DD221367A5 - Verfahren zur herstellung eines biospezifischen polymers - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines biospezifischen Polymers mit immobilisierten reaktiven biologischen Funktionen, mit Reaktivitaet zur Bindung spezifischer pathologischer Effektoren oder spezifischer Gruppen von pathologischen Effektoren darauf, gekennzeichnet dadurch, dass es aus Behandeln eines biokompaktiblen Polymertraegers mit einem Aktivierungsmittel und Binden einer biologischen Funktion mit mindestens einer funktionellen Gruppe, die reaktiv ist gegenueber dem aktivierten biokompatiblen Polymertraeger, wobei die Reaktion ausgefuehrt wird ueber einen Zeitraum, der ausreicht, um die biologischen Funktionen kovalent an den biokompatiblen Polymertraeger zu binden und wobei die biologischen Funktionen eine Groesse haben, so dass sie nicht in die Matrix des biokompatiblen Polymertraegers eindringen koennen, besteht.

Description

4 62 829 18

Verfahren zur Herstellung eines Toi ο spezifischen Polymers

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft biokompatible Polymere mit immobilisierten reaktiven biologischen Punktionen (biologicals), die ausgewählte spezifische pathologische Effektoren binden oder spezifische Gruppen von pathologischen Effektoren, die mit krankhaften Körperflüssigkeiten verbunden sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Der Verlauf vieler Kraniche it szustände wird oft durch erhöhte Werte von spezifischen Blutproteinen und anderen Molekülen widergespiegelt. Dieses Phänomen wird typischerweise als ein diagnostisches Instrument verwendet, um den Krankheitsverlauf zu definieren und um den Verlauf der klinischen Behandlung zu verfolgen. In vielen Fallen sind diese spezifischen Blut!componenten direkt oder indirekt verantwortlich für die primären und sekundären Manifestationen des Kraniche it sprozesses. "Autoimmun"-rKranlcheiten können als Krankheiten, die durch das Zirkulieren von Antikörpern gegen endogene Sub-.strate und Gewebeproteine, die der Körper für normales Wachstum und Aufrechterhaltung braucht, charakterisiert werden. "Neoplastische"-Krankheiten sind typischerweise charakterisiert durch unkontrolliertes iTachstum einer undifferenzierten transformierten Zellinie, die dem natürlichen Abwehrmechanismus des Körpers entgeht oder ihn ausgleicht durch '

Produktion von immunosuppressiven blockierenden Faktoren, die

Antigenoberflache maskierenden Komponenten und/oder Wachstumsregulatorkomponenten. Die spezifische Aufteilung (compartmentalization) dieser pathologischen Effektoren an einem biokompatiblen Substrat geht einher mit der Wiederherstellung von "normalen" Körperfunktionen durch Entfernung der pathologischen Effektoren des Krankheitsprozesses.

Die Grundfunktion der Organe, Zellen und Moleküle, die das Immunsystem bilden, ist das Erkennen und Eliminieren fremder Substanzen aus dem Körper. Diese fremden Substanzen werden eliminiert durch Reaktion zwischen der fremden Substanz und Antikörpern die gebildet werden als Antwort auf die Substanz. Im allgemeinen wird diese Funktion wirksam durchgeführt und ohne Nachteil für den Wirt. Jedoch können, in bestimmten Fällen, Störungen auftreten, die zu pathogenen Störungen führen wie z. B. eine unkontrollierte Antwort (allergische Störungen) oder eine abnormale Antwort (Autoimmunkrankheit) Die Pathogenese von beiden Störungen wird direkt oder indirekt mit der Produktion von Antikörpern mit Kreuzreaktivitäten entweder zu den umgebenden Antigenen (Allergenen) oder Eigenantigenen in Verbindung gebracht.

Eine Autoimmunkrankheit ist ein pathologischer Zustand, der eintritt, wenn ein Wirtskörper immunologisch antwortet durch Produktion von Antikörpern mit Reaktivität zu einem Eigenantigen. Autoimmunität kann fast jeden Teil des Körpers ergreifen und bedingt im allgemeinen eine Reaktion zwischen einem Eigenantigen und einem Immunoglobulin-(IgM oder IgG) Antikörper. Repräsentative Autoimmunkrankheiten können die Schilddrüse, Niere, Pankreas, Neurone, Magenschleimhaut, Nebennieren, Haut, rote Zellen und Synovialmembranen ebenso erfassen wie Thyreoglobulin, Insulin, Desoxyribonukleinsäuren und Immunoglobuline.

Für einige Arten von Autoimmun- und neoplastischen Krankheiten wurden nichtspezifische immunosuppressive Behandlungen wie Ganzkörperröntgenbestrahlungen oder die Verabreichung cytotoxischer Drogen mit begrenztem Erfolg angewendet. Die Nachteile einer solchen Behandlung schließen die Toxizität der gebrauchten Agenzien und das vermehrte Vorkommen verschiedener Krebsarten, insbesondere Lymphomas- und Retikulozellen sarkomas ein, die einer derartigen Therapie folgen. Zusätzlich vermehrt die Verwendung nichtspezifischer Agenzien zur chronischen zellulären Suppression sehr stark die Suszeptibilität des Patienten für ernste Infektionen durch Umweltpilze, Bakterien und Viren, die unter normalen Umständen keine Probleme bereiten würden. Die hier·offenbarte Erfindung ist spezifisch dafür, daß sie nur die pathologischen Effektoren oder die Gruppen der pathologischen Effektoren, die bezogen auf und verantwortlich für die Manifestationen einer einzelnen Krankheit sind, entfernen.

Bei der Betrachtung des Standes der Technik findet man, daß in jüngster Zeit allgemein"zweierlei Vorgehen für die therapeutische Behandlung von Autoimmun- und/oder neoplastischen Krankheiten unternommen wurden. Beim ersten wird ein Material in den Patienten eingeführt, das eine spezifische Art von immunologischer Toleranz, die hergestellt werden soll, verursacht. Diese Unterdrückung der Antikörper- Antwort würde dann eine Toleranz gegenüber dem angreifenden Antigen bewirken. Ein typisches Beispiel dieser Art von Vorgehen ist in US-PS 4 222 907, Katz, 16.09.1981 beschrieben. In dieser Referenz wird dem erkrankten Patienten eine therapeutische Behandlung gegeben, die daraus besteht, Konjugate eines Antigens, das an ein D-Aminoglutarsäure; D-Lysin-Copolymer gebunden ist, einzuführen.

Das zweite Vorgehen ist der extrakorporale Weg. Die Behandlungsweisen bedingen im allgemeinen die Entfernung des gesamten Blutes, die Separation von zellulären und löslichen Blutsubstanzen, die Substitution oder Behandlung des Blutplasma und die Rekombinationsinfusion des behandelten ganzen Blutes. Das erste Beispiel dieses Vorgehens' wäre Plasmasubstitution oder Austausch mit Salz-, Zucker- und/oder Proteinlösungen und ist beschrieben bei McCullough et al, "Therapeutic Plasma Exchange", Lab. Med. 12 (12) , p. 745 (1981) . Plasmaaustausch ist eine ziemlich rohe Technik, die ein großes Volumen an Ersatzlösung erfordert. Ein zweites Beispiel dieses Vorgehens erfordert physikalische und/oder biochemische Modifikationen des Plasmaanteils des gesamten Blutes. Typisch für den Stand der Technik für diese therapeutische Behandlung sind z. B. der Terman et al Artikel "Extracorporeal Immunoadsorption: Initial Experience in Human Systemic Lupus Erythematosus", The Lancet, October 20, 1979, p. 824-826. Dieser Artikel beschreibt ein Hämodialyse-System, das zwei mechanische Filter benutzt mit einem DNA-Kollodium-Kohlenfilter zwischen diesen beiden mechanischen Filtern. Die adsorbierende Säule ist jedoch typisch für diesen Stand der Technik nur eine halbspezifische für Immunkomponenten, weil das Kohlensubstrat viele vitale niedrigmolekulare Konstituenten nicht spezifisch aus dem behandelten Plasma entfernt. Eine zweite Anwendung dieses Vorgehens kann gezeigt werden durch den Terman et al Artikel "Specific Removal of Circulated Antigen by Means of Immunoadsorption", FEBS Letters, Vol. 61, No. 1, January, 1976, p. 59-62. Diese Referenz lehrt die spezifische Entfernung von radioaktiv markiertem Antigen durch mit Antikörper behandelten Cellulosemembranen. Der Autor zeigt jedoch, daß Kontrollmembranen eine signifikante Aufnahmefähigkeit haben, um Proteine unspezifisch zu adsorbieren.

Eine dritte Anwendung dieses Vorgehens wird gezeigt in dem Bansal et al Artikel "Ex vivo Removal of Serum IgG in a Patient With Colon Carcinoma", Cancer, 42(1), pp. 1-18 (1978). Dieser Bericht lehrt die halbspezifische Adsorption von Immunoglobulin durch ex vivo-Behandlung von Plasma mit Formalin und Hitze getötetem Staphylococcus aureus. Die biologische Aktivität bestimmter Stämme von S. aureus wird zurückgeführt auf ein Molekül, das auf der Zellwand ist und Protein A genannt wird, das zusammenwirkt und bindet mit dem Fc-Anteil von Säugetier-IgG. Diese Behandlung unterscheidet nicht zwischen normalen und pathologischen IgG-Komponenten, weil sie mit dem Fc-Anteil zusammenwirkt und Experimente haben die Möglichkeit von signifikanten Nebeneffekten gezeigt.

Eine vierte Anwendung dieses Vorgehens kann gezeigt werden durch den Malchesky et al Artikel "On-line Separation of Macromolecules by Membrane Filtration With Cryogelation", Artif. Organs 4:205, 1980. Diese Publikation lehrt die halbspezifische Entfernung von Cryoglobulinsubstanzen aus dem Plasma durch die Kombination von Filtration und Kältebehandlungskammern. Das Auftreten und die Zusammensetzung von cryoglobulären Präzipitaten ist nicht notwendig übereinstimmend mit oder anzeigend für viele Autoimmun- oder neoplastische Krankheiten.

Ein weiteres Problem, das mit dem derzeitigen Stand der Technik verbunden ist, ist, daß ohne Systeme, die mechanische Filtration verwenden, die spezifischen pathologischen Effektoren, die entfernt werden sollen, nicht entfernt werden konnten in genügend großen Mengen, um den Zustand des erkrankten Patienten zu verbessern, da die Säulen nicht spezifisch im wesentlichen nur die gewünschten spezifischen pathologischen Effektoren absorbieren.

23,2_#1984

AP A 61 K/253 399/0 - 6 - 62 829/18

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, Blut oder Plasma in wirtschaftlicher Weise zu behandeln* um mit hoher Spezifität pathologische Effektoren zu entfernen»

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde» pathologische Effekt toren an aktivierte biokompatible Polymere mit biologischen Funktionen zu binden.

23,2,1984

AP A 61 K/253 899/0 ~ 7 - 62 829/18

Die vorliegende Erfindung stellt ein biospezifisches Polymer mit immobilisierten reaktiven biologischen Funktionen zur Verfügung, wobei diese biologischen Funktionen eine hohe spezifische Aktivität für die Bindung von Komplementen haben, die pathologische Effektoren sind, bestehend aus einem biokompatiblen Polymerträger, mit oder ohne Spacer, gebunden an den biokompatiblen Polymerträger, der eine physikalische Dimension hat, die diesen Spacer dazu zwingt, von der Oberfläche des biokompatiblen Polymerträgers sich zu erstrecken und aus einer biologischen Funktion oder biologischen Funk« tionen» die immobilisiert· an dem biokompatiblen Polymerträger oder dem Spacer sind über eine chemische Bindung und dadurch gekennzeichnet, daß diese biologische Funktion oder diese biologischen Funktionen ihre Reaktivität zur Bindung spezifischer pathologischer Effektoren oder spezifischer Gruppen pathologischer Effektoren behalten*

Die Erfindung betrifft auch eine V/eise für die therapeutische Behandlung von Autoimmunkrankheiten, bestehend aus dem Durchgang des Bluts, Plasma oder einer anderen Körperflüssigkeit eines erkrankten Patienten über ein biospezifisches Polymer mit immobilisierten reaktiven biologischen Funktionen, wobei die gewünschten pathologischen Effektoren entfernt werden aus dem Blut oder Plasma des Patienten und dann dem Rückführen des Blutes in den Patienten,

Weiterhin betrifft diese Erfindung, allgemein gesprochen, ein Verfahren zur Herstellung dieser biospezifischen Polymere mit immobilisierten reaktiven biologischen Funktionen mit hoher spezifischer Aktivität für die Bindung von Komplementen, die pathologische Effektoren sind..

Weiterhin betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung biospezifischer Polymere auf einem mechanischen Träger um eine ausgezeichnete mechanische Integrität zu schaffen.

Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind offenbart und beschrieben in der detaillierten Beschreibung und in den Ansprüchen.

Die biokompatiblen Polymerträger, die geeignet sind in der vorliegenden Erfindung, sind Materialien, die nicht dazu neigen, nachteilige Effekte zu verursachen im Kontakt mit Körperflüssigkeiten wie z. B. Plasma oder dem gesamten Blut, während sie zur selben Zeit eine reaktive aber immobilisierte biologische Funktion aufrechterhalten, die so orientiert ist, daß die biologische Funktion aus der Oberfläche des Polymerträgers herausragt. Die Materialien, die geeignet sind, sind solche, die in Filme oder andere physikalische Formen gegossen werden können, während sie gleichzeitig empfänglich sind, um die biologischen Funktionen chemisch an sich zu binden ohne weder sich selbst noch die daran gebundenen Funktionen zu schädigen. Die Arten von Materialien, die allgemein als geeignet in Betracht gezogen werden, sind in der Technik bekannt als Hydrogele und können entweder Copolymere oder Homopolymere sein.

Modifizierte Cellulose und Cellulosederivate, insbesondere Celluloseacetate, haben Anwendung gefunden als biokompatible Träger, die geeignet sind für die vorliegende Erfindung. Unter modifizierten Cellulosederivaten werden Cellulosepolymere verstanden, deren Oberfläche modifiziert ist dadurch, daß entsprechende biokompatible Oberflächengruppen an das cellulosische Substratpolymer kovalent gebunden werden, das dadurch mehr biokompatibel wird. Solche Oberflächengruppen sind wohl bekannt und brauchen hier nicht beschrieben zu werden, jedoch zeigte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Albumin eine besondere Nützlichkeit als modifizierende Gruppe. Verfahren um solche Gruppen anzuhängen, werden nachfolgend beschrieben.

Homopolymere können auch verwendet werden als geeignete biokompatible Polymerträger in der vorliegenden Erfindung. Es wird jedoch verstanden, daß wenn von Homopolymeren die Rede ist, diese Materialien einschließen, die auch als leicht vernetzte Homopolymere identifiziert werden können. Das heißt, daß sie eine relativ kleine Menge einer zweiten Komponente enthalten, die mit der Produktion des Monomers einhergeht oder absichtlich zugegeben wird, um eine genügende Vernetzung zu sichern, um die Homopolymeren davor zu schützen, daß sie langsam in einem wässrigen Μεαίμιη, wie z. B. Blut, aufgelöst werden. Ein Beispiel für diese Art Homopolymer, die oft leicht vernetzt ist, ist Hydroxyethylmethacrylat (HEMA).

Bezüglich der Hydrogele können geeignete Polymere entweder reguläre Homopolymere sein, die im wesentlichen kein anderes Material in ihren Matrizen enthalten, oder sie können Copolymere sein, die aus zwei oder mehr Monomeren hergestellt wurden wie z. B. Styrol und Vinylacetat. In bestimmten Fällen kann diese Art des

Zuschneidens der Copolymere mit verschiedenen Monomeren die erwünschten Eigenschaften des biokompatiblen Polymerträgermaterials verbessern. Beispiele für geeignete Monomere, die copolymerisiert werden können, schließen z. B. Hydroxyethylmethacrylat und Glycidylmethacrylat ein.

Ebenso sind Terpolymere geeignet, die eine Subklasse von Copolymeren sind, die drei Monomere enthalten, die polymerisiert sind. Ein Beispiel für ein geeignetes Terpolymer ist Glycidyl-Methacrylat/N-Vinyl-Pyrrolidon/ Hydroxyethylmethacrylat (GMA/NVP/HEMA).

Zusätzlich zu den spezifischen Copolymeren und Homopolymeren, die oben aufgeführt sind, können Copolymere, die mit oder ohne verschiedene zusätzliche Monomere hergestellt wurden und Homopolymere, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, polymerisiert werden aus den folgenden Monomeren: Hydroxyalkylacrylate und Hydroxyalky!methacrylate, ζ. B. Hydroxyethylacrylat, Hydroxypropylacrylat und Hydroxybutylmethacrylat; Epoxyacrylate und Epoxymethacrylate wie z. B. Glycidylmethacrylat, Aminoalkylacrylat und Aminoalkylmethacrylate, N-Viny!verbindungen wie z. B. N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylcarbazol, N-Vinylacetamid und N-Vinylsuccinimid; Aminostyrole; Polyvinylalkohole und. Polyvinylamine, die aus geeigneten polymerischen Vorläufern hergestellt werden müssen; Polyacrylamid und verschieden substituierte Polyacrylamide; Vinylpyridin;" Vinylsulfonate und Polyvinylsulfate; Vinylencarbonate; Viny!essigsäure und Viny!crotonsäure; Allylamine und Allylalkohol; Vinylglycidylether und Allylglycidylether. Verfahren und Herstellungsarten zur Herstellung von Copolymeren

und/oder Homopolymeren aus den obigen Monomeren sind wohl bekannt in dieser speziellen Technik. Diese Parameter sind nicht kritisch für die vorliegende Erfindung mit der Einschränkung, daß das endgültige Copolymer und/oder Homopolymer nicht toxisch ist für Tiere.einschließlich Menschen.

Das Verfahren zum Gießen dieser Materialien in eine Form, die geeignet ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, ist nicht von kritischer Wichtigkeit. Eine gegenwärtig bevorzugte Methode ist das Spingießen {spin casting) und ist ausgeführt in den Beispielen 2, 3 und 4.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können biologische Funktionen definiert werden als chemische Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, kovalent an biokompatible Polymerträger oder Spacer, wie später definiert, zu binden, während sie gleichzeitig eine Aktivität behalten um an die gewünschte pathologisch wirkende Komponente zu binden. Zusätzlich müssen die verwendeten biologischen Funktionen von solcher Größe sein, daß sie kovalent an die Oberfläche des Polymerträgers binden und dürfen nicht so klein sein, daß sie die poröse Matrix des P.olymerträgers durchdringen und dadurch innerhalb oder im Inneren des Trägermaterials chemisch gebunden werden. Angesichts dessen muß ein Spacer angewendet werden, um zu sichern, daß die reaktive Stelle der biologischen Funktion, die erhalten bleibt und die empfänglich ist mit der gewünschten pathologischen Komponente zu binden, tatsächlich dieser Komponente angeboten werden kann, d. h. daß sie außerhalb des Trägers von diesem weggehalten wird, so daß sie in Kontakt kommt mit der Körperflüssigkeit, die über den Träger fließt. Es ist offensichtlich aus dem

obigen, daß natürlich die Reaktivität für die Bindung der gewünschten pathologischen Komponente tatsächlich nach der Immobilisation der biologischen Funktion auf den biokompatiblen Polymerträger erhalten bleibt. Beispiele für Materialien, die verwendet werden können als biologische Funktionen, schließen z. B. ein: Acetylcholin, Rezeptorproteine, gewebeverträgliche Antigene, Ribonucleinsäuren, Basalmembranproteine, Immunoglobulinklassen und Unterklassen, Myelomaproteinrezeptoren, Komplementkomponenten, Myelinproteine und verschiedene Hormone, Vitamine und ihre Rezeptorkompo-' nenten. Einzelne Beispiele sind das Anhängen von Insulin an einen biokompatiblen Polymerträger um Antiinsulin-Antikörper zu entfernen, der verbunden ist mit der Autoimmunkrankheit Insulinresistenz; Anhängen von Anti-Clq und/oder CIq an einen biokompatiblen Polymerträger um Immunkomplexe zu entfernen, die verbunden sind mit Bindegewebs- und proliferativen -Krankheiten wie z. B. Rheumatoide arthritis und Carcinome.

Jedes allgemein bekannte Verfahren des chemischen Anhängens ist ausreichend, um die biologischen Funktionen an den biokompatiblen Polymerträger anzuhängen, mit der Einschränkung, daß die biologische Funktion noch mindestens eine aktive Stelle für die einzelne Autoimmun-krankheitsbezogene Komponente hat. Im allgemeinen fallen die Verfahren zum chemischen Anbinden unter drei Klassen oder Wege des Anbindens. Diese drei Wege sind

1. spontane Bindung,

2. chemische Aktivierung terminaler funktioneller Gruppen und

3. Bindung mit Kupplungsmitteln.

Spontane kovalente Bindung von biologischen Funktionen an Polymerträgeroberflächen geschieht über chemisch reaktive Gruppen, die von dem Polymerträger weggehen. So kuppeln z. B. reaktive Gruppen wie Aldehyd und Epoxy, die von dem Polymerträger weggehen, sofort mit biologischen Funktionen die verfügbare Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppen enthalten. Ebenso kuppeln z. B. freie Aldehydgruppen auf dem Polymerträger über Acetalbindungen mit Hydroxylgruppen enthaltenden biologischen Funktionen und über Imidbindungen mit Aminogruppen enthaltenden Molekülen. Außerdem kuppeln z. B. freie Oximgruppen über Alkylamin-, Ether- und Thioetherbrücken mit biologischen Funktionen, die Amin-, Hydroxyl- und Thiogruppen enthalten, entsprechend. Aus Vereinfachungsgründen werden alle diese Bindungen und Kupplungen definiert als Immobilisationen. Weitergehende Diskussionen dieser Reaktionen können z. B. in "Chemical Procedures for Enzyme Immobilization of Porous Cellulose Beads", Chen, L. F. et al, Biotechnology and Bioengineering, Vol. XIX, pp. 1463-1473 (1977) und "Epoxy Activated Sepharose", 6B, Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography, pp. 27-32 (1979) entnommen werden.

Chemische Aktivierung terminaler funktioneller Gruppen kann durch Aktivierung der Polymeroberflächen-funktionellen Gruppen durch chemische Modifikation ihrer terminalen Komponenten erreicht werden. Dieses Verfahren kann erläutert werden durch die Oxidation terminaler Epoxyfunktionen mit Perjodsäure um aktive Aldehydgruppen zu bilden. Dieses Verfahren wird weiter erläutert z. B. in "Immobilization of Amyloglucosidose on Poly-(Glycidylmethacrylat)-Co-(Ethylen-Dimethacrylat) -Carrier and Its Derivatives", Svec, F. et al, Biotechnology and Bioengineering, Vol. XX, pp. 1319-1328 (1978). Die Immobilisierung der biologischen Funktionen

geschieht, wie weiter oben beschrieben. Kondensationsreaktionen können durchgeführt werden zwischen freien Carboxyl- und Aminogruppen über Carbodiimid-Aktivierung der Carboxygruppen wie sie beschrieben ist z. B. in "New Approaches to Non-Thrombogenic Materials", Hoffman et al, Coagulation - Current Research and Clinical Applications, Academic Press, N.Y. (1973). Die Immobilisierung der biologischen Funktionen wird durchgeführt durch Carbodiimid-Aktivierung von entweder den Polymeroder den Carboxylgruppen der biologischen Funktion und Kondensation mit einem freien Amin um eine stabile Peptidbindung zu bilden. Die endgültige Orientierung der biologischen Funktion bestimmt im allgemeinen, ob man ein Amin oder ein Carboxyl enthaltendes Polymer verwendet.

Die Bindung über Kupplungsreagenzien kann durchgeführt werden unter Verwendung einer Vielzahl von Kupplungsmitteln um kovalente Brücken zwischen den polymeren und den biologischen Funktionen zu bilden. Hier werden freie Hydroxyl- und/oder Amingruppen enthaltende Polymere und biologische Funktionen kovalent gekuppelt durch Reagenzien wie z. B. Bromcyan, Diisocyanate, Dialdehyde und Trichlor-s-triazine. Eine erschöpfendere Diskussion dieser Technik kann z.B. gefunden werden in dem Chen et al Artikel, der oben zitiert wurde.

Die bevorzugte Methode zur Immobilisierung reaktiver biologischer Funktionen auf einen biokompatiblen Polymersubstrat in einem gegebenen Fall wird im allgemeinen'durch die molekulare Lage des reaktiven bindenden Teils der biologischen Funktion vorgeschrieben und durch die funktionellen Gruppen auf der biologischen

Funktion und dem Polymersubstrat, die kovalent kombiniert werden können. Zum Beispiel ist es zur Zeit bevorzugt, Polymersubstrate mit terminalen Hydroxyfunktionen zu aktivieren durch Behandlung mit einer alkalischen Lösung von Bromcyan (10 bis 20 % w/v). Typischerweise wird die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) für etwa 30 Minuten gehalten. Der pH der Lösung wird in einem Bereich von etwa 10 bis 12 gehalten durch Zugabe eines alkalischen Stoffes, z. B. KOH oder NaOH. Das Polymer wird ausgiebig mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9 g%) gewaschen und inkubiert mit Lösungen einer gereinigten biologischen Funktion aufgelöst in einer leicht alkalischen Pufferlösung etwa 12 bis 16 Stunden bei 2 bis 8⁰C. Das Polymer wird ausgiebig gespült mit physiologischer Kochsalzlösung um ungebundene oder nicht spezifisch gebundene biologische Komponenten zu entfernen.

Biologische Funktionen werden immobilisiert an Glycidylgruppen enthaltenden Polymeren über Ether, Thioether oder Alkylaminbindungen. Epoxy-aktivierte Polymersubstrate werden gespült und gequollen mit wäßrig-neutralen Pufferlösungen bei Raumtemperatur. Gereinigte biologische Funktionen, gelöste Borate, Carbonate oder Phosphatpufferlösungen werden inkubiert, mit dem Glycidylpolymersubstrat 12 bis 20 Stunden lang bei 4 bis 30°C. Überschüssige und nicht spezifisch gebundene biologische Funktionen werden entfernt durch Spülen des Polymers mit Kochsalzlösung, Essigsäure (0,2 bis 1,0 M) und Phosphat-gepufferten (pH = 7,2 + 0,2) Kochsalzlösungen. Die Aktivierung von Amin- und Carboxylgruppen enthaltenden Polymermatrizen wird durchgeführt durch Behandlung mit gereinigten biologischen Funktionen, aufgelöst in leicht sauren

(pH 4,5 bis 6,5) Pufferlösungen eines wasserlöslichen Carbodiimids. Biologische Funktionen werden kovalent gekuppelt an Polymerträgersubstrate durch Inkubation des Polymerträgers, der biologischen Funktion und Carbodiimid-reaktanten 12 bis 16 Stunden lang bei 2 bis 8⁰C. Die Polymer-biologische Funktion-Konjugate werden abwechselnd in Säure- und Alkalispüllösungen gewaschen, bis die Spüllösungen frei von biologischen Funktionen und Carbodiimid-Reaktanten sind.

Um die spezifischen Bindungseigenschaften der polymerimmobilisierten biologischen Funktionen zu bestimmen, wurden physiologische Serumlösungen von komplementären Biomolekülen behandelt mit aktivierten Membranen. Die Mengen an Biomolekülen wurden radiochemisch gemessen. Die signifikante Verringerung spezifischer Biomoleküle ergab die folgenden kurzen Ausführungen über die biologisch modifizierten Polymersubstrate.

In der vorliegenden Erfindung kann ein Spacer definiert werden als ein Molekül oder eine Verbindung, die fähig ist zur Bindung an die Oberfläche eines biospezifischen Polymerträgers und die groß genug ist, um von der Oberfläche dieses Trägers herauszuragen und die fähig ist, eine biologische Funktion und/oder biologische Funktionen zu,immobilisieren. Der Spacer sichert, daß die aktive Stelle der biologischen Funktion außerhalb des Trägers von diesem weg gehalten wird, so daß sie mit der Körperflüssigkeit wirksamer in Verbindung tritt. Es ist offensichtlich aus dem obigen, daß natürlich die Reaktivität für die Bindung mit dem gewünschten Krankheitskomplex auch nach der Immobilisierung der biologischen Funktionen auf den Spacer und dadurch auf den biokompatiblen Polymerträger erhalten bleibt.

Die Spacer leiten sich ab von organischen Molekülen mit mindestens zwei reaktiven funktionellen Gruppen, die im allgemeinen an entgegengesetzten Enden des Moleküls sind. Solche Gruppen dienen als Bindungsvermittler, die fähig sind zum Kuppeln des Spacers an den Polymerträger und an die biologische Funktion. Die reaktiven funktionellen Gruppen auf dem Spacer können gleich oder verschieden sein mit der Einschränkung, daß sie mit den funktioneilen Gruppen entlang der Oberfläche des Polymerträgers und den funktioneilen Gruppen, die aus den biologischen Funktionen herausragen reagieren unter Bildung kovalenter Bindungen. Jede bekannte Methode zum Ausführen solcher Kupplungsreaktionen ist ausreichend. Zum Beispiel können die Methoden, die hier beschrieben werden, und die die Kupplungswege unreißen zum Binden von biologischen Funktionen direkt an einen Polymerträger, verwendet werden.

Geeignete Beispiele von Spacern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wo die reaktiven funktionellen Gruppen gleich sind, schließen z. B. ein: 1,6-Diaminohexan, Glutaraldehyd, 1,4-Cyclohexan-dicarbonsäure, Ethylendiamin-tetraessigsäure, Triethylenglykol, 1,4-Butandioldiglycidylether, Methylen-p-phenyldiisocyanat und Süccinsäureanhydrid. Beispiele von Spacern, in denen die reaktiven funktionellen Gruppen nicht gleich sind, schließen z. B. ein: 6-Aminocapronsäure, p-Nitrobenzoylchlorid, 1,2-Epoxy-3-(p-nitrophenoxy)-propan, Aminopropyltriethoxy-silan und Homocystein-thiolacton.

Auch Polypeptide und Proteine können als Spacer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Albumin, ein Protein mit geringer Affinität, wurde z. B. erfolgreich angewendet als Spacer. Zusätzlich dienen Albumin und andere natürliche Proteine dazu den Polymerträger mehr biokompatibel zu machen.

Schließlich wird verstanden, daß bestimmte Materialien gleichzeitig als Spacer und als Aktivator in der Reaktion, die verwendet wird um den Spacer und den biokompatiblen Träger zu verbinden, dienen. Beispiele von dieser Art von Verbindungen schließen z. B. ein: Glutaraldehyd und 1 ,,4-Butandioldiglycidylether.

Die meisten, wenn nicht alle der geeigneten biokompatiblen Polymerträger haben eine sehr geringe mechanische Stabilität. Die meisten dieser Materialien sind in der Tat Gele oder gelähnlich im Gegensatz zu Materialien mit hoher mechanischer Stabilität wie z. B. Polypropylenfolien. Deshalb ist in den meisten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein mechanisch stabiler Trägerteil notwendig. Dieser Trägerteil erlaubt, daß große Oberflächenteile verwendet werden können, um ein schnelle sowohl medizinisch als auch kommerziell akzeptable Entfernung von mit Immunkrankheiten zusammenhängenden Komponenten zu sichern. Der Trägerteil sollte, außer daß er mechanisch stabil ist, auch nicht teuer sein und muß sterilisierbar sein, um ihn kompatibel zu machen für den Gebrauch in einem System, worin das Blut eines erkrankten Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden muß. Beispiele von Materialien, die geeignet sind für die vorliegende Erfindung als Trägerteile schließen z. B. ein: Filterpapier,

23.2*1984

AP A 61 K/253 899/0 « 19 « 62 829/18

Polyesterfaser, Polycarbonate, netzartige Polyurethane* NORYL , ein Polyphenyloxidpolymer, mikroporöse Polyolefine wie Polypropylen und Baumwollgewebe*

Viele Methoden zum Binden des aktivierten oder biokompatiblen Polymerträgers, der biologische Funktionen chemisch gebunden hat, können verwendet werden; so z* B, Methoden wie Drehbeschichtung (spin coating), horizontales Gießen, Vakuumimprägnierung, Tauchbeschichtung, Tauchbeschichtung mit späterer Vernetzung und Lösungscopolymerisation. Spezielle Beispiele dieser Verfahren können in den unten beschriebenen Beispielen gefunden werden»

Allgemein gefaßt umfaßt die hier betrachtete therapeutische Aft und Weise der vorliegenden Erfindung für die therapeutic . sehe Behandlung von Autoimmunkrankheiten und anderen Krankheiten, daß Blut oder Plasma eines erkrankten Patienten einem biospezifischen Polymer mit immobilisierten reaktiven biolo~ gischen Funktionen aussetzt, wobei spezifische pathologische Effektoren entfernt werden aus dem Blut oder Plasma des Patienten und daß dieses Blut dann in den Patienten zurückgeführt wird. Diese therapeutische Behandlung kann oder kann nicht den Gebrauch von Bluttrennungstechniken erfordern» Deshalb wird beabsichtigt, die Behandlung in einer Weise durchzuführen, die ähnlich ist der Dialysebehandlung mit dem Vorteil, daß die gesamte Bluttrennung unnötig sein kann und daß sehr wenig wenn überhaupt physikalische Schädigung der normalen Blutkomponenten auftritt.

Es ist natürlich auch möglich, die vorliegende Erfindung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Plasma zu verwenden. Das Plasma kann erhalten werden aus dem gesamten Blut durch jede der derzeit bekannten und durchgeführten Methoden. Deshalb kann z. B. das Plasma vom Blut eines Patienten getrennt werden durch bekannte Methoden, dann behandelt werden gemäß der vorliegenden Erfindung und dann mit den anderen Blutkomponenten rekombiniert werden und in den Patienten zurückgeführt werden unter Verwendung derzeit bekannter Verfahrensweisen. Zusätzlich kann Plasma, das in bekannten medizinischen Behandlungen verwendet wird, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden um das Plasma zu behandeln bevor es einem Patienten, der Plasma braucht von einer Blutbank z. B., verabreicht wird. -Natürlich kann das gesamte Blut einer Blutbank auch -behandelt werden gemäß der vorliegenden Erfindung.

Es ist auch zu verstehen, daß die vorliegende Erfindung ebenso verwendet werden kann mit anderen Körperflüssigkeiten um die Entfernung pathologischer Effektoren zu bewirken.

Wegen der Vorteile der vorliegenden Erfindung, ebenso derer die oben angeführt, werden als auch anderer, die dem Fachmann bekannt sind, wird angenommen, daß viele Arten von Krankheitszuständen auf die vorliegende Erfindung, bei Verwendung in therapeutischer Art und Weise, ansprechen. Allgemein gesprochen könnten sechs Gruppen von Krankheitszuständen vorteilhafterweise behandelt werden. Diese sechs Krankheitskategorien sind Störungen von Immunkomponenten, Drogenexzesse, Giftaufnahme, Ungleichgewichte von Körpersubstanzen, Infektionen und neoplastische Zustände. Viele Krankheiten werden gegenwärtig behandelt unter Verwendung von

Plasmapheresis und Cytopheresis, wobei das gewünschte Resultat die Entfernung einer spezifischen Substanz ist. Die vorliegende Erfindung und das Verfahren der Erfindung kämen für die Krankheiten, die derzeit durch Plasmapheresis und Cytopheresis behandelt werden in frage.

Beispiele von Immunkomplexkrankheiten, die behandelt werden können, sind z. B. jeder Krankheitszustand, der Antikörper, Antigen, Antikörper-Antigen, Antigen-Antigen und Antikörper-Antikörper-Wechselwirkungen, Zelloberflächenkomplexe, Cytoplasmakomplexe etc. hervorruft.

Beispiele von Drogenüberdosen, die behandelt werden können, sind z.B. Uberdosen von Eisen, Dioxin, Aspirin, Tylenol, Methotrexat und andere Tricyclen.

Beispiele von Giften und Toxinen, für die die vorliegende Erfindung geeignet ist, sind ζ. B. Blei, Aluminium, Pilze (Anatoxin) und organische Phosphate.

Körpersubstanzen, die im Überschuß vorhanden sind, können zur Erkrankung führen. Beispiele dieser Substanzen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung entfernt werden können, schließen z. B. ein: Cholesterin, Harnsäure, Immunoglobuline, Sichelzellen, uremische Toxine, Bilirubin, Porphyrin, Cortison und Prostaglandine.

Einige Beispiele von infektiösen Mitteln, die behandelt werden können, sind z. B. virale Störungen wie Cytomegalovirus; Protozoenstörungen wie Malaria, Trypanosomen und Leishmania; bakterielle Infektionen wie Streptococcen,

Pilzinfektionen wie Tinea versicolor, Mykoplasmen wie Pleuro-pneumonia-ähnliche Organismen; Rickettsien, Krankheiten wie Typhus und Fleckfieber; Spirochäten wie Syphilis und Chlamydia in der Psittacosis-Lympho-granulotrachoma Krankheitsgruppe.

Neoplasmen, die behandelt werden können unter Verwendung der vorliegenden Erfindung, schließen z. B. ein Lymphome, Sarcome, Carcinome und Leukämien. Diese können durch die spezifische Entfernung einer Zellinie, von Inhibitoren, Initiatoren der Krankheit und Kombinationen entfernt werden.

Weitere Beispiele von Krankheitszuständen, die behandeltwerden können unter Verwendung der vorliegenden Erfindung, schließen z. B. folgende ein:

Infektionen wie Poststreptococcale Glomerulonephritis, Subakute bakterielle Endocarditis, Sekundäre Syphilis, Pneumococcale Sepsis, Lepomatöse Lepra, Ventriculäre Shunt Infektion, Infektiöse Mononukleosis, Typhoides Fieber, Subakute sclerosierende Encephalitis, Landry-Guillain-Barre-Syndrom, Hepatitis-B-Infektion, Quartanmalaria, Schistosomiasis und Trypanosomiasis.

Neoplasmen wie Hepatom, Lymphom und Hodgkinskrankheit, akute Leukämie, Hypernephrom, Coloncarcinom, Bronchogenes Carcinom und Burkitts Lymphom.

Bindegewebstörungen wie Periarteritis nodosa, chronische Glomerulonephritis, akute oder subakute Thyroiditis, Vinylchloridvergxftung, chronische Lebererkrankung, gemischte Cryoglobulinämie, Berger's Krankheit oder IgA Nierenleiden, schnell fortschreitende Glomerulonephritis und Sichelzellenanämie.

Hämatologische Krankheiten wie thrombische thrombocytopenische Purpura, autoimmune hämolytische Anämie, idiopatische thrombocytopenische Purpura, idiopatische Neutropenie, Kaltehemmerglutininkrankheit, paroxysmale Kältehämoglobinurie, zirkulierende Antikoagulanzien, erworbene Hämophilie, die Leukämiearten, Lymphome, Erythroblastosis fetalis, perniziöse Anämie und Rh Erkrankungen.

Neurologische Krankheiten wie akute demyelinierende Encephalitis, Multiple Sklerose, Landry Paralyse, Guillain-Barre-Syndrom, periphere Neuritis und Myasthenia gravis.

Kollagenerkrankungen wie Raynaud's, Lupus Erythematösus, Polyarteritis nodosa, Scleroderma, Dermatomyositis, Sjogren Syndrom, rheumatoide Arthritis, rheumatisches Fieber und Erythema nodosa.

Endokrine Krankheiten wie z. B. Cushing's Syndrom und Cushing's Krankheit, Thyroiditis, Thyrotoxicosis, Addison's Krankheit und Aspermatogenesis.

Gastrointestinale Erkrankungen wie Portalzirrhose, akute Hepatitis, chronisch aktive Hepatitis, lupoide Hepatitis, billiäre Zirrhose, Ulcerative colitis-, regionale Enteritis und Pancreatitis.

Mannigfaltige Krankheiten wie z. B-. Hypercholesterinemie, Glomerulonephritis, Basalmembrankrankheiten, psychogene Zustände - Drogen, Postaortaklappen-Prothesen - hämolytische Anämie, exfoliative Dermatitis, Id-Reaktion, Psoriasis, Behcet's Syndrom, Carcinome, subakute bakterielle Endocarditis, Hypertension, Asthma, erbliche angioneurotische Ödeme, Meningococcemia, Crohn Krankheit, hepatitische Encephalopathie und Raynaud Krankheit.

Weiterhin Krankheiten, die charakterisiert sind durch Antikörper gegen Nuklearantigene, cytoplasmische Antigene, Zelloberflächenantigene und Unterklassen können durch die vorliegende Erfindung behandelt werden. Geeignete Beispiele schließen z. B. ein: Antikörper gegen native DNA (Doppelstrang) oder Einzel- und Doppelstrang, Antikörper gegen SS-DNA, Antikörper gegen Desoxyribonukleoprotein, Antikörper gegen Histone, Antikörper gegen Sm, Antikörper gegen RNP, Antikörper gegen Sc 1-1 - Scleroderma, Antikörper gegen SS-A Sjogrensyndrom, Siccakomplex, Antikörper gegen RAP rheumatoide Arthritis, Sjogrensyndrom, Antikörper gegen PM-I - Polymyositis-dermatomyositis und Antikörper gegen nukleoläre systemische Sclerosis, Sjogren Syndrom.

Auch Antikörper, die mit spezifischen autoimmunen Störungen verbunden sind wie Antikörper gegen glatte Muskeln - chronische Hepatitis, Antikörper gegen Acetylcholinrezeptoren - Myasthenia gravis, Antikörper gegen Basalmembran an der Dermal-epidermalen Verbindung

- Bullus pemphigus, Antikörper gegen Mucopolysaccharid-Proteinkomplex oder intracelluläre Bindemittelsubstanz

- Pemphigus, Antikörper gegen Immunoglobuline rheumatoide Arthritis, Antikörper gegen glomeroläre Basalmembran - Glomerulonephritis, Goodpasture's Syndrom, idiopathische primäre Hemasiderosis, Antikörper gegen Erythrocyten - autoimmune hämolytische Anämie, Antikörper gegen die Schilddrüse - Hashimoto, Antikörper gegen den Intrinsicfaktor - perniziöse Anämie, Antikörper gegen Plutplättchen - idiopathische thrombocytopenische Purpura, Alloimmunisierung, Antikörper gegen Mitochondrien - primäre biliäre Zirrhose, Antikörper gegen Speichelgangzellen - Sjogren's Syndrom,

Antikörper gegen die Nebenniere - iodiopathische adrenale Atropathie, Antikörper gegen Schilddrüsenmikrosomen - Grave's Krankheit, Antikörper gegen Thyroglobulin - Addison-Krankheit und Antikörper gegen Inselzellen Diabetes Mellitus.

Paraproteinemien wie zum Beispiel multiple Myelome, Makroglobelinemie, Cryoglobulinemie und L-Kettenkrankheit.

Hyperlipidemien wie primäre biliäre Zirrhose und familiäre Hypercholesterolemie.

Endokrinopathien wie Grave-Krankheit und Diabetes mellitus.

Alloimmunisierung wie die hämolytische Krankheit der Neugeborenen und renale Homotransplantat-Abstoßung.

Weiterhin sind für die Behandlung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung geeignet z. B. Posttransfusions-Purpura und Autoantxkörperkrankheiten wie Goodpasture Syndrom, Myasthenia gravis, Pemphigus vulgaris, hämatologische Krankheiten, idiopathische (autoimmune) thrombocytopenische Purpura, autoimmune hämolytische Anämie, Inhibitor gegen Faktor VIII, und Polyradiculopathie/ Guillain-Barre-Syndrom.

Immunkomplexkrankheiten können auch behandelt werden und schließen ein: z. B. systemischen Lupus Erythematosus, Polyarteritis nodosa, Cutanöse Vaskulitis, rheumatische Arthritis, Glomerulonephritis und Dermatomyositis.

Während man nicht einer einzelnen Theorie Vorrang gegenüber einer anderen einräumen kann, zeigt ein Rückblick über den wahrscheinlichen Verlauf von Autoimmunkrankheitsbildern, daß die pathologische Folge sehr wahrscheinlich ausgelöst wird durch Ablehnung eines freien Antigens, gefolgt von einer Antikörperentwicklung und wird ergänzt und beendet durch Antikörperüberschuß und Komplementfixierung gebildeter Komplexe. Deshalb wären für eine richtige Selektion der biospezifischen Polymerförmulierung und Vorkehrung für richtige Wirksamkeit vorläufige diagnostische Verfahren notwendig um die prädominante Form des autoimmunen Effektors zu bestimmen. Eis anschauliches Beispiel dafür ist unten beschrieben für die Behandlung von rheumatoiden Krankheiten. Kurz können rheumatoide Krankheiten charakterisiert werden als dem Verlauf folgend von

a) freies RF-Antigen (atypisches Ig) (rheumatische Bedingung) ,

b) freie RF-Antikörperbildung und RF-Komplexierung und schließlich

c) Antikörperüberschuß und Komplement-aktivierte RF-Komplexfixierung.

Deshalb könnte die Behandlung von rheumatoiden Krankheiten in ihrem frühen Stadium bestimmt werden durch den Nachweis von atypischen Immunoglobulinen durch monoklonale Rheumatoidfaktor-(m-RF)-Antikörper. Eine Behandlung in diesem Stadium würde am wirksamsten durch m-RF-aktivierte biospezifische Polymere durchgeführt, um das anregende Antigen zu entfernen und dadurch die Entwicklung endogener RF-(e-RF)-Antikörper zu verhindern, Der diagnostische Nachweis von e-RF würde die Verwendung von biospezifischen Polymeren anzeigen, die sowohl m-RF als auch an Gammaglobulin gebundene biologische Funk-

tionen (RF-Antigen) haben. Alternativ könnten zwei biospezifische Polymere in Serie verwendet werden, wobei jedes eine Art von aktiver biologischer Funktion trägt. Im einen Fall würde diese Kombination von m-RF und gebundenem Gammaglobulin das anregende Antigen und die Antikörpermoleküle adsorbieren um das Fortschreiten der Krankheit zu unterbinden. In dem Fall, wo signifikante Werte von RF-Antigen-Antikörper-Komplexen entdeckt werden, würden biospezifische Polymere, die CIq und/oder Collagen-Effektor-Moleküle enthalten, erforderlich. Schließlich würde, wenn der Krankheitsprozeß bis zu dem Stadium der Komplementfixierung geformter Imunkomplexe fortgeschritten ist, ein effektives biospezifisches Polymer ein oder mehrere Antikomplement-Antikörper enthalten wie z. B. Anti-Clq, Anti-C, oder Anti-C.. Die biologischen Funktionen können, wenn mehr als eine erwünscht, ist, wieder immobilisiert werden an einem einzigen biokompatiblen Träger oder jedes kann an einem separaten Träger sein und in Bezug auf den Blut- oder Plasmafluß in Serie verbunden sein.

Wie oben vorgeschlagen wurde, wird der effektive Gebrauch der vorliegenden Erfindung realisiert durch sorgfältige Definition der Dynamik und des Stadiums der Immunantwort für eine effektive Krankheitsbeeinflussung.

Heute sind Plasmapherese und Cytophorese die Behandlungen für Krankheiten durch Entfernung von schädlichen Substanzen oder Zellen aus dem Blut. Es wird gegenwärtig angenommen, daß jede Krankheit, die durch Plasmapherese und/oder Cytopherese behandelt wurde, wo das gewünschte Resultat die Entfernung einer spezifischen Substanz ist, vorteilhaft mit dem Produkt und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden kann.

Noch spezifischer kann eine derzeit erwogene therapeutische Maßnahme für das gesamte Blut wie folgt ausgeführt werden:

•a) ' Es wird ein Gefäßzugang vorgesehen, der geeignet ist für

b) einen Blutfluß von etwa 30 ml/min bis etwa 200 ml/min, -

c) es wird ein Antikoagulans in das Blut verabreicht und

d) es wird eine Pumpe bereitgestellt;

e) das Blut geleitet wird, mit Kontakt zu der vorliegenden Erfindung;

f) abhängig von dem verwendeten Antikoagulans kann eine zusätzliche Medikation notwendig oder erwünscht sein, um den antikoagulatorischen Effekt in dem so behandelten Blut zu neutralisieren;

g) das behandelte Blut wird in den Patienten zurückgeführt.

Die Dauer, die gegenwärtig erwogen wird für die obige Verfahrensweise, bewegt sich.annähernd in einem Rahmen von etwa 2 Stunden bis etwa 4 Stunden. Es ist natürlich berücksichtigt, daß abhängig von der Situation ein solcher zeitlicher Rahmen entweder gekürzt oder verlängert werden kann.

Eine gegenwärtig erwogene therapeutische Anwendungsweise für Plasma kann wie folgt geschildert werden:

a) ein Gefäßzugang wird geschaffen, der berechnet ist für

b) einen Blutfluß von etwa 30 ml/min bis etwa 200 ml/min,

c) ein Antikoagulans wird in das Blut verabreicht; und

d) eine Pumpe wird bereitgestellt;

e) Trennungsmittel für die Trennung von Plasma und gebildeter Blutkomponente werden bereitgestellt;

f) das Plasma wird gleitet, mit Kontakt zu der vorliegenden Erfindung;

g) Filtration durch ein 0,2 μπι Filter um jegliche Mikroembolie, Bakterien und/oder Pilze zu entfernen;

h) das behandelte Plasma und die gebildeten Blutkomponenten werden rekombiniert;

i) abhängig von dem verwendeten Antikoagulans kann eine zusätzliche Medikation notwendig oder gewünscht sein um den antikoagulierenden Effekt in dem behandelten Blut zu neutralisieren;

j) das behandelte Blut wird in den Patienten zurückgeführt. .

Der Gefäßzugang kann geschaffen werden.unter Verwendung "wohlbekannter Techniken und Verfahren in der medizinischen Technik. So kann z. B. eine innewohnende große Bohrkanüle intravenös oder arteriell verwendet werden. Beispiele von geeigneten Venen oder Arterien.schließen die Antikubitalvene, Subklaviavene und Brachial- oder Radialarterien ein. Es ist weiterhin zu verstehen, daß ein arteriell-venöser Shunt oder Fistulae (AV Shunt) auch verwendet werden kann. In diesem Fall ist das Herz die Pumpe. Wenn nicht ein AV Shunt oder Fistulae verwendet wird, ist die bevorzugte Pumpe während des venösen Zugangs eine Förderperistalikpumpe, die geeignet ist, eine Durchflußrate von etwa 30 ml/min bis etwa 200 ml/min zu schaffen.

Geeignete Antikoagulantien, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen z. B. ein: saure Zitratdextrose (annähernd 1 ml je 8 ml des gesamten Blutes), Heparin, Heparin/saure Zitratdextrosemischungen (z. B. 1250 IU Heparin in 125 ml saurer

23,2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 30 - 62 829/18

Zitratdextrose/L), und Prostaglandin. Es wird allgemein verstanden, daß bei Verwendung von Antikoagulantien wie Heparin und Prostaglandin, dem behandelten Blut oder Plasma eine ent" gegengesetzte Medikation verabreicht werden sollte» bevor es zurückgeführt wird oder bevor dieses Blut oder Plasma einem Patienten gegeben wird.

Weiterhin wird verstanden, im Fall der Behandlung von Plasma, · daß jede konventionelle Methode des Entfernens gebildeter Blut komponenten benutzt werden kann. Geeignete Beispiele von Verfahren zur Trennung von Plasma von gebildeten Blut komponenten schließen ein: Plasmapherese, zentrifugale Zelltrennung und Zellsedimentation in einem Plasmasack, IVo es möglich ist, sind sowohl kontinuierliche Trennung als auch diskontinuierliche Trennung geeignet - die vorher erwähnten Methoden zur Trennung sind unabhängig von der vorliegenden Erfindung und ihrer Verwendung.

Schließlich ist die Form der vorliegendenErf indung im allgemeinen nicht kritisch. Deshalb kann die vorliegende Erfindung verwendet werden als biokompatibler Träger, der beispielsweise die biologische Funktion in Form von Folien, Hohlfasern, zylindrischen Fasern, netzförmigem Netzwerk, zylindrischen oder rechteckigen Kanälen, Kugeln und Kombinationen davon enthält» Der Gebrauch eines Fließbettes kann in manchen Fällen auch vorteilhaft sein.

Ausführunqsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert-

23,2_#1984

AP A (61 K/253 899/0 ~ 31 ~ 62 829/18

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Gießen des biokompatiblen Polymerträgers und ein Verfahren zum chemischen Anhängen einer biologischen Funktion direkt an den Polymerträger. Dieses Beispiel wird auch benutzt, um die Verwendung eines Systems zu beschreiben, das mit keinem mechanischen Träger verbunden ist*

Absorption von Antiinsulin-Ant!körpern unter Verwendung von Insulin-aktivierter Polyhydroxyethylmethacrylat: (p~HEMA)-.Membran:

A) Polymergießen:

Lösungen des Monomers werden hergestellt durch Vermischen von 15,0 g 2-Hydroxyethylmethacrylat, 15,0 g Ethylenglykol, 0,08 g Natriumbisulfit und 0,036 g Ammoniumpersulfat. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Annähernd 5 ml der Lösung wurden auf eine Glasplatte (127 mm 1 χ 127 mm w χ 9,5 mm) (5" 1 x 5" w χ 3/8"t) gegeben in der Mitte eines Polyethylen-Zwischenstückes (0,5 mm dick), das so geschnitten ist, daß es einen Dichtring mit einem Fenster 102 mm χ 102 mm bildet. Eine zweite Glasplatte wurde über die Dichtung und die Lösung gegeben, an Ort und Stelle festgeklemmt und der ganze Aufbau bei 60 ⁰C über Nacht inkubiert. Die Klammern wurden entfernt, und die Glasplatten wurden leicht auseinandergespreizt und in ein Bad mit deionisiertem Wasser für mindestens 24 Stunden gebracht. Die gequollene Polymermembran wurde

23,2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 32 - 62 829/18

sorgfältig von den Glasplatten entfernt und wurde gespült «- gewässert für mindestens drei Tage in frisch ausgetauscht tem deionisiertem Wasser (500 ml pro Tag),

B) Polymeraktivierung:

Membranscheiben (5 mm Durchmesser) wurden aus der Polymer-'folie zur Aktivierung und Analyse geschnitten. Eine 10 bis 20 g/% Bromcyanlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 1,69 g feinverteilten BrCN-Kristallen in 10 ml 0,2 M Na₁₃CO (pH 11;1) mit kontinuierlichem Rühren bei 4 ⁰C. Der pH der Lösung wurde bei über 11 gehalten durch tropfenweise Zugabe von 5 N NaOH, bis die Kristalle gelöst waren und der pH stabilisiert war. Vier Membranscheiben wurden in ein kleines Sieb gegeben und mit annähernd 5 ml 0,1 N HCl gespült und 15 Minuten in die Bromcyanlösung inkubiert. Die Scheiben wurden jeweils mindestens zwei weitere Male mit 5 ml Teilen 0,1 N HCl gespült und über Nacht in 5,0 ml

U/100 regulat ILETIN Insulin-Injektionslösung inkubiert, die auf einem pH von 8,7 eingestellt war durch Zugabe von 1 N NaOH, Die Membranscheiben wurden gespült mit 5 ml 0,5 M NaCl, 0,1 M Na₂CO -Lösung und 3mal in 5 ml Teilen Phosphat-(0,05 M) gepufferter Kochsalzlösung (0,9 g%) (pH = 7,4),

G) Auswertung der Membranadsorption von Antiinsulin-^Antikörper

Ein doppelt Antikörper kompetitiv bindender Radioimmunoassay wurde durchgeführt durch Inkubieren von 560 picogram

125 I markiertem Schweineinsulin und Reihenverdünnungen

23.2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 33 - 62 829/18

(980 bis 15 pg) von nicht markiertem Schvveineinsulin oder p.-HEMA-Membranscheiben mit 280 pg Meerschwein-Antischwein« insulin-Antikörper in 0,5 ml Phosphat~(0,,05 M) gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) (0,9 g%) enthaltend 1 g%"Rinderserumalbumin für zwei Stunden bei Raumtemperatur, Die p-HEMA-Scheiben wurden entfernt aus jeder Testlösung, Ein 0,1 ml Anteil von Ziegen-Antimeerschwein-Gammaglobulin wurde zu jedem Test röhrchen dazugegeben. Die Testlösungen wurden gemischt und für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Ein 1,0 ml Anteil von kalter (2 bis 4 C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, Jede Testlösung wurde gemischt und zentrifugiert 15 Minuten bei 4 ⁰C bei 7500 G, und der Oberstand wurde in 20 ml Szintillationsfläschchen dekan-? tiert. Der Überstand wurde geliert mit 5,0 ml Aquasol flüssig als Szintillationsflüssigkeit und in einem Isocap 300 Counter 4 Minuten ausgezählt. Insulinbehandelte Membranscheiben adsorbierten 111 pg Antiinsulin-Antikörper

2 aus der Lösung oder 690 pg pro cm Oberfläche,

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt, wie eine biospezifische Membran ohne Träger hergestellt werden kann. Es beschreibt auch,, wie eine 6-Aminocapronsäure (mit einer Kette aus 6 Kohlenstoffe atomen) als Spacer verwendet werden kann, um Insulin an den biokompatiblen Polymerträger anzuhängen, der verwendet wird, um den Insulinantikörper zu entfernen und zur Adsorption von Antiinsulin«-Antikörper unter Verwendung der Insulin*-aktivierten Polyhydroxyethylmethacrylat-Membran (p-HEMA),

23.2,1984

AP A 61 K/253 899/0 ~ 34 ~ 62 829/18

A) Polymergießen

Lösungen der Monomere wurden hergestellt durch Mischen von 15,0 g 2~Hydroxyethyl«Methacrylat (Polysciences Ine*, Warrington, PA) mit 15,0 g Ethylenglykol, 0,08 g Natriumbisulfit und 0,036 g Ammoniumpersulfat, Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Annähernd 5mal der Lösung wurden auf eine Glasplatte (127 mm χ 127 mm x 9,5 mm) gegeben in der Mitte eines Polyethylen<-Zwischenstücks (0,25 mm dick), das so geschnitten war,, daß es einen Dich*« tungsring mit einem Fenster 102 mm χ 102 mm bildete· Eine zweite Glasplatte wurde über den Dichtungsring und die Lösung gegeben, an Ort und Stelle festgeklemmt, und der gesamte Aufbau wurde bei 60 ⁰C über Nacht inkubiert» Die Klemmen wurden entfernt, und die Glasplatten wurden leicht auseinandergespreizt und in ein Bad mit deionisiertem Was« ser befördert für mindestens 24 Stunden, Die gequollene Polymermembran wurde sorgfältig entfernt von den Glasplatten und wurde gespült - gewässert für mindestens drei Tage in frisch ausgetauschtem deionisiertem Wasser (50C ml) pro Tag),

B) Polymeraktivierung

Membranscheiben wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben» Eine 10 bis 20 g% Bromcyanlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 1,69 g feinverteilten Bromcyankristallen in 10 ml 0,2 M Na₂CO (pH 11,1) durch kontinuierliches Rühren bei 4 C. Der pH der Lösung wurde bei über 11 gehalten durch tropfenweise Zugabe von 5 N NaOH,

23,2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 35 - 62 829/18

bis die Kristalle aufgelöst waren und der pH stabilisiert war» Vier Membranscheiben wurden in ein kleines Sieb gebracht und gespült mit annähernd 5 ml 0,1 N HCl und 15 min in die Bromcyanlösung inkubiert. Die Scheiben wurden jeweils mindestens zwei weitere Male gespült mit 5 ml Anteilen 0,1 N HCl und über Nacht inkubiert in 10 ml einer 10 g% 6-Aminocapronsäurelösung (w/v), hergestellt in 0_tl M Na₂CO , 0,5 M NaCl Pufferlösung, pH 8,6. Die Membran* scheiben wurden gespült mit 5 ml O₁I M Na₂CO , 0,5 M NaCl Puffer und mit drei 5 ml-Anteilen Phosphat-gepufferter (0,05 M) (pH = 7,4) Kochsalzlösung (0,9 g%)₀ Die Membranscheiben wurden aus der Spüllösung entfernt, aktiviert durch Inkubation in 10 ml einer 10%igen (w/v) 1-Cyclohexal-3-(2~Morpholinoethyl)<-Carbodiimid~Lösung hergestellt in 0,1 M (2-N^morpholilino-ethansulfonsäure) (MES) Puffer (pH 6,0) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, und jede Scheibe wurde in 5 ml ka! salzlösung gespült.

be wurde in 5 ml kalter (4 ⁰C) Phosphat-gepufferter Koch=?

Membranscheiben wurden in zweifacher Ausfertigung über Nacht in 5 ml entweder U-IOO regular ILETIN Insulininjek~ tionslösung oder Schweineinsulin regular ILETIN Lösung bei 4 ⁰C inkubiert_# Die Membranscheiben wurden entfernt aus den Proteinlösungen und dreimal gespült in 5 ml Phosphat« gepufferter Kochsalzlösung,

C) Auswertung der Membranadsorption von Antiinsulin-Antikörper

Ein doppelt Antikörper kompetitiv bindender Radioimmuoassay

23*2.1984

AP A 61 K/253 899/0 -36« 62 829/18

125

wurde durchgeführt durch Inkubieren von 560 pg I markiertem Schvveineinsulin und Reihenverdünnungen (980 bis. 15 pg) von nicht markiertem Schweine-Insulin oder p-HEMA-Membranscheiben mit 280 pg Meerschwein-Antischweininsulin— Antikörper in 0,5 ml Phosphat-(0,05 M) gepufferter (pH 7,4) Kochsalzlösung (0,9 g%), die 1 g% Rinderserumalbumin enthielt, für zwei Stunden bei Raumtemperatur» Die p-HEMA-Scheiben wurden entfernt aus jeder Testlösung* Ein 0,1 ml Anteil von Ziegen-AntimeerschweinwGammai-Globulin wurde zu jedem Teströhrchen dazugegeben. Die Testlösungen wurden gemischt und inkubiert für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur. Ein 1,0 ml Anteil kalter (2 bis 4 ⁰C) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) wurde zu jedem Röhrchen dazugegeben. Oede Testlösung wurde gemischt und zentrifugiert 15 min bei 4 ⁰C bei 7500 G, und der Überstand wurde in 20 ml Szintillationsfläschchen abdekantiert. Der Überstand wurde geliert mit 5,0 ml Aquasol flüssiger Szintillationsflüssigkeit und in einem Isocap 300 Counter 4 Minuten lang ausgezählt» Insulin-behandelte Membranscheiben adsorbierten 271 pg Antiinsulin-Antikörper aus Lösung oder 690 pg pro cm Oberfläche,

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Gießen der kompatiblen Polymertrager sowohl mit als auch ohne mechanischen Träger durch Drehgießen» Es wird außerdem ein zweiter Weg der chemischen Bindung der biologischen Funktion an den

23.2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 37 - 62 829/18

biokompatiblen Polymerträger beschrieben»

Adsorption von Anti-Human-Immunoglobulin G (IgG) Antikörper (rheumatoider Typ "FACTORS") unter Verwendung von Immuno" globulin-aktivierten Polyhydroxyethylraethacrylat-Co-Glycidylmethacrylat (p-HEGL) Membranen:

I, Polymergießen

Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung von sowohl gestützten als auch ungestützten Polymermembranen durch Drehgußtechniken»

A) D'rehgußvorrichtungen

Die Drehgußvorrichtung besteht aus einem geschlossenen Aluminiumzylinder mit 6 mm dicken Wänden. Die inneren Dimensionen des Zylinders sind 10 cm im Durchmesser und 13 cm in der Länge. Der Zylinder ist verbunden mit einem Mofor, der den Zylinder dreht, und der Zylinder rpm wird gemessen mit einem Strobe-Fototachometer (Modell 1891M, Eine Hitzeabblasepistole erhitzt den sich drehenden Zylinder, thermoelektrische Elemente messen die interne Zylindertemperatur und die Temperatur der Luft, die aus dem Zylinder fließt. Der Zylinder wird gereinigt mit Stickstoff vor und während der Polymerisation,

B) Herstellung der Trägermembran

Whatman Grade 50 gehärtetes Filterpapier wurde verwendet

23.2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - 38 - 62 829/18

als Rückabstützung, um den Drehgießlingen mechanische Festigkeit zu verleihen. Das Papier wurde in rechteckige Blätter (101 mm bis 24 mm χ 30 mm bis 11 mm) geschnitten und dann in Ethylenglykol (EG) 30 Minuten bei Raumtempera«· tür eingeweicht. Per Überschuß an Glykol wurde von dem Papier ablaufen gelassen, nach dem Ablaufenlassen

23.2.1984

AP A 61 K/253 899/0 - 39 ~ 62 829/18

Das Gebläse (ca. 35 ft /min) und die Heizvorrichtung auf dem Heizgebläse wurden gestartet, und der Zylinder wurde auf 70 bis 75 ⁰C 90 Minuten lang erhitzt. Die Hitze wurde dann unterbrochen, aber das Gebläse wurde in Betrieb gelassen, um den Zylinder zu kühlen, bis die innere Zylindertemperatur auf etwa 30 C abgesunken war. Der kalte Zylinder wurde aus dem Drehguß-Apparat entfernt und mit deionisiertem Wasser gefüllt« Nach einstündigem Einweichen wurde das Gegossene von dem Zylinder entfernt,

II. Polymeraktivierung

Membranscheiben wurden hergestellt wie oben in Beispiel 1 beschrieben» 14 verschiedene Scheiben wurden jeweils inkubiert in 1,0 ml 1,0 M Hexandiamin-Lösung 72 Stunden bei 4 C. Die Scheiben wurden aus der Hexandiamin«Lösung entfernt und dreimal mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen« Eine 4,0 g% Human«Gamma-Globulin (HGG)-Lösung wurde hergestellt durch Auflösen von 4,0 g HGG in. 100 ml 0,1 M MES Pufferlösung (pH 6,0) unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur» Nachdem das Protein völlig aufgelöst war, wurden Reihenverdünnungen hergestellt durch fortlaufende Übertragungen von 1,0 ml Proteinlösung zu 9,0 ml MES-Lösung, um Proteinkonzentrationen von 4 mg/ml, 400 jjg/ml, 40 ^ig/ml und 4 ug/rnl Puffer zu erhalten. Zwei verschiedene Polymerscheiben wurden jeweils inkubiert in 0,5 ml der Proteinlösungen und 0,5 ml einer 0,25 M l-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid (Sigma Chemical Co.) Lösung hergestellt in MES Puffer 72 Stun-

23.2,1984

AP A 61 K/253 899/0 - /Z - k-0 — 62 829/18

den bei 4 ⁰C_- Gede Membranscheibe wurde aus der Proteinlösung entfernt und dreimal mit 2 ml kalter (4 C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült.

III, Auswertung der Membranadsorption von Anti^IqG-»Anti~ körper aus physiologischen Lösungen

Ein Radioimmunassay wurde durchgeführt durch Inkubieren

125

von einzelnen Membranscheiben mit 10 ng I Ziegen-Antihuman IgG in 1,0 ml PBS, die 1,0 g% Humanserum-Albumin enthielt zwei Stunden bei Raumtemperatur, Die Radiotracer-Lösung wurde entfernt, und jede Membran wurde gespült dreimal mit 2,0 ml PBS Lösung, Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ⁰C in der letzten Spüllö— sung inkubiert. Einzelne Membrane wurdenaus den Spüllösungen entfernt und in einem Innotron—Hydragamma— Counter jeweils für eine Minute ausgezählt. Die Counts pro Minute wurden umgewandelt in Zerfälle pro Minute (DPM), durch Division mit der Detektonvirksamkeit, Die Menge an adsorbiertem Antikörper wurde angenähert durch Dividieren der durchschnittlichen DPM durch die .spezifische Aktivität des Radiotracers, Die folgenden Resultate wurden erhalten:

HGG Behandlung Adsorbiertes AntilgG

(mg/ml) (pg/cm )⁺

20,0 2453

2,0 1919

0,2 1271

0,02 664

0,002 ++

23,2.1984

AP A 61 K/253 899/0

62 829/18

⁺ Picogramm an Radiotracer-Material pro cm der Membran

Hintergrundaktivität

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Gebrauch von Aminocarbonsäure als Spacer für Gammaglobulin.

Adsorption von Antihuman-Immunoglobulin G-(IgG) Antikörpern (rheumatoider Typ "Factors") unter Verwendung von Immuno~ globulin-aktivierten Polyhydroxyethylmethacrylat-co-glycidylmethacrylat (p—HEGL) Membranen.

A) Polymergießen

Drehguß-p-HEGL Membranen.wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben»

B) Polymerderivatisierung und Aktivierung

Membranscheiben wurden hergestellt und behandelt, wie im Beispiel 2 beschrieben mit der Ausnahme, daß 1,0 M 6-Aminocarbonsäure für Hexandiamin ersetzt wurde als ein Derivatisierungs- und Spacer-Reagens*

C) Auswertung der Membranadsorption von Anti-IgG—Antikorper aus physiologischen Lösungen»

Ein Radioimmunoassay wurde durchgeführt, wie im Beispiel 3 beschrieben, und die folgenden Resultate wurden erhalten:

HGG Behandlung	adsorbiertes Anti-IgG
(mg/ml)	(pg cm2)*
20,0	2395 '
2,0	1828
0,2	1310
0,02	732
0,002	158

* Picogramm an Radiotracermaterial pro cm² Membran.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt den Gebrauch von Albumin (67,000 MW) als Spacer für Folat. Das Folat wird verwendet, um Folsäure bindendes Protein zu entfernen.

Adsorption von Folsäure bindenden Proteinen (FABP) durch Folat-Albumin aktivierte Polyhydroxyethyl-methacrylat-(p-HEMA) Membranen:

A) Polymergießen:

Filterpapier, verstärkt durch p-HEMA Polymermembranen, wurde drehgegossen wie beschrieben in Beispiel 2 unter Verwendung der folgenden Polymerformulierung :

15.0 g 2-Hydroxyethyl-Methacrylat

15,0 g Ethylenglykol

0,08 g Natriummetabisulfit

0,036 g Ammoniumpersulfat

23,2,1984

AP A 61 K/253 899/0

62 829/18

B) Polymerderivatisierung und -aktivierung

Ein Folsäure-Rinderserumalbumin^Komplex wurde durch Carbodiimid-Kondensation hergestellt von Folate-Carboxylgruppen mit Albumin-terminalen Aminogruppen* Um dies zu erreichen, wurden200 mg Folsäure in 8 ml 0,1 N NaOH gelöst und 400 mg 1-Cyclohexy1-3(2-Mo rpholinoethyl)-ca rbodiimid-Metho~ptoluolsulfonat wurden gelöst in 2,0 ml 0,1 M MES Puffer (pH 6,0), und 1,0 g Rinderserumalbumin (BSA) wurde gelöst in 40,-0 ml 0,1 M MES Puffer* Die Lösungen wurden vereint, gemischt und inkubiert für 72 Stunden bei 4 C, Nicht reagiertes Folat und Carbodiimid wurde aus der Lösung entfernt dadurch, daß 20 ml der Mischung mit 20 ml einer BSA (2,5 g%) ~ Kohle (1,25 g%)-Suspension 30 Minuten bei 4 ⁰C behandelt wurden« Die Suspension wurde 15 Minuten mit 3400 G bei 4 C zentrifugiert, dekantiert und durch ein 0,22 pm Filter gefiltert,

Membranscheiben wurden hergestellt und behandelt mit Bromcyanlösung wie vorher beschrieben im Beispiel 1» Nachdem die Scheiben in kalter Kochsalzlösung gespült waren, wurden Sätze von acht Scheiben zu 20 ml entweder physiologischer Kochsalzlösung, 160 mg% BSA oder der Folat-Albumin-Komplexlösung, die vorher hergestellt wurde, zugegeben und inkubiert. Die Scheiben wurden inkubiert 72 Stunden bei 4 C. CJeder Membransatz wurde aus der Lösung entfernt _t trockengelöscht und in 20 ml Kochsalzlösung bei 4 ⁰C gegeben zum Spülen für mindestens 24 Stunden, Doppelte Membranen wurden behandelt mit 8 ml 1 % Glutaraldehydlösung eine Minute und über Nacht in 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gespült»

23*2.1984

AB A 61 K/253 899/0

62 829/18

C) Auswertung der Membranadsorption von Folsäure*-bindendem Protein (FABP) aus physiologischer Lösung

Ein kompetitiver Proteine-bindender Radioassay wurde durchgeführt durch Inkubieren von 370 pg H~pteroylglutaminsäure (PGA) und Standardlösungen (48 bis 348 pg) nicht radioaktivem PGA oder p-HEMA Membranscheiben mit 234 pg bindender Aktivität an FABP (Kamen, B, A, und Caston, 0, D₄, "Direct Radiochemical Assay for Serum Folate: Competition between H^Folic Acid and 5-Methyl·- tetrahydrofolic Acid for a Folate Binder", 0, Lab* Clin, Med,, 83, 164, 1974) in 1,0 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,6), der 20 μΐ Folat-freies normales Humanserum und 5 mg Natriumascorbat enthielt. Die Radioassay-Röhrchen wurden gemischt, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten bei 4 C inkubiert. Einzelne Membranscheiber wurden aus den Testlösungen entfernt und 0,5 ml einer kalten (4 ⁰C) BSA (2,5 g%) Kohle-(1,25 g%)Suspension wurden zu jedem Röhrchen dazugegeben.

Alle Testlösungen wurden 10 Minuten bei 4 ⁰C inkubiert und zentrifugiert mit 2000 G 15 Minuten bei 4 ⁰C. Die Überstände wurden dekantiert in 20 ml Szintillationsfläschchen. 12 (12,0) ml flüssige Szintillationsflüssigkeit wurden zu jedem Fläschchen dazugegeben. Die Proben wurden in einem Isocap Counter 2 Minuten ausgezählt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

Membranbehandlung	adsorbiertes FABP
	(pg/cm2
Kochsalzlösung	67
Bromcyan	54
Rinderserumalbumin	39
Folat-BSA-Komplex	758

Die oben beschriebenen Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu erläutern, ohne sie einzuschränken.

Claims (15)

62 829 18 Erfindung sanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines biospezifischen Polymers mit immobilisierten reaktiven biologischen Punktionen, mit Reaktivität zur Bindung spezifischer pathologischer Effektoren oder spezifischer Gruppen von pathologischen Effektoren darauf, gekennzeichnet dadurch, daß es aus Behandeln eines biokompatiblen Polymerträgers mit einem Aktivierungsmittel und Binden einer biologischen Punktion mit mindestens einer funktioneilen Gruppe, die reaktiv ist gegenüber dem aktivierten biokompatiblen Polymerträger, wobei die Reaktion ausgeführt wird über einen Zeitraum, der ausreicht, um die biologischen Funktionen kovalent an den biokompatiblen Polymerträger zu binden und wobei die biologischen Funktionen eine Größe haben,so_: daß sie nicht in die Matrix des biokompatiblen Polymerträgers eindringen können, besteht.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zum Binden der biologischen Funktion einen Spacer, der eine mit dem aktivierten biokompatiblen Trägerpolymer reaktive Funktion aufweist, mit dem Trägerpolymer umsetzt, den Spacer am Trägerpolymer mit einem zv/eiten Aktivierungsmittel behandelt und dann die biologische Funktion daran immobilisiert.

3-(3-d:unethyl-aminopropyl)~carbodiimid oder 1-Cyclohexal-3-(2-morpliolinoethyl)-carbo"diimid·.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zum Binden der biologischen Funktion das biokompatible Trägerpolymer mit einem Spacer umsetzt, der spontan mit dem biokompatiblen Trägerpolymer bindet, den Spacer am Trägerpolymer mit einem Aktivierungsmittel behandelt und dann die biologische Funktion daran immobilisiert.

62 329 18

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Akt ivierungsmittel C]MBR ist.

5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Spacer ausgewählt ist aus der Gruppe 6-Aminocapronsäure oder Albumin.

6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das erste Alct ivierungsmittel GITBR ist.

7. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das zweite Alct ivierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid oder 1-Gyclohexal-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid.

8, Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Spacer 1,6-Diaminohexan ist.

9. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Aktivierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe 1-Ethyl-

10·, Verfahren nach Punkt 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Aktivierungsmittel und die biologischen Funktionen gleichzeitig mit dem Polymerträger-Spacer reagieren.

11. - Verfahren nach Punkt .1, 2 oder 3» gekennzeichnet dadurch,

daß der biokompatible Polymerträger ein Hydrogel ist.

12. Verfahren nach Punkt 1, 2, oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß der biokompatible Polymerträger das leicht vernetzte Homopolymer Hydroxyethy1-Methacrylat ist.

13. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß der biokompatible Polymerträger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus polymerisiertem Glycidylacrylat und polymerisiertem Glycidyl-Methacrylat.

14. Verfahren nach einem der Punkte 1,' 2 oder 3» gekennzeichnet dadurch, daß der biokompatible Polymerträger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus copolymerisiertem N-Viny!-Pyrrolidon und Glycidylmethacrylat, wobei das Copolymer weiterhin ein Monomer enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyalkylacrylaten und Hydroxyalkylmethacrylaten und Mischungen davon.,

15. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß der biospezifische Polymerträger an einen mechanisch stabilen Trägerteil gebunden ist.

16_O. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, gekennzeichnet da_ durch, daß die biologische Punktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Insulin, Gammaglobulin und Polat.