JPS6094097A - 補酵素ｂ１２の嫌気的発酵用接種材料の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は補酵素Ｂ、２の嫌気的発酵に適する断続式又
は連続式発酵において使用するための、新規な嫌気性中
温性メタン生産性混合微生物集団を含有する新規々接種
材料に関する。

この明細書において使用する「補酵素Ｂ、２」なる語は
、補酵素Ｂ、２それ自体のみならず、他の生物学的に活
性なコリノイド（例えば、ファクター１）をも意味する
［Ｂａｒｋｅｒ等、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２３５４８０
（１９６０））。

文献に従えば、接種材料は、「新たな無菌培養物の製造
のために使用されるウィルス溶液、微生物もしくは細胞
懸濁液、又は植物性器官、織組もしくは細胞」である（
　５ｔｒａｕｂ、Ｆ、Ｂ：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｃ
ｙｅｌｏｐａｄｊａｌ、２８７頁、Ａｋａｄｅｍｌａｌ
　Ｋｉａｄ。

ツダペス）　、１９７８年）。この発明の接心材料は嫌
気性非無菌的中温性メタン生産性混合微生物集団を含有
する。

この明細書において用いる前駆体なる語は、一連の生物
学的反応によって目的最終生成物を製造するための出発
化合物（前掲［４３７、例えば５．６−シメチルーイン
ズイミグゾール、塩化コバルト等）である。

ブロスは、微生物の発酵において使用するために調製さ
れた培地である。ブロスは、発酵中に微生物が必要とす
る資化可能な形のすべての栄養素（前掲ＪＴ　、　２４
９　；例えばメタノール、炭酸水素アンモニウム、塩化
マグネシウム等）を含有すムこの明細書において、「ブ
ロス」なる語は栄養素の組み合わせ及び前駆体を含有す
る培地を意味する。

栄養素は、微生物集団のために必要な化学物質、例えば
炭素源及び窒素源である。この発明の方法においては、
メタノールは２つめ機能を有し、１つは生合成のための
炭素源であシ、そして同時に混合微生物集団を形成する
ために必要なエキルギーを提供する。

（従来の技術） 知られているように、約２０年前、補酵素Ｂ１□は汚泥
中に存在する微生物を用いて下水汚泥の栄養素からの発
酵によシ製造された。場合によっては、下水汚泥に種々
の他の栄養素がさらに補充された。この方法は、非無菌
的条件下で発酵を行うことができるという利点を有する
が、各発酵について大量の下水汚泥を発酵ゾ２ントに輸
送しなければならず、汚泥の組成及び細菌集団が変動し
、いわゆる「野性株」が下水汚泥に侵入することがあシ
、この存在によって安定な細菌集団の形成が不可能とな
る。

ハンガリー特許第１５３，７４０号明細書によれは、補
酵素Ｂ、２は、嫌気的無菌的条件下において、次の方法
によシ製造される。必要な栄養素を含有するブロスに下
水汚泥を１回のみ加え、そして少なくとも５口軽代接種
した後混合微生物集団を富化し、これが接種材料として
機能し、そして補酵素Ｂ１２が発酵ブロス１１当シ約６
〜６．２ｍｇの量で製造される。このいわゆる下水汚泥
−不含法においては、下水汚泥由来の微生物を順応せし
めて補酵素Ｂ１２を生産せしめるために少なくとも５回
の接種が必要であシ、このためにこの方法は煩雑なもの
となる。さらに、補酵素Ｂ１２の生産性が低く、多数の
異なる栄養素が必要であシ、従って製造コストが高い。

増加した補酵素Ｂ、２含量を有する発酵ブロスを製造す
るために、多くの方法が当業界において知られておシ（
例えば、米国特許第３，９５４，９７１号、及び第３，
９７９，２５９号明細書を参照のこと）、これらの方法
は上記「下水汚泥−不含」法の強化に関する。

中温性メタン生産性混合微生物集団は最初、／・ンガリ
ー特許第１６７．６５８号明細書忙記載されたｒコリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｈａｃｔｅｒｌｕｍ）、ｓ
ｐ。

（２４Ａ１　）、コリネバクテリウムｓｐ、（６２８９
λラクトパシルス（Ｌａｃｔｏｈａｃｊ　ｌ　１ｕｓ）
ｓｐ、（２４４Ｂ／Ｃ１，）及びグロビオニパクテリウ
ム（Ｐｒｏｐｉｏｎｌｂａｅｔｅｒｊｕｔｎ）ｉｐ（２
３９Ａ１／６）；それぞれ、Ｈｕｎｇａｒ　ｔａｎ　Ｎ
ａｔｌｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＯＫＩ）Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｐｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅに、ＡＯ
ＯＯ７６１，４６０００７７、／１６０００７８　、及
び４０　ｏ　Ｏ７９として寄託されている〕。しかしな
がら、この嫌気性中温性メタノール生産性混合微生物集
団は、一般的でない栄養素を含有するブロスに順応する
のが困難であシ、６〜７回の経代接種を必要する。１回
の継代接種サイクルに約７日間を要するとして、大量生
産のための、上記微生物集団に基礎を置く順応は約４０
〜５０日間継続し、これは非常に長期間であシ、そして
このために生産コストが高くなる。

（発明が解決しようとする問題点） この発明は上記の欠点を除去することを目的とする。所
望の結果を得るために、すでに確立された上記の嫌気性
中温性メタン生産性混合微生物集団を新たなブロスに順
応せしめるのではなく、発明者等は下水汚泥に返って、
これに存在する微生物集団から、全く新規な栄養素組成
を有するがその他の点では常用のブロスと同一であるブ
ロスにおいて、新規な嫌気性中温性メタン生産性微生物
集団を開発した。「常用のブロス」なる語は、例えば米
国特許第３，９５４．９７カ明細１に開示されているブ
ロスを意味する。この新規な微生物集団中に存在する菌
株は、Ｈｕｎｇａｒｉａｎ　ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｅｔｓｒｌ
ａ（ＯＫＩ）Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　
ｏｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅ　Ｉｃ、／１６ｏ００７６．４０
００７９、及び１６００２７２として寄託され−ｃお、
１、それぞれコリネバクテリウＡ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｌｕｍ）ｓｐ、（２４Ａ１）、グロピオニバクｆ
１７ウム（Ｐｒｏｐｌｏｎｌｂａｅｔｅｒｌｕｍ）ｓｐ
、（２３９Ａ４／６　）　、　及びメタノコツカｙ、　
（Ｍｅｔａｎｏｃｏｃ’ｃｕｓ　）ｓｐ、（ＭＣ−０１
７）である。

接種材料を製造するためのこの発明の新規な方法を用い
ることにょシ、新規な混合微生物集団を１回の接種によ
ル再現性良く製造することができる。栄養に富むブロス
の代シに少ない栄養を含有するブロスを使用すること、
及びコーンステイープリカーの熱処理（加水分％）とは
別に、この方法は、最初におりてすでに本負土少ない細
菌がブロスを伴う系に適用され、従って接種のため忙使
用される汚泥の細菌が有効である点において有利である
。少量の有機物を含有し、そして有機成分として特にメ
タノールを含有するブロスけ、メタノールを分解し、そ
してメタンを生産する細菌にとって好都合である。

さら姉、この発明の方法は、嫌気性中温性メタン生産性
非無菌的発酵のために非常に確実な条件を提供する。目
的とする微生物集団をいつでも低コストで急速に再生産
することができ、そして補酵素Ｂ１□の製造のために使
用することができるからである。

（問題点を解決するための手段） この発明は、補酵素Ｂ１２（コパミドコエンザイム）の
回分式、半連続式又は連続式発酵のために適切な新規な
嫌気性中温性メタン生産性混合微生物集団を含有する新
しい接種拐料の製造方法に関する。この方法に従えば、
′補酵素Ｂ１２の嫌気的中温非無菌的発酵のために常用
されるブロスよシも少ない種類の栄養素を低い合計濃度
において含有するがその他の点では回し組成を有するブ
ロス７５〜８５容量チを、嫌気的に消化された下水２５
〜１５容量％−と混合し； 毎日０，３〜０．５容量チのメタノールを加えながら嫌
気的中性非無菌的条件下において約７日間にわたって前
記混合物を発酵せしめ、 得られた発酵ブロス（第一代ブロス）又はその部分を、
前記と同じ組成を有するブロス数容量倍、好ましくは４
〜６倍、に加え、そして声が５〜５５に低下するまで同
じ条件下で発酵を継続し；得られた発酵ブロス（第２代
ブロス）の部分、好ましくはその５〜１５容量チを取シ
出し、そして同じ栄養素を含有するが前躯体が富化され
ている同容量のブロスによシ置き換え；そして所望によ
シ、 さらに１〜２日間発酵を継続して、嫌気性中温性メタン
生産性の新規な混合微生物集団を含有する、補酵素Ｂ、
２の製造に適する接種材料を得る。

この発明の方法を実施する場合、ブロスは従来使用され
ている商業的に得られる栄養成分であるコーンススティ
ープリカーの代シに、熱処理したコーンステイープリカ
ー（加水分解物）、又はコーンヌロッデを用いて調製す
る。

「コーンスロッｆＪｌ−１、コーンスティーフト蒸留残
渣の混合物を蒸発せしめることによって得られる蒸留廃
棄物である。

熱処理前に、コーンステイープリカーを微生物学的試験
に付し、そして熱処理（加水分Ｍ）を十分ｔのコーンス
テイーシリカ−についてのみ行う。

微生物学的試験のために、本質上例１に記載したのと同
様な発酵を使用する。試験の４８目において、バイオが
ス生産が０．３〜０．６１／１発醇プロス／日であれは
、コーンステイーシリカ−紘この発明の幼規な接種材料
の製造のために適当である。

この場合、微生物学的に適当なコーンステイーグリカー
に同容ｉの水を加え、そしてこの混合物を１５分間煮沸
して、所望の熱処理コーンステイープリカー（加水分解
物）を得る。

新しい接種材料の製造において使用するブロスはそれ自
体公知の方法によりｓ造される（例えば例１）。

この発明の方法において使用されるブロスは、従来使用
されていたブロスと次の点においてＪｌ。

◎有機物質含量が少なく、そして有機物質として特徴的
にメタノールを含有スる。

◎商業的に入手できるコーンステイープリカーと異ル、
その熱処理物（加水分解物）、又はコーンスロッグを含
有する。

新規なブロス組成の結果として、接種材料の製造中に富
化された混合微生物集団の組成及び生産性が変化し、そ
して６〜７回の継代接種ではなく１回の接種と数日間（
１〜２日間）の発酵で十分である。

メタノール、コーンステイーシリカ−加水分解物、炭酸
水素アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、
５，６−シメチルペンズイミダゾール、及び亜硫酸ナト
リウムを含有する新しいブロスに、１５〜２５容ｆｉｌ
の消化された下水汚泥を加える。この下水汚泥は、好ま
しくは公共下水汚泥の嫌気性後消化檀から新たに得る。

十分に均一にした後、３０℃〜３２℃にお−て発酵を開
始し、そして約１週間（ｐ）Ｉが５．０〜５．５に低下
するまで）継続し、この間に毎日メタノール全添加しそ
して発酵ブロスからサンプルを採取する。このサンプル
から、発酵ブロスのμｍ及びメタノール含量、湛びにバ
イオがスの発生速度を決定する。これら３つのデータは
、発酵の進行についての非常に重要な情報である。すな
わち、嫌気性中温性混合微生物東回の形成のためには、
わずかに酸性（ＰＨ５〜６）の培地が好都合であること
が知られている。高過ぎる又は低過ぎるメタノール濃度
は順応を遅延せしめるから、発酵ブロスのメタノール濃
度も重要である。最後に、メタノール濃度とバイオがス
発生速度との間に直接的な相互関係が存在するから、バ
イオがス発生速度及びメタノール資化速度が重要である
。

この発明の好ましい態様に従えば、上記のように、発酵
を約１週間継続する。この後、第１代プロスと称する得
られた発酵ブロス、又はその部分を（場合によっては拡
大された規模において）接種する。すなわち、数倍量の
ブロスに加える。このブロスの組成は出発ブロスのそれ
と同一である。

発酵を、上記の条件と実質上同じ条件下でさらに数日間
継続する。この第２発酵後に得られた発酵ブロスを第２
代ブ’ｏス・ビ・称する。この後、約１０容量俤の第２
代プロスを、同容量の培養ブロスで置き換える。この培
養ブロスは同じ栄養素を含有するが、メタノール、５，
６−シメチルペンズイミダゾール及び塩化コバルト以外
の濃度は１／１０である。

上記の新鮮なブロスを補充された発酵ブロスを３３℃〜
３４℃にてさらに１日又は２日保持する。

このよ５ＪＣして、Ｂ、２発酵の開始に：Ｊｍする接画
材料が得られる。この接種材料は新規な嫌気性中温性メ
タン生産性混合微生物集団を官有する。

この発明の新規な接種材料は、本出願人の同日の特許出
願の明細書に記載されているようにして、補酵素Ｂ１２
の発酵において使用することができる。

次に１この発明の方法をさらに詳細に説明する。

但し、これによシこの発明の範囲を限定するものではな
い。

例１゜ １０１の実働容積を有する実験室規模のがラス製発酵槽
に、あらかじめ３０℃〜３３℃に加温した水道水を加え
、次に下記の栄養素を加える。

メタノール　３５ｍ１ ５０　ｌｌ（７）：Ｊ−ンステイーゾリカ　１００ｍ１
−から得られた加水分解物 炭酸水素ナトリウム　３０９ 塩化マグネシウム　１．ＯＩ 塩化コバルト、　０．０５．９ ５．６−シメチルペンソーイミダゾール　０．０３，９
亜硫酸ナトリウム　０．３０＃ 次に、培養ブロスを十分に均一にし、そして３０℃〜３
３℃の水道水により５ｏｏｏｉにした。

このブロスに、公共下水グランドから新たに得た消化後
の下水汚泥２０００ｍ１ｆ加えた。この混合物を混合し
、ガラス製発酵槽をゴム板で檀い、そして３２℃〜３４
℃の恒温器に入れる。

発酵の次の期間において、毎日５ｒ）ｍｌのサングルを
（均一にした後に）採取し、そして３５ｍ１のメタノー
ルを発酵槽に加え、この後さらに２００ｍ１のサンプル
を採取し、発酵槽をゴム板で嫂い、そして同じ温度にお
いてさらに７日間嫌気的発酵を継続する。

第１の７日間の後に得た発酵ブロスを第１代プロスと称
する。

メタノールの添加前に採取したサンプルから、発酵ブロ
スの−及びメタノール濃度を測定する。

メタノールの添加後に取シ出した２００ｄの発酵ブロス
をガスメーターに入れ、そしてバイオがスの発生速度を
測定する。サンプルをガスメーターから取シ出し、そし
て次のメタノールの添加と平行して発酵槽に再充填する
。

発酵の７日目に５倍のスケールアップを行う。

すなわち、５０ノの実働容積を有する発酵槽に、３０〜
３２℃の水道水３０１を入れ、次にこれに下記の栄π素
を補充する。

メタノール　１７５ｍ１ ２５０９　（Ｄ　：Ｉ−＝ｙステイープリカーから　５
００ｍｌ得た加水分解物 炭酸水素アンモニウム　１５０．９ 塩化マグネシウム　５９ 塩化コバルト　０．２５ｇ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．１５１！亜
硫酸水素ナトリウム　１．５ｇ 栄養素の添加が完了した時、ブロスを３０℃〜３２℃の
水道水によｐ４０１にする。

次に、７日目の発酵ブロス（第１代ブロス）の全量（１
０１）を新たに調製したブロスに加え（接ｆｆ１）、そ
して強力に均一化した援発酵槽を密封し、そしてさらに
７日間３２℃〜３４℃において嫌気的発酵を継続する。

第２の７日間の間、毎日５０ｍ１のサンプルを採取し、
１７５ｍ１のメタノールを発酵槽に加え、そして次に２
００４のサンプルを採る。発酵槽を密封し、そして３２
℃〜３４℃にて発酵を継続する。

メタノール添加の前後において採取したサングルから−
、メタノール濃度、及びバイオがス発生速度を測定する
。

第２の７日間の後に得られた発酵ブロスを第２代プロス
と称する。１（１（５，ＯＡりの第２代ブロスを取シ出
し、そしてこれと同じ容ぶ°の次の組成を有するブロス
を加える。

３０℃〜３２℃の水道水　５０〇− メタノール　１７５ｍ１ ２５．９のコーンヌティープリカーから　５　Ｑｍｌ得
られた加水分解物 炭酸水素アンモニウム　１５．９ 塩化マグネシウム　０．５Ｉｌ 塩化コバルト　０．２５Ｆ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．１５１！亜
硫酸水素ナトリウム　０．ＩＩ ブロスを添加した後、発酵ブロスを十分に混合し、発酵
槽を密封し、そして３２℃〜３４℃にて発酵をさらに１
日継続する。

上記の手順を通して、新しい嫌気性中温性メタン生産性
混合微生物集団が形成され、このものは、コリネバクテ
リウムｓｐ、（２４Ａ１）、プロピオニバクテリウムＩ
１ｍ）、（２３９Ａ、／６）、及びメタノコツカスｓｐ
、（ＭＣ−０１７）を含有しこれらはそれぞれＨｕｎｇ
ａｒｉａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　ｊｎＭｅｄｌｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ（ＯＫＩ）Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨ）’ｇｌ＠
ｎｅに、Ａ０００７６、／１６０００７９、及び４００
２７２として寄託されている。この接種材料は５．４〜
５．８のｐｌ（，０，５〜０．８１７日／ｌのバイオが
ス生産によって特徴付けられる。

得られた接種材料は補酵素Ｂ１２の製造に適する。

ハンがり一特許第１６７．６５８号明細書において開示
されている方法によシ、−半連続操作の第１日目に採取
したサンプルから測定された発酵ブロスの活性成分濃度
は７．３１ｒＱ／ＩＩである。

栄養成分は次のようにして調製する。約４５チの乾物量
を有するコーンステイープリカーを同容量の水道水によ
シ稀釈し、この混合物を１５分間沸騰せしめる。次に溶
液を冷却し、そして水道水によシもとの容量にする。得
られた新鮮な溶液はいわゆる熱処理コーンステイーシリ
カ−（加水分解物）である。

活性成分製造用接種材料の製造のために使用されるコー
ンステイープリカーの適合性を、その使用前に次のよう
にして決定する。１ｏｌの実働容積を有する実験室用ガ
ラス製発酵槽に、３０℃〜３２℃の水道水９Ｉｌを入れ
、次に下記の栄養素を加える。

メタノール　５ｏｒｎ１ ４５％ｏ−たを麻１する・試験すでｐ戸処Ｍ（未加　分
　コーンステイー　カー　５０！Ｉ炭酸水素アンモニウ
ム　３０Ｉ！ 塩化マグネシウム　１１ 塩化コバルト　０．０５．９ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．０３，９亜
硫酸ナトリウム　０．２０ｆ 均一にした後、補酵素Ｂ１□の発酵槽がらの発酵ブロス
３００ｍ１をブロスに加え、次にこれを、３０℃〜３２
℃の水道水により１０！、にする。発酵槽をゴム板で覆
い、そして３２℃〜３４℃の恒温器に入れる。毎日、混
合物に５９ｍ１のメタノールを加え、均一にした後２０
０ｄの発酵ブロスを取シ出し、バイオガスの生産速度を
測定し、発酵槽を覆い、そして３２℃〜３４℃にて発酵
を継続する。発酵の４日目にバイオがスの生産が０．３
〜ｏ、６１！発酵ブロスｌ／日であれば、このコーンス
テイーシリカ−は、前記の熱処理の後、接種材ヤ１の製
造のため′に適当である。

５．６−シメチルイミダゾールは、規定量のメタノール
に溶解した稜プロスに加える。

他の栄養素はブロスに直接加え、そしてその中に溶解す
る。

例２゜ この例は、スケールアップを伴わない接種材料の製造を
例示する。この技法は、少量の接種材料で十分な場合に
一般に使用される。

例１に記載した手順に従って第１代の接種材料を、１０
１の実働容積を有するガラス製発酵槽中に調製する。

発酵の７日目（第１代）に、十分に混合した発酵ブロス
から２ノを取り出し、そしてこれを１０１の実働容積を
有する他のガラス製発酵槽に注入することによシ接種を
行う。この後、３０℃〜３２℃の水道水６／、及び次に
下記の栄養素を後者の発、酵槽に加える。

メタノール　３５ｍ１ ５０Ｆのコーンステイープリカーがら得　１００ｄられ
る加水分解物 炭酸水素アンモニウム　３０．９ 塩化マグネシウム　１９ 塩化コバルト　０．０５１！ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．０３．ｆｉ
亜硫酸水素ナトリウム　０．３０．Ｉ７成分の添加が完
了した時、混合物を十分に均一にし、３０℃〜３２℃の
水道水で１０４’にし、再度均一にし、そしてガラス製
発酵槽をゴム板で種い、そして３２℃〜３４℃の恒温器
に入れる。

この後毎日、５０ｍ１のサンプルを採取し、３５ｍ１の
メタノールを加え、そしてさらに２００ｍ／のサンプル
を取シ出し、そして発酵槽をゴム板で覆い、そして同じ
温度においてさらに７日間嫌気的発酵を継続する。

この第２の７日間の後に得られ九発酵ブロヌを第２代プ
ロスと称する。

第２代ブロスから、均一にした発酵ブロス１０容量チを
取り出し、そして下記の組成を有する同容量のブロスを
導入する。３０℃〜３２℃の水道水１．０１に次の栄養
素を加える。

メタノール　３５ｍ１ ５°（Ｊ９０°−″′イー“）”−力゛ら得られ　、。

。 た加水分解物 炭酸水素アンモニウム　３．０ｇ 塩化マグネシウム　０．１ｇ 塩化コバルト　０．０５１１ ５．６−ジメテルペンズイミダ′ゾール　０．０３ｇ亜
硫酸水素ナトリウム　０．０２．９ ブロスを添加した後、発酵ブロスを十分に混合し、発酵
槽をゴム板で快い、そして３２℃〜３４℃にてさらに２
４時間発酵を継続する。

２４時間の発酵の後に得られた発酵ブロス（接種桐料）
は補酵素Ｂ、２の製造において使用するのに適する。

思ユ この例は、この発明の方法が工業的規模においても実施
され得ることを示す。

２．０ｍ’の実働容積を有する発酵槽に、３０℃〜３２
℃に加温した水道水１０００１をポンプ送入し、この後
、例１に記載したようにして調製した後下記の栄養素を
加える。

メタノール　７．０１ １０ｋＩ！：コーンステイープリカーから得ら　。。、
。ｌれた　水分解物 炭酸水素アンモニウム　６．０ｋＰ 塩化マグネシウム　０．２ｋｐ 塩化コバルト　０．０１ｋｐ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．００６ｋｐ
亜硫酸水素ナトリウム　０．０６１＃ 上記の栄養素を含有するブロスを十分に均一にし、そし
て次に例１に記載した嫌気的下水汚泥４００Ａ！を加え
る。混合物を、３０℃〜３２℃の水道水によシ２ｍ３と
し、均一にし、発酵槽を密封し、そして３０℃〜３２℃
にて嫌気的発酵を開始する。

この後毎日、（２０分間攪拌した後に）発酵ブロスから
サンプルを採取し、７．０／のメタノールを加え、攪拌
を２０分間継続し、サンプルを採取しそして発酵を２４
時間継続する。メタノールの添加前に採取したサンプル
から発酵ブロス中のメタノール濃度及びＰＨを測定し、
他方メタノール添加後に採取したサンプルを用いてバイ
オがスの発生速度を測定する。

発酵の７日目（第１代）に培養物を新鮮なブロスに接鍾
し、規模を５倍に拡大する。１０ｍ３の実働容積を有す
る発酵槽に３０℃〜３２℃に加温した水道水６ｍ　をポ
ンプ送入し、この後下記の栄養素を導入する。

メタノール　３５．０１ ５０１ｇｃＤコーンステイープリカーから得　１０（１
Ｏ１られた加水分解物 炭酸水素アンモニウム　３０．０ｋｔ 塩化マグネシウム　１．（＃ 塩化コバルト　０．０５に＃ ５．６−ノメチルペンズイミダゾール　０．０３ｋａｃ
亜硫酸水素ナトリウム　０．３０に、Ｆ十分に均一にし
た後、７日間発酵したブロス２ｍ’を、前記のブロスに
ポンプ送入し、次にこれして均一にした後、３０℃〜３
２℃にて嫌気的発酵を開始する。

この後毎日、発酵ブロスを３０分間攪拌し、サンプルを
採取し、３５〕のメタノールを導入し、攪拌をさらに３
０分間継続し、そしてさらにサンプルを採取する。

サンプルは前記のようにして規則的に分析する。

４０分間攪拌した後１０容ｆチの第２代発酵プロスを取
シ出し、そして下記のようにして調製した同容量のブ覧
スを導入する。

３０℃〜３２℃に加温した水道水０．５ｍ’に次の栄養
素を溶解する。

メタノール　３５、Ｏｌ 炭酸水素アンモニウム　３．０ｋｇ 塩化マグネシウム　０．１に＃ 塩化コバルト　０．０５ヰ ５．６−シメチルペンズイミダゾール　０．０３ｋｐ亜
硫酸水素ナトリウム　０．０２４ 進水によｐ　１０ｍ３にする。これを３０分間攪拌し、
次に攪拌を停止し、そしてさらに２４時間嫌気的発酵を
継続する。

２４時間後、接種材料の製造が完了する。発酵ブロスの
特性は、ｐｌ（＝５．４〜５．８；がス発生０．５〜０
．８１／発酵ブロスｌ／日；活性成分含１８、３　ｍ９
／ｌである。

得られた発酵ブロスは補酵素Ｂ１□の製造において使用
するのに適する。

栄養素の調製、及びコーンステイープリカーの品質は例
１に記載した方法によシ調節する。

特許出願人 リヒターケアオンペシェセテイ　）ｒシレーアール、チ
ー・特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　非無菌条件下で補酵素Ｂ、２（コパミドコエンザ
   イム）を回分式、半連続式又は連続式に発酵するために
   適する、新規な嫌気性中温性メタン生産性混合微生物集
   団を含有する新規な接種材料の製造方法であって、 少ない種類の栄養素を低い合計濃度忙おいて含有する点
   を除き補酵素Ｂ、２の嫌気的中温非無菌的発酵のために
   使用される當用のプロスと向じ組成を有するプロス７５
   〜８５容：＃俤を、嫌気的に消化された下水汚泥２５〜
   １５容量チと混合し；７日間発酵せしめ、 得られた発酵プロス（第１代）又はその部分を、同じ条
   件下でｐＩ（が５〜５．５に低下するまで発酵を継続し
   ； 得られた発酵ブロス（第２代）５〜１５容量チを毎日取
   シ出し、そしてこれを、同じ栄養素を含有するが前駆体
   に富む回廟積のプロスで置き換え、そして所望によシ さらに数日間にわたシ発酵を継続することによシ、補酵
   素Ｂ１□の製造における使用に適し、嫌気性中温性メタ
   ン生産性混合微生物東回を含有する接種材料を得ること
   を特徴とする方法０２、栄養素成分として、微生物学的
   に適当な、そして熱処理された（加水分解された）コー
   ンステイープリカーの水溶液を使用する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、１５〜２５容ｔＳの嫌気的に消化された公共下水汚
   泥をプロスに添加する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ４、嫌気的に消化された下水汚泥として、公共下水処理
   プラントの新鮮な消化後下水汚泥を使用す、ｂｅ許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、　使用されるブロスがメタノール、コーンステイー
   プリカー加水分解物及び／又は熱処理されたコーンスロ
   ップ、炭酸水素アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化
   コパル）、５．６−シメチルペンズイミダゾール、及び
   亜硫酸水素ナトリウムを含有する特許請求の範囲＃！１
   項Ｆ載の方法。