DD222123A1 - Verfahren und vorrichtung zur fluorometrischen bestimmung der menge in partikeln eingebetteten stoffs - Google Patents
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Abstract
Verfahren und Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung der Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs auf der Grundlage der hydrodynamischen Partikelzufuehrung in ein von einem Laserstrahl beleuchtetes Volumen, anwendbar in der Medizin und der technischen Mikrobiologie, mit dem Ziel der Erhoehung des Aufloesungsvermoegens der Messung. Mit der Erfindung wird die Aufgabe geloest, den Einfluss der Partikelgrenzflaeche auf die fluorometrische Messung zu unterdruecken. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur streulichtgestuetzten Brechzahlanpassung der Suspensionsfluessigkeit sowie eine geeignete geomtrische Anordnung der erfindungsgemaessen Vorrichtung geloest.
Description
Titel der/Erfindung .
Verfahren und Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung der Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung der Menge in Partikeln. eingebetteten Stoffs» Dabei kann es sich um markierte Zellinhaltsstoffe von Gewebezellen aber auch von einzelligen Mikroorganismen handeln. Als Anwendungsgebiete sind Histochemie und Zytochemie von Zellen aus der Medizin und der technischen Mikrobiologie zu nennen. Sie ist in die IPK G 01 Έ einzuordnen,
Die bekannten technischen Lösungen zur fluorometrisehen Bestimmung der Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs auf der Basis von schnellen Einzelpartikelmessungen sind dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel in nicht, angepaßter Flüssigkeit suspendiert und in dieser Suspension vereinzelt, geführt und positioniert werden,. Mit Hilfe der Hüllstromtechnik nach CROSLAUD-TAYLOR (A Device for Counting Small Particles Suspended in a Fluid. Through a Tube, Nature 171 (1953), 37) können einige Tausend Partikel pro Sekunde einzeln vermessen werden (HORAW, WHEELESS, Science 198 (1977), 149;. Der fluorometrischen
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Bestimmung der Menge eines.bestimmten Stoffes liegt die Gültigkeit des Lambert-Beersehen Gesetzes zugrunde. Wie KERKER9 M, und Mitarbeiter .gezeigt hab.en (siehe z, B. Topics in Current Physics Bd* 16, Aerosol Microphysics I, Ed, Marlow, Springer Verlag 1980), kann für kleine Partikel in nicht angepaßter Flüssigkeit die Gültigkeit des Lambeilt~Beerschen Gesetzes nicht mehr vorausgesetzt werden, da die Grenzbedingungen, die das elektrische Feld an der Partikeloberfläche erfüllen muß, den Zusammenhang zwischen der Menge des fluoreszierenden Stoffs und der emittierten Intensität modifizieren. Dieser Einfluß kann minimiert werden, wenn die Polarisationsebene des anregenden Lichts senkrecht zur Ebene der Fluoreszenzdetektion gewählt wird» Auf dieser Basis arbeiten kommerziell verfügbare Vorrichtungen zur Partikelanalyse (Druckschrift Becton-Dickinson PACB Systems, 1979; Druckschrift Ortho-Diagnostic Systems, Cytofluorograf Systems 30/50; Coulter, EPICS IV). Grundsätzlich wird jedoch dabei der Nachteil der Verfälschung der Fluoreszenzintensität durch
2ß die Grenzfläche des Partikels, durch Form und Struktur nicht ausgeschlossen, wie auch sorgfältige Messungen beweisen (KERKER, M. et. al., Cytometry 3. (1982), 71).
Die Erfindung verfolgt das Ziel, das.Auflösungsvermögen bei der fluorometrischen Bestimmung der Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs zu verbessern.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben zur fluorometrischen Be-3Θ Stimmung der^ Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs derart, daß der störende Einfluß der Partikelgrenzfläche
ausgeschlossen wird. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß in einem ersten Verfahrensschritt'der mittlere Brechungsindex der Partikel bestimmt und in einem zweiten Verfahrenaschritt in brechzahlangepaßter .Suspensionsflüssigkeit die fluorometrisch^ Bestimmung durchgeführt wird· Basierend auf der hydrodynamischen Partikelzuführung in ein von einem Laserstrahl beleuchtetes Volumen ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, bestehend aus einem Laser, einer Fokussierungsoptik, einer HüllStromkammer sowie einer Fluoressenz- und einer Streulichtsammeleinrichtung, gekennzeichnet durch eine Anordnung der Streulichtsammeieinrichtung S unter einem Winkel zur Ausbreitungsrichtung ζ des Laserstrahls, bei dem das Verhältnis des Anteils der Lichtbrechung an der Lichtstreuung zu dem Anteil der Beugung wesentlich erhöht ist gegenüber der Vorwärtsstreuung sowie einen nachgeschalteten Streulichtdetektor SD* Ferner gekennzeichnet durch die Anordnung einer Fluoreszenzsammeieinrichtung F derart, daß die durch die Reflektion an der zylinderförmigen Grenzfläche des Probenstroms P entstehende störende Lichtstreuung nicht zum Fluoreszenzdetektor FD gelangt. Dies wird erreicht, indem der Strahl des Probenstroms P in der Ebene y-z um einen Winkel i gegen die Senkrechte zum Laserstrahl geneigt wird, der größer ist als der Öffnungswinkel cc der Fluoreszenzsamme !einrichtung F·
Der erste Verfahrensschritt wird durchgeführt, indem die zu messenden Partikel in Flüssigkeiten suspendierten Partikel wird mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ge~ messen und die Suspensionsflüssigkeit mit der geringsten Streulichtintensität der Partikel bestimmt (Brechzahlanpassung).
1üEZ.1984*2l7535
Der zweite Verfahrensschritt wird durchgeführt, indem die Fluoreszenz der Partikel mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung in der Suspensionsflüssigkeit gemessen wird, in der die niedrigste Streulidatintensiiät erhalten wurde, In d,en nächfolgenden Beispielen wird die 'Erfindung näher erläutert,
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Bestimmung des DNA-Gehaltes von Hefezellen Saccharomyces cerevisiae nach Fluoroehromierung der Zellen mit Olivomycin durchgeführt. Im ersten Verfahrensschritt wurde mit der Streulicht- sammeleinrichtung S, bestehend aua einem Mikroskopobjektiv der numerischen Apertur 0,20 und dem Streulichtdetektor SD, bestehend aus einem Sekundärelektronenvervielfacher durch Messung der Streulichtintensität unter 25 Grad zur Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls ein mittlerer Brechungsindex der Hefezellen von η = 1,38 bestimmt. Im zweiten Verfahrensschritt wurde die Flureszenzintensität der Hefezellen, suspendiert in einer 20 %-igen CaCl?-Lösung mit η = 1,38, mit der Fluoreszenz-1 sammeleinrichtung F, bestehend aus einem Mikroskopobjektiv der numerischen Apertur 0,25 und dem Fluoreszenzdetektor FD, bestehend aus einem Sekundärelektronenvervielfacher, in einem um 30 Grad geneigten Probenstrom P ' gemessen. Das Histogramm der Fluoreszenzintensität der Hefezellen zeigt eine Verbesserung des Auflösungsvermögens, z, B. gemessen durch den Variationskoeffizienten um den Faktor 2,
Beispiel 2
Nach dem erfindungsgemäßer] Verfahren wurde mittels der beschriebenen er'findungsgemäßen Vorrichtung eine Bestimmung des DNA-Gehaltes an menschlichem Sperma durchgeführt. Die Pluorochromierung erfolgte mit Ethidiumbromid, die Zellen wurden in einer Flüssigkeit mit dem Brechungsindex η = 1,52 suspendiert. Die Histogramme der Fluoreszenzintensitäten zeigen eine Reduzierung des Formfaktors der Spermien gegenüber den in Wasser suspendierten.
Claims (3)
1, Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung der Menge in Partikeln eingebetteten Stoffs auf der Grundlage der hydrodynamischen Partike!zuführung in ein von einem Laserstrahl beleuchtetes Volumen (V), dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Verfahrensschritt der Brechungsindex der Partikel mittels Streulichtmeesungen bestimmt und in einem zweiten Verfahrens- .! schritt die fluorometrisch^ Messung in brechzahlangepaßter Suspensionsflüssigkeit des Probenstroms (P) durchgeführt wird·
2· Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1, bestehend aus einem Laser, einer Fokussierungsoptik, einer Hüllstromkainmer sowie einer Fluores- " zenz- und einer Streulichtsammeieinrichtung, gekenn~ zeichnet durch die Anordnung der Hüllstromkammer derart, daß der Probenstrom (P) um einen Winkel (i), der größer ist als der Öffnungswinkel ( ) der Fluoreszenzsammeieinrichtung (F), gegen die Senkrechte zur Ausbreitungsrichtung
(z) des Laserstrahls geneigt ist·
/3·.Vorrichtung nach Punkt 2, gekennzeichnet durch die Anordnung der Streulichtsammeieinrichtung (S) derart, daß unter einem Streuwinkel ( ), der den Lichtbrech- ' ungsanteil am Streulicht begünstigt, die Streulicht-. Intensitäten gemessen werden.
ή Seite Zeichnung
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| EP0610036A3 (de) * | 1993-01-28 | 1995-03-15 | Japan Res Dev Corp | Verfahren zur Spectrometrie und Vorrichtung hierzu. |
| DE102004034486A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-02-09 | Infineon Technologies Ag | Verfahren zum Nachweis von Lumineszenzlicht aus einer porösen Trägerstruktur |
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1984
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