DD221844A1 - Verfahren zur durchfuehrung von enzym-immuno-assays - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchfuehrung von Enzym-Immuno-Assays. Sie hat das Ziel, die bisher verwendeten Leukofarbstoffe durch weniger gesundheitsschaedliche und weniger lichtempfindliche sowie einfacher herstellbare Farbstoffe zu ersetzen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als Leukofarbstoff 2-Brom-1-naphthol verwendet wird. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die biotechnologische und medizinische Diagnostik.

Description

Dr. F. Noll

Prof· Dr. E· Schmitz

0· Pagenkopf

^Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays, die geeignet sind, in der medizinischen und biotechnologischen Diagnostik angewendet werden zu können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Enzym-Immuno-Assays sind vor etwa IO Oahren in die Immunchemie eingeführt worden (E· Engvall, K. Oonsson and P. Perlmann, Biochem. Biophys. Acta 251, (1971), 427 - 434; E. _r Engvall and P· Perloann, 3· Immol. 109, (1972), 129 - 135) und sind seither so weit entwickelt worden, daß ihre Empfindlichkeit der von Radio-Immunb-Assays nahe kommt· Enzym-Immuno-Assays (EIA) sind für den Antikörpernachweis ebenso wie für die Bestimmung von Antigen einsetzbar· Grundsätzlich gibt es zwei Arten von EIA:

- Verwendung eines Enzymsubstrates, das nach Oxydation einen löslichen Farbstoff ergibt· Durch Absorptionsmessung ist eine quantitative Antigen (Ag)- bzw. Antikörper (Ak)-Bestimmung möglich«

- Verwendung eines Enzymsubstrates, das nach Oxydation einen unlöslichen Farbstoff ergibt· Dadurch ist eine Lokalisation der Lage von Ag oder Ak auf einem Träger (z, B. Nitrozellulose, Diazobenzyloxymethylzellulose oder histologische Präparate) möglich· Darüber hinaus ermöglicht die Farbintensität, des Fleckes - gemessen anhand einer Eichkurve - die Abschätzung der Konzentration des zu untersuchenden Antigens oder Antikörpers.

Diese Art des EIA hat gegenüber der anderen den großen Vorteil, daß weit weniger (/10 - /100) des meist sehr kostbaren Antigen-Materials benötigt wird«

Im einzelnen wird ein EIA z, B. für einen Ag-Nachweis in einer Lösung wie folgt durchgeführt:

!.Fixieren des dem Ag entsprechenden Ak an einen Träger, z« B. durch Adsorption oder kovalente Bindung

2. Inkubation mit der zu untersuchenden Ag-haltigen Lösung, wobei der fixierte Ak das Ag aus der Lösung bindet

3. Nach Entfernen der Lösung und Waschen des Trägers Aufbringen eines Ak-Enzym-Konjugates (z. B. Ak-Peroxidase-Konjugates) und Inkubation

4. Nach Entfernen des nicht gebundenen Antikörper-Peroxidase-Konjugat-Anteils und Waschen Durchführen der Enzymreaktion durch Zugabe eines Enzymsubstrates (Leukofarbstoff), wobei je nach Art des Substrates ein löslicher oder unlöslicher Farbstoff entsteht· Die Farbstoffintensität ist das Maß für die Ag-Konzentration. Die Lage des Farbfleckes z. B. auf einem durch elektrophoretischen Transfer erhaltenen Abklatsch eines Gel-Elektropherogramms (Western Blotting) gibt die Lage des entsprechenden Antigens wieder und ermöglicht somit die Identifizierung des gesuchten Antigens in einer elektrophoretisch aufgetrumten Proteinmischung. Als Leukofarbstoffe wurden bisher 0-Dianisidin und 3,3-Diaminobenzidin verwendet (H. Towbin, th· Staehelin and

J. Gordon, Proc. 'Nati. Acad. Sei. 76, (1979), 4 350 4 354). Dies© Farbstoffe sind jedoch cancerogen und deshalb gesundheitsschädlich. Ein weiterer Nachteil besteht darin j daß sie lichtempfindlich und in Lösung nicht lange haltbar sind. Als Alternative zu diesen Farbstoffen wird in der Literatur 4-Chlor-l-naphthol empfohlen (R, Hawkes, E. Niday, 0, Gordon, Anal. Biochem. ,119,(1982), 142 - 147. Ein Nachteil dieses für EIA's ansonsten gut geeigneten Farbstoffs besteht jedoch darin, daß seine Herstellung zu einem Isonierengemisch führt, das sich nur schwer voneinander trennen läßt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, die gesundheitsschädlichen Leukofarbstoffe, die bisher im EIA unter Verwendung von Peroxidase-markierten Antikörpern mit unlöslichen Farbstoffen verwandt wurden, durch weniger gefährliche und weniger licht» empfindliche zu ersetzen. Es soll ein Farbstoff verwendet werden, der in einfacher Weise in reiner Form zu erhalten -ist· · . ; ' ' . .' .·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein EIA zum Nachweis und der Lokalisation eines gesuchten Antigens oder Antikörpers auf einem Träger mit dem Leukofarbstoff 2-Brom-l-naphthol, der nach Reaktion mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat unlöslich wird und an der Reaktionsstelle ausfällt und so einen Farbfleck auf der Unterlage ergibt, durchgeführt« Der Einsatz von 2-Brom-lnaphthol hat gegenüber den bisher für EIA's verwendeten Farbstoffen den Vorteil, daß es nicht gesundheitsschädlich ist und in einer sehr spezifischen neuen Reaktion (Patententwicklung von D. Pagenkopf und E, Schmitz "Verfahren zur ortho-Bromierung von 2-Substituierten Phenolen") hergestellt werden kann, die ein völlig isomerenfreies Produkt liefert. Deshalb ist 2-Brom-l-naphthol dem 4-Chlor-l-naphthol auf jeden Fall vorzuziehen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung von 2-Brom-l-naphthol liegt in der Stabilität der Farbe nach Reaktion mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat, so daß eine sofortige Auswertung unter Lichtschutz und mehrmaliges Waschen nach Reaktionsende nicht erforderlich sind. Außerdem ergibt dieser Farbstoff eine zu vernachlässigende Untergrundfärbung. Dieser Farbstoff ist für die Dot-EIA-Methode zum Screening auf Ag oder Ak ebenso einsetzbar wie zur Identifizierung von antigenen Fraktionen in Polyakrylamid-Stabgelen (nach Western Blotting) mittels der Immunoblotting-Methode; darüber hinaus auch für die immunhistochemische Identifizierung von antigenen Zellbestandteilen in Zellen oder Zellschnitten· Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Aus führunpsbeispiele Beispiel 1 Antikörper-Nachweis

1. Mittels Dot-EIA-Methode;

\ Nitrozellulose-Plättchen (3 χ 3 mm) werden in H₂O gewaschen« anschließend getrocknet· Danach werden 0,1 0,3 /Ul der entsprechenden Antigenlösung (0,01 - 1 rag/ml) mittels fein ausgezogener Kapillare aufgetragen und angetrocknet.

Das mit dem Antigen beladens Plättchen wird nun in einer proteinhaltigen Lösung (200 ,ul) inkubiert₄ zwecks Blokkierung aller proteinbindenden Stellen auf dem Plättchen. Danach werden die Plättchen in Mikrotestplatten (mit 96 Näpfen) übertragen und in der zu untersuchenden Antikörper-haltigen Lösung (50 ,ul) für mehrere Stunden bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4⁰O inkubiert· Anschließend wird 3 χ in PBS/Tween gewaschen und dann für 1 Std· bei Zimmertemperatur mit Peroxidase-raarkierten Antikörpern gegen Immunglobulinmoleküle der gleichen Tierspezies (50 100 ,ul), von der auch die zu untersuchenden Antikörper abstammen (z· Antikörper), inkubiert» Nach gründlichem Waschen mit PBS erfolgt schließlich die Inkubation mit dem . Leukofarbstoff 2-Brom-l-naphthol nach folgender Vorschrift; 4,16 ral Tris/HCl-Puffer, 0,01 M*. pH 7,4 0,50 ml 0,3 % H₂O₂

0,34 ml 2-Brom-l-naphthol (3 mg/ml Methanol) Nach etwa 10 - 30 min erscheinen bei Anwesenheit und abhängig von der Konzentration der zu untersuchenden Antikörper ein blau-violetter Fleck von 1 mm Durchmesser (= der Ag-Auftragestelle)·

2. Als Immunoblotting-Methode in Form eines EIAt

Für die Suche nach Antikörpern, die mit einem Ag reagieren, das sich jedoch in einem Antigen-Gemisch befindet, kann die spezifische Ag-Ak-Reaktion. nach elektrophoreti-

scher Auftrennung in Polyakrylamidgel und anschließender Übertragung des Proteins auf z· B. Nitrozellulosepapier in Form der Immunoblotting-Methode gemessen werden· Hierfür wird das Nitrozellulosepapier nach dem Proteintransfer in PBS gewaschen und die unspezifischen Protein-' bindungssteilen auf der Nitrozellulose mittels einer proteinhaltigen Lösung (vorzugsweise verdünntes Serum) blokkiert· Anschließend erfolgt die Inkubation mit der den zu suchenden Ak enthaltenden Lösung. Danach wird das Nitrozellulosepapier gewaschen und mit dem Anti-Antikörper (2· Antikörper)~Peroxidase-Konjugat behandelt· Die weitere Prozedur s. Beispiel 1. 1.

Beispiel 2

Antigen-Nachweis • 1. Mittels Dot-EIA-Methode:

Das anzuwendende Versuchsprinzip ist im wesentlichen dasselbe wie in Beispiel 1, da ein Antikörper nicht ohne das entsprechende Antigen und ein zu suchendes Antigen nicht ohne den passenden Antikörper bestimmt werden können· Nach an sich bekannten Verfahren wird der dem Antigen entsprechende Antikörper auf Plättchen adsorbiert, wobei die Antikörperkonzentration bei etwa 1 ,ug/ml liegen sollte· Nach Blockieren der unspezifischen proteinbindenden Stellen auf den Plättchen (s. o·) werden diese dann in Mikrotestplatten (mit 96 Näpfen) gegeben und dort mit der zu untersuchenden Antigen-haltigen Lösung (50 ,ul) inkubiert und nach gründlichem Waschen in PBS/Tween mit dem Peroxidase-markierten anti-Antigen-Antikörper (50 - 100 ,ul) für 1 Std. bei Zimmertemperatur behandelt« Nach abermaligem Waschen mit PBS (5 x) erfolgt schließlich die Inkubation mit dem Leukofarbstoff un£er gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.

Die Intensität der erhaltenen Farbflecke auf den Plättchen ist Ausdruck für die Antigen-Konzentration in der zu untersuchenden Lösung, wobei die Auswertung visuell vorgenommen wird

2. Als iromunoblotting-Methode in Form eines EIA:

Zur Identifizierung eines gesuchten Antigens innerhalb eines Antigen-Gemisches kann nach der elektrophoretischen Auftrennung dieses Gemisches in Polyakrylamidgelen die Immunoblotting-Methode eingesetzt werden« Dabei erfolgt der Ag-Nachweis nach Übertragung der getrennten Proteine aus dem Gel auf z. B* Nitrozellulosepapier mittels eines EIA (s. Beispiel1, 1).

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch _

   Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays zum Nachweis und der Lokalisation von unter Verwendung von Peroxidase-markierten Antigenen oder Antikörpern auf einem Träger mit Hilfe eines Leukofarbstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß als Leukofarbstoff
2. 2-Brom-l-naphthol verwendet wird.