; ;...' "

Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (44,8 g). Die Suspension wird eine !lacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Uiedersohlag wird in etwas kaltem (+4 C⁰) Tria-HOl-Puffer (pH 7,0)gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren..

Ausbeute: 62 mg Carboxypeptidase B. '' · ^{: :}

Spezifische Aktivität: 89,0 ,uMol hydrolysiertes: Hippuryl- -I-Arginin/Minute/mg Protein. . .. ^;: ^₁

Beispiel 15 .·· .' ".' ,': -' V ' .^:; :.'/ '. .. V ; ' " ' -

0,25 kg Schweinepankreäs werden in einer Pleischmühle ge- _: mahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,Q5 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben» Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten

'.. . . · ι . ' . ^:

Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit' Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüs-

' . , '' . . . ' "' . ·· · ·"- . / gigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (65 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etv/as kaltem (+4 C°) Tris-HGl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 106,5 mg Carboxypeptidase B.

' ' ; ' ' . ; ' . ' ' . -. :' .. ·. ' " \ ·.-'^: . Spezifische Aktivität: 95,5 /UMol hydrolysiertes Hippuyyl-

\ , ' / . . ' ' : . '.·

-L^Arginin/Minute/mg Protein. Beispiel 16

0,2 kg Schweinepankreäs werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird

• die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird,mit Ammojiiumsulfat bis zu einer Konzentration von

.310 g/l gesättigt (319 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (67,2 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem . (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 135 mg Carbpxypeptidase B.

., Spezifische Aktivität: 44,3 /UMol hydrolysiertes Hippuryl- -Ij-Arginin/Minute/mg Protein. ..

Beispiel 17 / '' ;

0,25 kg Schweinepankreäs werden in einer Fielschmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (ppi 6,0) zügegeben. Die Sespension wird auf 60 c° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehen- ' ' gelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten'Wassers

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wird die-Suspension zentrifugiert. Die suspensierende Flüssigkeit v/ird rait Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt,(386,4). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird' verworfen und die superna tier ende -.Flüssigkeit: mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 36O g/1 gesättigt (52 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HGl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert". Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 76 mg Carboxypeptidase B.

Beispiel 18 \ /,

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Pleiscbmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen v/erden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0)- zugegeben. Die Suspension wird auf 60 G° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l gesättigt (39 g). Die Suspension wird eine .Nacht.· lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Mach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

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'. . · . - 23 - ; ·. -.·; .;. ·.. ;.; ·;. ' · -

Ausbeute: 45 mg Carboxypeptidase B. :

Spezifische Aktivität: 286,7 ,uMol hydrolyaiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein. .

Beispiel· 19 . ... . ;

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer'Pleischinuhie gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang"bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol..Teilen eiskalten Wassers, wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Fiüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüs- aigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 340 g/l gesättigt (26 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser -.salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 25,5 ^mS Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 195,8 yUM.ol hydrolysiertes Hippuryl- -I-Arginin/Minute/mg Protein. .

- 24 -

	Fraktionierung mit	370.	Tabell	e 3 ,	von Garboxypeptidase B
Wirkung der	Ammoniumsulfatkonzentration (g/l) .1. Sättigung 2. Sättigung	370	Amraoniumsulfat auf	die Aktivität	Spezifische Aktivität (Einheit/mg)
	340	370	Gesamtaktivität (Einheit/kg Pankreas)	Gesamtprotein (mg/kg Pankreas)	.56,2 ' ; '
330	... -370 .;· ;	21373 -	330	89,σ
320	360 ^:	27670	310	• 95,5
310	. · ³⁵° ' '. " -^:;;	40697 ;	426	.44,3
320	340 ^ .·	29914 ;	• 675	123,8
320	37629	.304	286,7; ; ;.
320	5161O ;."..'	: ISO: .	195,8 .· · ' '
''19977..	102

Beispiel 20 .' , :,

1 kg Rinderpankreas wird in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen wird 1 Liter eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben, worauhin die Suspension auf 60 C° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen, wird. Mach Zugabe von 2 Vol. Teilen (3»8 1) eiskalten Wassers wird'die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer,Konzentration von 320 g/l gesättigt (1,6 kg). Die

. < ." .' ' .. ~ Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag-wird· verworfen. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l (165 g) gesättigt. Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4 0°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und mit destilliertem Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert. Es werden 406 mg Natriumchlorid zugegeben, woraufhin die Lösung gefroren wird.

Ausbeute: 238,7 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 15,4 /UMol hydrolysiertes Hippur^l- -L-Arginin/Minute/mg Protein. \

Claims

· '.- ,' · - 26 - · ;.· ; ." ;. ': .;. ; : , ' " / : .' :

Erfindungsanspruch: ; ^:

Verfahren zur Isolierung des Carboxypeptidase B Enzyms aus der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren, gekennzeichnet dadurch» daß man ein Pankreashomogenisat herstellt und dieses autolysiert, das Autolysat mit einem Puffer mit, einem"pH- ' Wert zwischen 5,0 und 8,5,' vorzugsweise,zwischen 6,0 und 7,0, in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und bei einer Temperatur von 50-75 G°» vorzugsweise 50-65 C°» 5-30 Minuten lang, vorzugsweise 1 5-^25 Minuten lang, einer Wärmebehandlung unterwirft, danach das so erhaltene Gemisch, zentrifugiert oder filtriert, der supernatierenden Flüssigkeit· 200-320 g/l, vorzugsweise 300-320 g/l, Ammoniumsulfat zugibt, die erhaltene Suspension gegebenenfalls zentrifugiert, die Fraktion, welche das aktive Carboxypeptidase B Enzym enthält, aus der erhaltenen 'Flüssigkeit·, durch Zugabe von 10-80 g/l, vorzugsweise 25-35 g/lj Arnmoniumsulfat ausfällt, den Niederschlag zentrifugiert und das so erhaltene Enzym in YiFasseiv oder in einer Pufferlösung löst und gegen Wasser oder eine Pufferlösung dialysiert tmd das erhaltene Produkt in gefrorenem Zustand lagert« ^ ;