CH619983A5 - - Google Patents

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CH619983A5
CH619983A5 CH1495475A CH1495475A CH619983A5 CH 619983 A5 CH619983 A5 CH 619983A5 CH 1495475 A CH1495475 A CH 1495475A CH 1495475 A CH1495475 A CH 1495475A CH 619983 A5 CH619983 A5 CH 619983A5
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CH
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gly
arg
benzoyl
substrate
glu
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CH1495475A
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Leif Erik Aurell
Karl Goeran Claeson
Original Assignee
Kabi Ab
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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Material, in welchem die Serinproteasen bestimmt werden sollen, mit einem Substrat zusammenbringt, das die folgende Formel aufweist:
Ri-Ai-A2-Gly-Arg-NH-R2
(I)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen, die Anwendung dieses Verfahrens in einem diagnostischen Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten neuen Substrate sind insbesondere geeignet zur Bestimmung des Faktors Xa (E.C. 3.4.21.6) bzw. zum Studium von Reaktionen, die dazu führen, dass der Faktor Xa entweder gebildet oder gehemmt oder verbraucht wird oder auch zur Bestimmung von solchen Faktoren, die diese erwähnten Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen.
Der Faktor X ist eine Schlüsselsubstanz in einer Reihe von Reaktionen, die zur Koagulierung vom Blut führen. Die Aktivierung des Faktors X führt zur Bildung des proteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, der direkt verantwortlich für den Übergang von Prothrombin in Thrombin ist. Es wäre daher sehr vorteilhaft, wenn ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa für Diagnose-Zwecke zur Verfügung stehen bzw. Salze dieser Verbindungen, wobei in der angeführten For-5o mei I Ri ein Wasserstoffatom, eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine Benzoylgruppe oder eine substituierte Benzoylgruppe, die vorzugsweise mit 1 oder 2 Halogenatomen, Methyl-, Amino- oder Phenylgruppen substituiert ist, eine Benzolsulfonylgruppe oder die 55 eine Toluolsulfonylgruppe bedeutet, R2 eine Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe darstellt, Ai eine Einfachbindung bedeutet oder für eine der folgenden Aminosäuren Gly, Ala, Val, Leu, lieu, Pro, Met, Phe oder Tyr steht und A2 eine der folgenden 60 Aminosäuren Glu, Gin, Asp oder Asn bedeutet.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens in einem diagnostischen Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa. Dabei bringt man ein Produkt, das diese Materialien enthält, mit den Verbindungen 65 der Formel I zusammen.
Das im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzte Substrat der Formel I kann nach den folgenden 2 prinzipiell unterschiedlichen Arbeitsverfahren hergestellt werden:
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1. Arbeitsverfahren
Das erste Arbeitsverfahren basiert auf der Kupplung der chromophoren Gruppe R2 an das Arginin und auf dem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur durch nachein-anderfolgende Ankupplung der restlichen Aminosäuren. Die chromophore Gruppierung wird hier als blockierende Gruppierung für die am endständigen Kohlenstoffatom gebundene Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
2. Arbeitsverfahren
Das zweite Arbeitsverfahren beruht auf einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur, worauf dann anschliessend die verwendeten Schutzgruppen oder blockierenden Gruppen entfernt werden und die chromophore Gruppierung R2 an die Peptidstruktur gebunden bzw. angekuppelt wird.
Durch die Anwendung des stufenweisen Aufbaues des Pep-tidgrundgerüstes nach diesen beiden Arbeitsverfahren, ist es möglich, in geeigneter Weise eine Reinigung durch Gelfiltration nach jeder Ankupplung einer neuen Aminosäure durchzuführen.
Die Kupplungsverfahren, die zur Durchführung dieser stufenweisen Synthese der Peptidderivate angewandt wurden,
sind bekannt und sie werden üblicherweise in der Peptidchemie eingesetzt. An sich bekannte und in der Peptidchemie üblicherweise verwendete Schutzgruppen oder blockierende Gruppen werden zur Blockierung der Aminogruppen verwendet und als Beispiele für diese Gruppierungen seien genannt: Cbo (Carbobenzoxy),
MeOCbo (p-Methoxy-carbobenzoxy),
NChCbo (p-Nitrocarbobenzoxy),
MCbo (p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy), BOC (tert-Butyloxycarbonyl),
TFA (Trifluoracetyl) bzw. Formyl.
Die a-Carboxylgruppe kann aktiviert werden, indem man sie in die verschiedenen aktivierten und in der Peptidchemie bekannten und oft verwendeten Derivate umwandelt, wobei diese entweder isoliert oder in situ gebildet werden können und als Beispiele für derartige aktive Derivate seien genannt:
p-Nitrophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphe-nylester, N-Hydroxysuccinimid-ester, Säureazide, Säureanhydride, wobei diese zuletzt genannten Verbindungen entweder symmetrische oder unsymmetrische Säureanhydride sein können. Die Säuregruppierung kann auch unter Verwendung von Carbodiimiden aktiviert werden, beispielsweise unter Verwendung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid. Die am endständigen Kohlenstoffatom stehende Carboxylgruppe in dem Aminopep-tidderivat oder dem Aminosäurederivat kann geschützt werden, beispielsweise durch Veresterung, wie zum Beispiel durch Herstellung der entsprechenden Methyl-, Äthyl- oder Isopro-pylester oder durch Umwandlung in das chromophore Anilinderivat, das in diesem Fall als Schutzgruppe oder blockierende Gruppe während des Aufbaues der Peptidkette wirkt. Diejenigen freien funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, können während der Synthese der Peptide oder der Peptidderivate in folgender Weise geschützt werden:
Zur Blockierung der zurückbleibenden Arginyl-8-guanido-gruppierung kann man solche Aminoschutzgruppen verwenden, die üblicherweise in der Peptidchemie angewandt werden, wie zum Beispiel eine Protonisierung, NO2 oder Tos (p-Toluol-sulfonyl). Zur Schützung der Carboxylgruppe in der Glutaminsäure und der Asparaginsäure kann man solche Schutzgruppen einsetzen, die üblicherweise in der Peptidchemie angewandt werden, wie zum Beispiel Benzylschutzgruppen oder tert.-Butylschutzgruppen.
Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben, in denen die Herstellung von verschiedenen beim erfindungsgemässen Verfahren einsetzbaren Substraten mit Hilfe einer stufenweise Synthese erläutert wird.
Bei der Dünnschichtchromatographie, die zur Analyse von 5 Eluaten und Produkten angewandt wurde, verwendete man Glasplatten mit Silikagel F254 (Merck) als Absorptionsmedium. Die Lösungsmittelsysteme, die verwendet wurden, wurden wie aus der folgenden Tabelle ersichtlich ist, bezeichnet:
1 » Abkürzungen für Lösungsmittelsysteme in der
Dünnschichtchromatographie :
Bezeichnung Lösungsmittel
Mengenverhältnisse in Volumina
20
A:
n-Butanol : Essigsäure :
Wasser
3
: 1
: 1
C:
n-Propanol : Essigsäure
äthylester : Wasser
7
: 1
:2
D:
n-Heptan : n-Butanol : Essig
säure
3
:2
: 1
Pi:
Chloroform : Methanol
9
: 1
Nach Durchführung der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zuerst im UV-Licht (254 nm) untersucht und anschliessend unter Verwendung der Chlor/Toluidin-Reaktion als Entwicklungsverfahren. Dieses Entwicklungsverfahren ist in G. Pataki: Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure-, und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co.,Berlin, 1966, auf Seite 125 beschrieben.
Die Bedeutungen der Abkürzungen, die in der Folge verwendet werden, sind die folgenden:
Abkürzungen für Aminosäuren
Diese Abkürzungen beziehen sich auf den Aminosäurerest. Die freie Aminosäure oder das Peptid wird bei dieser Abkürzungsweise als H- bei der Aminogruppierung und als -OH bei der Carboxylgruppe bezeichnet. Die Aminogruppe ist immer links angegeben und die Carboxylgruppe rechts.
Falls nicht ausdrücklich andere Angaben vorliegen, dann werden alle hier erwähnten Aminosäuren in der L-Form verwendet.
Tabelle
Abkürzung
Aminosäure
Ala
Alanin
Arg
Arginin
50 Asn
Asparagin
Asp
Asparaginsäure
Gin
Glutamin
Glu
Glutaminsäure
Gly
Glycin
55 Ileu
Isoleucin
Leu
Leucin
Met
Methionin
Phe
Phenylalanin
Pro
Prolin so Tyr
Tyrosin
Val
Valin weitere Abkürzungen Abkürzung 65 Ac AC2O AcOH BOC
Bedeutung Acetyl
Essigsäure-anhydrid Essigsäure tert.-Butyloxycarbonyl
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4
Bz
Benzoyl
(Molekulargewicht 715,8)
Bzl
Benzyl
2,65 g (5,0 mMole) des Produktes la wird von der Carbo-
BZ2O
Benzoesäureanhydrid benzoxygruppe befreit (decarbobenzoxyliert) und anschlies
Cbo
Carbobenzoxy send mit 2,50 g (5,5 mMolen) an der Verbindung t-Boc-Glu-
DCC1
Dicyclohexylcarbodiimid
5 (y-OBzl)-OpNP gekuppelt, wobei man hierzu das in Beispiel la
DMF
Dimethylformamid beschriebene Arbeitsverfahren anwandte. Das erhaltene rohe
EtsN
Triäthylamin
Produkt wird durch Gelchromatographie auf einer Säule gerei
MCbo p-Methoxyphenylazo-
nigt, die Sephadex LH-20 in Methanol enthält.
carbobenzoxy
Die Ausbeute an dem so hergestellten Produkt lb betrug
MeOH
Methanol
10 3,25 g, entsprechend 91% der theoretischen Ausbeute. Bei einer
OtBU
tert.-Butyloxy
Dünnschichtchromatographie in dem Lösungsmittelsystem Pi
OEt
Äthyloxy erwies sich das Produkt als homogen und hatte einen RpWert
OMe
Methyloxy von 0,22.
OpNP
p-Nitrophenoxy
Die optische Drehung war [a]o4-34° (c 1,0,MeOH).
OisoPr
Isopropyloxy
15
pNA
p-Nitroanilid c) Herstellung von Cbo-Ileu-Glu(y-OBzl)-Gly-Arg(N02>pNA
TFA
Trifluoracetyl
(Molgewicht 862,9)
Tos p-Toluolsulfonyl
1,08 g (1,5 mMole) des Produktes lb werden in 10 ml Tri-
fluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang bei Falls nicht ausdrücklich andere Temperaturangaben vorlie- 20 Zimmertemperatur gerührt und dann giesst man sie langsam in gen, wurden sämtliche Beispiele bei einer Temperatur von 0°C 75 ml heftig gerührten trockenen Äther ein. Die ätherische durchgeführt. Lösung wird dekantiert und der so erhaltene körnige Rück stand nochmals zweimal mit 50 ml Äther behandelt. Dann Beispiel 1 trocknet man im Vakuum über Phosphorpentoxid und Plätz-
Herstellung von HCl- Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA 25 chen aus Kalilauge bei einer Temperatur von 30 °C. Dabei a) Herstellung von Cbo-Gly-Arg-(N02>pNA (Molekularge- erhält man 1,08 g des Trifluoressigsäuresalzes des Tripeptidde-wicht: 530,4) rivâtes, was einer fast quantitativen Ausbeute entspricht.
5,0 g (10,6 mMole) an Cbo-Arg(N02>pNA werden in 21 ml Das Produkt erweist sich bei einer Dünnschichtchromato-Essigsäure sowie 22 ml an 4 n Bromwasserstoffsäure in Essig- graphie im Lösungsmittelsystem A als homogen. Dieses Prosäure unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Diese Lösung 30 dukt wird dann in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst. Die wird eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann Lösung wird auf -10 °C gekühlt und unter Verwendung von langsam in 200 ml heftig gerührten Äther eingegossen. Die 0,23 ml Triäthylamin neutralisiert; dann setzt man 0,65 g (1,68 Ätherlösung wird dekantiert und der erhaltene körnige Rück- mMole) und Cbo-Ileu-OpNP zu und lässt die Lösung sich langstand wird noch zwei weitere Male mit 100 ml Äther behandelt, sam bis auf Zimmertemperatur erwärmen. Nach etwa 3 Stun-Anschliessend trocknet man im Vakuum über Phosphorpento- 35 den wird die Lösung wieder auf -10 °C abgekühlt und unter xid und über Plätzchen aus Kalilauge bei einer Temperatur von Verwendung von 0,12 ml an Triäthylamin abgepuffert. Dieses 30 °C. Dabei erhält man als Ausbeute das Hydrobromidsalz des Pufferungsverfahren wird nach 2 bis 3 Stunden nochmals Aminosäurederivates. Die Ausbeute beträgt 4,95 g und ist fast wiederholt und die Lösung lässt man dann über Nacht stehen, quantitativ. Es wurde eine Dünnschichtchromatographie unter Der Überschuss an dem Cbo-Ileu-OpNP wird dann zerstört, Verwendung des Lösungsmittelsystems A durchgeführt und4!! indem man etwa 100 mg (etwa 1,4 mMole) an n-Butylamin zu das Produkt erwies sich dabei als homogen. der Lösung zusetzt. Der Überschuss an dem aktiven Ester ist
Das oben erwähnte Produkt wird dann in 50 ml destillier- deshalb unerwünscht, weil es schwierig ist, ihn von dem Tetra-tem Dimethylformamid aufgelöst. Die Lösung wird auf -10 °C peptid durch Gelfiltration abzutrennen. Nach etwa 30 Minuten abgekühlt und man setzt dann Triäthylamin zu, bis die Lösung wird die Lösung im Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C neutral ist, was einer Zugabemenge von 2,1 ml entspricht. Das « eingedampft. Das zurückbleibende schwere Öl wird mit 3 Por-ausgefällte Triäthylamin-hydrobromid der Formel Et3N*HBr tionen an destilliertem Wasser gewaschen. Dann löst man das wird abfiltriert und das Filtrat auf — 10°C abgekühlt. Dann Öl in Methanol auf und reinigt es durch Gelchromatographie setzt man 3,9 g (11,8 mMole) an Cbo-Gly-OpNP zu und lässt die auf einer Säule mit Sephadex LH-20 in Methanol.
Temperatur der Lösung langsam bis auf Zimmertemperatur Die Ausbeute an dem so erhaltenen Produkt lc beträgt ansteigen. Nach 3 Stunden wird die Lösung wieder auf-10 °C 5« 1,07 g, entsprechend 83% der theoretischen Ausbeute. Das abgekühlt und man puffert sie unter Verwendung von 0,54 g Material ist bei Durchführung einer Dünnschichtchromatogra-(5,3 mMol) an Triäthylamin ab. Dieses Pufferungsverfahren phie im Lösungsmittelsystem Pi homogen und besitzt einen Rr wird nach 2 bis 3 Stunden nochmals wiederholt. Die Reaktions- Wert von 0,35.
lösung lässt man über Nacht stehen und dampft dann im Die optische Drehung beträgt [cc]d4 -32° (c 0,3, MeOH: Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C ein. Das zurückblei- "> DMF,95 :5).
bende schwere Öl wird sorgsam mit 100 ml destilliertem Wasser verrührt. Das Wasser wird dann dakantiert und das Wasch- d) Herstellung von Bz-Ileu-Glu(y-0Bzl)-Gly-Arg(N02)-pNA verfahren noch zwei weitere Male wiederholt. Das zurückblei- 260 mg (0,30 mMole) des Produktes lc werden von der Car-bende Öl wird in warmem Methanol aufgelöst und beim Küh- bobenzoxygruppe befreit, und zwar unter Verwendung des len fällt das Produkt in kristalliner Form aus. «> Arbeitsverfahrens, das in Beispiel la beschrieben ist. Das Pro-
Die Ausbeute dieses Produktes la betrug 4,2 g, entspre- dukt zeigt bei der Durchführung einer Dünnschichtchromato-chend 75% der theoretischen Ausbeute. graphie unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A zwei
Das Produkt war nach einer Dünnschichtchromatographie, Flecken mit einem RrWert von 0,45 bzw. 0,60. Aus dem IR-die unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Pi durchge- Spektrum sieht man, dass das Produkt eine Mischung aus den führt wurde, homogen und besass einen RrWert von 0,16. es folgenden Bestandteilen
Die optische Drehung war [a]o4-36° (c 0,50, MeOH). HBr • H-Ileu-Glu( y-0H)-Gly-Arg(N02)-pNA sowie
HBr - H-Ileu-Glu( y-0Bzl)-Gly-Arg(N02>pNA ist.
b) Herstellung von t-Boc-Glu(y-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA Diese Mischung wird mit 800 mg (0,35 mMolen) Benzoe
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säure-anhydrid nach demjenigen Arbeitsverfahren umgesetzt, Die Substrate, die in den obigen Beispielen beschrieben das in Beispiel la beschrieben ist. Das rohe benzoelierte Pro- wurden, wurden verwendet, um den Faktor Xa in der folgenden dukt wird auf einer Säule aus Sephadex LH-20 in Methanol Weise zu bestimmen: Das Prinzip dieses Bestimmungsverfah-gereinigt. rens beruht auf der Tatsache, dass das Produkt, das durch die
Man erhält dabei 2 Fraktionen: s enzymatische Hydrolyse gebildet wird, ein UV-Spektrum lie-
a: 130mg,optische Drehung:[a]£4-l5°(c0,5,CHsCN, fert, das völlig verschieden von demjenigen des Substrates ist.
RrWert = 0,20 im Lösungsmittelsystem Pi und So hat das Substrat des Beispiels 1, nämlich die Verbindung der
ß: 105 mg, optische Drehung [a]o4 -11° (c 0,5, CH3CN) Formel
RrWert = 0,06 im Lösungsmittelsystem Pi.
Aus dem IR-Spektrum sieht man, dass die beiden Fraktio-10 Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA-HCl nen das Bz-Ileu-Glu( y-0Bzl)-Gly-Arg(N02)-pNA sowie das Bz-
Ileu-Glu-Gly-Arg(N02)-pNA sind die als Substrat I bezeichnet wird, ein Absorptionsmaximum
Eine Umsetzung mit Fluorwasserstoffsäure gibt aus beiden bei 315 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von Fraktionen das gleiche Endprodukt le. 12 000. Die Absorption des Substrates bei 405 nm ist unbedeu-
15 tend.
e) Herstellung von HCl • Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA (Molge- Das p-Nitroanilin, das mit pNA abgekürzt wird, und das sich wicht 734,3) aus dem Substrat im Verlauf der enzymatischen Hydrolyse bil-
100 mg (0,12 mMole) der a-Fraktion des Produktes d) und det, hat ein Absorptionsmaximum bei 380 nm mit einem mole-0,5 ml Anisol werden in ein Reaktionsgefäss einer Sakakibara- kularen Extinktionskoeffizienten von 13 200, das bei einer Wel-Apparatur gegeben. Etwa 5 ml an trockenem Fluorwasserstoff 20 lenlänge von 405 nm lediglich auf 9620 absinkt. Es ist aus die-werden in das Gefäss hineindestilliert und man lässt 75 Minuten sem Grund möglich, durch eine spektrophotometrische unter Rühren bei 0 °C reagieren. Der Fluorwasserstoff wird Bestimmung bei einer Wellenlänge von 405 nm mit Leichtig-dann unter vermindertem Druck abdestilliert und der ölige keit das Ausmass der enzymatischen Hydrolyse zu bestimmen, Rückstand in 10 ml Essigsäure (33%ig in Wasser) aufgelöst, wobei das Ausmass der enzymatischen Hydrolyse proportional Dann reinigt man chromatographisch unter Verwendung einer 25 der bestimmten Menge an dem gebildeten p-Nitroanilin ist. Der Säule von Sephadex G-15 in 33%iger Essigsäure in Wasser. Die- Überschuss an Substrat, der anwesend ist, beeinflusst die jenige Fraktion des Eluates, die das reine von der Schutzgrup- Bestimmung bei der angegebenen Wellenlänge nicht. Diese pen befreite, Tetrapeptidderivat enthält, wird dann lyophili- Situation ist für andere erfindungsgemäss zu verwendende Sub-siert. Die so erhaltene Verbindung wird in einer Mischung aus strate praktisch identisch und aus diesem Grund wurden sämt-Methanol plus destilliertem Wasser im Verhältnis 95 :5 aufge- 30 liehe spektrophotometrische Bestimmungen bei 405 nm durchlöst und man chromatographiert auf einem schwach-basisch geführt.
anionischem Ionenaustauscher, nämlich dem Produkt QAE- In der folgenden Tabelle I ist ein relativer Vergleich der Sephadex A-25 in seiner Chloridform mit der gleichen Lösungs- Reaktionsgeschwindigkeiten für unterschiedliche Enzyme des mittelmischung als Elutionsmittel. Das Methanol wird aus dem Typs der Serin-proteasen (E.C. 3. 4. 21) zusammengestellt, und Eluat bei 30 °C unter vermindertem Druck entfernt und die 35 zwar zwischen dem bereits vorher erwähnten Substrat S-2160 zurückbleibende wässrige Lösung lyophilisiert. Die Ausbeute und dem erfindungsgemäss zu verwendenden Substrat I. Die beträgt 75 mg, entsprechend 85% der theoretischen Ausbeute Reaktionsgeschwindigkeiten, die in dieser Tabelle angeführt und das Produkt ist nach einer Dünnschichtchromatographie sind, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren im Lösungsmittelsystem A homogen und besitzt einen RrWert bestimmt.
von 0,48. 40
Die optische Drehung beträgt [oc]d4 -40° (c 0,5, 50% Essig- T h 11 I
säure in destilliertem Wasser). a e e
Die Aminosäureanalyse ergab die folgenden Werte:
Ileu: 0,98, Glu: 0,95, Arg: 0,98, Gly: 1,00.
Konzen
Substrat relative Reaktionsgeschwindigkeiten tration
gegenüber den Enzymen
Thrombin Xa Trypsin Plasmin
0,1 mM
S-2160
100 1 100 100
0,25 mM
I
2 100 500 75
Beispiel 2
Herstellung von 2 HCl* H-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA a) Herstellung von 2 HCL- H-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA (Molgewicht 666,6)
100 mg (0,116 mMole) des Produktes lc werden mit Fluor- w wasserstoffsäure umgesetzt und man reinigt und führt eine Aus der oben angeführten Tabelle I sieht man, dass der Fak-Behandlung mit einem Ionenaustauscher nach denjenigen tor Xa das Substrati gerade lOOmal besser spaltet als dies für Arbeitsverfahren durch, die im Zusammenhang mit Beispiel le das Substrat S-2160 der Fall ist. Ferner sieht man aus der beschrieben wurden. Tabelle, dass das Substrat I nur in unwesentlichem Ausmass
Die Ausbeute beträgt 56 mg, entsprechend 73% der Theorie 55 durch Trombin angegriffen wird, und zwar im Vergleich mit und das Produkt ist nach einer Dünnschichtchromatographie dem Substrat S-2160. Aus diesem Vergleich sieht man deutlich, im Lösungsmittelsystem A homogen und besitzt dort einen Rr dass das Substrat I das für den Faktor Xa am besten geeignete Wert von 0,34. Substrat ist. Ferner sieht man aus der Tabelle, dass das Substrat
Die optische Drehung beträgt [a]g4 -35° (c 0,5, 50% Essig- mit Erfolg auch als Substrat für Trypsin verwendet werden säure in destilliertem Wasser). m kann. Diese positive Wirkung gegenüber Trypsin stört jedoch
Die Aminosäureanalyse ergab die folgenden Werte: nicht bei einer Bestimmung des Faktors Xa, weil Trypsin nor-
Ileu: 0,96, Glu: 0,94, Arg: 0,96, Gly: 1,00. malerweise im Blut nicht anwesend ist.
#
G

Claims (9)

  1. 619983
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Bestimmung von Serinproteasen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Material, in welchem die Serinproteasen bestimmt werden sollen, mit einem Substrat zusammenbringt, das die folgende Formel 5
    Ri-Ai-A2-Gly-Arg-NH-R.2
    (I)
    in welcher Ri ein Wasserstoffatom, eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, die io Benzoylgruppe oder eine substituierte Benzoylgruppe, eine Benzolsulfonylgruppe oder eine Toluolsulfonylgruppe bedeutet, R2 ein Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxy-naphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylrest ist, Ai eine Einfachbindung oder eine der folgenden Aminosäuren: Gly, Ala, Val, 15 Leu, Heu, Pro, Met, Phe oder Tyr darstellt und Ai eine der folgenden Aminosäuren Glu, Gin, Asp oder Asn bedeutet, aufweist, oder ein Salz dieser Verbindung I ist.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass Ri eine mit 1 oder 2 Halogenatomen, Methylaminogrup- 20 pen oder Phenylgruppen substituierte Benzoylgruppe ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass die Verbindung der Formel I Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin oder H-Phe-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin oder ein Salz dieser Verbindungen ist. 25
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass die Verbindung der Formel I Benzoyl-Leu-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin oder Benzoyl-Val-GIu-Gly-Arg-p-nitroanilin oder ein Salz dieser Verbindungen ist.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 30 dass die Verbindung der Formel I Benzoyl-Leu-Asp-Gly-Arg-p-nitroanilin oder Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-2-naphthylamid oder ein Salz dieser Verbindungen ist.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass die Verbindung der Formel I Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-4- 35 methoxy-2-naphthylamid oder Benzoyl-Ileu-Gln-Gly-Arg-p-nitroanilid oder ein Salz dieser Verbindungen ist.
  7. 7. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 in einem diagnostischen Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa.
  8. 8. Anwendung gemäss Anspruch 7 zur Bestimmung des 40 Faktors Xa in einer Blutprobe.
  9. 9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als aktiven Bestandteil ein chromogenes Substrat der Formel I enthält.
    würde.
    Die bis jetzt verwendeten Reagenzien zur Bestimmung des Faktors Xa bestanden üblicherweise aus Estersubstraten von sehr unspezifischem Charakter. Eines dieser Reagenzien ist beispielsweise p-Nitrophenyl-p'-guanidino-benzoat, das mit p-NPGB abgekürzt wird, wobei dieses Reagens auch ein gutes Substrat für Thrombin, Trypsin und Plasmin ist. Die Anwendbarkeit dieses Reagens zur Bestimmung des Faktors Xa ist daher auf die Verwendung in gereinigten Enzympräparaten beschränkt. Die Ergebnisse, die erzielt werden, wenn man Blut verwendet, sind praktisch nicht auswertbar, und zwar aufgrund der Anwesenheit von anderen Esterasen, die eine Aktivität gegenüber p-NPGB aufweisen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von L. Smith in J. Biol. Chem. 248,2418 (1972) verwiesen.
    Sehr gute chromogene Amidsubstrate für Enzyme, die ähnlich dem Thrombin sind, wurden in der schwedischen Patentschrift Nr. 380 257 beschrieben. Eines von diesen, das die folgende Formel
    Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid aufweist und als S-2160 bezeichnet wird, liefert sehr gute Ergebnisse bei der Bestimmung von Thrombin, jedoch wird dieses Produkt nur sehr wenig gespalten, wenn es im Zusammenhang mit dem Faktor Xa verwendet wird. Die Empfindlichkeit eines Substrates gegenüber Thrombin soll jedoch vernachlässigbar sein, wenn dieses Substrat zur Bestimmung des Faktors Xa in diagnostischen Verfahren in der Blutanalyse eingesetzt werden soll.
    Es wäre daher sehr wünschenswert, wenn ein Substrat zur Verfügung stünde, das spezifischer gegenüber dem Faktor Xa ist und dementsprechend weniger empfindlich gegenüber einer Spaltung durch Thrombin. Mit Hilfe eines derartigen Substrates wäre es möglich, die biologische Funktion des Enzymes zu messen oder bestimmen, d. h. Amidbindungen zu spalten. Ausserdem ist es wünschenswert, wenn ein derartiges Substrat rasch in leicht-bestimmbare Produkte gespalten werden kann, wie zum Beispiel in chromophore Verbindungen, die leicht spektrophotometrisch bestimmt oder verfolgt werden können.
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