DD226014A1 - Verfahren zur herstellung der w-tert. butylester von aminodicarbonsaeuren - Google Patents

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Michael Beyermann
Michael Bienert
Hans-Dieter Jakubke
Monika Przybylski
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Akad Wissenschaften Ddr
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiv in der Seitenkette geschuetzten a-Aminodicarbonsaeurederivaten durch enzym-katalysierte Hydrolyse der entsprechenden a-, v-Di-tert. Butylesterderivate. Derartige selektiv geschuetzte Derivate der Asparaginsaeure und Glutaminsaeure finden Anwendung bei der Synthese von Peptiden und damit in der pharmazeutischen Industrie.

Description

Verfahren zur Herstellung der CJ.-tert. Butylester von Aminodicarbonsäuren
Anwendunqsqebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiv ü -geschützten Asparaginsäure- und Glutaminsäurederivaten mittels enzyraatischer Hydrolyse entsprechender oC -, OJ -Diesterderivate. Derartige selektiv geschützte Derivate der Asparaginsäure und Glutaminsäure finden Anwendung bei der Synthese von Peptiden Und damit in der pharmazeutischen Industrie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die Synthese asparaginsäure- oder gIuta^insavrehsl^tiger Peptide erfordert den selektiven Schutz der Seitenketten funktion gegenüber der für die Peptidkupplung notwendigerweise freien oL-Carboxylgruppe. Als Schutzgruppen kommen dabei der Benzylester oder der tert.-3utylester zur Anwendung. Während die Darstellung von U) -Benzylestern von Asp und GIu durch chemische Methoden mit guten Ausbeuten in einer einstufigen Reaktion realisierbar ist, (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie Vol» 15/1 Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, S. 645 ff.) ist die Darstellung entsprechender (C tert. Butylester bedeutend aufwendiger. In der Praxis finden zwei Varianten Anwendung (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie Vol. 15/1 Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, 3. 649 ff.):
1.) Ausgehend von N -geschützter Aminosäure (Z-Asp bzw. Z-GIu) wird über das Anhydrid der oC -Methylester hergestellt, der mittels Isobuten in der Seitenkette in den tert. Butylester überführt wird. Die anschließende alkalische Hydrolyse des dL -Methylesters und hydro-
geholytische Abspaltung der Aminoschutzgruppe führt zum gewünschten^ -tert. Butylester,
2. N -Benzyloxycarbonyl-Asparagin bzw. -Glutamin wird in den Methylester überführt. Anschließend erfolgt die Abspaltung des Seitenkettenamides. Durch Umsetzung mit Isobuten wird die Seitenkettenfunktion in den tert. Butylester überführt. Die sich anschließende Abspaltung der N - und C 0^-Schutzgruppen entsprechend 1. führt zum gewünschten W -tert. Butylderivat.
Nach Sirr (EP-P3 006 856) lassen sich ^ -tert. Butylester der Asparaginsäure und der Glutaminsäure durch direkten Umsatz mit Isobuten und anschließender Reinigung herstellen» Dabei werden die unterschiedlichen Veresterungsgeschwindigkeiten an der cL - und der W -Carboxylgruppe ausgenutzt. Bei diesem Verfahren ist der gebildete CO -Monoester stets entsprechend dem Verhältnis der Sildungsgeschvvindigkeiten von oL - und iO -Monoester mit cL -Monoester verunreinigt. Für die weitere Verwendung des O-tert. Butyl-monoesters in der Peptidsynthese muß jedoch eine Ve run !reinigung mit cL -tert. Butylmonoester ausgeschlossen werden können» Es ist deshalb eine aufwendige quantitative Trennung der hinsichtlich ihrer physiko-chemischen Eigenschaften sehr ähnlichen cL - und CJ -Monoester erforderlich.
Ein analoges Verfahren zur Herstellung von iJ-tert. Butylester der Glutaminsäure durch direkten Umsatz von Glutaminsäure mit Essigsäure-tert.-butylester wurde bereits 1963 von Taschner et al. (Taschner, E. et al., Ann. Ghem. 663, (1963) ISS) beschrieben. In d.er peptidchsmischen Praxis wird zur Gewährleistung der Isomerenfreiheit des LO -tert. 3utylesters dem zwar aufwendigeren, aber dafür sicheren, Verfahren über den temporären Schutz der C^-Carboxylgruppe der Vorrang gegeben, um die entsprechende Reinheit der zu synthetisierenden Peptide zu sichern* Neben den o.g. chemischen Verfahren sind keine enzymatischen Verfahren zur Darstellung von (J-tert. Butylesterderivaten bekannt.
Ziel der Erfindung
Es ist das Ziel der Erfindung, LO -tert. Butylester von Asparaginsäure und Glutaminsäure sowie deren N-Acylderivate unter Inanspruchnahme weniger Schritte und unter Ausschluß der Möglichkeit einer Verunreinigung mit dem entsprechenden ei -tert. Butylester bzw· dessen N-Acylderivat in guten Ausbeuten herzustellen,
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem mit geringem Aufwand cL -, U? -Di-tert.-Sutylesterderivate selektiv in die U) -Monoesterderivate umgesetzt werden .
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß 'die"""du"rch"T)msetzung in Isobuten/Schwefelsäure einfach und in hohen Ausbeuten herstellbaren cL -, LO -Di-tert. Butylesterderivate der allgemeinen Formel I, in der R=H, Acyl und η = 1 oder 2 bedeuten, unter Einwirkung von Enzymen selektiv in die Lo -Monoesterderivate überführt werden. Die Selektivität der Hydrolyse wird durch die Selektivität der Enzyme gewährleistet»
R-NH-CH-COOC(CH-)
ι O
COOC(CH3)3
Im Ergebnis der enzyraatischen Hydrolyse wird der entsprechende W -tert. Butylestsr erhalten, der bei unvollständiger Hydrolyse lediglich mit Diester verunreinigt sein kann. Dieser kann jedoch j ebenso wie das Enzym,auf einfache Weise abgetrennt werden. Zur Hydrolyse können in diesem Zusammenhang Enzyme oder enzymhaltige Mixturen mit hinreichender Esteraseaktivität gegenüber Substraten der allgemeinen Formel I verwendet werden. Besonders bewährt hat sich der Einsatz leicht zugänglicher proteolytischer Enzyme, wie cL -Chymotrypsin oder Pronase F. Hinsichtlich der Reinheit der Enzyme sollten
lediglich Verunreinigungen vermieden werden, die die Produktisolierung erschweren. So können u.a. auch durch die Verwendung von entfettetem Schweine- und Rinderpankreas (Pancreatin) gute Resultate erzielt werden. Darüber hinaus lassen sich bei analogem Vorgehen auch die O-Senzylester von Asparaginsäure oder Glutaminsäure bzw· deren N-Acylderivate durch enzymatische Hydrolyse der entsprechenden oC-» lO -Dibenzylesterderivate herstellen.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Ausführunqsbeispiele Beispiel 1;
100 mg H-GIu(OBut)-OBut, gelöst in 5 ml 0,05 M TRIS/HCl 0,005 M CaCl2, pH 7,5,werden mit 20 mg oC-Chymotrypsin versetzt. Der Ansatz wird S^Tage~bei 37 0C gerührt· Die quantitative Auswertung der dünnschichtchromatographischen Untersuchung (QTLC) des Ansatzes (auf KG 60 - Glasfertigplatten der Fa. Merck nach Entwicklung mit Ninhydrin oder Senzidin) zeigte eine 91%ige Bildung von H-GIu(OBu )-OH an. Zur Isolierung des gewünschten Monoesters wird der eingeengte Ansatz über eine mit Kieselgel 60 gefüllte Säule (2 χ 10 cm) in Chloroform mit steigendem Ethanolgehalt chroraatographiert· Es wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt. Aus den Fraktionen . 53 - 61 wurden 3,2 mg H-GIu(OBut)-OBu und aus den Fraktionen 85 - 102 80,1 mg H-GIu(OBu )-OH durch Einengen i.V. gewonnen.
Beispiel 2:
10 mg H-Glu(03ut)-0But, gelöst in 1 ml 0,05 M TRIS/HCl 0,005 M CaCl-, pH 7,5, werden mit 5 mg Pankreatin versetzt.
Nach 3 Tagen Rühren bei 37 0C zeigte die QTLC 56%, nach 5 Tagen 68 % und nach 10 Tagen 74 % gebildeten H-GIu(OBu*)-
Isolierung wie im Beispiel 1.
Beispiel 3;
100 mg H-GIu(OBu Z) -OBu11, gelöst in 5 ml 0,05 M TRIS/HCl 0,005 M CaCl-t pH 7,5, werden mit 20 mg Pronase P versetzt und der Ansatz bei 37 0C gerührt. Nach 20 h werden weitere 10 mg Pronase P zugesetzt und noch 1 h gerührte Die QTLC ergab eine 93%ige 3ildung von H-GIu(OBu1")-OH»
3eispiel 4:
43 mg H-ASp(OBu11)-OBu11, gelöst in 5 ml 0,05 M TRIS/HCl 0,005 M CaCl2, pH 7,5, werden mit 12 mg Pronase P versetzt. Nach 14 h Rühren bei 37 0C konnte eine 9O50ige Bildung von H-Asp(0But)-0H nachgewiesen werden (QTLC).
3eispiel 5:
120 mg Z-GIu(OBu*)-OBu* werden in 5 ml 0,05 M TRIS/HCl 0,005 M CaCl2, pH 7,5, suspendiert. 15 mg Pronase P werden zugesetzt und der Ansatz bei 37 0C gerührt· Nach 22 h und 44 h werden jeweils weitere 15 mg Pronase P zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 66 h wurden 40 % Z-GIu(OBu^-GH gebildet (QTCL). Die Produktisolierung erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben»
3eispiel 6:
24 rag H-Asp(03ut)-0But, gelöst in 0,5 ml 0,05 M TRIS/HCL 0,05 M CaCl2, pH 7,5, werden mit 5 mg Pankreatin versetzt und der Ansatz bei 37 0C gerührt. Nach 7 h waren 75 % H-ASp(OBu1") OH gebildet worden (QTLC).
Beispiel 7:
5 mg Z-Asp(OBzl)-QBzI, gelöst in 0,05 ml N,N-Dimethylacetamid werden mit 2 rag o6-Chymotrypsin in 0,15 ml 0,1 M TRIS/HCL, pH 8, versetzt. Nach 16 h Rühren bei 37 0C wurden 53 % Z-Asp-(OBzI)-OH gebildet (QTLC). Die Isolierung erfolgte analog Beispiel 1·
Beispiel 8:
Wie Beispiel 7, nur an Stelle o(,-Chymotrypsin wird Pronase P verwendet. Nach 16 h wurden 95 % M Z-Asp(OBzI)-OH gebildet (QTLC).
3eispiel 9:
Wie Beispiel 7, nur anstatt oL -Chymotrypsin wird Pankreatin eingesetzt. Nach 16. h wurden 74 % Z-Asp(CBzI)-CH nachgewiesen (QTLC).

Claims (4)

ErfindungSanSpruch
1. Verfahren zur Herstellung der ü-tert. 3utylester von Amino-dicarbonsäuren entsprechend der allgemeinen Formel
R-NH-CH-COOH
Vn
COOC(CH3)3
wobei R=H, Acyl
η = 1, 2
bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß die entsprechenden cC - IO -Oi-tert» Butylester unter Verwendung von Enzymen in die gewünschten tu-tert, Butylraonoester überführt werden ·
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzyme Proteasen verwendet werden.
3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym oL -Chymotrypsin verwendet wird,
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym Pronase P verwendet wird·
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008968A1 (en) * 1996-08-26 1998-03-05 Nsc Technologies Llc REGIOSELECTIVE α-HYDROLYSIS OF AMINO ACID DIESTERS USING PIG LIVER ESTERASE

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008968A1 (en) * 1996-08-26 1998-03-05 Nsc Technologies Llc REGIOSELECTIVE α-HYDROLYSIS OF AMINO ACID DIESTERS USING PIG LIVER ESTERASE
US5928909A (en) * 1996-08-26 1999-07-27 Nsc Technologies Llc Regioselective α-hydrolysis of amino acid diesters using pig liver esterase

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