DD225840C2 - Verfahren zur herstellung eines mittels zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen im pulmonalen surfactant-system einhergehen - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines mittels zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen im pulmonalen surfactant-system einhergehen Download PDFInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Surfactant aus der Lunge von Säugetieren. Der von Alveolarzellen des Typs Il gebildete Wirkstoff kann zur kausalen Therapie des durch Surfactantmangel bedingten Atemnotsyndroms bei Neugeborenen und Erwachsenen angewendet werden.
Die Hyalinmembran-Erkrankung (HMD) beruht auf einem Mangel an Alveolar-Surfactant in der Lunge und bedingt dadurch die Ausbildung von Atelektasen. Eine medikamentöse und kausale Behandlungsmöglichkeit wird in der Verabreichung von Lungen-Surfactant in der Trachea gesehen. Tierexperimentelle und erste klinische Versuche an Neugeborenen wurden sowohl mit natürlichem Surfactant als auch mit dessen Hauptbestandteil Dipalmityllecithin, vorwiegend in Kombination mit Phosphatidylglycerol, durchgeführt. Das natürliche Surfactant wird von einigen Autoren (MORLEY, CN. et.al.: The Lancet 1 (1981), S. 64-68) wegen ungenügender und stark variierender Aktivität als unzureichend für einen therapeutischen Einsatz betrachtet. T. FUJIWARA entwickelte ein halbsynthetisches Surfactant, das aus einer Mischung von natürlich vorkommendem Surfactant aus Säugerlungen und synthetischen Phospholipiden besteht. An 10 frühreifen Neugeborenen mit HMD wurden gute Behandlungserfolge erzielt (FUJIWARA, T.et.al.: The Lancet 1 (1980), S.55-59).
Die Gewinnung von Lungen-Surfactant kann aus Lungenhomogenat (V. NEERGARD, K.: Verh. Dtsch. Ges. inn. Med.41 (1929), S.249; CLEMENTS, J.A.: Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 95 (1957), S. 170), durch pervasale Ausspülung (BONDURANT, S.: D. A. MILLER, J. appl. Physiol.17 (1962), S. 167) oder broncheale Spülung (CLEMENTS, J. A.: Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 95 (1957), S. 170) erfolgen. Für eine therapeutische Nutzung des Wirkstoffs kommt nur die Isolierung aus stark zerkleinertem -ungengewebe in Betracht. Der dabei gewönne Extrakt enthält allerdings nicht nur die Komponenten des oberflächenaktiven Systems, sondern auch in Abhängigkeit von den angewandten Extraktionsbedingungen, lösliche und emulgierbare Bestandteile der Lunge und des in der Lunge enthaltenen Bluts.
Eine Möglichkeit zur Gewinnung dieses oberflächenaktiven Materials zur Behandlung der HMD ist in der DE-OS 3021006 beschrieben. Durch Elektrolytlösung wird aus Säugerlunge ein rohes Material gewonnen, dem zur Erreichung eines Phospholipidgehaltes von 75-95,5% die erforderliche Menge Phospholipid zugesetzt wird. Der Proteingehalt beträgt 0,5-5,0%. Nach der Abtrennung von Zellbruchstücken bei 500-1500 UPM wird das rohe Wirkstoffgemisch durch Zentrifugation bei 12000-16000UPM und 0 bis 100C als Sediment erhalten. Die weitere Aufarbeitung erfolgt durch mehrfache Wiederaufnahme der Lipide in Natriumchloridlösung und Abtrennung durch hochtourige Zentrifugation. Nach Dialyse, Extraktion mit Aceton und Aufnahme der PhosphoHpide in einem Chloroform-Methanol-Gemisch sowie Abdampfen des Lösungsmittels wird ein Wirkstoffgemisch erhalten, dem danr ii Sezug auf den Phosphatgehalt im molaren Verhältnis 1:0,65:0,12 Dipalmityliecithin und Phosphatidylglycerol zugesetzt werden.
Auch andere in der Literatur beschriebene Verfahren (BROWN, E.S., et. al.: J. ApII. Physiol. 14 (1959), S.717; JOBE, A.: Biochem. Biophys. Acta 489 (1977), S.440-453; KING, R.J., J.A.CLEMENTS: Am. J.Physiol.223 (1972), S.707-714; BERGREN, P., et. al.: IRCS Med. Sei.9 (1981), S. 283-284) zur Gewinnung von natürlichem Surfactant basieren auf der Extraktion oder dem Spülen von Säugerlunge mit Elektrolytlösungen und der anschließenden Trennung durch mehrfache Zentrifugation bei unterschiedlichen g-Zahlen und Temperaturen, wobei die Abtrennung der Phospholipide die Anwendung hoher g-Zahleη und Dichtegradienten erfordert, was bei der Maßstabsvergrößerung hohe Aufwendungen mit sich bringt.
SCARPELLI, E. M., et. al. (J. Appl. Physiol.23 (1967), S.880-886) gewannen ein Roh-Surfactant durch Extraktion von Hunde- und Kaninchenlunge mittels isotonischer Natriumchlorid-Lösung und anschließende mehrstufige Zentrifugation. Für analytische Zwecke wurden die Bestandteile des Surfactant durch Gelfiltration über Sephadex* G 200 getrennt. Auf Grund der unterschiedlichen Partikaigrößen und der oberflächenaktiven Eigenschaften führt die Gelfiltration zu hohen Materialverlusten und erscheint für präparative Zwecke nicht geeignet.
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MORLEY, C. J., et. al. (The Lancet 111981], S.64-68) verabreichten Neugeborenem mit HMDein synthetisches Lungensurfactont, bestehend aus einer Mischung von Dipalmityllecithin und Phosphatidylglycerol im Verhältnis 7:3, dessen Wirkung jedoch unzureichend ist. Die Herstellung eines synthetischen, proteinfreien Surfactant, bestehend aus Dipalmityllecithin und Hexadekanol wird von Clements im US-Patent 4312860 beschrieben.
Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches, in den technischen Maßstab übertragbares Verfahren zu finden, das mit möglichst geringem Aufwand die Gewinnung eines zur Behandlung des akuten Atemnotsyndroms geeigneten Wirkstoff gemisches in großen Mengen aus Säugerlungen gestattet.
Die technische Aufgabe der Erfindung, Sufactant aus Säugerlunge durch ein einfaches Verfahren im technischen Maßstab zu gewinnen, wird dadurch gelöst, daß das komplexe Wirkstoffgemisch aus einer wäßrigen Phase in eine einheitliche Lösungsmittelphase, die mit Wasser nicht mischbar ist, überführt wird, aus der es anschließend isoliert werden kann. Überraschend wurde gefunden, daß der phospholipidreiche und proteinhaltige Surfactant-Komplex aus dem wäßrigen Extrakt von zerkleinerter Säugetierlunge oder der wäßrigen Phase der Lunge selbst in ein einheitliches, nicht mit Wasser mischbares Lipidlösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Dichlormethan, Tetrachlormethan oder Petroläther, überführt werden kann, ohne dabei seine biologische Wirksamkeit zu verlieren. Ein großer Teil von störenden Zellbestandteilen, insbesondere Proteine, fällt dabei aus und kann leicht abgetrennt werden. Das bisher zur Lösung des Surfactant hauptsächlich für analytische Zwecke verwendete Extraktionsmittel nach FOLCH (Chloroform/Methanol im Volumenverhältnis 2:1) wird somit durch ein einheitliches Lipidlösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, vorteilhaft sind auch andere halogenierte Kohlenwasserstoffe, unter Vermeidung eines Alkoholanteils, ersetzt. Dadurch kann die bei den bisher üblichen Laborverfahren angewandte Vielzahl von Zentrifugierschritten, zum Teil bei sehr hoher g-Zahl und unter Verwendung von Dichtegradienten, vermieden werden. Oarüber hinaus erleichtert die Anwendung eines einheitlichen Lipidlösungsmittels die Rückgewinnung des Lösungsmittels durch Redestillation gegenüber der Verwendung eines Gemisches verschiedener Lösungsmittel und trägt somit erheblich zur Verbesserung der Ökonomie des Verfahrens bei.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Säugetierlunge, vorwiegend Rinder- oder Schweinelunge, von Fettgewebe und Trachearesten befreit und mit Hilfe eines Fleischwolfes zerkleinert. Der so erhaltene Lungebrei wird entweder sofort mit einem Lipidlösungsmittel, wie Chloroform oder einem anderen halogenierten Kohlenwasserstoff, ausgerührt, oder vom Lungebrei wird in bekannterweise ein wäßriger Extrakt—vorteilhafterweise mit isotonischen Elektrolytoder Zuckerlösungen — hergestellt und dieser mit einem Lipidlösungsmittel, wie Chloroform oder einem anderen halogenierten Kohlenwasserstoff, ausgerührt. Die direkte Extraktion der Lunge mit einem Lipidlösungsmittel, wie halogenierten Kohlenwasserstoffen, führt man mit 0,5 bis 1Ol Lösungsmittel, vorteilhaft 1,51 Lösungsmittel, pro kg Lungebrei durch. Die Herstellung eines wäßrigen Extraktes erfolgt mit 0,1 bis 0,5kg Lunge pro I Lösung, die Extraktion des Surfactant aus 11 dieser Lösung ist mit 0,1 bis 2,01, vorteilhafterweise0,251, Lipidlösungsmittel, vorzugsweise halogenierten Kohlenwasserstoffen, möglich. Die Lungerückstände werden von den Extrakten jeweils durch Filtration über Gaze getrennt, die ausfallenden Proteine nach der Chloroformbehandlung des wäßrigen Extraktes werden vorteilhaft durch Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltene Chloroformphase wird nach Klärung über Filter unter Vakuum bei 400C konzentriert und anschließend kann durch Stickstoffeinleitung bei 400C das Lösungsmittel völlig ausgetrieben werden, so daß eine pastöse gelblich-bräunliche Substanz zurückbleibt. Deren Phospholipidgehalt beträgt bei direkter Chloroformextraktion 20-50%, überwiegend 30-40%, und bei Zwischenschaltung der wäßrigen Extraktion 30-75%, überwiegend 50-60%.
Der Proteingehalt liegt bei direkter Chloroformextraktion zwischen 0,8 und 1,5% und bei Zwischenschaltung der wäßrigen Extraktion unter 1 %, überwiegend bei 0,5%
Herstellung des pharmazeutischen Mittels
Aus dem erhaltenen natürlichen Surfactant mit einem Phospholipidgehalt zwischen 20 und 75% wird durch die im folgenden beschriebenen Verfahren ein pharmazeutisches Mittel hergestellt.
Die Substanz wird nach Lösung in halogenierten Kohlenwasserstoffen über Glasfilter und Filterpapier vorgeklärt und anschließend über lösungsmittelstabile Membranen sterilfiltriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakkum wird der erhaltene Rückstand mit Wasser zur Injektion oder sterilen wäßrigen Lösungen emulgiert, in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophylisiert.
Als wäßrige Lösungen können dabei isotone Natriumchlorid- oder Calciumchloridlösungen bzw. isotone Lösungen von Mono- und Disacchariden eingesetzt werden. Zum Homogenisieren eignet sich vorteilhaft ein Ultra-Turrax. Außerdem ist ein Zusatz von geeigneten Mitteln zur Verbesserung der Emulgierfähigkeit, Erhöhung der Stabilität und Pufferung zur Erhaltung bestimmter pH-Bereiche möglich.
Eine andere Möglichkeit ein pharmazeutisches Mittel zu erhalten besteht darin, das erhaltene natürliche Surfactant — unter Umgehung der Sterilfiltration in organischen Lösungsmitteln — gleich in Wasser oder wäßrigen Lösungen zu emulgieren, wobei die oben aufgeführten Lösungen und Zusätze hier ebenfö is zutreffen, und die Emulsioi, zu autoklavieren. Nach Abkühlung kann, falls nötig, nochmals emulgiert werden. Anschließend wird die Emulsion in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.
4,1 kg frische Rinderlunge wurden von Fettgewebe, größeren Tracheateilen sowie anhaftendem Blut befreit und dabei zerteilt.
Anschließend erfolgte eine Zerkleinerung der Lungenstücke in einem Fleischwolf mit 4mm Lochscheibe und die so gewonnenen 3,5kg Lungebrei wurden mit 14,01 isotonischer Natriumchloridlösung durch einstündiges intensives Rühren bei 20X extrahiert.
Nach Absaugen über Dederongaze konnten 12,41 eines trüben Extraktes gewonnen werden, der 1 Stunde lang bei 200C mit
7,61 Chloroform ausgerührt wurde. Nach einer Standzeit über 3 Tage wurde der entstandene feine Proteinniederschlag 15min
bei 2000g abzentrifugiert. Man erhielt 5,811 einer klaren Chloroformphase, die nach Konzentrierung im
Rotationsumlaufverdampfer unter Stickstoff zur Trockne eingeengt wurden. Es konnten 6,14g Substanz gewonnen werden.
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19,5kg Lungebrei wurden wie im Beispiel 1 beschrieben aus 21,4kg Rinderlunge gewonnen. 5,0kg davon wurden in Portionen zu 2,5 kg mit je 8,01 isotonischer Natriumchloridlösung 5 min bei 2O0C intensiv gerührt und die nach Absaugen über Dederongaze erhaltenen Extrakte vereinigt. Die so erhaltenen 14,61 wäßrigen Extraktes vom pH-Wert 6,53 wurden in einem Hängegefäß mit 105,0g wasserfreiem Calciumchlorid versetzt und mit 3,651 Chloroform 1 h lang gerührt. Nach Absetzen lassen der Chloroformschicht und des Proteinniederschlages wurden die Chloroformphase und ein Teil der wäßrigen Phase aus dem Gefäß abgelassen und für 15min bei 2000g zentrifugiert. Es konnten 2,741 klare Chloroformphase gewonnen werden, die nach Konzentrierung im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne unter Stickstoff eingeengt, 7,04g Substanz ergaben. Beispiel 3
14,5kg des unter Beispiel 2 gewonnenen Lungebreis wurden zu 5 Portionen von 2,5kg und einer Portion 2,0 kg mit je 8,01 bzw. 6,41 isotonischer Natriumchloridlösung extrahiert, indem der Brei 20min bei 200C intensiv gerührt wurde. Die nach Trennung über Dederongaze erhaltenen 42,51 Extrakt (pH 6,59) wurden in einem Hängegefäß mit 297,5g wasserfreiem Calciumchlorid versetzt und mit 10,61 Chloroform 1 h lang gerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 2 angeführt. Aus 6,981
klarer Chloroformphase konnten 13,9g Substanz gewonnen werden. _ _ _
20,0kg Lungebrei wurden wie im Beispiel 1 beschrieben aus 22,5kg frischer Rinderlunge gewonnen. Der Lungebrei wurde in Portionen zu 2,5 kg mit je 8,Ol isotonischer Natriumchloridlösung im Stutzen unter intensivem Rühren 20min bei 2O0C extrahiert. Es konnten 54,Ol Extrakt nach Abtrennen der Lungerückstände über Dederongaze erhalten werden. Davon wurden 30,Ol in 3 Portionen zu 8,Ol und einer Portion zu 6,Ol mit je 60,0g wasserfreiem Calciumchlorid versetzt und mit je 4,Ol bzw. 3,Ol Chloroform im Stutzen 30 min gerührt. Nach Absetzen über Nacht bei 40C wurde die überstehende wäßrige Phase weitestgehend abgesaugt und der Proteinniederschlag sowie die chloroformige Phase wurden bei 4000g in einer Kühlzentrifuge getrennt. Die erhaltene klare Chloroformphase von 10,01 wurde geteilt. Nach Einengen von jeweils 5,01 im Vakuumrotationsverdampfer "' vurde der eine Teil unter Stickstoff zur Trockne eingeengt, der andere unter Vakuum im Exsikkator bei 40°C getrocknet. Im ersten Fall konnten 3,43g und beim Einengen im Vakuum 3,31 g Substanz erhalten werden. Beispiel 5
200 kg Lunge wurden von Fettgewebe und großen Tracheateilen befreit und in einem Fleischwolf mit 8 mm Lochscheibe zerkleinert. Der Lungebrei wurde mit 600I isotonischer Natriumchloridlösung in einem Industrieextraktor 30min bei 17°C gerührt. Nach 15min Standzeit sammelte sich der überwiegende Teil der Lunge über der wäßrigen Phase. Diese konnte vom Boden des Extraktors abgezogen und über einen Separator von noch enthaltenen Lungeteilen und Blutzellen befreit werden. Die410l wäßrigen Extrakts wurden in 2001-Kippkesseln weiterverarbeitet. Zweimal wurden 1301 Extrakt mit je 1,1 kg wasserfreiem Calciumchlorid versetzt und mit je 32,Ol Chloroform (2. AB-DDR) 25min bei 150C gerührt, und einmal wurden 1501 Extrakt, versetzt mit 1,2kg wasserfreiem Calciumchlorid und 36,Ol Chloroform (2.AB-DDR), 25min gerührt. Nach einer Standzeit über Nacht wurde jeweils die wäßrige Oberphase und damit ein Teil der gefällten Proteine abdekantiert und der Rest über eine Schälzentrifuge getrennt. Es wurden etwa 6Ol Chloroformphase erhalten, die im Vakuumumlaufverdampfer und anschließend im Rotationsumlaufverdampfer eingeengt wurden. Mit Stickstoff wurden die Lösungsmittelreste ausgetrieben. Es konnten 513g Substanz gewonnen werden. Beispiel 6
2,0 kg Lungebrei, der wie unter Beispiel 1 beschrieben aus 2,2 kg Rinderlunge gewonnen werden konnte, wurde in 5,Ol Chloroform 60 min bei 200C gerührt. Nach dem Abfiltrieren der Lunge wurde der Chloroformextrakt nach Konzentrierung im Rotationsumlaufverdampfer unter Stickstoff zur Trockne eingeengt. Es wurden 2,84g Substanz erhalten. Beispiel 7
8,0kg Lungebrei, hergestellt aus Rinderlunge entsprechend Beispiel 1, wurde in 4 Portionen zu 2,0kg mit je 3,Ol Chloroform 60min bei 200C gerührt. Nach Abtrennen der Lunge über Filterpapier wurde der Extrakt wie im Beispiel 6 beschrieben, zur Trockne eingeengt. 37,0g Substanz konnten gewonnen werden
Beispiel 8
2,5kg Lungebrei, hergestellt aus Rinderlunge entsprechend Beispiel 1, wurde mit 3,Ol Chloroform 10min bei 2O0C ausgerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 6 beschrieben. Es wurden 6,63g Substanz gewonnen. Beispiel 9
276kg frische Rinderlunge wurden von Fettgewebe und größeren Tracheateilen befreit und in einem Industriefleischwolf mit 8mm Lochscheibe zerkleinert. Die so erhaltenen 250kg Lungebrei wurden mit 300I Chloroform bei 220C in einem Industrieextraktor 60min ausgerührt. Die Chloroformphase wurde nach 50min Standzeit abgelassen, am Vakuumumlaufverdampfer und Vakkuumrotationsverdampfer konzentriert und durch Stickstoffeinleitung zur Trockne eingeengt. Es wurden 950g Substanz erhalten
Beispiel 10
7,2kg frische Rinderlunge wurden von Fettgewebe und größeren Tracheateilen befreit und nach Abwaschen von anhaftendem Blut in einem Fleischwolf z«r' ieinert. Die 6,0kg Lungebrei wurden portionsweise mit isotonischer Natrium hloridlösung 30min ausgerührt, wobei auf 2,5kg Lungebrei 8,Ol wäßrige Lösung kamen. Nach Abtrennung der Lungerückstände über Dederongaze wurden 8,81 der erhaltenen 17,61 Extrakt mit 59,0g Calciumchlorid, wasserfrei, versetzt und mit 2,21 Tetrachlorkohlenstoff 30 min ausgerührt. Es konnten 1,971 organische Phase erhalten werden. Nach Abtreiben des Lösungsmittels wurden 2,34g Substanz gewonnen
Beispiel 11
Aus 2,0kg chloroformhaltigen Lungerückstand des Beispiels 7 wurde entsprechend der in der DD-PS 145544 beschriebenen Methode Aprotinin gewonnen. Es wurden 282 mg Substanz mit einer spezifischen Aktivität von 4770ATrE/my gewonnen. Beispiel 12
Aus 2,0 kg Lungerückstand des Beispiels 1 wurde entsprechend der in der DD-PS 145544 beschriebenen Methode Aprotinin gewonnen. Es wurden 315mg Substanz mit einer spezifischen Aktivität von 4210 ATrE/mg gewonnen. Beispiel 13
5,0g erfindungsgemäßen Wirkstoffs (Phospholipidgehalt: 56,8%) wurden in 50,0ml Chloroform (2. Arzneibuch der DDR) gelöst, über Glasfaserfilterpapier (Schichtdicke 1,80mm) und Filtrierpapier vorfiltriert sowie anschließend über Glasfaservorfilter (Schichtdicke 450Mm) auf Cellulose-Sterilfilter (0,2μητ> Porendurchmesser, 90^m Schichtdicke) sterilfiltriert.
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Nach Konzentration der sterilen Lösung am Vakuumrotationsverdampfer wurden durch Einleiten von sterilem Stickstoff bei gleichzeitiger Evakuierung des Gefäßes die Lösungsmittelreste ausgetrieben. Die so erhaltene sterile Substanz wurde mit 40,0ml sterilem Wasser mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und die Emulsion so in 25ml Rollrandflaschen abgefüllt, daß 7 Flaschen 400mg Phospholipid enthielten. Nach Einfrieren bei -50°C für 3 Tage wurden die Proben lyophilisiert, dabei wurde die Gegenheizung auf maximal 20°C eingestellt. Nach der Gefriertrocknung wurden die Flaschen mit Durchstechstopfen B und Alu-Capsolutverschluß verschlossen
Beispiel 14
4,5g erfindungsgemäßen Wirkstoffs (Phospholipidgehalt 40%) wurden mit 45,0ml destilliertem Wasser mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und in einem Erlenmeyerkolben mit Außenschliff-Stopfen 30min autoklaviert. Nach Abkühlen der Emulsion wurde diese zur Verbesserung der Qualität nochmals 2 min unter sterilen Bedingungen mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und die Emulsion so in 25ml-Rollrandflaschen abgefüllt, daß 9 Flaschen 200mg Phospholipid enthielten. Nach Einfrieren bei -250C für 5 Tage wurden die Proben lyophilisiert, dabei wurde die Gegenheizung auf maximal 200C eingestellt. Nach der Gefriertrocknung wurden die Flaschen mit Durchstechstopfen B 180 und Alu-Capsolutverschluß verschlossen. Zur Beschreibung der erhaltenen erfindungsgemäßen Substanz werden folgende analytische Methoden angewandt: Der Phospholipidgehalt wurde nach einer von BARTLETT (N.ZÖLLNER und D.EBERHAGEN: „Untersuchung und Bestimmung der Lipide im Blut"; Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1965) veröffentlichten Methode (s = ±2%) bestimmt. Als Vergleichssubstanz diente Kaliumdihydrogenphosphat. Der Gehalt an Cholesterol wurde mit einer kolorimetrischen Methode bestimmt, wobei neben dem Cholesterol auch der Cholesterolester erfaßt wird (s = +4%).
Die Neutrallipide ließen sich mit der Triglycerid-Bestimmungsmethode des 2. Arzneibuches der DDR, Methode 1A. 1.1. erfassen. Der Proteingehalt wurde nach einem von HESSE und LINDNER (Zeitschrift für AIIg. Mikrobiologie 11 (1971), S. 585-594; ebenda 15 [1975], S. 559-561) beschriebenen Verfahren bestimmt, das sich besonders gut zur Ermittlung von Proteinkonzentrationen in wäßrigen Emulsionen eignet (s = 3%). Die Bestimmung der einzelnen Phospholipide wurde nach ^ünnschichtchromatographischer Trennung entsprechend P.GENTER und Mitarbeiter (J. of Chromatography 206 [1981], j.200-204) kolorimetrisch (siehe N.ZÖLLNER und D.EBERHAGEN: „Untersuchung und Bestimmung der Lipide im Blut"; Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1965) durchgeführt (s = ±3%fürdie Hauptkomponenten). Als Vergleichssubstanz diente Kaliumdihydrogenphosphat. Der Elutionsverlust der Phospholipide liegt innerhalb der Streuung. Die Ermittlung des Gehaltes an freien Fettsäuren erfolgt nach dünnschichtchromatographischer Trennung und Elution im Gaschromatographen (s = ±10%).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Präparate zeigten, ohne daß weitere Zusätze notwendig sind, bei der in vivo-Testung an Tiermodellen eine hohe Wirksamkeit. Der Nachweis erfolgte an 2 international anerkannten Modellen.
1. Einfluß von Surfactant bei Erwachsenen-Atemnotsyndrom (Tabelle 2)
Der Einfluß einer Surfactant-Instillation beim Erwachsenen-Atemnotsyndrom wurde an Meerschweinchen untersucht. Vor Erzeugung der akuten respiratorischen Insuffizienz wurden die Tiere nach allgemeiner Anaesthesie tracheotomiert, ein Katheter zur Blutentnahme in die A. carotis eingeführt und druckkonstant mit reinem Sauerstoff beatmet. Das akute Atemnotsyndrom wurde bei den Tieren durch Smalige bronchiale Auswaschung des Surfactant mit warmer physiologischer Kochsalzlösung erreicht. Die Spülvolumina entsprachen der Vital kapazität der Tiere. Am Ende der Spülprozedur lag die arterielle Sauerstoffspannung bei diesen Tieren, trotz Beatmung mit Spitzendrucken von +30cm H2O, Positive Endexpiratory-Pressure (PEEP) von 8cm H2O und reinem Sauerstoff, unter 60mm Hg. 10 und 40 Minuten nach der letzten Lungenspülung erhielt die Hälfte der Tiere je 1 ml Surfactant tracheal instilliert. Die Blutgasanalysen erfolgten 5,15 und 30 Minuten nach der jeweiligen Surfactant-Gabe. Ein optimales Surfactant führt unter absolut gleichen Beatmungsbedingungen zu einer unmittelbaren Erhöhung der arteriellen Sauerstoffspannung um durchschnittlich 200mg Hg.
2. Einfluß von Surfactant in unreifen Lungen (Fig. 1, Tabelle 2)
Zur Testung des Einflusses vom Surfactant auf unreife Lungen wurden unreife Kaninchenneugeborene durch Hysterotomie im 27. Schwangerschaftstag geboren (Gesamtschwangerschaftsdauer: 31+1 Tag). Die Tiere wurden unmittelbar nach der Geburt tracheotomiert und ein Teil erhielt über die Trachealkanüle druchschnittlich 60 μΙ Surfactant in die Trachea instilliert; unbehandelte Schwestertiere des gleichen Wurfes dienten als Kontrollen. Anschließend wurden die Tiere in einem druckkonstanten Ganzkörperphlethysmographen (38°C) plaziert und mit reinem Sauerstoff bei kontinuierlicher Registrierung von Beatmungsdruck und Atemvolumen beatmet. Von den Primärdaten erfolgte die Berechnung der Thorax-Lungen-Compliance. Bei einigen Versuchen wurden alle Tiere nach der Geburt für 10-15 Minuten beatmet, und erst dann erhielt ein Teil der Tiere Surfactant über die Trachea instilliert.
In beiden tierexperimentellen Modellen konnten mit den getesteten Surfactant-Präparaten gute bis ausgezeichnete Ergebnisse erzielt werden. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Surfactant-Präparates erfolgt durch tracheale Instillation oder Tröpfcheninhalation mittels Verneblers bei allen akuten oder chronischen Lungenerkrankungen, die mit einem Surfactantmangel einhergehen. Die Therapie mit drm Surfactant-Präparat ist deshalb angezeigt beim Atemnotsyndrom der Erwachsenen, hervorgerufen durch
— Trauma (Schocklunge)
— Viruspneumonie
— Herzinfarkt
— akutes Nierenversagen
— Gasvergiftungen
— Verbrennungen
— Überinfusion („Überwässerung")
— Arzneimittelvergiftungen
— Lungenkontusion
— Fettembolien
— Sepsis " "" " ""
— Aspirationspneumonie
— Künstliche Beatmung
— Sauerstoffvergiftung
— Bestrahlung
— Post-Perfusions-Lunge
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und allen weiteren inneren und äußeren Noxen, die zu einem Lungenödem führen sowie bei Atemwegserkrankungen mitgestörtem bronialen Surfactant, wie z.B. bei allen chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (Asthma, chronische Bronchitisetc.). Außerdem kann das Surfactant-Präparat sowohl zur Verbesserung des nichtciliaren Mucustransports als auch zur
ist selbstverständlich, daß ein beim Erwachsenen-Atemnotsyndroms einsetzbares Präparat auch beim Neugeborenen-
für die Behandlung eines Erwachsenen 0,5g bis 20g, vorzugsweise 10 bis 15g, für die Behandlung eines Neugeborenen 0,1 bis
5,0g, vorzugsweise 0,2g, Phospholipid benötigt werden.
Methodik
mittels einer WILHELMY-Waage (Typ ATF 01, Hersteller: Fa.E.Biegler, Mauerbach, Österreich).
| Tabelle 1 | Phospho | PC PE PG | Sph | PS | Pl | Pro | Neutral- Chlor- | Freie | Was |
| lipid | tein | lipide esterol | Fett | ser | |||||
| gehalt | nicht bestimmt | säuren | |||||||
| Chemische Zusammensetzung (%) | gesamt | 31,9 3,0 0,7 | 6,7 | 0,8 | 1,4 | 0,32 | nicht bestimmt | ||
| 31,3 3,3 0,9 | 6,0 | 1,4 | 2,1 | 0,26 | 14,0 15,8 | 5,1 | 2,0 | ||
| 57,5 | 27,7 4,6 0,9 | 6,2 | 0,7 | 0,8 | 0,24 | 14,6 15,2 | 8,1 | 2,8 | |
| 56,8 | 16,4 5,2 0,5 | 3,5 | 0,2 | 0,5 | 0,22 | 15,2 16,5 | 9,1 | 2,2 | |
| 54,9 | nicht bestimmt | 0,83 | 61,3 9,9 | 3,6 | 1,3 | ||||
| 52,8 | 14,1 4,7 0,32 | 4,6 | 0,7 | 0,8 | 1,5 | nicht bestimmt | |||
| Beispiel 1 | 30,0 | nicht bestimmt | 1,1 | 51,5 20,9 | 4,6 | 2,2 | |||
| Beispiel 2 | 40,0 | 13,3 3,5 0,3 | 3,6 | 0,3 | 0,4 | 1,3 | nicht bestimmt | ||
| Beispiel 3 | 30,8 | nicht bestimmt | 1,2 | 54,2 13,5 | 2,1 | 2,4 | |||
| Beispiel 4*) | 33,2 | Phosphatidylcholin | 0,4 | nicht bestimmt | |||||
| Beispiel 5 | 26,4 | Phosphatidylethanolamin | Sph | Sphingomyalin | |||||
| Beispiel 6 | 53,2 | Phosphatidylglycerol | PS | Phosphatidylserin | |||||
| Beispiel 7 | :PC | Pl | Phosphatidylinosit | ||||||
| Beispiel 8 | PE | ||||||||
| Beispiel 9 | PG | ||||||||
| Beispiel 10 | |||||||||
| Abkürzungen: | |||||||||
*) Bei Beispiel 4 ist die unter Stickstoff eingeengte Substanz verwendet worden.
Compliance(ml/crr»H20-kg"1)
bei einem Beatmungsdruck von +25 cm H20,30 min nach Geburt
Arterielle Sauerstoffspannung (mm Hg) beim experimentellen Atemnotsyndrom durch Lungenspülung vor und nach Surfactant-Instillation vor Instillation 30 min nach
| Beispiel 1 | 1,18 ±0,24 | 4 | nicht bestimmt | 234 ± 51 | 4 |
| Beispiel 2 | 1,73 ±0,43 | 6 | 40 + 7 | 269 ± 36 | 4 |
| Beispiel 3 | 2,49 + 0,57 | 7 | 36+11 | 278 ± 42 | 3 |
| Beispiel 4*) | 2,35 + 0,35 | 4 | 46 ±9 | ||
| Beispiel 5 | 1,01+0,32 | 5 | nicht bestimmt | 224 ± 40 | 3 |
| Beispiel 6 | 1,36 ±0,21 | 5 | 51+8 | 260 ± 68 | 4 |
| Beispiel 7 | 1,60 + 0,3 | 7 | 39+13 | 250 ± 59 | 4 |
| Beispiel 8 | 1,42 + 0,42 | 8 | 54±9 | ||
| Beispiel 9 | 1,12 + 0,24 | 8 | nicht bestimmt | ||
| Beispiel 10 | 1,75 + 0,31 | 4 | nicht bestimmt | 88 + 59 | 36 |
| Kontrolltiere | 0,095 ± 0,061 | 124 | 56+18 | ||
*) Bei Beispiel 4 ist die unter Stickstoff eingeengte Substanz verwendet worden.
Hierzu .t..M^ Zeichnungen
Claims (8)
- -1- 257 642 4Erfindungsansprüche:1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Veränderungen im pulmonalen Surfactant-System einhergehen durch Extraktion zerkleinerter Lungen von Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerkleinerte Lunge oder einen wäßrigen Lungenextrakt mit einem nicht mit Wasser mischbaren Lipidlösungsmittel extrahiert, den Extrakt von ungelösten Bestandteilen befreit, das Lipidlösungsmittel entfernt und den erhaltenen lösungsmittelfreien Wirkstoff in eine zur Applikation geeignete pharmazeutische Form bringt.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wäßrigen Lungenextrakt verwendet, der durch Ausrühren von zerkleinerter Lunge mit der 2 bis 10fachen Gewichtsmenge isotonischer Kochsalzlösung oder Lösungen von Mono- oder Disacchariden gewonnen wurde.
- 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lipidlösungsmittel halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Di-, Tri- oder Tetrachlormethan oder Petrolether einsetzt.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man pro kg zerkleinerter Säugerlunge 0,5 bis 101, vorzugsweise 1,51 Lipidlösungsmittel einsetzt.
- 5. Verfahren nach Punkt 1,2,3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den wäßrigen Lungenextrakt mit dem 0,1 bis 2fachen Volumen an Lipidlösungsmittel extrahiert. ,
- 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff durch Lyophilisiation und Emulgieren in einer physiologischen Trägerflüssigkeit in eine zur Applikation über Atemwege geeignete Form bringt.
- 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in halogenieren Kohlenwasserstoffen gelöst, über geeignete Membranen oder Filterschichten sterilfiltriert, anschließend von den halogenierten Kohlenwasserstoffen befreit, emulgiert und lyophilisiert wird.
- 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff als Emulsion autoklaviert und anschließend liophylisiert wird.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25764283A DD225840C2 (de) | 1983-12-08 | 1983-12-08 | Verfahren zur herstellung eines mittels zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen im pulmonalen surfactant-system einhergehen |
| BG6777584A BG49073A1 (en) | 1983-12-08 | 1984-12-05 | Remedy for treatment of asthmatic syndrome caused by lack of surface- active substance and method for obtaining it |
| CS849383A CS938384A1 (en) | 1983-12-08 | 1984-12-05 | Pharmaceutical agent for breathlesness therapy and method of its production |
| FI844844A FI81261C (fi) | 1983-12-08 | 1984-12-07 | Foerfarande foer framstaellning av ett farmaceutiskt medel foer behandling av andnoedssyndrom paokallande av surfaktantbrist. |
| HU457984A HU192088B (en) | 1983-12-08 | 1984-12-07 | Process for producing pharmaceutical composition for treating dyspnoea in consequence of lack of surface-active materials |
| EP19840115103 EP0145005B1 (de) | 1983-12-08 | 1984-12-10 | Lungen-Surfactant, Verfahren zu seiner Herstellung und seine pharmazeutische Verwendung |
| AT84115103T ATE42040T1 (de) | 1983-12-08 | 1984-12-10 | Lungen-surfactant, verfahren zu seiner herstellung und seine pharmazeutische verwendung. |
| DE8484115103T DE3477642D1 (en) | 1983-12-08 | 1984-12-10 | Pulmonary surfactant, process for its preparation and its pharmaceutical use |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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|---|---|
| DD225840A3 DD225840A3 (de) | 1985-08-07 |
| DD225840C2 true DD225840C2 (de) | 1986-04-16 |
Family
ID=5552692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| DD25764283A DD225840C2 (de) | 1983-12-08 | 1983-12-08 | Verfahren zur herstellung eines mittels zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen im pulmonalen surfactant-system einhergehen |
Country Status (1)
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|---|---|
| DD (1) | DD225840C2 (de) |
-
1983
- 1983-12-08 DD DD25764283A patent/DD225840C2/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD225840A3 (de) | 1985-08-07 |
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