DE69424184T2

DE69424184T2 - Methode zur Herstellung von Peptidprodukten

Info

Publication number: DE69424184T2
Application number: DE69424184T
Authority: DE
Inventors: Loic Briand; Jean-Marc Chobert; Tomasz Haertle
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 2000-11-09
Anticipated expiration: 2014-12-21
Also published as: DK0736102T3; ES2145259T3; ATE192195T1; GR3033770T3; CA2179738A1; FR2714390A1; DE69424184D1; AU1319795A; FR2714390B1; EP0736102B1; WO1995017518A1; EP0736102A1; PT736102E; JPH09507478A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Peptidprodukten aus einem Substrat tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, das wenigstens ein Protein oder ein Peptid enthält, gemäß der Definition in den Ansprüchen.
Gemäß der vorliegenden Beschreibung definiert der Ausdruck "Peptidprodukte" sehr unterschiedliche peptidische Populationen, die verschiedene Entitäten, wie Peptide, peptidische Fraktionen, veresterte und nichtveresterte Aminosäuren und ihre Gemische enthalten können.
Die Proteine tierischen oder pflanzlichen Ursprungs und die aus diesen Proteinen hervorgegangenen Peptide werden aufgrund ihrer chemischen oder physikalisch-chemischen Eigenschaften in allen Arten von Industrie (pharmäzeutische, chemische, Nahrungsmittel-, Kosmetikindustrie....) sehr häufig verwendet.
Die enzymatische Hydrolyse der Milchproteine ergibt Peptide mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften. Das gleiche gilt für die Opiumpeptide (Zioudrou C., Streaty R. A. und Klee W. A. (1979), J. Biol. Chem. 254, 2446-2449; Brantl V., Teschemacher H., Henschen A. und Lottspeich F. (1981) Life Sci. 28, 1903-1909; Yoshikawa M., Yoshimura T. und Chiba H. (1984), Agric. Biol. Chem. 48, 3185-3187; Loukas S., Varoucha D., Zioudrou C., Streaty R. A. und Klee W. A. (1983), Biochemistry 22, 4567- 4573; Chiba H., Tani F. und Yoshikawa M. (1989), J. Dairy Res. 56, 363- 366; Fukudome S. I. und Yoshikawa M. (1992), FEBS Lett. 296, 107-111;
Antila P., Paakkari I., Järvinen A., Mattila M. J., Laukkanen M., Pihlanto- Leppälä A., Mäntsälä P. und Hellman J. (1991) Int. Dairy Journal 1, 215- 229; Meisel H. und Frister H. (1989), J. Dairy Res. 56, 343-349).
Außerdem wurden antihypertonische Peptide (Maruyama S., Mitachi H., Tanaka H., Tomizuka N. und Suzuki H. (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 1581-1586; Komura M., Nio N., Kubo K., Minoshima Y., Munekata E. und Ariyoshi Y. (1989), Agric. Biol. Chem. 53, 2107-2114) sowie immunstimulierende Peptide (Berthou J., Migliore-Samour D., Lifchitz A., Delettré J., Floc'h F. und Jollès P. (1987), FEBS Lett 218(1), 55-58; Migliore Samour D., Floc'h F. und Jollès P. (1989) J. Dairy Res. 56, 357-362) oder antithrombotische Peptide (Fiat A. M., Levy-Toledano S. P., Caen J. und Jollès P. (1989), J. Dairy Res. 56, 351-355) isoliert.
Andererseits weisen die aus den Milchproteinen hervorgegangenen Peptide gleichermaßen interessante physikalisch-chemische Eigenschaften und Grenzflächeneigenschaften auf (Fox P. F. und Mulvihill D. M. (1983), in Proceedings of IDF Symposium, Helsingör, Dänemark, 188-259; Chobert J. M., Bertrand-Harb C. und Nicolas M. G. (1988a), J. Agric. Food Chem. 36, 883-892; Chobert J. M., Sitohy, M. Z. und Whitaker, J. R. (1988b), J. Agric. Food Chem. 36, 220-224; Chobert J. M., Bertrand-Harb C., Dalgalarrondo M. und Nicolas M. G. (1989a), J. Food Biochem. 13, 335-352; Chobert J. M., Touati A., Bertrand-Harb C., Dalgalarrondo M. und Nicolas M. G. (1989b), J. Food Biochem. 13, 457-473; Vuillemard J. C., Gauthier S. und Paquin P. (1989 Lait 69, 323-351; Turgeon L. S., Gauthier F. S., Molle D. und Leonil J. (1992), J. Agric. Food Chem. 40, 669-675).
Unter ernährungswissenschaftlichen und therapeutischen Aspekten erlaubt es die enzymatische Hydrolyse, die Allergenität der Serumproteine zu reduzieren (Jost R., Monti J. CV. und Pahud J. J. (1987) Food Technol. 41, 118-121).
Im Sinne einer bibliographisch relevanten Referenz kann man auch das Patent EP-22019 zitieren, das ein enzymatisches Totalhydrolysat von Proteinen des Lactoserums sowie Anwendungen dieses Hydrolysats als Medikament und in der therapeutischen Ernährung beschreibt.
In physiologischer Hinsicht haben die Hydrolysate von Proteinen des Lactoserums die Eigenschaft, das Wachstum der Regeneration der Haut zu stimulieren (Wenner V. (1982), Lait 62, 549-565).
Es ist bekannt, dass es auf Proteine oder Peptide tierischen oder pflanzlichen Ursprungs einwirkt und ihre Eigenschaften modifiziert, insbesondere durch Pfropfen von Substituenten.
Insbesondere das Dokument WO-A-9318180 beschreibt die Veresterung von Peptiden tierischen oder pflanzlichen Ursprungs durch ein Verfahren, das "enzymatische Synthese von Alkylestern von Peptiden" genannt wird und den Einsatz von Enzymen erfordert, die zugleich eine proteolytische und esterolytische Aktivität besitzen. Das in Frage stehende Verfahren ist durch das gleichzeitige In-Kontakt-Bringen des Proteinsubstrats mit dem Enzym und mit eine m Alkohol gekennzeichnet, was zur Bildung von Alkylestern von Peptiden führt.
Andererseits beschreibt das Dokument EP-A-0 047 879 ein Verfahren zur Herstellung von Proteinzusammensetzungen, die durch Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäuren modifiziert sind. Dieses Verfahren besteht darin, dass man ein Proteinsubstrat durch ein Enzym hydrolysiert, die zusätzliche(n) Aminosäure(n) hinzufügt, die im voraus verestert wurden, und schließlich das Enzym so einwirken lässt, dass es die Rekonstitution des Proteins mit der (den) zusätzlichen Aminosäure(n) erlaubt.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das darin besteht, dass man eine Proteinsubstanz tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, die wenigstens ein Protein oder ein Peptid enthält, verestert und dann die veresterte Proteinsubstanz enzymatisch hydrolysiert, wobei das Verfahren zu einer neuen Peptidpopulation führt.
Die Modifikation der Proteine durch Veresterung führt zu einer neuen Familie von Peptiden mit neuartigen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften.
Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, eine Veresterungsreaktion mit wenigstens einer veresterungsfähigen Gruppe wenigstens eines der in dem Substrat tierischen oder pflanzlichen Ursprungs enthaltenen Proteine oder Peptide durchzuführen, um die spätere Wirkung des Enzyms (Spaltungsstellen und Reaktionskinetik) zu modifizieren.
Als nicht einschränkende Beispiele für ein Protein- oder Peptidsubstrat, das verwendet werden kann, seien genannt: Milchproteine (Caseine und Proteine des Lactoserums), Weizen- oder Maisgluten, Zein, Soja-, Erbsenund Ackerbohnenproteinkonzentrate und -isolate oder auch Collagen, Serumalbumin, Ovalbumin usw.
Diese Veresterungsreaktion wird gemäß den klassischen Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann wohlbekannt sind (siehe zum Beispiel das von Fraenkel-Conrat H. und Olcott H. S. 1945, 3. Biol. Chem. 161, 259-269), beschriebene Veresterungsverfahren in saurem Medium. Sie wird vorzugsweise mit wenigstens einer Carboxygruppe des Proteins durchgeführt; sie wird vorteilhafterweise in saurem Medium mit Hilfe eines Alkohols (oder eines aktivierten Derivats dieses Alkohols, das nach den dem Fachmann wohlbekannten klassischen Methoden erhalten wird) durchgeführt.
Es wird zum Beispiel die Verwendung eines aliphatischen Alkohols vorgeschlagen, der zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatome enthält (Methanol, Ethanol usw.).
Die Bedingungen der Durchführung der Veresterungsreaktion (Temperatur, Dauer, Druck, Säurekonzentration usw.) sind eine Funktion des gewünschten Veresterungsgrades und allgemeiner der Endprodukte, die man erhalten möchte.
Das veresterte Protein wird anschließend der Einwirkung wenigstens eines proteolytischen Enzyms unter den üblichen Bedingungen des einschlägigen technischen Gebiets unterworfen, um die Aminosäurekette zu spalten (siehe zum Beispiel das von A. Neuberger und K. Brocklehurst (1987) herausgegebene Werk der Reihe New Comprehensive Biochemistry, Vol. 16: Hydrolytic Enzymes, Elsevier, oder auch das von R. J. Beynon und J. S. Bond (1989) herausgegebene Werk der Reihe The Practical Approach Series: Proteolytic enzymes, a practical approach, IRL PRESS).
In diesem Schritt kann jedes proteolytische und/oder peptidasische Enzym (Protease, Peptidase) verwendet werden (Pepsin, Papain, Trypsin, Chymosin, Chymotrypsin, Thermolysin usw.); die Hydrolyse kann mit einem dieser Enzyme oder mit mehreren davon nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.
Gemäß einer Variante des Verfahrens der Erfindung geht der Veresterungsreaktion eine partielle Hydrolyse des Proteins mittels eines oder mehrerer proteolytischer oder peptidasischer Enzyme voraus. Der Grad der partiellen Hydrolyse wird der Einschätzung des Fachmanns überlassen, der einen großen Handlungsspielraum in Abhängigkeit von den Produkten hat, die er erhalten möchte. Die einzige Einschränkung besteht darin, keine totale Hydrolyse des Proteins oder des Peptids zu erhalten.
Erstaunlicherweise erlaubt die Tatsache, dass man dem Hydrolysevorgang eine Veresterungsreaktion vorausgehen lässt, eine Erhöhung oder Veränderung der Empfindlichkeit des Proteins gegenüber einer enzymatischen Hydrolyse. Das Enzym wird durch die Modifikation des Proteins "geködert"; in Abhängigkeit von den verwendeten Produkten und den Reaktionsbedingungen kann man in bezug auf das native Protein neue Spaltungsstellen erhalten und/oder bestimmte übliche Spaltungsstellen unterdrücken. Diese Vorgehensweise erlaubt es, atypische Spaltungsstellen zu erhalten, die zur Gewinnung neuer Peptide führen, von denen wenigstens einige verestert sind.
Die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung führt zu einem Gemisch von Peptiden oder Aminosäuren und ihren Estern. Diese Peptide, Aminosäuren und entsprechenden Ester können anschließend getrennt und gereinigt werden, um homogene Populationen zu erhalten.
Im Rahmen einer Veresterung durch einen aliphatischen Alkohol erhält man ein Protein, das an seiner C-terminalen Carboxygruppe und an den seitenständigen Carboxygruppen einiger Aspartyl- und/oder Glutamylreste verestert ist. Die spätere Wirkung des proteolytischen Enzyms erlaubt, es, ein terminales Peptid zu erhalten, dessen C-terminale Carboxygruppe verestert ist; alle anderen erhaltenen Peptide, verestert oder nicht, umfassen eine nicht veresterte C-terminale Carboxygruppe.
Diese Substitution an der Carboxygruppe ermöglicht es, eine negative Ladung auf dem erhaltenen Protein oder Peptid zu unterdrücken (Ladungsunterdrückung oberhalb des pK-Werts der COOH-Gruppe der konstitutiven Asparagin- und Glutaminsäurereste). Man erhöht den isoelektrischen Punkt des Proteins oder des Peptids; man macht sie basischer und stärker hydrophob, was zu einer besseren Affinität und Wechselwirkung mit den größtenteils negativ geladenen biologischen und künstlichen Grenzflächen führt.
Gemäß der Erfindung ermöglicht die Behandlung von Aminosäureresten durch Veresterung mit anschließender Proteolyse die Zubereitung neuer Proteine oder Peptidpopulationen. Die Mittel zur Durchführung sind einfach, kostengünstig, nicht-toxisch und erhalten den größten Teil der Nährwerte des Proteins.
Die erhaltenen veresterten Peptide haben unterschiedliche elektrostatische Eigenschaften, Hydrophobie und Amphiphilie, was ihnen besondere grenzflächenbezogene, physiologische, biologische und immunologische Eigenschaften verleiht.
Die Veresterung kann auch ein einfaches Mittel sein, um die Empfindlichkeit eines strukturierten Proteins gegenüber einer enzymatischen Wirkung zu erhöhen.
Es gibt verschiedene Anwendungsbereiche der Erfindung; die erhaltenen Produkte können -vorteilhafterweise als Bestandteile, Zusatzstoffe oder Wirkstoffe in Nahrungspräparaten, pharmazeutischen oder Kosmetikpräparaten verwendet werden.
Solche Anwendungen sind denjenigen ähnlich, die bereits für die enzymatischen Hydrolysen bekannter Proteine beschrieben wurden, wie sie in den am Anfang der Beschreibung und zur Erläuterung des Standes der Technik zitierten bibliographischen Referenzen genannt sind.

Beispiele

Beispiel 1: Pepsin-Proteolyse von β-Lactoalobulin

Rinder-β-Lactoglobulin (Variante B) wird nach dem Verfahren von Mailliart P. und Ribadeau-Dumas B. (1988, J. Food Sci. 53, 743-745) hergestellt.

Veresterung

Die Ester von β-Lactoglobulin werden unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das von dem von Fraenkel-Conrat H. und Olcott H. S. (1945, J. Biol. Chem. 161, 259-268), beschriebenen abgeleitet ist.
Das β-Lactoglobulin wird in Ethanol suspendiert, so dass man eine 2%ige Suspension erhält. Unter Rühren wird vorsichtig 12 N Salzsäure hinzugefügt, so dass man eine Protein-Alkohol-Suspension mit einem Säuregehalt von 0,06-0,68 N erhält. Dieses Präparat wird in Abhängigkeit vom gewünschten Veresterungsgrad mehrere Tage lang bei 4ºC gerührt. Nach dem Trocknen im Vakuum werden die Proben bei einer Temperatur von -80ºC aufbewahrt. Eine Kontrollprobe wird in derselben Weise, aber ohne Zugabe von HCl hergestellt.

Analyse der veresterten Proteine

Um den Grad der Veresterung des β-Lactoglobulins mit Ethanol zu bestimmen, verwendete man die von Halpin M. I. und Richardson T. (1945, J. Dairy Sci. 68, 3189-3198) entwickelte Farbreaktion mit Hydroxylammoniumchlorid, modifiziert nach Bertrand-Harb C., Chobert J. M., Dufour E., Haertle T. (1991, Sci. Aliments 11, 641-652).
Im vorliegenden Fall wurde das β-Lactoglobulin zu 40% verestert.

Hydrolyse

Die Proben des β-Lactoglobulins und des veresterten β-Lactoglobulins wurden anschließend mit Pepsin hydrolysiert (Schweine-Pepsin: 3200- 4500 BAEE E/mg von der Firma Sigma Chimie, St-Quentin Fallavier, Frankreich).
Pepsin (1 mg pro ml H&sub2;O, Anfangskonzentration) wird in einem Enzym/- Proteinsubstrat-Verhältnis (E/S) von 2% hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 37ºC inkubiert. Nach einer, zwei, vier, zwanzig und vierzig Stunden werden Proben entnommen; die Hydrolyse wird durch Zugabe von 1,5 Volumina eines 0,2 M Tris-HCl-Puffers, pH 8,0, abgebrochen.

Ergebnisse

Die verschiedenen erhaltenen Peptide wurden gereinigt und anhand ihrer Aminosäurezusammensetzung und ihrer N-terminalen Sequenz identifiziert.
Das HPLC-chromatographische Profil des Pepsin-Hydrolysats (nach 40 Stunden Hydrolyse) des ethylierten β-Lactoglobulins ist in Fig. 1 dargestellt (C&sub1;&sub8;-Kolonne, Porosität 10 um, Länge 25 cm, Innendurchmesser 0,4 cm, von SFCC Shandon, Gagny, Frankreich).
Die Primärstruktur des β-Lactoglobulins B mit den Pepsin-Spaltungsstellen (*) ist in Fig. 2 zu sehen.
Fig. 3 zeigt in Tabellenform die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminalen Sequenzen der Pepsin-Peptide des ethylierten β-Lactoglobulins (Esters).
Eine kinetische Untersuchung der enzymatischen Wirkung auf ein verestertes Derivat des β-Lactoglobulins zeigt, dass das veresterte Protein in wässriger Lösung sehr schnell hydrolysiert wird, während das native Protein gegenüber einer solchen Proteolyse unempfindlich ist.
Die Erfindung ermöglicht die Hydrolyse dieses Proteins, das ohne die beschriebene Modifikation nicht hydrolysiert werden würde; andererseits führt sie zur Schaffung von Spaltungsstellen, die für das verwendete Enzym nicht üblich sind.
Bei ethyliertem β-Lactoglobulin wurden 31 Spaltungsstellen identifiziert: Gln5-Thr6; Thr6-Met7; Leu10-Asp11; Asp11-Ile12; Gln13-Lys14; Trp19- Tyr20; Leu22-Ala23; Ser27-Asp28; Asp28-Ile29; Leu32-Asp33; Leu39- Arg40; Val41-Tyr42; Leu46-Lys47; Ile56-Leu57; Leu57-Leu58; Trp61- Glu62; Lys75-Thr76; Val81-Phe82; Phe82-Lys83; Leu87-Asn88; Glu89- Asn90; Val92-Leu93; Leu93-Val94; Asp98-Tyr99; Met107-Glu108; Leu117-Ala118; Asp130-Glu131; Leu133-Glu134; Phe136-Asp137; Asp137-Lys138; Leu149-Ser150.

Beispiel 2: Pepsin-Hydrolyse von β-Casein

Rohes β-Casein A1 wird nach dem von Zittle C. A. und Custer J. H. (1963, J. Dairy Sci. 46, 1183-1188) beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Substrat wird anschließend durch Chromatographie nach dem Verfahren von Mercier J. C., Maubois J. L., Poznanski S., Ribadeau-Dumas B. (1968, Bull. Soc. Chim. Biol. 50, 521-530) auf einer Kolonne des Typs Q- Sepharose Fast Flow (eingetragenes Warenzeichen) der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, gereinigt.

Beispiel 2a

Veresterung

Das veresterte β-Casein wird unter Verwendung einer Modifikation des von Fraenkel-Conrat und Olcott (1945, loc. cit.) beschriebenen Verfahrens hergestellt. Das gereinigte β-Casein wird in Ethanol dispergiert, so dass man eine 2%ige Suspension erhält. Unter Rühren wird vorsichtig 12 N Salzsäure zu der Protein-Alkohol-Suspension hinzugefügt, so dass man eine Suspension mit einem Säuregehalt von 0,06-0,68 N erhält. Das erhaltene Produkt wird in Abhängigkeit vom gewünschten Veresterungsgrad mehrere Tage lang bei 4ºC gerührt. Nach dem Trocknen im Vakuum werden die Proben bei einer Temperatur von -80ºC aufbewahrt. Eine Kontrollprobe wird in derselben Weise, aber ohne Salzsäure hergestellt.

Analyse der veresterten Proteine

Die Bestimmung des Grades der Veresterung des β-Caseins mit Ethanol erfolgte unter Verwendung der von Halpin und Richardson (1985) entwickelten Farbreaktion mit Hydroxylammoniumchlorid, modifiziert nach Bertrand-Harb und anderen (1991).
Im vorliegenden Fall wurde das β-Casein zu 55% verestert.

Hydrolyse

Das β-Casein und das veresterte β-Casein (2 mg/ml) wurden in 20 mM Zitronensäure, pH 2,6, gelöst. Pepsin (1 mg pro ml H&sub2;O, Anfangskonzentration) wurde in einem Enzym/Proteinsubstrat-Verhältnis (E/S) von 0,2% hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde bei 20ºC inkubiert. Nach 1, 2, 4, 20 und 40 Stunden wurden Proben entnommen; die Hydrolyse wurde durch Zugabe von 1,5 Volumina eines 0,2 M Tris-HCl-Puffers, pH 8,0, abgebrochen.

Beispiel 2b

Eine ähnliche Veresterung wurde mit β-Casein unter Verwendung von Methanol anstelle von Ethanol durchgeführt; die anschließende Hydrolyse des methylierten β-Caseins erfolgte in derselben Weise wie die oben beschriebene Hydrolyse des ethylierten β-Caseins. Auch in diesem Beispiel wurde das β-Casein zu 55% verestert.

Ergebnisse

Fig. 4 zeigt das HPLC-chromatographische Profil eines Pepsin-Hydrolysats von nativem β-Casein nach 10 Stunden Hydrolyse.
Fig. 5 zeigt das HPLC-chromatographische Profil (nach 10 Stunden Hydrolyse) eines Pepsin-Hydrolysats von methyliertem β-Casein (Ester), das gemäß Beispiel 2b hergestellt wurde.
Fig. 6 zeigt das HPLC-chromatographische Profil (nach 10 Stunden Hydrolyse) eines Pepsin-Hydrolysats von ethyliertem β-Casein (Ester), das gemäß Beispiel 2a hergestellt wurde.
Fig. 7 zeigt die Primärstruktur des β-Caseins A1 mit den Pepsin-Spaltungsstellen innerhalb des nativen β-Caseins (*), innerhalb des methylierten β-Caseins (+) und innerhalb des ethylierten β-Caseins (o).
Die Fig. 8, 9 und 10 zeigen in Tabellenform die Aminosäurezusammensetzungen und die N-terminalen Sequenzen der Pepsin-Peptide des nativen β-Caseins, des methylierten β-Caseins (Esters) bzw. des ethylierten β-Caseins (Esters).
Im Falle des veresterten β-Caseins wurden sechs neue Spaltungsstellen identifiziert: Glu11-Ile12; Asn73-Ile74; Met156-Phe157; Val162-Leu163; Leu198-Gly199; Ile207-Ile208.

Beispiel 3: Trypsin-Hydrolyse von β-Lactoglobulin

Das β-Lactoglobulin und das veresterte β-Lactoglobulin werden gemäß Beispiel 1 hergestellt und mit Trypsin (TPCK-behandeltes Rinder-Trypsin, 10 000-13 000 E/mg; von der Firma Sigma Chimie) hydrolysiert.
Das β-Lactoglobulin und das veresterte β-Lactoglobulin (2 mg/ml) werden in einem 0,2 M Tris-HCl-Puffer mit pH 8,0 gelöst. Das zuvor in 0,01 N HCl in Lösung gebrachte Trypsin wird in einem Enzym/Proteinsubstrat-Verhältnis (E/S) von 2,5% hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wird bei 37ºC inkubiert, und die Hydrolyse wird nach 24 Stunden durch Zugabe von 0,5 Volumina 0,2 N HCl abgebrochen.

Ergebnisse

Fig. 11 zeigt das HPLC-chromatographische Profil eines Trypsin-Hydrolysats von nativem β-Lactoglobulin (nach 24 Stunden Hydrolyse).
Fig. 12 zeigt das HPLC-chromatographische Profil (nach 24 Stunden Hydrolyse) eines Trypsin-Hydrolysats von ethyliertem β-Lactoglobulin (Ester).
Fig. 13 zeigt die Primärstruktur des β-Lactoglobulins B; angezeigt sind die 16 erhaltenen Trypsin-Peptide und die atypische Spaltungsstelle (*) des veresterten β-Lactoglobulins.
Die Fig. 14a, 14b und 14c zeigen in Tabellenform die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminalen Sequenzen der Trypsin-Peptide des nativen β-Lactoglobulins und des ethylierten β-Lactoglobulins.
Die Analyse der Trypsin-Peptide des β-Lactoglobulins zeigt, dass die Veresterung keinerlei Spaltung einer Zielbindung verhindert, auch wenn sich ein veresterter Aspartyl- oder Glutamylrest in der Nachbarschaft der Zielbindung befindet, was zur Gewinnung von veresterten Peptiden führt. Eine atypische Spaltungsstelle wurde nachgewiesen: Met145-His146.

Beispiel 4: Trypsin-Hydrolyse von β-Casein

Das gemäß Beispiel 2 erhaltene β-Casein und das veresterte β-Casein wurden der Einwirkung von Trypsin (TPCK-behandeltes Rinder-Trypsin, 10 000-13 000 E/mg) unterworfen.
Das native β-Casein und das veresterte β-Casein (2 mg/ml) werden in einem 0,2 M Tris-HCl-Puffer mit pH 8,0 gelöst. Das zuvor in 0,01 N HCl in Lösung gebrachte Trypsin wird in einem Enzym/Proteinsubstrat-Verhältnis (E/S) von 1,25º10 hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wird bei 20ºC inkubiert; die Hydrolyse wird nach 24 Stunden durch Zugabe von 0,5 Volumina 0,2 N HCl abgebrochen.

Ergebnisse

Fig. 15 zeigt das HPLC-chromatographische Profil eines Trypsin-Hydrolysats von nativem β-Casein (nach 24 Stunden Hydrolyse).
Fig. 16 zeigt das HPLC-chromatographische Profil (nach 24 Stunden Hydrolyse) eines Trypsin-Hydrolysats von methyliertem β-Casein (Ester).
Fig. 17 zeigt das HPLC-chromatographische Profil (nach 24 Stunden Hydrolyse) eines Trypsin-Hydrolysats von ethyliertem β-Casein (Ester).
Fig. 18 zeigt die Primärstruktur des β-Caseins A1; die Buchstaben A bis N zeigen die Trypsin-Peptide des nativen β-Caseins, und die atypischen Spaltungsstellen wurden angezeigt: für das ethylierte β-Casein (o) und für das methylierte β-Casein(*).
Die Fig. 19a und 19b zeigen in Tabellenform die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminalen Sequenzen der Trypsin-Peptide des nativen β-Caseins, des methylierten β-Caseins und des ethylierten β- Caseins.
Wie bei β-Lactoglobulin zeigt die Analyse der Trypsin-Peptide des β- Caseins, dass die Veresterung keinerlei Spaltung einer Zielbindung verhindert, auch wenn sich ein veresterter Aspartyl- oder Glutamylrest in der Nachbarschaft der Zielbindung befindet, was zur Gewinnung von veresterten Peptiden führt. Atypische Spaltungsstellen wurden nachgewiesen: Phe52-Ala53; Gln79-Thr80; Ser122-Gln123; Ser124-Leu125; Phe190-Leu191; Tyr193-Gln194; Val197-Leu198.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung eines Substrats tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, das wenigstens ein Protein oder ein Peptid, das mit wenigstens einer veresterungsfähigen Gruppe außer der C-terminalen Carboxygruppe der Kette versehen ist, enthält, durch eine enzymatische Hydrolysetechnik, die dazu führt, dass man peptidische Produkte erhält, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, dass man vor der enzymatischen Hydrolyseoperation das Proteinsubstrat einer Veresterungsreaktion mit wenigstens einer veresterungsfähigen Gruppe des Proteins oder des Peptids außer der eventuellen Veresterung der C-terminalen Carboxygruppe der Kette unterzieht, wobei die Abfolge der Operationen der Veresterung und der Hydrolyse es erlaubt, Peptide zu erhalten, von denen wenigstens einige an wenigstens einer ihrer veresterungsfähigen Gruppen verestert sind, mit Ausnahme ihrer C-terminalen Carboxygruppe.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, dass man die Veresterungsreaktion mit wenigstens einer Carboxygruppe des Proteins oder des Peptids durchführt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung des Proteins oder des Peptids in Gegenwart eines Alkohols erfolgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung in Gegenwart eines aliphatischen Alkohols erfolgt, der zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatome enthält.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Veresterungsreaktion eine partielle Hydrolyse des Proteins vorausgeht.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Veresterungsreaktion eine Abfolge von Hydrolyseoperationen mittels verschiedener proteolytischer oder peptidasischer Enzyme folgt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Proteinsubstrat verwendet wird, das aus der Milch stammt und das insbesondere β-Casein oder β-Lactoglobulin enthält.