DE3587633T2 - Verfärbungsverfahren für Proteine und Nukleinsäuren. - Google Patents

Verfärbungsverfahren für Proteine und Nukleinsäuren.

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DE3587633T2 DE85200854T DE3587633T DE3587633T2 DE 3587633 T2 DE3587633 T2 DE 3587633T2 DE 85200854 T DE85200854 T DE 85200854T DE 3587633 T DE3587633 T DE 3587633T DE 3587633 T2 DE3587633 T2 DE 3587633T2
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Description

  • Gelelektrophorese-Techniken sind wesentliche Hilfsmittel zum Analysieren komplexer Gemische von Polypeptiden und Nukleinsäuren. Bei ihrer Anwendung auf Proteine wird die hohe Auflösung dieser Techniken auch zum Prüfen der Bindungsaktivitäten von Antikörpern, Lektinen und verschiedenen Proteinen an spezifische Komponenten solcher Gemische ausgenützt. Die Techniken für eine solche Analyse werden Overlay-Assays genannt. Sie werden vorzugsweise an Elektrophoretogrammen durchgeführt, welche auf immobilisierende Matrizes, wie z. B. Membranen auf der Basis von Nitrozellulose oder Nylon, übertragen worden sind (Protein- oder Nukleinsäure-Blots). Für Proteine ist dieser Gegenstand kürzlich von Gershoni und Palade (Anal. Biochem. 1983, 131, 1-15) besprochen worden.
  • Die Empfindlichkeit der verschiedenen Overlay-Techniken ist sehr hoch: sie geht herunter bis auf unter 1 ng liegende Mengen. Daraus ist ein Bedarf nach einem empfindlichen Anfärbeverfahren entstanden, um eine direkte Wechselbeziehung zwischen dem Gesamtelektrophoretogramm und den in dem Overlay nachgewiesenen Banden zu ermöglichen. Anfärbemittel wie Coomassie-Blau, Amido-Schwarz und "Fast-Green" entsprechen nicht der hohen Empfindlichkeit von Overlay-Techniken. Für Membranen auf Nylonbasis, wie z. B. "Zetaprobe®" (Bio-Rad), ist kein brauchbares Anfärbeverfahren verfügbar. Die übliche Praxis besteht darin, die abgetrennten Proteine in einem doppelten Polyacrylamid-Gel gemäß einem Silber-Anfärbeverfahren anzufärben. Wegen des Schrumpfens des Gels in dem Blotting-Puffer (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 4350- 4354) werden jedoch die Größen des Blots bzw. des Gels nach dem Anfärben voneinander verschieden, wodurch die Herstellung einer solchen direkten Wechselbeziehung erschwert wird. Was aber noch wichtiger ist, ist der Umstand, daß dieses Anfärbeverfahren keinerlei Informationen über die Genauigkeit des Blotting-Verfahrens sowie über dessen Wirksamkeit erteilt, welche Genauigkeit und welche Wirksamkeit für gewisse Proteine problematisch sein können. Ein Verfahren des Anfärbens mit Ausziehtusche (Hancock und Tsang, Anal. Biochem. 1983, 133, 157-162) ist beschrieben worden, welches nur auf Nitrozellulose-Protein-Blots anwendbar ist, doch ist dieses Verfahren empfindlicher als die anderen Verfahren des Anfärbens von Proteinen, und es ist leicht anwendbar. Der nach diesem Verfahren erzielte Kontrast ist jedoch nicht sehr scharf.
  • Die Methodik des Analysierens komplexer Gemische von Nukleinsäuren ist z. B. in Devos et al., J. Mol. Biol., 128, 595-619 (1979) beschrieben. Das Anfärben von Nukleinsäuren wird gewöhnlich mit Ethidiumbromid durchgeführt. Obwohl die Empfindlichkeit dieses Verfahrens hoch ist, so hat es doch den ernstlichen Nachteil, daß es nicht auf Blotting-Membranen oder auf denaturierte DNA anwendbar ist.
  • In der am 23. Oktober 1985 veröffentlichten EP-A-0 158 746 sind Verfahren zum Sichtbarmachen, durch Verwendung eines kolloidalen Metallteilchens als Marker, eines Agglomerates beschrieben, welches durch eine Akzeptorsubstanz und ein spezifisches Bindungsmittel auf einer immobilisierenden Matrix (oder auf einem Blotting-Medium) gebildet worden ist. Gemäß einem Verfahren (dem direkten Verfahren) wird das spezifische Bindungsmittel mit dem Marker markiert; gemäß einem anderen Verfahren (dem indirekten Verfahren) wird der Marker an ein Makromolekül gekoppelt, welches sich spezifisch mit dem genannten, spezifischen Bindungsmittel verbindet. Somit ist der Marker, nämlich das kolloidale Metallteilchen, in diesem Test stets irgendeinem spezifischen Bindungsmittel zugeordnet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anfärben von Proteinen und Nukleinsäuren in oder auf festen Trägern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das angewendete Färbemittel eine Suspension von kolloidalen Metallteilchen ist und daß die Proteine und Nukleinsäuren als ein Farbsignal sichtbar gemacht werden, welches an der Stelle des Bindens der kolloidalen Metallteilchen an die Proteine und Nukleinsäuren lokalisiert ist, oder daß die Proteine und Nukleinsäuren an dieser Stelle nach auf dem Fachgebiet bekannten, spektralphotometrischen Verfahrensweisen quantitativ bestimmt werden, mit der Maßgabe, daß die kolloidalen Metallteilchen nicht an ein spezifisches Bindungsmittel für die anzufärbende und nachzuweisende oder zu bestimmende Nukleinsäure gebunden sind.
  • Die nachstehend beschriebene Erfindung betrifft das Anfärben von Proteinen oder Nukleinsäuren in oder auf allen Arten von Trägern. Die Nukleinsäuren umfassen diesbezüglich sowohl Ribonukleinsäuren als auch Desoxyribonukleinsäuren. Der wesentliche Punkt der vorliegend Erfindung besteht in der Verwendung kolloidaler Metallteilchen als Färbemittel, welche Metallteilchen auf einen optimalen pH-Wert und auf eine optimale Konzentration eingestellt worden sind. Der in diesem Zusammenhang verwendete Ausdruck "kolloidale Metallteilchen" soll Dispersionen von Teilchen, vorzugsweise Sole, umfassen, welche aus einem Metall, einer Metallverbindung oder aus Kernen bestehen, welche mit einem Metall oder mit einer Metallverbindung überzogen sind. Die kolloidalen Metallteilchen können nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrensweisen hergestellt werden, wie dieselben z. B. zur Herstellung von Suspensionen oder Solen von Gold, Silber, Platin oder Eisenhydroxid und dergleichen beschrieben worden sind.
  • Die Erfindung basiert auf dem überraschenden Befund, daß optimal konzentrierte und im pH-Wert eingestellte, kolloidale Metallteilchen sich mit hoher Affinität und Selektivität an die Proteine und Nukleinsäuren binden und eine für die verwendeten kolloidalen Metallteilchen charakteristische, klar kontrastierende Farbe erzeugen.
  • Gewünschtenfalls kann das Signal durch weitere physikalische Entwicklung, oder durch Umwandlung des kolloidalen Metalles in ein Metallion und anschließende Identifizierung nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zur Identifizierung der Farbe von Metallionen modifiziert und/oder verstärkt werden. Beispielsweise bilden die Fe³&spplus;-Ionen von kolloidalem Eisenhydroxid stabile Komplexe mit z. B. Ferrocyanidsalzkomplexen (z. B. K&sub4;Fe(CN)&sub6;, Kaliumferrocyanid), welche Komplexe stark gefärbt sind.
  • Beispiele kolloidaler Metallteilchen, welche sich an Proteine und Nukleinsäuren binden, wenn sie auf den optimalen pH-Wert und auf die optimale Konzentration eingestellt worden sind, sind die Metalle Platin, Gold, Silber und Kupfer, und die Metallverbindungen Silberiodid, Silberbromid, wasserhältiges Kupferoxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder wasserhältiges Eisenoxid, Aluminiumhydroxid oder wasserhältiges Aluminiumoxid, Chromhydroxid oder wasserhältiges Chromoxid, Vanadiumoxid, Arsensulfid, Manganhydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid, Bariumsulfat und Titandioxid. Es können auch Kolloide verwendet werden, welche aus Kernen bestehen, welche mit den oben erwähnten Metallen oder Metallverbindungen überzogen sind. Die Teilchen haben ähnliche Eigenschaften wie die kolloidalen Metalle oder Metallverbindungen, doch können die Größe, Dichte und der Metallgehalt in optimaler Weise vereinigt werden. Generell können alle kolloidalen Metallteilchen oder Metallverbindungen verwendet werden, welche auf den optimalen pH-Wert für das Binden von Proteinen eingestellt werden können, und welche beim Anfärben von Proteinen eine Farbintensität ergeben, welche ausreicht, um mit dem unbewaffneten Auge beobachtet zu werden. Vorzugsweise sind die Empfindlichkeiten gleich jenen oder größer als jene, welche mit den Metallen Gold und Silber erhalten werden.
  • Für das Anfärben von Proteinen werden besonders gute Ergebnisse mit kolloidalem Gold, Silber und Eisenhydroxid erhalten. Das kolloidale Eisenhydroxid hat sich für das Anfärben von Nukleinsäuren als besonders gut geeignet erwiesen.
  • Die Teilchengröße der kolloidalen Metall- oder Metallverbindungsteilchen liegt vorzugsweise zwischen 1 und 10 nm. Der geeignete pH-Wert ist vorzugsweise jener, bei welchem das Binden maximal ist, und bei welchem die intensivste Farbe erhalten wird. Das maximale Binden tritt dann ein, wenn die Proteine und die kolloidalen Metallteilchen entgegengesetzte Nettoladungen aufweisen. Dies stellt einen Unterschied zu den bekannten Verfahren zur Herstellung von mit Proteinen überzogenen, kolloidalen Metallteilchen dar,welche als Sonden in der Histochemie und in der Biochemie verwendet werden. Auf diesem Gebiet werden die Proteine an die kolloidalen Metallteilchen bei einem pH-Wert adsorbiert, welcher nahe bei dem pI-Wert des Proteins gelegen ist. Das Einstellen des pH-Wertes kann nach irgendeinem der üblichen Verfahren bewirkt werden. Das Zugeben eines Vorratspuffers bis auf eine Endkonzentration von etwa 10 mM zu den kolloidalen Metallteilchen ist ein bevorzugtes Verfahren.
  • Die passende Konzentration der kolloidalen Metallteilchen ist eine solche, welche innerhalb praktischer Inkubationszeiten (von einigen wenigen Minuten bis zu einem Tag) eine vollständige Farbsättigung ergibt. Diese Konzentration kann durch Auswählen der richtigen Konzentrationen der Rohmaterialien, aus welchen die Metallteilchen hergestellt werden, oder durch Verdünnen oder Konzentrieren nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erreicht werden.
  • Die Träger, in oder auf welchen Proteine und Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung angefärbt werden können, können von verschiedener Art sein, und sie umfassen z. B. Gele, und zwar insbesondere jene, welche für das Auftrennen von Proteinen und Nukleinsäuren durch Chromatographie oder Elektrophorese verwendet werden, oder jene, welche als Träger für irgendwelche der auf dem Fachgebiet bekannten immunchemischen Verfahrensweisen, wie z. B. Immundiffusion,Radioimmundiffusion, Immun-Elektrophorese, Gegen-Immun-Elektrophorese der Immunfixation, verwendet werden; und immobilisierende Matrizes, welche als Träger für Overlay-Techniken für Proteine und Nukleinsäuren (z. B. für Hybridisierungstechniken) verwendet werden.
  • Beispiele für solche Gele, auf welche das erfindungsgemäße Anfärbeverfahren mit Erfolg angewendet werden kann, umfassen z. B. Agarose- und Zelluloseacetat-Gele.
  • Die immobilisierenden Matrizes sollen irgendeine Art von Polymermaterial umfassen, auf welchem Proteine oder Nukleinsäuren immobilisiert werden können, insbesondere Materialien, auf welche Proteine oder Nukleinsäuren aus Trennmedien nach einem allgemein als "Blotting" bezeichneten Verfahren übertragen werden. Beispiele für solche Matrizes sind Nitrozellulose, Nylon (z. B. ein Polyhexamethylenadipamin), Zelluloseacetat und verschiedene modifizierte Zelluloseacetate, wie z. B. Diazobenzyloxymethyl-(DBM)- oder Diazophenylthioether-(DPT)-modifiziertes Zellulosepapier.
  • Es ist vorteilhaft, die Träger vor dem Anfärbevorgang zu waschen. Durch diese Waschvorgänge sollen anhaftende, störende Materialien, wie z. B. Polyacrylamid-Gelteilchen und restliches SDS (Natriumdodecylsulfat), wenn SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) zuvor angewendet worden ist, entfernt werden.
  • Es erweist sich auch als vorteilhaft, zu den kolloidalen Metallteilchen, vor oder nach dem Einstellen des pH-Wertes, ein Detergens zuzugeben. Obgleich Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaureat), Triton-X-100 und Myristyltrimethylammoniumbromid hier als Beispiele angeführt werden, können ebensogut auch andere, ähnliche grenzflächenaktive Substanzen verwendet werden.
  • Im Vergleich zu den vorhandenen Anfärbetechniken ist das erfindungsgemäße Verfahren deutlich überlegen, und zwar insbesondere wegen seiner wesentlich höheren Empfindlichkeit. Demzufolge kann das erfindungsgemäße Verfahren für den Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren in äußerst niedrigen Mengen angewendet werden, was unter vielen Umständen ein in hohem Maße erwünschtes Ziel ist. Wie oben bereits erwähnt worden ist, ist eine solche hohe Empfindlichkeit wesentlich für das angemessene Anfärben von Protein-Blots, doch hat dieses Verfahren auch große Vorteile in Verbindung mit der direkten Sichtbarmachung von Proteinen oder Nukleinsäuren in oder auf anderen Trägern, insbesondere Gelen, wie z. B. Trennmedien, z. B. Elektrophoretogrammen. Diesbezüglich ermöglicht es die Erfindung, Proteinauftrennungen von Proben mit einem sehr niedrigen Proteingehalt sichtbar zu machen, z. B. von bestimmten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Hirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF). Die CSF enthält nur sehr geringe Proteinmengen, und mit den üblichen Analyse- und Diagnosetechniken ist ein Konzentrieren der Flüssigkeit vor der Durchführung der elektrophoretischen Proteinanalyse erforderlich, und daher werden auch relativ große Proben benötigt. Aus einer Punktion kann nur eine begrenzte Menge an Punktat gewonnen werden, und wegen des Traumas für den Patienten und wegen der Anstrengung und Fachkenntnis, welche zur Gewinnung guter Proben erforderlich sind, wird jede Maßnahme als klarer Vorteil angesehen, durch welche das für die Analyse benötigte Volumen reduziert wird, und wodurch diese Technik, in höherem Maße als dies gegenwärtig der Fall ist, für die Routine-Analyse und -Diagnose verfügbar gemacht wird.
  • Die Tatsache, daß das vorbereitende Konzentrieren oder Anreichern der Probe vermieden werden kann, ist eine wichtige Verbesserung, durch welche Diagnoseverfahren erleichtert werden, welche auf verschiedene Flüssigkeiten, wie z. B. Serum und Urin, angewendet werden.
  • Demzufolge wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine beträchtliche Verbesserung gegenüber den vorhandenen Techniken für die Diagnose einer Anzahl von Stoffwechselstörungen und Krankheiten geschaffen, wie z. B. für den Nachweis von Hirntumoren durch CSF-Analyse und von Myelom durch die Analyse von Urinproben. Die vorliegende Erfindung ist daher von großem Nutzen, insbesondere bei der klinischen Diagnose.
  • Das Ergebnis des Anfärbevorganges kann sowohl für qualitative als auch für quantitative Bewertungen verwendet werden. Die qualitative Bewertung wird gewöhnlich durch bloße visuelle Beobachtung durchgeführt. Quantitative Messungen werden gewöhnlich mit spektroskopischen Techniken, wie z. B. Photometrie des Reflexionsgrades oder Densitometrie, durchgeführt. Bei Anwendung einer densitometrischen Technik kann erforderlich sein, den Träger zuerst durch Behandlung mit entsprechenden Lösungsmitteln, wie z. B. Xylol, durchsichtig zu machen.
  • Das Verfahren der Erfindung umfaßt die nachfolgenden Stufen:
  • i. Inberührungbringen eines ordentlich gewaschenen und
  • - gewünschtenfalls - anschließend an der Luft getrockneten Trägers für Proteine oder Nukleinsäuren während einer gegebenen Zeitspanne mit einer ausreichenden Konzentration kolloidaler Metallteilchen, welche in einem Medium suspendiert sind, welches vorzugsweise ein Detergens enthält, welches das Binden mit den Proteinen oder Nukleinsäuren nicht stört, wie z. B. 0,1% des nichtionischen Detergens Tween 20®, und dessen pH-Wert entsprechend eingestellt worden ist. Gewünschtenfalls kann das durch die kolloidalen Metallteilchen gebildete, optische Signal durch entsprechende Verstärker verstärkt werden, wie z. B. durch physikalische Entwickler und/oder es kann, nach Umwandlung des kolloidalen Metalles in ein Metallion, nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren der Farbidentifizierung verstärkt werden;
  • ii. Ablesen des Farbsignals, welches von den gebundenen, kolloidalen Metallteilchen erzeugt worden ist und für dieselben kennzeichnend ist, mit dem unbewaffneten Auge oder unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten, spektralphotometrischen Techniken, wie z. B. der Densitometrie.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, durch welche Beispiele der Schutzumfang der Erfindung aber keineswegs eingeschränkt werden soll.
    • Beispiel I
  • Anfärben eines Konzentrationsbereiches von Protein-Molekulargewichts-Markern, welche Marker auf eine Nitrozellulosemembran übertragen worden sind, mit kolloidalen Goldteilchen.
  • Die verwendeten Materialien umfassen ein kolloidales Goldsol, welches Teilchen einen mittleren Durchmessers von 20 nm aufweist (Lieferant: Janssen Life Sciences Products, Beerse, Belgien) und Nitrozelluloseblätter (0,45 um), Tween 20 und "High Molecular Weight" (HMW)-Standards (alles von Bio-Rad). Die HMW-Standards bestanden aus Myosin (200 kDa), B-Galactosidase (116,5 kDa), Phosphorylase B (92,5 kDa), Rinderserumalbumin (66,2 kDa) und Ovalbumin (43 kDa), alles in einer Konzentration von etwa 2 mg/ml, wie vom Hersteller angegeben.
  • Die HMW-Standards wurden durch SDS-Gelelektrophorese gemäß Laemmli, O.K. (Nature 1970, 227, 680-685) auf zwei 7,5% -Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt. Eine Reihenverdünnung (1.000 - 3,5 ng pro Polypeptidbande) wurde in 9 Vertiefungen jedes 10 Vertiefungen aufweisenden Gels eingebracht. In die letzte Vertiefung wurde nur Probenpuffer eingebracht.
  • Nach dem Durchlauf wurde ein Gel gemäß einem Silber-Anfärbe- Verfahren (Morissey, J.H., Anal. Biochem. 1981, 117, 307-310) angefärbt. Die aufgetrennten Proteine des anderen Gels wurden auf Nitrozellulosepapier (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 4350-4354) elektrophoretisch transferiert. Das Blot wurde in einer großen Petri-Schale mit phospatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus;, vom pH 7,2) und von 37ºC, gewaschen, welche 0,3% (Vol./Vol.) Tween 20 enthielt (PBS-TW), und es wurde 3·15 min mit PBS-TW bei Zimmertemperatur gewaschen. Das gewaschene Blot wurde in überschüssigem Wasser gespült.
  • Das gespülte Blot wurde mit aus kolloidalem Gold bestehendem Färbemittel inkubiert, welches (für 100 ml) wie folgt hergestellt worden war: - 75 ml kolloidales Gold (G20, Janssen Life Sciences Products) - 5 ml 2% Tween 20 in H&sub2;O - 20 ml 50 mM Citratpuffer, vom pH 3,0.
  • Das Tween 20 und das Gold-Sol wurden vor der Zugabe des Puffers gut miteinander vermischt. Die Inkubation dauerte vier Stunden.
  • Das gefärbte Blot wurde in H&sub2;O gespült und an der Luft getrocknet.
  • Die durch das aus dem kolloidalen Gold bestehende Färbemittel nachgewiesenen Protein-Banden erschienen als rote Banden. Die Empfindlichkeit des Anfärbens fiel in den gleichen Bereich wie jene des Silberfärbens von Proteinen in Polyacrylamid-Gel. Die Nachweisgrenze wurde auf ± 250 pg/mm² geschätzt.
    • Beispiel II
  • Anfärben von Molekulargewichts-Markern, welche auf eine Nitrozellulosemembran transferiert worden sind, mit kolloidalen Silberteilchen.
  • Die kolloidalen Silberteilchen wurden gemäß Frens und Overbeek (Koll. Z. u. Z. Polym. 1969, 223, 922-929) hergestellt. Die HMW-Standards, Nitrozelluloseblätter und das Tween 20 waren die gleichen wie im Beispiel I. 12,5 ul einer HMW-Standard-Vorratslösung wurden in 500 ul Probenpuffer verdünnt, während 3 min gekocht, wie im Beispiel I in einem 7,5%igen Polyacrylamid- Gel mit einer Vertiefung durchlaufen gelassen.
  • Die elektrophoretische Übertragung, das Waschen mit PBS-TW und das Spülen mit Wasser wurden wie im Beispiel I vorgenommen. Ein 4 mm breiter Streifen wurde mit dem Gold-Färbemittel angefärbt. Ein zweiter Streifen wurde mit einem aus kolloidalem Silber bestehenden Färbemittel inkubiert, welches wie folgt hergestellt worden war: - 75 ml kolloidales Silber (A394nm = 1,0, bei 100-facher Verdünnung in Wasser) - 5 ml 2%iges Tween 20® in H&sub2;O - 20 ml 50 mM Citratpuffer, vom pH 3,0.
  • Das Tween 20® und das Silber-Sol werden vor der Zugabe des Puffers gut vermischt. Die Inkubation dauerte 4 h. Das gefärbte Blot wurde in Wasser gespült und an der Luft getrocknet.
  • Die durch das aus dem kolloidalen Silber bestehende Färbemittel nachgewiesenen Protein-Banden erschienen als braune bis schwarze Banden. Die Empfindlichkeit fiel in den gleichen Bereich wie jene des aus dem kolloidalem Gold bestehenden Färbemittels.
    • Beispiel III
  • Anfärben von Molekulargewichts-Markern, welche auf eine Zetaprobe®-Membran übertragen worden sind, mit kolloidalen Eisenhydroxidteilchen.
  • Kolloidales Eisenhydroxid wurde gemäß Bradburry et al., Histochem. J. 1970, 2, 263-274, hergestellt. 200 ml 0,5 M FeCl&sub3; (6 H&sub2;O) wurden tropfenweise zu 800 ml siedendem Wasser unter ständigem Rühren zugesetzt. Das Kolloid wurde gegen mehrmals gewechseltes Wasser dialysiert.
  • Die HMW-Standards waren die gleichen wie im Beispiel I. Als Blotting-Medium wurde Zetraprobe® verwendet, nämlich eine Nylon-Matrix (ein als Nylon 66 bezeichnetes Polyhexamethylenadipamin), welches durch das Einführen zahlreicher tertiärer Aminogruppen während der Herstellung modifiziert worden ist (Lieferant: Bio-Rad). Triton-X-100® (Octylphenoxypolyethoxyethanol) (Lieferant: Sigma). 12,5 ul der HMW-Standardvorratslösung wurden wie im Beispiel II in 500 ul Probenpuffer verdünnt, während 3 min gekocht, und in einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit einer Vertiefung durchlaufen gelassen. Die elektrophoretische Übertragung auf die Zetaprobe®-Membran wurde wie von Gershoni und Palade, Anal. Biochem. 1982, 124, 396-405, beschrieben durchgeführt.
  • In dem Transferpuffer wurde kein Methanol verwendet.
  • Das Blot wurde über Nacht, bei Zimmertemperatur, in Wasser gewaschen, welches mit 1%igem Triton-X-100® ergänzt war.
  • Ein 4 mm breiter, vertikaler Streifen des Blots wurde dann in 0,2%igem Triton-X-100® gespült und weiterhin mit 5 ml des aus dem kolloidalen Eisenhydroxid bestehenden Färbemittels inkubiert, welches wie folgt hergestellt worden war: - 200 ul dialysiertes kolloidales Eisenhydroxid - 100 ul 10%iges Triton-X-100® in H&sub2;O (Vol./Vol.) - 4,7 ml 0,2 M Natriumcacodylat/HCl-Puffer, vom pH 7 (Lieferant: BDH Chemicals Ltd. Poole England).
  • Die Inkubation dauerte 4 h.
  • Das angefärbte Blot wurde in Wasser gespült und an der Luft getrocknet.
  • Die durch das kolloidale Eisenhydroxid nachgewiesenen Protein-Banden erschienen als braune Banden mit einem sehr hellen Hintergrund.
    • Beispiel IV
  • Anfärben von Molekulargewichts-Markern, welche auf eine Zetaprobe®-Membran übertragen worden sind, mit kolloidalen Goldteilchen.
  • Das Anfärben wurde mit kolloidalen Goldteilchen eines mittleren Durchmessers von 20 nm (Lieferant: Janssen Life Sciences Products, Beerse, Belgien) durchgeführt. Die HMW-Standards und die Zetaprobe®-Membran waren die gleichen wie im Beispiel III.
  • Das zum Anfärben verwendete Protein-Blot war in ähnlicher Weise wie im Beispiel III hergestellt worden. Das Blot wurde über Nacht, bei Zimmertemperatur, mit überschüssigem Wasser gewaschen.
  • Ein 4 mm breiter, vertikaler Streifen des Blots wurde weiterhin mit 5 ml des aus kolloidalem Gold bestehenden Färbemittels inkubiert, welches wie folgt hergestellt worden war: - 4 ml kolloidales Gold-Sol - 1 ml 10%iges (Gew./Vol.) Myristyltrimethylammoniumbromid.
  • Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8 eingestellt.
  • Die Inkubation dauerte 4 h.
  • Das angefärbte Blot wurde in Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Die mit diesem aus kolloidalem Gold bestehenden Färbemittel nachgewiesenen Protein-Banden erschienen als rote Banden mit einem hellrosa Hintergrund. Die Empfindlichkeit war mit jener vergleichbar, welche mit dem kolloidalen Eisenhydroxid auf der Zetaprobe®-Membran erhalten worden war (Beispiel III).
    • Beispiel V
  • Anfärben von Molekulargewichts-Markern, welche auf eine Zetaprobe®-Membran übertragen worden sind, mit kolloidalen Eisenhydroxidteilchen, mit anschließender Hydrolyse mit Chlorwasserstoffsäure und Umwandlung in Turnbulls-Blau (= Berliner Blau) mit Kaliumferrocyanid [K&sub4;Fe(CN)&sub6;].
  • Es wurde gemäß Beispiel III ein mit kolloidalem Eisenhydroxid angefärbter Streifen hergestellt.
  • Nach Beendigung der Inkubation in kolloidalem Eisenhydroxid wurde der Streifen mehrmals in Wasser gewaschen, und dann wurde er während ± 60 s mit der folgenden Lösung behandelt: - 2 Teile 1N HCl, - 2 Teile Wasser - 1 Teil 0,05 M K&sub4;Fe(CN)&sub6;.
  • Diese Lösung wurde frisch hergestellt.
  • Der Streifen wurde mit mehrmals gewechseltem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • Die durch diese Anfärbe-Verfahrensweise nachgewiesenen Protein-Banden erschienen als blaue Banden gegen einen hellblauen Hintergrund. Die Sichtbarkeit der Proteine war beträchtlich verstärkt, und die Empfindlichkeit näherte sich nunmehr derjenigen, welche mit einem aus kolloidalem Gold bestehenden Anfärbemittel auf Nitrozellulose-Blots erhalten worden war.
    • Beispiel VI
  • Anfärben von Proteinen in Zelluloseacetat-Membranen.
    • A. Elektrophoretische Auftrennung
  • Cellogel wurde in 30%igem Methanol gelagert und vor dem Gebrauch getrocknet. Die Membran wurde in Elektrophorese-Puffer gewaschen, welcher 1,34 g Veronal und 10,3 g Veronal-Natrium pro 1.000 ml enthielt (pH 8,6). Die Proben, welche aus 3 ul Pferdeserum bestanden, welches mit Elektrophorese-Puffer im Verhältnis von 1/2, 1/10 bzw. 1/100 verdünnt worden war, wurden mit einer Mikroappliziereinrichtung aufgebracht. Die elektrophoretische Auftrennung wurde bei 200 V (und bei einer maximalen Stromstärke von 10 mA) während 35 min durchgeführt.
    • B. Anfärben
  • Duplikat-Gele wurden entweder mit Amidoschwarz oder mit einem aus kolloidalem Gold bestehenden Färbemittel angefärbt, welches mit dem im Beispiel I beschriebenen identisch war.
    • 1. Anfärben mit Amidoschwarz.
  • Die Membranen wurden dadurch angefärbt, daß man sie während 30 min mit einer Lösung in Berührung brachte, welche 0,5 g Amidoschwarz in 50 ml Methanol, 40 ml Wasser und 10 ml Essigsäure enthielt. Das Entfärben wurde während 15 min mit einem Gemisch von 500 ml Methanol, 100 ml Essigsäure und 400 ml Wasser durchgeführt.
    • 2. Anfärben mit Gold.
  • Die Membran wurde während 30 min in einem Gemisch von 50 ml Methanol, 40 ml Wasser und 10 ml Essigsäure fixiert. Sie wurde dann dreimal während 15 min mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (vom pH 7,6) gewaschen. Anschließend wurde die Membran in dem Gold-Anfärbemittel so lange inkubiert, bis die Anfärbung gesättigt war (etwa 2 h).
    • C. Ergebnisse
  • Mit Amidoschwarz wurde das übliche Protein-Anfärbemuster erhalten. In der im Verhältnis von 1/100 verdünnten Probe konnte nur ein schwaches Anfärben der Albuminbande nachgewiesen werden.
  • Mit dem Gold-Färbemittel waren die Protein-Banden purpurrot angefärbt. In der im Verhältnis von 1/100 verdünnten Probe waren alle Hauptprotein-Banden noch sichtbar. Nach dem Trocknen verfärbten sich die Banden auf schwarz.
  • Es zeigt sich, daß das Gold-Färbemittel wenigstens 50 mal empfindlicher als das Amidoschwarz ist.
    • Beispiel VII Verfahrensweise für den Nachweis von Nukleinsäuren, welche auf Membranen auf Nylonbasis fixiert sind, unter Anwendung eines Anfärbens mit einem aus kolloidalem Eisenhydroxid bestehenden Färbemittel.
  • Nukleinsäuren (DNA oder RNA) werden direkt auf die Filter aufgebracht (mit Hilfe einer Rundlochplatte = Dot Blot), oder sie können, nach der Auftrennung in Agarose-Gelen, unter Anwendung der Southern-Technik (Southern E., Methods in Enzymology, 68 (1979) 5.152) oder der Northern-Technik (Thomas, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, (1980) S. 520) übertragen werden.
  • Anschließend werden die Nukleinsäuren auf den Membranen dadurch fixiert, daß man sie während 1 h auf 80ºC erhitzt. Wird die "Dot-Blot"-Technik für DNA angewendet, dann kann das Filter mit einer Denaturierungslösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) behandelt und vor der Stufe des Erhitzens mit einer 3M NaAc- Lösung (vom pH 5,8) neutralisiert werden.
  • Für Übertragungen aus Gelen (Southern- oder Northern-Blotting) wird die Denaturierung der Nukleinsäuren routinemäßig in dem Gel, noch vor dem Transfer, vorgenommen. Nach der Stufe des Erhitzens werden die Membranen kurz mit 0,2%igem Tween 20 (zweimal; während jeweils 5 min) gewaschen und anschließend unter leichtem Hin- und Herbewegen in einer Suspension von kolloidalem Eisenhydroxid (während 1 h) inkubiert. Diese Suspension wurde genauso hergestellt, wie dies für das Anfärben von Proteinen beschrieben worden ist. Die Nukleinsäuren werden als bränlich-gelbe Tupfen oder Banden, in Abhängigkeit von der Art und Weise ihrer Aufbringung auf die Membran, nachgewiesen. Anschließend werden die Filter umfassend mit Wasser gewaschen (dreimal, jeweils 5 min) und getrocknet. Es ist auch möglich, die für das Anfärben von Proteinen beschriebene Reaktion mit K&sub4;Fe(CN)&sub6; anzuwenden. In diesem Falle wird die bräunlich-gelbe Farbe auf hellblau umgewandelt, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt.
  • Es ist aufgezeigt worden, daß die späteren Hybridisierungsergebnisse durch dieses Anfärben von Nukleinsäuren vor der Hybridisierung nicht gestört werden.

Claims (13)

1. Verfahren zum Anfärben von Proteinen und Nukleinsäuren in oder auf festen Trägern,dadurch gekennzeichnet, daß das angewendete Färbemittel eine Suspension von kolloidalen Metallteilchen ist und daß die Proteine und Nukleinsäuren als ein Farbsignal sichtbar gemacht werden, welches an der Stelle des Bindens der kolloidalen Metallteilchen an die Proteine oder Nukleinsäuren lokalisiert ist, oder daß die Proteine und Nukleinsäuren an dieser Stelle nach auf dem Fachgebiet bekannten, spektralphotometrischen Verfahrensweisen quantitativ bestimmt werden, mit der Maßgabe,daß die kolloidalen Metallteilchen nicht an ein spezifisches Bindungsmittel für das anzufärbende und nachzuweisende oder zu bestimmende Protein oder für die anzufärbende und nachzuweisende oder zu bestimmende Nukleinsäure gebunden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kolloidalen Metallteilchen aus Gold, Silber oder Platin oder aus Gold-, Silber-, Platin-, Eisen- oder Kupferverbindungen bestehen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kolloidalen Metallteilchen aus Gold- oder Silbermetall oder aus Eisenhydroxid bestehen und eine zwischen 1 und 100 nm liegende Teilchengröße aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der endgültige Nachweis der kolloidalen Metallteilchen nach Anwendung eines physikalischen Entwicklers, der eine silberhältige Verbindung ist, bewirkt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Färbemittel eine kolloidale Suspension von Eisenhydroxid ist und wobei der endgültige Nachweis des Färbemittels nach einem Hydrolysieren des Eisenhydroxides mit einer Säure und einem Behandeln des so gebildeten Ferrisalzes mit einem Ferrocyanidsalzkomplex bewirkt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteine und Nukleinsäuren auf einer immobilisierenden Matrix fixiert sind und wobei das Färbemittel ein Sol von kolloidalen Metallteilchen ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, welches die folgenden Stufen umfaßt:
i) Immobilisieren der nachzuweisenden Proteine und Nukleinsäuren auf einer immobilisierenden Matrix;
ii) gegebenenfalls Waschen der immobilisierenden Matrix;
iii) Inberührungbringen der immobilisierenden Matrix mit einer Färbemittelsuspension, welche aus einem Sol von Metallteilchen in einem geeigneten Medium besteht, und welche auf eine entsprechende Konzentration und auf einen entsprechenden pH-Wert eingestellt worden ist, und welche mit wenigstens einem Detergens ergänzt worden ist, welches das spezifische Binden der kolloidalen Metallteilchen an die Proteine und Nukleinsäuren fördert;
iv) gegebenenfalls Waschen der immobilisierenden Matrix; und
v) Nachweisen des Farbsignals an der Reaktionsstelle auf der Oberfläche der immobilisierenden Matrix.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Proteine und Nukleinsäuren in einem Gelträger befinden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, welches die folgenden Stufen umfaßt:
i) Inberührungbringen des Gelträgers - gegebenenfalls nach einem Fixieren der Proteine oder der Nukleinsäuren mit auf dem Fachgebiet bekannten Fixiermittellösungen - mit einer Färbemittelsuspension, welche kolloidale Metallteilchen, und zwar vorzugsweise ein Sol, in einem entsprechenden Medium enthält, und welche auf eine entsprechende Konzentration und auf einen entsprechenden pH-Wert eingestellt worden ist, und welche mit wenigstens einem Detergens ergänzt worden ist, welches das spezifische Binden der kolloidalen Metallteilchen an die Proteine und Nukleinsäuren fördert;
ii) gegebenenfalls Waschen des Gelträgers; und
iii) Nachweisen des Farbsignals an der Reaktionsstelle in dem Gelträger.
10. Kit für die Verwendung in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, welcher eine Färbemittelsuspension enthält, welche aus einem Sol von Metallteilchen in einem geeigneten Medium besteht, und welche auf eine entsprechende Konzentration und auf einen entsprechenden pH-Wert eingestellt worden ist, und welche mit wenigstens einem Detergens ergänzt worden ist, welches das spezifische Binden der Teilchen aus dem kolloidalen Metall oder aus der kolloidalen Metallverbindung an die Proteine und Nukleinsäuren fordert.
11. Kit nach Anspruch 10, welcher enthält:
i) eine Färbemittelsuspension, welche aus einem Sol von Metallteilchen in einem geeigneten Medium besteht, und welche auf eine entsprechende Konzentration und auf einen entsprechenden pH-Wert eingestellt worden ist, und welche mit wenigstens einem Detergens ergänzt worden ist, welches das spezifische Binden der kolloidalen Metallteilchen an die Proteine und Nukleinsäuren fordert; und
ii) Reagentien zum Modifizieren und/oder Verstärken des aus dem kolloidalen Metall oder der kolloidalen Metallverbindung stammenden Signals.
12. Kit nach Anspruch 11, wobei die Färbemittelsuspension aus einem Goldsol besteht, und wobei die Reagentien zum Modifizieren und/oder Verstärken des Signals eine Silberverbindung als physikalischen Entwickler umfassen.
13. Kit nach Anspruch 12, wobei die Färbemittelsuspension aus einem Sol von Eisenhydroxid als Metallverbindung besteht, und wobei die Reagentien zum Verstärken des aus der Metallverbindung stammenden Signals einen Ferrocyanidsalzkomplex umfassen.
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