DD228303A5

DD228303A5 - Verfahren zur herstellung eines neuen inokulums fuer die erzeugung des coenzyms b tief 12 durch anaerobe fermentation

Info

Publication number: DD228303A5
Application number: DD84267301A
Authority: DD
Inventors: Laszlo Szemler; Pechany Eva Cserey
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1984-09-14
Publication date: 1985-10-09
Also published as: US4752584A; IT1207560B; HU188954B; CS693184A2; DE3430895C2; IN160227B; FR2552103B1; CS274650B2; JPS6094097A; NL8402693A; GB2149817B; IT8422675A0; DE3430895A1; FR2552103A1; GB8423198D0; JPH0542262B2; BE900572A; GB2149817A; HUT35285A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden Inokulums fuer die Erzeugung des Coenzyms B12 (Cobamid) durch anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen. Fuer das Ferfahren ist kennzeichnend, dass man - 75-85 Vol.-% eines fuer die Herstellung des Coenzyms B12 durch anaerobe, mesophile, septische Fermentation eine geringere Anzahl von Naehrstoffen in geringerer Menge enthaltenden Naehrbodens mit 15-25 Vol.-% anaerobem, verrottetem Abwasserschlamm vermischt,-das Gemisch etwa eine Woche lang unter Zusatz von taeglich 0,3-0,5 Vol.-% Methanol anaerob, mesophil und septisch fermentiert,-die erhaltene Fermentbruehe zu einem mehrfachen, vorzugsweise 4- bis 5fachen Volumen Naehrboden der gleichen Zusammensetzung gibt und die Fermentierung unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines p H-Wertes von etwa 5-5,5 fortsetzt,-einen Teil der dabei erhaltenen Fermentbruehe, vorzugsweise 5-15 Vol.-%, fortnimmt und durch das gleiche Volumen eines die gleichen Naehrstoffe enthaltenden, jedoch an Praekursoren reicheren Naehrbodens ersetzt und-gewuenschtenfalls die Fermentierung noch ein bis zwei Tage fortsetzt.

Description

16 151 55 ~ Λ ~

Verfahren zur Herstellung eines neuen Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B-.« äurch anaerobe Fermentation

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, - eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden - Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B₁ ρ (Cobamid) durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen.

Der Einfachkeit halber wird im folgenden immer das Coenzym B-ρ genannt, im Rahmen dieser Beschreibung werden unter diesem Ausdruck jedoch auch die sonstigen biologisch aktiven Corrinoide (z.B. der Faktor III) verstanden (Barker et al., Biol. Chem. 235, 480/1960/).

Das Inokulum kann ein zum "Anlegen neuer, steriler Kulturen verwendeter Virus, Mikroorganismus, eine Zellsuspension oder ein pflanzliches Organ, ein Gewebe oder eine Zelle sein" (Sträub, F.B.: Biol6giai Lexikon,II. unveränderter Machdruck S. 287, Akademiai Kiadö Budapest, 1978). Das erfindungsgemäß herzustellende Inokulum enthält eine anaerobe, septische, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation.

Präkursoren (Vorstufen) sind Ausgangsverbindungen, aus denen im Laufe der biologischen Reaktionen das Endprodukt entsteht (s. ebenda III, S. 437, zum Beispiel 5»6-Dimethylbenzimidazol, Cobaltchlorid usw.).

Der Nährboden ist das zur Zucht der Mikroorganismen bereitete Nährmedium. Der Nährboden enthält im aufnehmbaren Zustand alle diejenigen Nährstoffe·, die der Mikroorganismus während der Kultivierung benötigt (s. ebenda IV, S. 249, z.B. Methanol,. Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid usw.). In der vorliegenden Beschreibung soll unter dem Ausdruck Nährmedium das die Nährstoffe und mit diesen zusammen die Präkursoren enthaltende Medium verstanden werden.

Nährstoffe sind die für die Mikropopulation lebenswichtigen chemischen Substanzen (zum Beispiel die Kohlenstoff- und die Stickstoffquelle). Das Methanol hat in der vorliegenden Erfindung eine doppelte Funktion: es ist einesteils die Kohlenstoffquelle der Biosynthese und liefert darüber hinaus die zur Entstehung der gemischten Mikropopulation erforderliche Energie.

Es ist bekannt, daß vor etwa zwei Jahrzehnten das Coenzym B-o ^aus <^en i-^m Abwasserschlamm enthaltenden Nährstoffen mit Hilfe der ebenfalls dort enthaltenden Mikroorganismen durch Fermentation hergestellt wurde. Gegebenenfalls wurde der Abwasserschlamm durch unterschiedliche weitere Nährstoffe ergänzt. Das Verfahren hat den großen Vorteil, daß es unter

septischen Bedingungen durchgeführt werden kann. Nachteilig ist jedoch, daß für jede Fermentierung eine große Menge Abwasserschlamm von der jeweiligen Abwasserreinigungsstation zum Fermentierbetrieb transportiert werden mußte. Die Zusammensetzung des Abwasserschlammes j seine Bakterienpopulation schwankte, und nicht zuletzt konnten auch "Feldstämme" in den Abwasserschlamm gelangen, die die Entstehung oder besser ausgedrückt, die gezielte Herausbildung einer stabilen Bakterienpopulation unmöglich machten.

In der HU-PS Ur. 153 740 wird ein neues Verfahren zur Herstellung des Coenzyms B-, ₂ auf anaerobem, septischem Wege vorgeschlagen. Gemäß diesem Verfahren wird dem die entsprechenden Nährstoffe enthaltenden Nährmedium nur ein einziges Mal Abwasserschlamm zugesetzt, und nach wenigstens fünfmaligem Weiterimpfen reichert sich eine gemischte Population an, die bereits an sich fähig ist, die Funktion des Inokulums zu übernehmen und Coenzym B₁₂ iⁿ einer Menge von 6-6,2 mg/1 Fermentbrühe zu produzieren. Bei diesem sog. "abwasserschlammfreien" Verfahren muß jedoch wenigstens fünfmal weitergeimpft (übergeimpft, auf ein frisches Medium übertragen) werden, d.h. die Adaptierung der im Abwasserschlamm vorhandenen Mikroorganismen an die Produktion von B₁₂ ^³^ zeitraubend, die Mikroorganismen produzieren wenig Coenzym B₁₂ und benötigen viele verschiedene Nährstoffe, deshalb ist das Verfahren teuer.

Zur Herstellung des Coenzyms B₁₂ ^und- ^ZVJC Erhöhung der Ausbeute sind zahlreiche weitere Methoden bekannt (z.B. US-PS 3 954 971 und 3 979 259); diese wurden alle zu dem alleinigen Zweck ausgearbeitet, das oben erwähnte "abwasserschlammfreie" Verfahren zu intensivieren.

Eine mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation wurde zum ersten Mal in der HU-PS 167 958 beschrieben. Sie besteht aus den im Ungarischen Landesinstitut für Ge-

sundheitswesen (OKI) unter den Nummern 00076, 00077, 00078 und 00079 hinterlegten folgenden Stämmen: Corynebacterium sp. (Bezeichnung 24Al), Corynebacterium sp. (Bezeichnung 62B9), Lactobacillus sp. (Bezeichnung 244B/C1) und Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239 Al/6). An Nährböden, die von den üblichen abweichende Nährstoffe enthaltenden, läßt sich diese anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Population jedoch nur schwer adaptieren, es muß β-7-mal weitergeimpft werden, und ein Weiterimpfungszyklus dauert etwa sieben Tage. Um eine Fermentation in industriellem Maßstab auf diese gemischte Mikropopulation umzustellen, sind demnach 40-50 Tage erforderlich, d.h. das Ganze ist zeit- und kostenaufwendig.

Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung war die Beseitigung des oben genannten Nachteils. Zur Erreichung dieses Ziels wurde nicht der Y/eg beschritten, die oben definierte, bereits vorhandene anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation an einen neuen Nährboden zu adaptieren, sondern es wurde auf den Abwasserschlamm zurückgegriffen. Aus der in diesem vorliegenden Mikropopulation wurde auf einem neuartig zusammengesetzten, jedoch im übrigen mit den üblichen Nährmedien identischen Nährboden eine neue, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation gemischter Zusammensetzung gezüchtet. Die' in dieser Mikropopulation vorhandenen Stämme sind beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen (OKI) unter den Nummern 00076, 00079 und 00272 /CorynebactBrium sp. (Bezeichnung: 24 A 1), Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239 A^/6) und Methanococcus sp. (Bezeichnung: MC-01727 hinterlegt. Unter den üblichen Nährböden werden hier Nährböden wie der zum Beispiel in der US-PS 3 954 973 beschriebene verstanden.

Mit dem 'erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines neuen Inokulums gelingt es, die neue gemischte Mikropopulation wesentlich schneller, durch einmaliges Weiterimpfen in reproduzierbarer Weise herzustellen.

Durch Fortlassen des an Nährstoffen reichen Nährbodens und die Wärmebehandlung (Hydrolyse) des Maisquellwassers sind bereits zu Beginn wesentlich weniger mit dem Nährboden eingebrachte lebende Bakterien vorhanden, wodurch die Bakterien des zum Überimpfen verwendeten Schlammes in der Mehrheit sind. Der wenig organische Substanzen und .unter diesen vor allem Methanol enthaltende Nährboden ist unter den eingebrachten Bakterien den Methanol zersetzenden, methanproduzierenden Bakterien günstig.

Das Verfahren bietet für die anaerobe, mesophile, methanproduzierende, septische Fermentation große Sicherheit, weil die gewünschte Mikropopulation jederzeit, mit geringen Kosten und schnell wieder hergestellt und die Produktion des Coenzyms B-ρ fortgesetzt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, - eine gemischte, anerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden - Inokulums für die Erzeugung des Coenzyms B^ ρ (Cobamid) durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist kennzeichnend, daß man

- 75-85 VoI·-# eines für die Herstellung des Coenzyms B₁₂ durch anaerobe, mesophile, septische Fermentierung zum Teil bekannten, eine geringere Anzhal von Nährstoffen in geringerer Menge enthaltenden Nährbodens mit 15-25 YoI.-% anaerobem, verrottetem Abwasserschlamm, vermischt,

- das Gemisch, etwa eine Woche lang unter Zusatz von täglich 0,3-0,5 Vol.-% Methanol anaerob, mesophil und septisch fermentiert,

- die erhaltene Permentbrühe (1. Generation) oder einen Teil davon zu einem mehrfachen, vorzugsweise 4-6-fachen Volumen Nährboden der gleichen Zusammensetzung gibt und die Fermentierung unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines pH-Wertes von etwa 5-5,5 fortsetzt,

- einen Teil der dabei erhaltenen Permentbrühe (2. Generation), vorzugsweise 5-15 ToI.-%, abzieht und durch das gleiche Volumen eines die gleichen Nährstoffe enthaltenden, jedoch an Präkursoren reicheren Nährbodens ersetzt und

- gewünschtenfalls die Fermentierung noch ein bis zwei Tage fortsetzt.

Auf diese V/eise wird eine anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation erhalten, die als Inokulum für die fermentative Herstellung des Coenzyms B-. ρ geeignet ist.

Zur Bereitung des Nährbodens wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren statt des als Nährbodenkomponente- üblichen und im Handel erhältlichen Maisquellwassers wärmebehandeltes Maisquellwasser (Hydrolysat) oder Maisschlempe verwendet. (Maisschlempe ist ein bei der Alkoholherstellung anfallender Abfallstoff, der dadurch entsteht, daß das zum Einweichen des Maises verwendete Wasser zusammen mit dem Kesselrückstand der Alkoholherstellung eingedampft wird.)

Vor der Wärmebehandlung wird das Maisquellwasser mikrobiologisch untersucht. Zur Herstellung des Hydrolysats wird nur den Anforderungen entsprechendes Maisquellwasser verwendet. Die mikrobiologische Untersuchung ist im wesentlichen ein Fermentationsprozeß, der in Beispiel 1 ausführlich beschrieben wird. Wenn am vierten Tag der Untersuchung die Produktion an Biogas 0,3-0,6 1/1 Fermentbrühe und Tag

beträgt, ist das Maisquellwasser zur Herstellung des neuen Inokulums geeignet. Das Maisquellwasser wird mit der gleichen Menge Wasser versetzt und 15 Minuten lang gekocht. Auf diese Weise wird das wärmebehandelte Hydrolysat des Maisquellwassers (beziehungsweise der Maisschlempe) hergestellt.

Der zur Herstellung des neuen Inokulums erforderliche Nährboden wird in an sich bekannter Weise hergestellt (Beispiel

Der erfindungsgemäße Nährboden unterscheidet sich in den folgenden Punkten von den bisher verwendeten Nährböden:

- er enthält weniger organische Substanzen, charakteristisch ist der Methanolgehalt;

- statt des im Handel befindlichen Maisquellwassers enthält der Nährboden die wärmebehandelte (hydrolysierte) Lösung des Maisquellwassers beziehungsweise der Maisschlempe.

Infolge der neuartigen Zusammensetzung des Nährbodens verändern, sich Zusammensetzung und Produktionseigenschaften der sich während der Herstellung des Inokulums anreichernden gemischten Population. Statt der bisher erforderlichen 6-7fachen Weiterimpfung sind nur eine einmalige Weiterimpfung und einige Tage (1-2 Tage) Fermentierung erforderlich.

Zu dem neuen Nährboden, der Methanol,

Hydrolysat des Maisquellwassers, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid Kobaltchlorid,

5,6-Dimethylbenzimidazol und Natriumhydrogensulfit enthält, gibt man 15-25 Vol.-% verrotteten Abwasserschlamm.

Dieser wird zweckmäßig der anaeroben Nachverrottung des städtischen Abwasserschlanmies jeweils frisch entnommen, lach gründlichem Homogenisieren wird bei 30-32 C mit der Fermentierung begonnen. Einmal täglich wird Methanol zugesetzt. Die Fermentierung wird etwa eine V/oehe lang, bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 5-5»5 fortgesetzt. Täglich wird eine Probe genommen, an dieser werden der pH-Wert, der Methanolgehalt und die Geschwindigkeit der Biogasbildung bestimmt. Diese Informationen geben wichtige Aufschlüsse über den "Verlauf der Fermentation. Pur die Herausbildung der anaeroben, mesophilen, gemischten Mikropopulation ist ein schwach saurer pH-Wert (5-6) günstig. Die Methanolkonzentration der Permentbrühe ist von besonderer Wichtigkeit, weil zu viel oder zu wenig Methanol die Adaption verlangsamt. Aus der Biogasproduktion kann auf die Geschwindigkeit der Methanolassimilation geschlossen werden, was jeweils die Einhaltung der optimalen Konzentration ermöglicht.

Gemäß einer -bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die beschriebene Permentierung etwa eine Woche lang fortgesetzt. Die erhaltene Permehtbrühe (im folgenden als 1. Generation bezeichnet) oder ein Teil davon wird - gegebenenfalls unter Vergrößerung des Maßstabes - auf ein mehrfaches Volumen Nährboden weitergeimpft. Dieser Nährboden hat die gleiche Zusammensetzung wie der der 1. Generation. Die Permentierung wird unter den gleichen Bedingungen etwa eine Woche lang fortgesetzt. (Die dabei erhaltene Permentbrühe wird als 2. Generation bezeichnet.) Von der Permentbrühe der 2. Generation werden etwa 10 Vol.-% entnommen und durch das gleiche Volumen eines Nährbodens ersetzt, der sich von-dem vorhergehenden nur dadurch unterscheidet, daß mit Ausnahme des Methanols, des 5,6-Dimethylbenzimidazols und des Kobaltchlorids die Konzentration der Nährbodenkomponenten nur den 10. Teil der ursprünglichen Konzentration beträgt. Die auf diese Weise ergänzte Permentbrühe win mentiert.

brühe wird bei 33-34 ⁰C noch ein bis zwei Tage lang fer-

Das erhaltene Inokulum enthält eine neue anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Population und ist zur fermentativen Herstellung des Coenzyms B^p geeignet. Die Verwendung des neuen, erfindungsgemäß hergestellten Inokulums zur fermentativen Herstellung des Coenzyms B-. ρ i-³^ ^ⁿ ^er parallel eingereichten ungarischen Patentanmeldung Ir. 3210/83 beschrieben.

Ausführungsbeispiele:

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

In einen Laborglasfermentor von 10 1 Nutzvolumen werden 6000 ml auf 30-32 ⁰C vorgewärmtes Leitungswasser gefüllt. Die folgenden, entsprechend vorbereiteten (s. weiter unten) Nährstoffe werden zugesetzt:

Methanol

Hydrolysat aus 50 g Maisquellwasser

Ammoniumhydrogencarbonat

Magnesiumchlorid Kobaltchlorid 5,6-Dimethylbenzimidazol Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der Komponenten wird das Nährmedium gründlich homogenisiert und dann mit Leitungswasser der genannten Temperatur auf 8000 ml aufgefüllt. Dann werden dem Nährboden 2000 ml nachverrotteter Abwasserschlamm zugesetzt, der der anaeroben Nachverrottung der städtischen Abwasserreinigungsstation frisch entnommen wurde. Das Gemisch wird verrührt, der Glasfermentor durch eine Gummiplatte verschlossen und dann in einen Thermostat von 32-34 ⁰C Temperatur gestellt.

- 10 -

35	ml
100	ml
30	S
1,0	S
0,05	g
0,03	g
0,30	g

Im folgenden wird jeden Tag (nach vorherigem Homogenisieren) eine Probe von 50 ml.Volumen genommen. Dann v/erden 35 ml Methanol zugesetzt, eine v/eitere Probe von 200 ml Volumen wird genommen und die Fermentation nach Verschließen des Permentors fortgesetzt.

Uach siebentägiger Fermentierung bei konstanter Temperatur erhält man die Fermentbrühe der 1. Generation.

Aus der vor dem Zusatz des Methanols genommenen Probe werden der pH-Wert und die Methanolkonzentration der Fermentbrühe bestimmt. Die nach dem Methanolzusatz genommene Probe von 200 ml wird in ein bei 32-34 ⁰C thermostatisiertes Gasometer gefüllt.

An der Probe wird die Geschwindigkeit der Biogasentwicklung gemessen. Bei Zusatz der nächsten Portion Methanol wird die Probe wieder in den Fermentor gegossen. Am siebenten Tag der Fermentierung wird eine Maßstabvergrößerung 1:5 vorgenommen: ein Fermentor des Nutzvolumens von 50 1 wird mit 30 Liter auf 30-32 ⁰C vorgewärmtem Wassers aufgefüllt. Dazu werden die folgenden auf die bereits angegebene Weise vorbereiteten Nährstoffe gegeben:·

175 ml Methanol

500 ml Hydrolysat aus 250 g Maisquellwasser

150 g Ammonoimhydrogencarbonat

5 . g Magnesiumchlorid " .

0,25 g Kobalichlorid

0,15 g 5,6-Dimethylbenzimidazol

1>5 g Natriumhydrogensulfat.

Nach dem Zusatz der Nährstoffe wird der Nährboden mit Wasser der gleichen Temperatur wie oben auf 40 1 aufgefüllt.

Nun wird die gesamte Menge der siebentägigen Permentbrühe (10 1) zu dem frischen Nährmedium gegeben. Nach intensivem Homogenisieren wird der Permentor verschlossen. Bei 32-34 G wird weitere sieben Tage lang anaerob fermentiert. Auch in diesem Zeitabschnitt werden jeden Tag 50 ml als Probe abgezogen und danach 175 ml Methanol in den Permentor gegeben. Danach wird die Probe von 200 ml für die Messung der Geschwindigkeit der Biogasentwicklung genommen. Die Bestimmung der Parameter erfolgt wie bereits beschrieben.

Die nach den zweiten sieben Tagen erhaltene Permentbrühe ist' die sog. 2. Generation. Nach dem Homogenisieren werden davon 10 Vol.-% (5,0 1) entnommen und durch das gleiche Volumen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

Leitungswasser der Temperatur von 32-34 ⁰C

Methanol

Hydrolysat aus 25 g Maisquellwasser

Ammoniumhydrogencarbonat

Magne siumchlorid

Kobaltchlorid

5T6-Dimethylbenzimidazol

Natriumhydrogensulfit.

Nach dem Zusatz des Nährmediums wird der Permentor nach dem Homogenisieren verschlossen. Die Permentierung wird bei 32-34 ⁰C noch einen Tag fortgesetzt.

Auf die beschriebene YiTeise entsteht die neue, anaerobe, mesophile, methanproduzierende gemischte Mikropopulation, deren Stämme unter den Nummern 00076, 00079 21.12.71 und 00072 26.7.83 beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponiert wurden. Es handelt sich in der genannten Reihenfolge um die Stämme Corynebacterium sp. (Bezeichnung 24 A 1), Propionibacterium sp. (Bezeichnung 239 A^/6) und Methanococcus sp. (Bezeichnung MC-017). Das Inokulum

5000	ml
175	ml
50	ml
15	g
0,5	g
0,25	g
0,15	g
0,10	g

hat einen pH-Wert von 5»4-5»8 und entwickelt Biogas in einer Menge von 0,5-0,8 Liter/Liter Fermentbrühe und TagI

Im folgenden ist das Inokulum bereits zur Produktion des Coenzyms B-ρ geeignet. Am ersten Tag der halbkontinuierlichen Fermentierung wurde eine Probe genommen, deren gemäß der ungarischen Patentschrift Nr. 167 658 bestimmter Wirkstoff gehalt 7,3 mg/1 betrug.

Die Nährstoffe werden auf folgende Weise vorbereitet. Zur Wärmebehandlung des Maisquellwassers wird Maisquellwasser mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 45 Gew.-% mit der gleichen Menge Leitungswasser verdünnt, bis zum Sieden erhitzt und 15 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wird die Lösung auf ihr ursprüngliches Volumen auf- · gefüllt. Die auf diese Weise bereitete frische Lösung ist das Maisquellwasserhydrolysat.

Das zur Herstellung des Inokulums vorgesehene Maisquellwasser wird vor der Verwendung-auf seine mikrobiologische Eignung geprüft. Dazu werden in einem Laborglasfermentor von 10 Liter Nutzvolumen zu 9 Liter Wasser der Temperatur die folgenden Nährstoffe gegeben:

Methanol

des zu untersuchenden Maisquellwassers (unhydrolysiert, ohne Wärmebehandlung) mit etwa 45 % Trockensubstanzgehalt

Ammoniumhydrogencarbonat Magnesiumchlorid . Kobaltchlorid 5 j6-Dimethylbenzimidazol Natriumhydrogensulfit.

Nach dem Vermischen werden aus dem B₁p-Fermentor 300 ml Fermentbrühe zugegeben, das Volumen wird mit-auf 30-32 C

von 30-32	05	⁰C
50	03	ml
50	20	g
,.30	g
1	g
o,	g
o,	g
o,	g

vorgewärmtes Leitungswasser auf 10 Liter aufgefüllt. Die Öffnung des Fermentors wird mit einer Gummiplatte verschlossen und der Fermentor bei 32-34 C thermostatisiert. Täglich wird aufgerührt, mit 50 ml Methanol versetzt und eine Probe von 200 ml Volumen entnommen, an der die Geschwindigkeit der Biogasbildung gemessen wird. Wenn am 4. Tag der Fermentierung die Biogasbildung wenigstens 0,3-0,6 1 Gas/l Fermentbrühe und Tag ausmacht, ist das Maisquellwasser nach der beschriebenen Wärmebehandlung zur Herstellung des Inokulums geeignet.

Das 5»6-Dimethylbenzimidazol wird in der vorgeschriebenen Menge Methanol gelöst zu dem Nährmedium gegeben. Die übrigen Nährstoffe werden unmittelbar zugesetzt.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die ohne Vergrößerung des Maßstabes vorgenommene Herstellung des Inokulums beschrieben. Diese Verfahrensweise kommt dann in Betracht, wenn nur eine kleine Menge Inokulum gebraucht wird.

Die 1. Generation des Inokulums wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in einem Glasfermentor von 10 1 Nutzvolumen hergestellt.

Am siebenten Tag der ersten Generation wird eine Weiterimpfung vorgenommen. Dazu werden von der gründlich aufgerührten Fermentbrühe 2 Liter entnommen und in einen sauberen Glasfermentor des Nutzvolumens von 10 Liter eingefüllt. Nach Zusatz von 6 Liter Trinkwasser der Temperatur von 30-32 ⁰C werden folgende Nährstoffe zugesetzt:

35	05	ml
100	03	ml
30	30	g
1 .	S
ο,	g
ο,	g
ο,	g

Methanol

Hydrolysat aus 50 g Maisquellwasser

Ajnmoniumhyd.ro g encarb onat

Magnesiumchlorid

Kobaltchlorid

5,β-D ime thylb enz imidaz öl

Natriumhydrogensulfit.

Nach Zusatz der einzelnen Komponenten wird die Flüssigkeit gründlich homogenisiert und dann mit Trinkwasser der Temperatur von 30-32 ⁰C auf 10 Liter aufgefüllt. Wach erneutem Homogenisieren wird der Permentor mit einer Gummiplatte verschlossen und bei 32-34 ⁰C thermostatisiert.

Täglich wird eine Probe von 50 ml Volumen genommen. Each der Probenahme werden 35 ml Methanol zugesetzt und dann weitere 200 ml entnommen. Der Permentor.wird erneut verschlossen. Die anaerobe Fermentierung wird bei der angegebenen Temperatur sieben Tage lang fortgesetzt. Die erhaltene Permentbrühe ' ist die 2. Generation.

Die 2. Generation wird gründlich homogenisiert, dann werden 10 YoI.'-% entnommen und durch das gleiche "Volumen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

Liter Trinkwasser (30-32 °C) Methanol

Hydrolysat aus 5,0 g Maisquellwasser Ammoniumhydrogencarbonat Magnesiumchlorid Kobaltchlorid 5,6-Dimethylbenzimidazol Hatriumhydrogensulfit.

Nach Zugabe der Nährstoffe wird die Permentbrühe gründlich homogenisiert, der Permentor wird verschlossen und die

- 15 -

1,0	Li
35	ml
10	ml
3,5	g
0,1	g
0,05	g
0,03	g
0,02	g

Fermentierung bei 32-34 ⁰C v/eitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Danach ist die Herstellung des Inokulums beendet. Die Fermentbrühe ist zur Produktion des Coenzyms B-2 geeignet.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung des Inokulums im Maßstab eines Kleinbetriebes.

In einen Versuchsfermentor von 2,0 nr Nutzvolumen werden 1000 Liter auf 30-32 ⁰C vorgewärmtes Trinkwasser eingepumpt. Dann werden die folgenden, auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise vorbereiteten Nährstoffe zugegeben.

Methanol

Hydrolysat aus 10 kg Maisquellwasser

Ammoniumhydrogencarbonat

Magnesiumchlorid

Kobaltchlorid

5,6-Dimethylbenzimidazol

Natriumhydrogensulfit.

Das die genannten Stoffe enthaltende Hährmedium wird gründlich homogenisiert· Dann werden 400 1 anaerober Abwasserschlamm gemäß Beispiel 1 zugesetzt. Das Volumen wird mit Trinkwasser der Temperatur von 30-32 ⁰C auf 2 tst aufgefüllt. Nach dem Homogenisieren wird die Arbeitsöffnung des Permentors verschlossen und mit der anaeroben Fermentierung bei 32-34 ⁰C begonnen.

Der Inhalt des Fermentors wird einmal täglich 20 Minuten lang gerührt, dann wird eine Probe entnommen, nach Zusatz von 7,0 Liter Methanol erneut 20 Minuten lang gerührt, eine weitere Probe genommen und dann weitere 24 Stunden lang fermentiert. An der vor dem Methanolzusatz genommenen Probe •werden der pH-Wert und die Methanolkonzentration gemessen,

7,0	1
20,0	1
6,0	kg
0,2	kg
0,01	kg
0,006	kg
0,06	kg

die nach dem Methanolzusatz genommene Probe dient zur Bestimmung der Geschwindigkeit der Biogasentwicklung.

Am siebenten Tag der' Fermentierung wird die Kultur (die 1. Generation) auf ein frisches Nährmedium weitergeimpft. Dabei v/ird der Maßstab im Verhältnis 1:5 vergrößert. In einen Permentor von 10 rar Mutzvolumen werden 6 m auf 30-32 ⁰C vorgewärmtes Trinkwasser gepumpt. Dazu werden folgende, auf die beschriebene Weise vorbereitete Nährstoffe gegeben:

Methanol

Hydrolysat aus 50 kg Maisquellwasser

Ammoniumhydrogencarb onat

Magnesiumchlorid

Kobaltchlorid

5,6-Dimethylbenzimidazol

Natriumhydrogensulfit.

Wach gründlichem Vermischen werden die 2 nr Permentbrühe der 1. Generation eingepumpt. Das Volumen wird mit auf 30-32 ⁰C vorgewärmtem Trinkwasser auf 10 rar aufgefüllt, lach gründlichem Rühren wird die Fermentierung bei 30-32 ⁰C begonnen.

Der Inhalt des Permentors wird jeden Tag 30 Minuten lang aufgerührt, dann wird eine Probe genommen, nach Zusatz von 35 1 Methanol wird erneut 30 Minuten lang gerührt und dann eine weitere Probe genommen. An den Proben werden die bereits erwähnten Parameter jeden Tag gemessen.

Von der Permentbrühe der 2. Generation werden nach 40minütigern Rühren 10 Vol.-% (1 m ) entnommen und durch das gleiche Volumen Nährboden der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

35,0	1
100,0	1
30,0	kg
1,0	kg
0,05	kg
0,03	kg
0,30	kg

35,0	1
10,0	1
3,0	kg
0,1	kg
0,05	kg
0,03	kg
0,02	kg

Methanol

Hydrolysat aus 5,0 kg Maisquellwasser

Ajnmoniumhydrogencarbonat

Magnesiumchlorid

Kobaltchlorid

5,6-Dimethylbenzimidazol

Natriumhydrogensulfit

werden in 0,5 m auf 30-32 ⁰C vorgewärmtem Leitungswasser gelöst. Die Lösung wird in den Permentor eingespeist. Dann wird das Volumen mit auf 30-32 ⁰C vorgewärmtem Leitungswasser auf 10 r aufgefüllt. Es wird noch 30 Minuten lang gerührt und dann weitere 24 Stunden lang anaerob fermentiert. Danach ist die Herstellung des Inokulums beendet. Das Inokulum hat einen pH-Wert von 5,4-5,8, die Biogasproduktion beträgt 0,5-0,8 1/1 Fermentbrühe und Tag, der Wirkstoff gehalt ist 8,3 mg/1. Die Fermentbrühe ist zur fermentativen Produktion des Coenzyms B₁₂ geeignet. Die Vorbereitung der Nährstoffe und die Qualitätsuntersuchung des Maisquellwassers werden nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen, eine gemischte, anaerobe, mesophile, methanproduzierende Mikropopulation enthaltenden Inokulums zur Herstellung des Coenzyms B-JO (Cobamid) durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche anaerobe Fermentation unter septischen Bedingungen, gekennzeichnet dadurch, daß man

- 75-85 Vol.-% eines für die Herstellung des Coenzyme B-JP durch anaerobe, mesophile, septische Fermentation zum Teil bekannten, eine geringere Anzahl von Nähr-

. stoffen in geringerer Menge enthaltenden Nährbodens mit 15-25 Vol.-% anaerobem, verrottetem Abwasserschlamm vermischt,

- das Gemisch etwa eine Woche lang unter Zusatz von täglich 0,3-0,5 Vol.-% Methanol anaerob, mesophil und septisch fermentiert,

- die erhaltene Fermentbrühe (1. Generation) oder einen Teil davon zu einem mehrfachen, vorzugsweise 4-6fachen. Volumen Nährboden der gleichen Zusammensetzung gibt und die Fermentierung unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines pH-Wertes von etwa 5-5»5 fortsetzt,

- einen Teil der dabei erhaltenen Fermentbrühe (2. Generation), vorzugsweise 5-15 Vol.-%, fortnimmt und durch das gleiche Volumen eines die gleichen iahrstoffe enthaltenden, jedoch an Präkursoren reicheren Nährbodens ersetzt und

- gewünschtenfalls die Fermentierung noch ein bis zwei Tage fortsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man. als Nährbodenkomponente mikrobiologisch untersuchtes, wärmebehandeltes Maisquellwasser in Form seiner hydrolysierten wäßrigen Lösung verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zu dem Nährmedium 15-25 Vol.-% anaeroben, verrotteten Abwasserschlamm aus der städtischen Abwasserreinigung gibt.

4· Verfahren nach Anspruch 1 oder 3> gekennzeichnet dadurch, daß man als Abwasserschlamm den frisch aus dem Nachverrotter der städtischen Abwasserreinigung entnommenen Abwasserschlamm verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Methanol, Maisquellwasserhydrolysat und/oder wärmebehandelte Maisschlempe, Ammoniumhydrogencarbonat, Magnesiumchlorid, Kobaltchlorid, 5,6-Dimethylbenzimidazol und Natriumhydrogensulfit enthaltendes Nährmedium verwendet.