DD229713A5

DD229713A5 - Verfahren zur herstellung von gereinigtem htnf

Info

Publication number: DD229713A5
Application number: DD84264523A
Authority: DD
Inventors: Lloyd J Old; Eleizabeth C Richards; Berish Y Rubin; Barbara D Williamson; Jay S Prendergast
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1983-06-27
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1985-11-13
Also published as: FI842560L; EP0131789A3; HU197358B; DK311984A; DD241271A5; ES533767A0; DK311984D0; AU2933784A; CA1265444A; JPS6036420A; PT78773B; DD241268A5; FI842560A0; PT78773A; HUT34775A; ES8608885A1; AU587959B2; GR82260B; NZ208648A; ZA844377B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren von gereinigtem menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor allein oder in Verbindung mit menschlichem Interferon. Ziel der Erfindung ist, eine neue diagnostische Moeglichkeit zur Krebserkennung zu finden. Die Erfindungsaufgabe ist, ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem hTNF bereitzustellen, das dadurch geloest wird, dass in einem ersten Inkubationsschritt menschliche haematopoietische Zellen in Kulturloesung inkubiert werden, dass anschliessend die Zellen von den Loesungsueberstaenden abgetrennt, gesammelt und in einem zweiten Inkubationsschritt erneut in einer Kulturloesung inkubiert werden und dass die Ueberstaende gesammelt und tiefgefroren werden. Das hTNF ist gekennzeichnet durch ein MG im Bereich von 70 000 Dalton, Stabilitaet im p H-Bereich von 6 bis 8, Stabilitaet bei 79C und bei 20C sowie 60 Minuten bei 56C und eine spezifische Aktivitaet im Bereich von 2 bis 5104 Einheiten/mg Protein. Das Verfahren kann fuer klinische Untersuchungen nuetzlich sein.

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Behandlung von Krebs, bei der gereinigter menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor (hTNF) oder hTNF in Verbindung mit menschlichem Interferon (hIFN) verwendet wird. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von hTNF.

Der Beginn der Geschichte des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF) liegt mehr als ein Jahrhundert zurück. Es wurde damals festgestellt, daß während gewisser bakterieller Infektionen beim Menschen gleichzeitig ein Rückgang von Tumoren zu verzeichnen war. Über vierzig Jahre lang behandelten COLEY und Mitarbeiter bösartige Erkrankungen beim Menschen mit zellfreien Bakterien-Filtraten oder gemixten Bakterien-Vakzinen, wobei oft positive Ergebnisse erzielt wurden.

Es wurden ferner auch Untersuchungen an Meerschweinchen und Mäusen durchgeführt. Der Antitumor-Effekt bei den Versuchstieren besteht aus einer schweren hämorrhagischen Reaktion im Kern des Tumors während der Bakterienbehandlung des Versuchstieres binnen vier Stunden. Auf den Antitumor-Effekt folgt ein langsamerer, nekrotisie-

render Effekt, dessen Intensität in den nächsten 48 'Stunden zunimmt. Das Tumorgewebe wird dabei zunehmend dunkler, wodurch Absterben und Blutung angezeigt wird, die in vielen Fällen zu einem vollständigen Rückgang des Tumors führen. Diese plötzliche hämorrhagische Nekrose, die bei gewissen Tumoren durch gramnegative Bakterien oder durch aus deren Zellwänden gewonnenes Endotoxin (Lipopolysaccharide) ausgelöst wird, wurde lange als die experimentelle Ergänzung zu den klinischen Beobachtungen angesehen, die oben beschrieben sind.

Arbeiten, die am Sloan-Kettering-Institut durchgeführt wurden, führten jedoch zu dem Ergebnis, daß aufgrund der Reizung mit Bakterien ein Faktor freigesetzt wird, möglicherweise von Makrophagen, der direkt oder indirekt verantwortlich ist für das Absterben der Tumorzellen. Dieses Ergebnis wird durch Untersuchungen gestützt, die zeigen, daß die Injizierung des Serums BCG-infizierter Mäuse zusammen mit Endotoxin eine hämorrhagische Nekrose eines transplantierten Sarkoms Meth A und anderer Tumore auslöst. Serum von mit BCG-injizierten Mäusen oder Serum von normalen Mäusen, denen Endotoxin gegeben wurde, ist inaktiv. Endotoxin allein besitzt keine Toxizität für die meisten in vitro gehaltenen Tumorzellen. Der aktive Serum-Bestandteil wird Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) genannt .

Die TNF-Aktivität kann nicht auf restliches Endotoxin zurückgeführt werden, wie das pyrogene Verhalten, der Limulus-Test und die chemische Analyse auf Endotoxin-Teile zeigt. TNF ist im Gegensatz zum Endotoxin direkt cytotoxisch für gewisse in vitro Tumor-Zellen. Normale Kultur-Zellen bleiben unverletzt .(Lloyd J. Old, New Developments in Cancer Therapy, MSKCC Clinical Bulletin £: 118 (1976), E. A. Carswell et al Proc. Nat ¹I Acad. Sei. USA 22. 3666-70 Sept 1975). Andere Nagetiere, z. B. Ratten oder Kaninchen, bilden ebenso TNF, wenn ihnen BCG und zusätzlich Endotoxin verabreicht wird. TNF wurde zuerst in einem Serum von Mäusen gefunden, das mit Bacillus Calmette-Guerin (BCG) versetzt und 2-3 Wochen später mit Endotoxin von E. CoIi überprüft wurde. Weder BCG oder seine Gegenstücke (siehe unten) noch Endotoxin erzeugen allein den TNF-Faktor im Mäuse-Serum; es müssen beide anwesend sein. Um TNF freizusetzen, können bei der Injizierung von Mäusen anstelle von BCG C_-1. granulosum, C. Parvum, Malaria oder Zymosan (Schaum-Zellwände) eingesetzt werden, die wie BCG eine massive Hyperplasie der Makrophagen und anderer zellulärer Elemente des reticulo-endothelial Systems induzieren. Diese Faktoren sind die Gegenstücke von BCG. Das nach der BCG- und Endotoxin-Behandlung gewonnene Serum ist deswegen atypisch, da es nicht vollständig gerinnt. Eine Vorschrift für die opti-

male Produktion und die Prüfung von TNF in Mäusen beinhaltet:

a) BCG: eine Injektion von 2 χ 10 lebensfähigen BCG-Organismen zur maximalen Stimulation und Hyperplasie des reticulo-endothelial (RES) Systems,

b) Endotoxin: 14 - 21 Tage später, auf der Höhe der RES-Stimulation durch BCG, eine 0,25 - 25 Mikrogramm Injektion von Endotoxin (Lipopolysaccharide w von

E. CoIi). Die höchste Dosis gibt die besten .TNF-Spiegel in den Mäusen,

c) Sammlung von TNF:

die optimale Zeit hierfür ist 2 Stunden nach Verabreichung des Endotoxins (längere Zeiten sind weniger geeignet wegen eines durch Schock verursachten Kreislaufkollaps), und

d) TNF-Untersuchungen: 1. In Vivo:

Der nekrotische Effekt von TNF-positivem Mäuseserum auf BALb/c Meth A ascites Sarkom transplantiert in einen (BALb/c χ C57 BL/6) F^Hybrid wird wie folgt demonstriert. Nach sieben Tagen wird der Effekt des TNF-positiven Serums auf subcutanes in. vivo Tumortransplantat während 24 Stunden abgeschätzt. Eine erste Reaktion ist nach 3-4 Stunden sichtbar. Bei 7-Tage-Transplantaten korrespondiert die nekrotische Reaktion allgemein mit dem

Volumen des TNF-positiven Serums, das in Dosen von ungefähr 0,1 - 0,5 ml verabreicht wird. +++-Reaktion zeigt, daß das Tumorgewebe vollkommen oder nahezu vollständig zerstört ist, wobei nur ein peripherer Rand von anscheinend lebensfähigem Tumor-Zellgewebe zurückbleibt. 6-Tage-Transplantate reagieren weniger leicht, 5-Tage-Transplantate reagieren überhaupt nicht.

2. In Vitro

TNF-empfindliche L-M Zellen wurden aus geklonten Mäusezellen gewonnen. Diese Zellen sind unter der Nummer L 929 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Durch wiederholten Durchfluß von TNF-empfindlichen L-Zellen durch Medien, die TNF enthielten, wurde eine TNF-resistente Linie von L-Zellen erhalten. TNF wirkt cytotoxisch gegen TNF-empfindliche L-Zellen (L(S)), aber nicht gegen TNF-resistente L-Zellen (L(R)).

Zur Untersuchung nimmt man 0,5 ml eines Mediums, das fortlaufende Verdünnungen von TNF enthält, und gibt es in Behälter (24 well Costar plates), die 2-3 Stunden vorher mit 50000 typsinierten L-Zellen in 0,5 ml von Eagle's minimal essential medium besetzt werden. Danach

bestimmt man den Gehalt an Protein, der einen 50 %igen Zelltod zur Folge hat, geschätzt nach 48 Stunden durch Phasen-Mikroskopy oder Trypanblau-Ausschluß. In einer Standard-probe entspricht z. B. einer Einheit eines in vitro partiell gereinigten Mäuse-TNF 58 ng oder einer spezifischen Aktivität von 20000 Einheiten/mg Protein. Dieses partiell gereinigte Mäuse-TNF enthält kein IFN. Vor der Reinigung enthält das Original-Serum noch Interferon (IFN).

Neben BCG können als Impfmittel auch noch C. granulosum, C. Parvum, Malaria oder Zymosan (Zellwand vom Schaum) eingesetzt werden. Green et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 59: 1519 (1977) berichten, daß Mäuse 6 Tage nach der Injektion von C.Parvum ein Maximum an überempfindlichkeit gegen Endotoxin erreichen. Bei dieser Methode wird vier Tage, nachdem C.Parvum injiziert wurde, Endotoxin verabreicht. Die Endotoxin-Dosen betragen 0,25 Mikrogramm, aber 25 Mikrogramm werden gebraucht, um TNF freizusetzen. 90 Minuten nach der intravenösen Injektion von einem Mikrograram Endotoxin ist die TNF-Freisetzung am größten. Die TNF-Produktion variiert mit unterschiedlicher Färbung der Mäuse.

Endotoxin von gram-negativen Bakterien, wie E. CoIi, hat sich bis heute als das wirksamste Mittel herausgestellt',

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um TNF in vivo freizusetzen (Carswell et al, Supra). Der Einfluß von TNF zeigt sich bei einer Vielfalt von Mäuse-Tumorsystemen, und zwar bei: Sarkomen S-180 (-CD-I Swiss), BP8 (C3H); Leukemien EL4 (C57B1/6), ASLl (A Strain), RADA-I (A Strain), RLoI (BALb/c), und Mastozytomen P815 (DBA/2). Meth A ist höchst empfindlich gegen TNF, wenn der Tumor intradermal injiziert wird wie bei der In vivo Untersuchung. Über weniger empfindliche Tumore wurde auch berichtet: Reticulum-Zellsarkom RCS5 (SJL) war resistent, Brust-Tumore der Art (C3H/An χ I) F, waren nur geringfügig empfindlich und AKR spontane Leukemien zeigten mittelmäßige Empfindlichkeit. Hieraus ist ersichtlich, daß Mäuse-TNF einen therapeutischen Einfluß auf Mäuse-Tumore besitzt (Carswell et al, Supra).

In vitro zeigten sich transformierte Murin-Fibroblasten (L-Zellen) in'Kultur wesentlich empfindlicher gegen TNF als Meth A Sarcom-Zellen oder Mäuseembryo-Fibroblasten (MEF). Lebensfähige Zellen wurden auch nach 48stündiger Behandlung mit TNF gefunden. Der Einfluß ist hier sowohl zytotoxisch als auch zytostatisch. Er tritt aber verzögert auf, da er in den ersten 16 Stunden nicht sichtbar ist. Der Einfluß zeigt sich bei dem Meth A in vivo Test in einem Nekrose-Prozeß, der in dem Zentrum des Meth A-Tumors beginnt und sich nach außen fortsetzt, wobei ein

Rand von scheinbar nicht angegriffenem Tumor-Zellgewebe zurückbleibt. Von diesem Rückstand aus kann der Tumor weiter wachsen. Bei einem hohen Prozentsatz der Versuchstiere konnte durch Behandlung mit einer optimalen Dosis von TNF der Tumor vollständig unterdrückt werden. Der L-Zellen-Effekt ist die Grundlage für die in vitro Untersuchung, Supra. Eine resistente Linie von L-Zellen wurde dadurch entwickelt, daß man wiederholt TNF-empfindliche Zellen durch Medien leitete, die TNF enthielten. TNF ist zytotoxisch gegen empfindliche L-Zellen (L(S)), aber nicht gegen resistente L-Zellen (L(R)). Diese Untersuchungen wurden ferner benutzt für die Untersuchung auf hTNF (siehe unten).

Indirekte Anzeichen deuten insofern auf Makrophagen als Ursprungsquelle für TNF bei Mäusen und Kaninchen, da Leber- und Milz-Makrophagen eine massive Hyperplasie durchmachen unter dem Einfluß von BCG (oder seinen Gegenstücken) und Endotoxin.

Zusammengefaßt kann man daher sagen:

1. Mittel, die für die Freisetzung von TNF verantwortlich sind, bewirken eine merkliche Makrophagen-Hyperplasie

2. eine selektive Lysis von Milz-Makrophagen kann kurz nach der Endotoxin-Injektion bei BCG-behandelten

Mäusen beobachtet werden 3. Serum, das TNF enthält, ist reich an Enzymen von Lysosomen und bezeichnenderweise enthalten aktivierte Makrophagen eine Menge solcher Lysosomen.

Geklonte Linien von Mäuse-Histozytomen (J774 and PU5-1.8) produzieren TNF gemäß ihrer Veranlagung. Die Produktion kann noch gesteigert werden, wenn die Zelllinien Endotoxin ausgesetzt werden (Mannel et al. (1980) Infect. Immun. 3_Q_, 523-530 und Williamson et al. (nicht veröffentlicht)).

Mäuse-TNF, das aus dem Serum isoliert wird, ist ein Glykoprotein und liegt in mindestens zwei Formen vor, eine mit einem Molekulargewicht von 40 - 60000 und eine mit einem Molekulargewicht von 150000 (Mannel et al. (1980) Infect. Immun. 23., 204 - 211; KuIl et al. (1981) Jpn J. Exp. Med., £1, 191 - 194; Green, S. et al. (1976) Proc. Nat ¹I Acad. Sei. USA 7_3_, 381 - 385 und unveröffentlichte Arbeiten). TNF ist im gefrorenen Zustand, vorzugsweise unterhalb -70° C stabil. Seine Aktivität wird zerstört, wenn es für 30 Minuten bei 70° C gehalten wird. Bei Kaninchen wirkt TNF pyrogen in einem Bereich von 5 - 500 Mikrogramm pro kg und nichtpyrogen bei 5 Mikrogramm pro kg. Es wird berichtet, daß TNF ein Molekulargewicht im Bereich von annähernd 39 - 68 k Dalton

hat (Ruff, M. R. et al. (1980) J. Immunol. 125., 1671 1677; Matthews, N. et al. (1980) Br. J. Cancer Al, 416 422; Matthews, N. et al. (1978) Brit. J. Cancer M, 302 309; Ostrove, J. M. et al. (1979) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. IM, 354 - 358) .

Interferon

Als Ergebnis einer zuvor erfolgten Virusinfektion wird im Organismus von Tieren proteinhaltiges Interferon produziert. Das gebildete Interferon schützt das Tier gegen eine nachfolgende .Virusinfektion. Es konnte gezeigt werden, daß IFN eine wichtige Rolle in der Regelung des Immunsystem spielt. Interferon beeinflußt folgende Zellfunktionen: Es unterdrückt die Zellteilung, das Tumorwachstum, die Antikörperbildung, erythroide Differenzierung und Adipozyten-Differenzierung, während es die Makrophagen-Phagozytose, Lymphozyten-Toxizität, NK-Zellaktivität, den Antigen-Ausdruck an der Zelloberfläche und die Antikörperproduktion steigert. Weiterhin wurde gefunden, daß Interferon (IFN) ein mögliches Mittel zur Krebsbekämfung ist.

Es gibt drei wichtige Interferon-Typen, nämlich alpha, beta und gamma, die sich untereinander durch ihre antigenen und biochemischen Eigenschaften unterscheiden.

Alpha-Interferon wird abgesondert durch Leukozyten, Beta-Interferon durch Fibroblasten, wobei beide auch durch Viren induziert werden können. Gamma-Interferon wird abgesondert durch Lymphoidzellen und ist bekannt als "Immun"-Interferon (Stewart, W. E. II, et al., Nature 286. 110 (1980)). Größere Antigen-Unterschiede bilden die hauptsächliche Basis, um die drei Interferon-Arten zu unterscheiden. Die Interferone unterscheiden sich zusätzlich noch in einigen biologischen und physikochemischen Eigenschaften. Menschliches Alpha- und Beta-Interferon wurden rein dargestellt und ihre Aminosäuresequenzen wurden bestimmt, teilweise durch direkte Aminosäure-Sequenzierung (Knight, E. Jr., et al., Science 207, 527 - 528 (1980)) und noch vollständiger durch Analyse der geklonten komplementären DNA-Sequenzen (Mantei, N., et al. Gene IQ., 1-10 (1980); Taniguchi, T., et al., Gene IH, 11 - 15 (1980)). Der Vergleich von geklonten Alpha- und Beta-Interferon DNA-Sequenzen zeigt, daß bei den beiden Interferonen nur 29 % der Aminosäuren übereinstimmen (Taniguchi, T., Mantei, N., et al., Nature 285, 547 - 549 (1980)). Bei jedem der drei Interferon-Haupttypen treten molekulare Untergruppen auf, die weniger heterogen sind. Einige der Untergruppen des menschlichen Alpha-Interferons ließen sich durch Vergleich der geklonten DNA-Sequenzen feststellen (Nagata, S., et al., Natura 231 401 - 408 (1980)).

Sehr viel weniger Information liegt für das Gamma-Interferon vor. Dieses Interferon wird gewöhnlich in Überständen von Lymphozyten-Kulturen gefunden, die Mitogenen, z. B. verschiedenen Lektinen oder spezifischen Antigenen in Kulturen sensibilisierter Zellen, ausgesetzt sind. Die Definition von Gamma-IFN beruht auf zwei Hauptkriterien:

(i) im Gegensatz zu Alpha- und Beta-IFN ist die biologische Aktivität des Gamma-IFN bei einem pH-Wert von 2 weitgehend zerstört, und

(ii) eigens gegen Alpha- und Beta-IFN hergestellte Antisera zeigen keine Gegenreaktion mit Gamma-IFN.

Zusätzlich lassen Experimente, die mit relativ unreinen Präparaten von Gamma-IFN durchgeführt wurden, auf eine Reihe von biologischen Unterschieden schließen. Z. B. wurde gezeigt, daß Gamma-IFN den antiviralen Zustand viel langsamer induziert als Alpha- oder Beta-IFN (Dianzani, F., et al., Natura 283, 400 - 402 (1980)). Im Gegensatz dazu kann Gamma-IFN sehr viel aktiver sein als Zellwachstumshemmer und Antitumor-Agens (Crane, J. L. Jr., et al., J. Nat. Cancer Insti. £1, 871 - 874 (1973) Gupta et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. ü. S. A. 1£, 4817

(1979) Blalock et al. ,· Cellular Immunology H, 390 (1980)) .

Die klinische Erprobung von Interferon in der Krebstherapie wurde dadurch behindert, daß nicht genug Interferon hergestellt werden konnte. Durch entsprechende Entwicklungen in der Gen-Technologie wurde dieses Problem überwunden, und somit ist das National Cancer Institute in der Lage, in großem Umfang Versuche mit menschlichem Interferon (hIFN) durchzuführen. Es sind also sowohl natürliche als auch rekombinante menschliche Interferone bekannt, die beide auch klinisch benutzt werden.

Kurzfassung

Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von menschlichem TNF (hTNF) an. Ein solches Verfahren könnte für klinische Untersuchungen nützlich sein. Über 30 menschliche Zell-Linien in Zellkultur wurden daraufhin überprüft, ob sie sich für die Produktion von TNF eignen. Weiterhin wurde gefunden, daß Phorbol 12-myristat, 13-acetat (PMA) notwendig ist, um die hTNF-Produktion zu steigern. PMA ist bekannt als ein Stoff, der Krebs verursachen kann. Gegenwärtig sind B-Zell-Linien mit oder ohne PMA die Ausgangsstoffe für die hTNF-Produktion, von denen man sich am meisten ver-

spricht. Die oben beschriebenen Standard-TNF-Untersuchungen werden auch benutzt für die Untersuchung auf hTNF, z. B. bei der in vivo Untersuchung auf Tumor-Nekrose und der in vitro Untersuchung auf L-Zellen Zytostase / Zytotoxizität. T-Zellen, Monozyten- und Promyelozyten-Zell-Linien produzieren wenig oder kein TNF. Bei dieser Methode sind weder exogenes BCG, noch exogenes Endotoxin notwendig für die hTNF-Herstellung. Ein überraschender, synergistischer Anti-Tumor-Zelleffekt tritt dann auf, wenn hTNF und entweder rekombinantes oder natürliches hIFN zusammen verwendet werden, um menschliche Tumorzellen zu töten oder deren Wachstum zu unterdrücken. Jede der beiden Substanzen hIFN oder hTNF besitzt für sich eine Anti-Tumor-Wirkung, aber diese Wirkung ist größer, wenn hTNF zusammen mit hIFN eingesetzt wird, als die Summe der einzelnen Antitumor-Wirkungen.

Beschreibung

Als Quelle für hTNF können gemäß der Erfindung menschliche Zell-Linien dienen. Die Methoden zur Produktion von Mäuse-TNF scheinen weitgehend abhängig zu sein von den Einflüssen des BCG und des Endotoxins. Nach der hier vorgestellten Methode zur Herstellung von menschlichen B-Zellen kann TNF produziert werden, ohne daß BCG oder

Endotoxin zugesetzt wird. Daraus folgt, daß dieses TNF im wesentlichen frei ist von exogenem Endotoxin, und bakteriellen Verunreinigungen als auch Verunreinigungen aus dem Serum. Wie in Tabelle I an den getesteten hämatopoietischen Zellen gezeigt ist, läßt sich mit B-Zellen am besten hTNF herstellen, überraschenderweise lassen sich hohe Gehalte an TNF erreichen, ohne daß exogenes BCG oder exogenes Endotoxin zugegen ist. Kleinere Gehalte oder Spuren von hTNF k-ann man in überständen von Zell-Linien finden, die von T-Zellen oder Zellen monozytischen oder promyelozytischen Ursprungs abstammen. Nach der in vitro L-Zellen-üntersuchung (Carswell et al., Supra) ließen sich Gehalte an TNF bestimmen, das von Zellen menschlichen Ursprungs produziert wurde. In dieser Studie wurden also zum erstenmal Gehalte von TNF gefunden, die frei waren von irgendeiner exogenen Endotoxin-Verunreinigung, da, wie weiter unten noch beschrieben wird, kein Endotoxin der Kultur zugesetzt wurde. Neuere Studien durch andere an Mäusen ergaben, daß Endotoxin insofern problematisch ist, da in einem System vorhandenes Endotoxin nicht so leicht entfernt werden kann.

EBV-transformierte B-Zell-Linien stammen von Patienten mit einem Melanom. Andere Zell-Linien stammen von Zellsammlungen der Herren Dr. Lloyd Old, Dr. Jörgen E. Fogh

oder Dr. Peter Ralph des Sloan-Kettering Institutes. Lukll-Zellen wurden von Dr. W. Steward erhalten (Pickering et al. (1980) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA TL, 5983 - 5942). EBV-transformierte B-Zell-Linien stammen von Patienten mit einem Melanom (Houghton et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, ZZ 4260 (1980).

Um menschliche Zellen hämatopoietischen Ursprungs auf ihre Eignung zur Herstellung von TNF hin zu überprüfen (siehe Tabelle I), werden 5 χ 10 Zellen pro ml in eine Kulturlösung RPMI 1640 gegeben, die 8 %iges fetales Kälberserum (FCS) mit oder ohne PMA (10 ng/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)) enthält. Tabelle 2 zeigt die Zusammensetzung von RPMI 1640. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 37° C werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in einer Konzentration von 1 χ 10 Zellen pro ml in einer RPMI 1640-Lösung resuspendiert, die kein PMA enthält, und für weitere 48 Stunden stehen gelassen. Anschließend werden die zellfreien Überstände durch Zentrifugation der Zellkulturen gesammelt. Diese Überstände werden bei -20° C tiefgefroren. Die TNF-Aktivität wird bestimmt durch L-Zellen-Überprüfung, bei der die überstände auf die Hälfte ihrer Konzentration verdünnt werden.

Für die in vitro Untersuchung wurden L-M-Mäusezellen der

NCTC clone 929 (L) Linie vom American Type Culture Collection (ATCC) verwendet und in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (GIBCO, Grand Island, N. Y.) bei 37° C gezüchtet, das zusätzlich noch nicht essentielle Aminosäuren, Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 g/ml) und 8 %i hitzeinaktiviertes, fetales Kälberserum enthielt. Eine Mäuse-TNF-resistente Zeil-Linie L(R) wurde dadurch gewonnen, daß man empfindliche L-ZellenL(S) wiederholt ein Medium passieren ließ, das Mäuse-TNF enthielt. Die Aktivität von hTNF wird bestimmt, indem man gleiche Volumina (z. B. 0,5 ml) eines Mediums, das fortlaufende Verdünnungen von TNF enthält, in Behälter gibt (24-well Costar plates), die drei Stunden zuvor mit 50.000 trypsinierten L-Zellen in 0,5 ml des Mediums besetzt wurden. Danach wurde der Gehalt an Protein bestimmt, der einen 50 %igen Zelltod zur Folge hat, geschätzt nach 48 Stunden durch Phasen-Mikroskopie oder Trypanblau-Ausschluß.

Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, ist hTNF, das durch menschliche B-Zellen abgegeben wird, zytotoxisch für Mäuse L(S)-Zellen aber nicht für Mäuse L(R)-Zellen gemäß der Standard-Mäuse-TNF in vitro Untersuchung, die oben beschrieben ist. Zellen, die auf hTNF hin überprüft wurden, wurden mit und ohne einem, das Tumorwachstum fördernden Mittel gezüchtet. PMA z. B. ist in der Lage,

den hTNF-Ausstoß der B-Zellen mehrfach zu steigern. Dies ist aus den L(S)-Spalten der Tabelle I, insbesondere der Spalte mit der Überschrift "kein PMA" ersichtlich. PMA ist auch unter dem Namen TPA bekannt.

In Kultur gehaltene L-M-Mäusezellen von L(929) (ATCC), die resistent gegen hTNF gemacht wurden durch wiederholten Durchtritt durch ein Medium, das hTNF (kontinuierliehe Zugabe von 2-3 Mikrogramm pro Woche zu etwa 10 Zellen) enthielt, sind auch vollständig resistent gegen Mäuse-TNF. Dies ist ein interessanter Kreuzresistenz-Effekt.

Um die überprüfung auf hTNF in vivo vorzunehmen, erhalten (BALB/c χ C57BL/gF, ? Mäuse (Jackson Labs), denen sieben Tage zuvor 5 χ 10 Meth A Sarkom-Zellen intradermal injiziert wurden, eine einzelne intravenöse Dosis von hTNF. Eine nach 24 Stunden auftretende hämorrhagische Tumor-Nekrose wird dabei wie folgt gekennzeichnet: keine Reaktion (-), leicht (+), mittelmäßig (++), oder stark (+++), wobei die letztere Kennzeichnung 90 % der Tumor-Oberfläche umfaßt (siehe Carswell Supra). Demgemäß zeigt hTNF bei Standard-TNF-üntersuchungen in vivo und in vitro einen ähnlichen Effekt, obwohl im allgemeinen hTNF eine höhere spezifische Aktivität gegenmenschliche Zellen besitzt als vergleichsweise Mäuse-TNF.

Endotoxin wird durch Limulus-Amebocyte-Lysat-Test (Microbiological Associates) bestimmt.

Seitdem durch geklonte Zell-Linien von Mäuse-Histiozyten TNF hergestellt werden konnte, mußten weitere Untersuchungen an -normalen und bösartigen menschlichen Histiozyten erfolgen, um eindeutig die Produktion von hTNF durch diese Zellen beim Menschen festzustellen. Die in Tabelle I angeführten Beispiele von B-Zellen lassen darauf schließen, daß normale B-Zellen auch diese Eigenschaft besitzen.

Beispiel für die Herstellung und Konzentrierung von hTNF (von Lukll-Zellen)

5 χ 10 Zellen/ml werden kultiviert in RPMI 1640,das 5 % FCS und 10 ng/ml PMA enthält, und 48 Stunden lang bei 37° C inkubiert. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in einer Konzentration von 8 - 10 χ 10⁵ /ml in serum-freien R-ITS PREMIX (Insulin (5 microgramm/ml), Selenum (5ng/ml) Serum substitute (Collaborative Research, Waltham Mass)) und 2 nM Ethanolamin resuspendiert. Danach werden die Zellen für weitere 48 Stunden inkubiert. Die überstände sind frei von Zellen und werden bei -20° C tiefgefroren. Lukll-

Überstände werden konzentriert durch Amicon bewegte Zellen (PM 10 Membrane) und auf eine DEAE-Sephadex A-50 Säule (40 χ 2.6) aufgegeben, die mit Tris 0.05 M, NaCl 0.15 M Puffer auf einen pH-Wert von 7,3 bei 5° C eingestellt wurde. Mit der gleichen Puffer-Lösung werden danach 5 ml-Fraktionen aus der Säule ausgewaschen. Die TNF-Aktivität wird in den Durchfluß-Fraktionen bestimmt und die Fraktionen werden anschließend zusammengefaßt. Nach diesem Verfahren wird ein 25-facher Anstieg der spezifischen Aktivität erzielt (2 - 5 χ Io Einheiten/mg Protein). hTNF-aktive Fraktionen, die nach dem L-Zellenin vitro-Verfahren bestimmt wurden, werden zusammengefaßt und in Amicon-Zellen konzentriert.

Die spezifische Aktivität von den zusammengefaßten Fraktionen des hTNF liegt ungefähr im Bereich von 1 χ Io

4 1 χ 10· . Dies gilt für Zellen, die in Kulturlösungen gezüchtet wurden, die zusätzlich fetales Kälberserum (FCS) enthielten. Bei Zellen, die in serum-freien Medien gezüchtet wurden, liegt die spezifische Aktivität der zusammengefaßten Fraktionen des hTNF ungefähr im Bereich

4 von 2 - 5 χ 10 microgramm.

Intravenöse Injektionen von DEAE-fraktonierter hTNF verursachte eine hämorrhagische Nekrose von Meth A Tumoren in dem in vivo Test, Supra. 300 microgramm

erzeugten +++ Nekrose bei 1/5 der Mäuse und bei den restlichen 4/5 ++ Nekrose. 150 microgramm des hTNF riefen bei 5/7 der Mäuse ++ Nekrose hervor und bei 2/7 der Mäuse + Nekrose. 75 microgramm hTNF erzeugten bei 1/5 der Mäuse ++ Nekrose und + Nekrose bei den restlichen 4/5. Keine Nekrose wurde bei allen dreien der drei Kontroll-Mäuse beobachtet, denen vergleichbare DEAE-Fraktionen der Kulturlösung (RPMI 1640) injiziert wurde. Daraus folgt, daß hTNF voll aktiv ist bei in vivo und in vitro Standard-Tests, die bei der Bestimmung der TNF-Aktivität verwendet werden.

Unabhängig davon, ob mit oder ohne FCS gezüchtet wurde, liegt das Molekulargewicht von hTNF ungefähr bei 70.000 Dalton. Dies wurde durch Chromatographie an einer Sephacryl S-200 Säule bestimmt. Hohe oder niedrige pH-Werte, die z. B. 12 Stunden lang eingestellt werden, zerstören die Aktivität des hTNF. Zum Beispiel beträgt der Aktivitätsverlust bei einem pH-Wert von 2,0 etwa 90 %, bei einem pH-Wert von 4,0 55 % und bei einem pH-Wert von 10 etwa 45 %.. Die Aktivität von hTNF ist stabil in einem pH-Bereich von etwa 6-8. Die Untersuchung der Hitzestabilität ergab, daß die hTNF-Aktivität zerstört wird, wenn hTNF 60 Minuten lang einer Temperatur von 70° C ausgesetzt wird. hTNF ist aber 60 Minuten lang bei 56° C stabil. Seine Aktivität bleibt auch über längere

Zeiträume erhalten, wenn es bei -78 C oder -20 C aufbewahrt wird.

Eine IFN-Aktivität von 100 Einheiten/ml wird bei dem nicht fraktionierten Überstand von PMA-stimulierten LUKII-Zellen gefunden. Keine Interferon-Aktivität kann in den zusammengefaßten Fraktionen des durch DEAE-Chromatographie gereinigten hTNF festgestellt werden, noch ist sie in dem verwendeten gereinigten Mäuse-TNF feststellbar. Die menschliche Interferon-Aktivität wird bestimmt durch Hemmung des zytopatischen Effektes eines vesikulären Stomatis Virus vom WISH oder GM 2767 cells (Stewart W. E. II (1979) The Interferon System (Springer, Vienna) und verglichen gegen einen internationalen Standard im Fall von rekombinanten menschlichen Alpha-IFN (Hoffmann-La Roche) und gegen einen Laborstandard im Falle von natürlichem menschlichem Gamma-IFN.

Rekombinantes Alpha-hlFN ( 2 - 4 χ 10 Einheiten/mg Protein) wurde von der Firma Hoffmann-La Roche erhalten, natürliches Alpha-hlFN von Leukozyten (0,64 χ 10 /mg Protein) wurde für das Sloan-Kettering Institut Auswertungsprogramm vom Kocher-Laboratorium, Bern (Schweiz) hergestellt, natürliches Beta-hlFN (1 χ 10 Einheiten/mg Protein) lieferte das Roswell Park Memorial Institut (RPMI) und natürliches Gamma-hlFN von Leukozyten (1 χ 10 Einheiten/mg Protein) stammt von Dr. Berish Rubin,

Sloan-Kettering-Institut. Im partiell gereinigten Zustand zeigen weder Mäuse-TNF noch menschliches TNF nachweisbare IFN-Aktivität. Die verschiedenen menschlichen Interferone besitzen keine nachweisbare hTNF-Aktivität, wie durch fehlende Zytotoxizität oder Zytostase an L(S)-Zellen bei der in vitro Untersuchung, Supra gezeigt werden kann.

Das hergestellte hTNF hat unterschiedlichen Einfluß auf verschiedene Zell-Linien, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Zytotoxisches Verhalten wird notiert, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen nach 7 Tagen um 35 % oder mehr zurückgegangen ist, dagegen eine Zytostase, wenn die Anzahl der Zellen nach 7 Tagen um 35 % oder mehr zurückgegangen ist. Für diese Untersuchung und für alle weiteren Untersuchungen, die in der Beschreibung angeführt sind, wurde ein hTNF eingesetzt, das wie oben beschrieben durch die LUKII-Zell-Linie hergestellt wurde. Dieser spezielle Satz von Beispielen soll die Erfindung nur erläutern, die Erfindung wird dadurch aber nicht begrenzt. hTNF von einer anderen B-Zell-Linie und TNF von anderen Zellquellen beim Menschen können offensichtlich bei einer Vielzahl von menschlichen Zellen in vivo und iß. vitro eingesetzt werden. Für den Fachmann ist der Einfluß von BCG und seinen Gegenstücken und ferner Endotoxin auf die TNF-Herstellung in menschlichen Zellen

in vitro und la vivo klar ersichtlich.

Der Einfluß von hTNF auf Zell-Linien der menschlichen Brust (Tabellen 3 und 4) ist mit dem des Mäuse-TNF vergleichbar, da beide auf die Mehrzahl der Zell-Linien zytotoxisch wirken, die von Brustkrebs stammen. Lungen- und Melanom-Zellen werden ebenso durch hTNF angegriffen, aber hier ist der vorherrschende Einfluß zytostatischer Natur. Von den vier normalen Zell-Linien, Lunge, Nieren, fetale Lunge und fetale Haut, die mit hTNF getestet wurden, ist keine gegen hTNF empfindlich. Es scheint daher, daß der zytotoxische, zytostatische oder hämorrhagische Nekrose Einfluß von hTNF auf menschliche Zellen sich auf menschliche Tumorzellen beschränkt. Im Vergleich zu Mäuse-TNF hat hTNF eine höhere spezifische Aktivität bei menschlichen Zellen.

Menschliches Interferon, ob rekombinant oder natürlich, oder in der Alpha-, Beta- oder Gama-Form, besitzt einen wohlbekannten, hemmenden Einfluß auf das Tumor-Zellwachstum, wie dies am Beispiel von vier Tumor-Zell-Linien in den Tabellen 5, β und 9 gezeigt ist. Im allgemeinen ist die Anzahl der antiviralen Einheiten an IFN, die benötigt werden, um einen 35 %igen oder größeren zytotoxischen oder zytostatischen Effekt auszulösen, beim Alpha-hlFN größer als beim Beta- oder Gamma-hlFN.

Keines der IFN-Präparate zeigte Zytotoxizität oder Zytostase bei L(S)-Mäusezellen la vitro, wodurch angezeigt wird, daß keine hTNF-Aktivität vorhanden ist. Außerdem zeigen diese beiden zellulären Produkte, wenn sie in reiner Form vorliegen und zusammen verwendet werden, einen Einfluß, der größer ist als die Summe ihrer separaten Einflüsse, wie an den Beispielen in den Tabellen 7 und 8 verdeutlicht ist. Der kombinierte zytotoxische Effekt von IFN und hTNF kann auch synergistisch, z. B. pharmakologisch synergistisch, sein nach der Methode, vorgeschlagen durch CLARK (Clark, D. A. (1958) Ann. N. Y. Acad. Sei. 2£ 915 - 921). Dies ist aus den Tabellen 10, 11 und 12 ersichtlich. Dieses unerwartete Resultat kann von enormem Wert bei der Behandlung von menschlichen Tumoren sein.

Im folgenden soll am Beispiel einer Methode dargelegt werden, welchen Einfluß hTNF, hIFN oder eine Kombination der beiden Substanzen hat. Trypsinierte Zellen werden

4 zweimal gewaschen, jeweils 4 - 5 χ 10 Zellen werden in einen Behälter (24 well Costar plates) in MEM eingebracht, das 8 % FCS enthält, und bei 37° C inkubiert. Nach 16 - 24 Stunden wird das Medium abgesaugt und eine 1 ml Verdünnung entweder von DEAE-fraktionierter hTNF oder IFN oder hTNF und IFN wird dann dem Medium zugesetzt. Die gesamte Anzahl an Zellen (lebensfähige und

nicht lebensfähige) wird nach 3, 5 und 7 Tagen durch Phasenmikroskopie bestimmt. Die Kulturen werden am 5. Tag mit frischem Medium versorgt, das gleiche Konzentrationen an hTNF und/oder hIFN enthält. Diese Methode wurde bei den Ergebnissen verwendet, die in den Tabellen 3 bis 9 aufgeführt sind. Das Protokoll gemäß CLARK, Supra zur Überprüfung auf Drogen-Synergismus oder Potentiation soll zwei Faktoren χ und y testen, in diesem Falle hIFN (x) und hTNF (y) allein und in Kombination. Verstärkte Tumor-Hemmung oder Zell-Toxizität führt zu Versuchen mit 1/4 χ + 1/4 y, oder in diesem Fall 1/4 hIFN + 1/4 hTNF, um zu sehen, ob diese Kombination einer viertel Dosis vergleichbar ist mit der vollen Dosis einer jeden Substanz, und um den Synergismus der beiden Faktoren χ und y, hier hIFN und hTNF, zu demonstrieren. Dies ist aus den Tabellen 10, 11 und 12 ersichtlich, bei denen die gleiche Methode verwendet wird wie bei den Beispielen der Tabellen 4 bis 8, aber nur an den Tagen 3 und 5. Ein klarer Synergismus-Effekt ist bei 1/4 hIFN + 1/4 hTNF vorhanden, der größer ist als der Effekt von TNF oder hIFN allein für die drei Zell-Linien in den Tabellen 10, 11 und 12.

Die beiden Substanzen, hTNF und hIFN, können folglich in vielfältigen Kombinationen verwendet werden, um menschliche Tumore und Krebs zu behandeln, da sie zusammen

eine viel größere zytotoxische Aktivität gegen Krebs entwickeln als jede Substanz für sich allein. Es ist in der Tat offensichtlich/ daß zur Erzielung eines maximalen therapeutischen Effektes Krebspatienten stimuliert werden sollten, um TNF und/oder IFN zu bilden, oder mit wechselnden Kombinationen der beiden oben genannten therapeutischen Substanzen (TNF und IFN) behandelt werden sollten, wobei man die beiden Substanzen auch sich abwechseln lassen könnte, um einen maximalen Nutzen zu erzielen oder ferner auch die zeitliche Abfolge variieren könnte. Wenn andere Faktoren, wie TNF, notwendig sind für die maximale Wirkung von IFN, kann die Lieferung dieser Mangel-Faktoren zu einer verstärkten IFN-Aktivität gegen Krebs führen. Die verstärkte IFN-Wirkung kann auch daran liegen, daß hTNF als ein Wandler der biologischen Antwort des Immun-Systems wirkt. Es liegt daher für den Fachmann nahe, in weiteren Versuchen die Wirkung von hIFN gegen menschliche Krebszellen in Verbindung mit anderen, die biologische Antwort modifizierenden Substanzen (allein oder in Kombination), z. B. Hormonen, oder hormonartigen Molekülen, wie IL-2, oder anderen Zytokinen, Lymphokinen oder Lymphtoxin zu untersuchen. Es werden in der Tat Versuche durchgeführt, um das Verhalten wechselnder Kombinationen der verschiedenen Interferone und derartiger Moleküle gegen Krebs zu untersuchen. Hinzu kommen noch Versuche, bei denen hTNF oder hIFN von verschiedenen Zellquellen gegen Krebs eingesetzt wird.

HierzujÖLSeiteft Tabellen

Tabelle I

Überprüfung menschlicher Zell-Linien häinatopoietischen Ursprungs für die hTNF-Produktion

L-Zellen Lebensfähigkeit (in %) in Vitro

Zeil- L (S) Linie

kein

B-Zelle PMA +PMA.

BE* . 47% 20%

BI* 57% 43%

CL* 95% 37%

'CW* 28% 8%

DE* 45% 18%

CM* 18% 11%

DS* 88% 38%

EJ* 27% 16%

EL* 70% 16%

EQ* 15% 11%

ER* 47% 22%

FC* 19% · 8%

FD* 44% 16%

FG* 80% 30%

ARH-77 68% 12%

DADDI 97% 97%

LuK II 20% 13%

KEMI 1788 78% 35%

RFMI 8226 96% 84%

REMI 8866 32% 10%

SK-LY-16 98% 100%

SK-LY-18 99% 100%

ÄRA-10 77% 39%

BMiL-I " 100% 100%

T-Zelle

CCRF-CEM 100% 100%

P-12 95% 94%

MQLT-4 100% 100%

T-4S 100% 100%

HPB-ALL 100% 97%

TALL-I 96% 94%

Monozyten

JlIl 100% 100%

ΊΗΡ 96% 80%

U-937 100% 100%

Promyelozyten

HL-60 - 96% 97%

kein PMA

+PMA

2.3 1.3 2.6 3.5 2.5 1.6 2.3 1.7 4.4 1.4 2.1 2.4 2.8 2.7 5.7

1.5 2.2 1.1 3.2

2.0

L (R)

kein PMA

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 97% 100% 100% N.T. 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

100%

99%

100%

96%

99% 99% 99%

99%

+PMA

100%

98%

97% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

97% 100% N.T. 100% 100%

86%

98% 100%

98%

97% 100%

100%

98%

96%

100%

96%

98% 99%

99%

98%

*EBV- transformierte Zell-Linien gewonnen aus peripherem Blut

Tabelle 2

RPMI 1640 flüssig (IX)

Bestandteil Anorganische Salze

O₃)^H₂O 100.00

· 400.00

HgSOi, ·7H₂O 100.00

^NaC1 6000.00

NaHCO₁ 2000.00

Na₂HPO,-7H₂O 1512.00

Andere Bestandteile:

D-Glucose 2000 00

Glutathion (reduziert) _lQQ

Aminosäuren:

L-Arginin (freie Base) 200.00

L-Asparagin 50.00

L-Aspartic acid ' 20.00

L-Cystin 50.00

L-Glutaminsäure 20.00

L-Glutamin 300.00

Glycin _10<00

L-H is ti din (freie Base) 15.00

L-Hydroxyprolin 2o!oO

L-Isoleucin ' 50.00

L-Leucin (Methiqnin· frei) 50.00

L-Lysin HCl ' 40 !oo

L-Methionin 15.00

L-Phenylaianin 15.00

L-Prolin (Hydroxy L-Prol in frei) 20.00

L-Serin 30.00

!.-Threonin 20.00

L-Tryptophan 5'.00

L-Tyrosin^ 20.00

L-VaI in 20.00

Vitamine:

Biotin 0.20

O-Ca-pantothenat 0^25

Cholin chlorid 3^00

Folsäure 1.00

i-Inositol 35.00

Nikoti.namid l.'oo

Para-ami nobenzoesäure 1.00

Pyridoxin HCl \\qq

Riboflavin 0.20

Thiamin HCl l.OO

Vitamin Bμ θ!θΟ5

Tabelle 3

Einfluß von hTNF auf menschliche Zell-Linien

Zytotoxisch

SK-M3-4 (Astrozytcm)

MZF-7 (Brust Ca)

ΕΓ-20 (Brust Ca)

SK-BK-3 (Brust Ca)

ME-180 (Hals Ca)

SK-COrI (Colon Ca) KPMI 7931 (Melanan)

Zytöstatisch

SK-LU-I (Lungen Ca) RPMI 4445 (Melancm) SK-MEL-29 (Melanan) SK-MEL-IO (Melanom) SK-OV-3 (Eierstock Ca)

Kein Effekt

T-24 (Gallenblasen Ca) 5637 (Gallenblasen Ca) MQA.-MB-361 (Brust Ca) S-48 (Colon Ca) SK-LC-4 (Lungen Ca) SK-LC-6 (Lungen Ca) SK-LC-I2 (Lungen Ca) SK-MEL-19 (Melancm) SK-OT-I (Uterus Ca) SäcS-2 (Oestrogenisches Sarccm) U20S ' (Oestrogenisches Sarcam) WI-38 (Normale Fetale Lunge) MY (Normales Nieren-Epitheliam) F-136-35-56 (Normale Fetale Lunge) F-136-35-56 (Normale Fetale L

Tabelle 4

Der Einfluß von hTNF auf vier menschliche Turror-Zell-Linien

4 (Tag 0 - 5 χ 10 Zellen überzogen mit hTNF)

Zeil- hTNF microgramm	BT-20	3. Tag	TNF Einheiten	48	1263	24%·	ZeIl-	5. Tag	ZeIl-	7. Tag	wac	1.45
Linie Protein/Kultur	(Brust)		19.2	505	30	wachs-		wachs-		tum	1.38
	(cyto -	% lebens	9.6	253	45	tunu	% lebens	tum,-		x10	1.3
	toxic)	fähige	4.8	126	49	x10^b	fähige	χ1Ο^	% lebens- ZeI	1.23
		Zellen	1.2	32	50	1.03	Zellen	1.55	fähige	2.43
•		Ccntrol	0	93	1.08		1.43	Zellen	3.39
	ME-180	24.5	645	83	1.05	16%	1.53		6.33
(Hals)	9.8	258	83	1.03	19	1.6	5%	7.38
(cyto-	4.9	129	80	1.05	21	1.8	7	8.03
toxic)	. 2.45	63	81	.99 .	30	2.23	10	8.23
	Ccntrol	0	98	1.78	53	2.7	18	1.01
SK-MEL-109	24.5	645	91	1.73	94	2.83	61	1.68
(Melancm)	9.8	258	96	1.75	52	3.48	96	2.68
(cytostatic)	4.9	129	94	1.73	57	4	49	2.93
	2.45	63	94	1.62	70	4.48	49	3.13
	Ccntrol	0	98	.8	76	1.63	58	9.78
T-24	48	1263	95	1.15	97	1.93	63	7.75
(Gallenblase)	19.2	505	96	1.35	86	2.13	97	8.58
kein Effekt	9.6	253	97	1.25	90	2.1	72	8.33
	4.8	126	98	2.19	93	3.89	91	8.33
	Ccntrol	0	100	2.38	93	4.6	90	8.38
		2.83	98	4.55	92
		2.78	98	4.65	99
	3.25	97	4.55	99
	3.23	98	4.53	98
	99	. 98
	98	98
		99

Tabelle 5

Der Einfluß von rekombinantem msnschlichen α-Interferon auf vier menschliche Zell-Linien

(ο. ~4,ß £* IO Zellen überzogen mit IFN )

Zeil-	hTNF itiicrograirm	781	3. Tag	Zell	.6	5. Tag	31	ZeIl-	7. Tag	ZeIl-
Linie	Protein/Kultur	Kontrolle		wachs	.65		47	wachs-		wachs
		50,000	% lebens	tum,.	.72	% lebens	74	tum_q	% lebens	^tumc
		12,500	fähige	x10^b	.75	fähige	75	xicr	fähige	x1O
		3,125	Zellen		1.04	Zellen	93		Zellen'
	IFN-Einheiten/	781		1.02		78	.65		.9
	Kultur	Kontrolle		1.18		86	.95		.92!
BT-?n	50,000	83	1.3	91	1.15	28	1.37
	12,500	85	1.42	93	1.32	38	1.4
	3,125	83	1.87	98	2.3	65	5.4
	781	83	.6'	15	1.67	70	2
	Kontrolle	•95	.65	34	1.92	97	3.4
	50,000	85	1.12	52	2.02	62	4.2
ME-180	12,500	91	1.42	69	2.7	79	4.9
	3,125	90	2.2	98	5.91	87	7.8
	781	95	1.6	94	1.35	90	1.25
	Kontrolle	98	1.7	96	1.77	98	2.1
	50,000	62	• 1.98	95	1.8	10	2.4
	12,500	58	2.72	94	2.37	37	2.5
SK-MEL-109 3,125	67	3.43	96	3.6	54	6.8
	79		4.1	74	4.8
	97		4.7	98	5.3
	95	4.8	83	5.9
	94	4.97	89	7.4
	94	6.05	90	7.9'
T-24	97	90
	98	93

Tabelle 6

Der Einfluß von natürlichem menschlichen Gamma-Interferon auf vier menschliche Zell-Linien

4 ν

( Tag 0 - 5 χ 10 Zellen überzogen mit IFN J

Zeil-	¹V	ME-180	-hlFN-	3. Tag	Zell	5. Tag	ZeIl-	/. Tag	Zell
Linie			Einheiten/		wachs		wachs-		wachs
			Kultur	% lebens	tum-	% lebens	tum,-	% lebens	tunu
				fähige	x1O^b	fähige	x10⁵	fähige	x10
			Zellen	1.33	Zellen	2.2	Zellen	2.83
				1.43		2.43		3.15
	SK-MEL-109	250 units	73	1.78	79	2.7	58	4.03
BT-20		125 units	81	1.93	81	2.78	66	3.83
		31.25 units	84	1.64	86	3.61	79	5.44
	7.8 units	86	1.15	93	1.23	87	1.95
	Kontrolle	95 ·	1.2	97	1.3	97	1.9
	250 units	67	1.32	49	1.3	22	1.78
T-24	125 units	69	1.55	56	1.38	26	2.65
	31.25 units	72	2.45	61	5	34	7.75
7.8 units	79	1	67	1.73	50	2.3
Kontrolle	98	1	98	2	96	2.78
250 units	55	1.18	51	3.02	23	3.35
125 units	67 '	1.15	61	3.28	38	5.45
31.25 units	74	2.05	82	3.53	61	5.43
7.8 units	85	1.75	90	2.58	77	2.48
Kontrolle	98	2.08	98	2.52	96	3.1
2000 units	100	2.4	95	2.9	93	3.52
500 units	100	3.03	95	4.95	94	6.45
125 units	99	3.35	95	7	96	9.45
31.25 units	99	4	98	7.35	98	10.4
7.8.units	99	98	98
Kontrolle	99	98	99

Tabelle 7

Der Einfluß vco hTNF -und rekanbinantero -menschlichen Alpha-Interferon auf vier :menschliche Zell-Linien

.4

(Tag 0 - 5 χ 30 Zellen plus hTNF und TPN )

-% lebensfähige Zellen 3. Tag 5. Tag 7. Tag

MNF +. IFN* 26 6 5

MNF 4 U - 74 . 64 62

^{OT 20}IFN 3125 U · 83 74 65

Kontrolle 95 93 97

MNF + IFN* 53 25 20

ME-180 MNF 16 U 85 82 70

IFN 3125 U 90 91 87

Kontrolle 98 98 98

MNF + IFN* 33 19 25

SK-MEL- MNF .33 ü 96 96 96

IFN 781 U 79 69 74

Kontrolle 97 98 98

hiNF + IFN* 97 93 85

T-24 MNF 33 U 98 95 88

IFN 781 U 94 95 90

Kontrolle 98 96 93

*Bei der Kombination wurden gleiche Mengen an hTNF und hIFN verwendet wie bei der Einzelanwendung bei jeder der Zell-Linien

U = Einheiten

Tabelle 8

Der Einfluß von hTNF und natürlichem menschlichen Gamma-Interferon auf vier menschliche Tumor-Zell-Linien

(Tag 0 - 5 χ 10⁴ Zellen plus hTNF und hIFN )

% lebensfähige Zellen 3. Tag 5. Tag 7. Tag

	hTNF +. IFN*	11
	hTNF 4 U	56
3Σ—ΖΌ	Uli 3125 U	84
	Kontrolle	95
	hTNF + IFN*	2
ME-180	hTNF 16 U	77
	ΠΝ 3125 U	69
	Kontrolle	98
	hTNF + HH*	9
SK-MEL-	hTNF 33 U	95
109	IFN 781 U	67
	Kontrolle	98
	hTNF + IFN*	99
T-24	hTNF 33 U	97
.	IFN 781 U	99
	Kontrolle	99

10 6

46 31

86 79

97 97

4 5

72 60

56 26

98 96

6 2

93 92 61 38 98 96

94 94 97 96

97 93

98 93

*Bei der Kombination wurden gleiche Mengen an hTNF und hXFN verwendet wie bei der Einzelanwendung bei jeder der Zell-Linien

U = Einheiten

Tabe-Me

Der zytotoxische und zytostatische Einfluß von menschlen Interferonen auf fünf menschliche Zell-Linien Anzahl der antiviralen Einheiten, die 35 % Zytotoxizität oder Zytostase verursachen

Zell-Linien

Menschliches Interferon

Natürliches Alpha-IFN

Rekombinantes Alpha-IFN

Natürliches Beta-IFN

Natürliches Gamma-IFN

BT-20

CT

CS

ME-180

CT

CS

SK-MEL-109

CS

T-24

CT

CS

WI-38

CT

CS

230

270

-25

6500 .

110 • ·

CT

26

>50,000

1,900

>50,000

3125

<781

44,000

<781

1250

<781

. >50,000

16,000

>50,000

160

<49

260

<49

1400

<49

>12,500

<49

•>25,000

>2000

130

72

<7.8

<49

27

>2000

25 ι

>2000

22

CT - zytotoxisch CS - zytostatisch

Tabelle 10 ET-20 Synergismus Experiment mit natürlichem Gamma-hlFN und hTNF

IFN Einheiten/Kultur 3. Tag 5.· Tag

*& 250 J₅ X 125 . h X 62.5

	% lebens		% lebens
Zellen	fähig	Zellen	fähig
XlO⁵		xlO⁵
1.08	74	1.4	64
1.03	76 .	1.83	79
.95	84	1.73	83

hTNF (Einheiten/Kultur)

J₅* Ht	50 25 12.5	1.15 1.1 .98	48 52 59	1. 1. 2.	75 98 28	37 47 54
	IFN.+ hTNF	(50 Einheiten)
χ - J₅X H x	H Y 250 + Jj Y 125 + Y 62.5	.75 .75 .7	3 10 7	1. 1. 1.	,05 ,05 ,05	5 5 9
	IFN + hTNF	(25 Einheiten)
χ - JjX JiX	% Y 250 + h Y 125 + h Y 62.5	.85 .73 .75	12 14 13	1. 1	.05 .8	5 7 12
	IFN + hTNF	(12,5 Einheiten)
X + H Y 250 % X + h Y 125 Synergismus h : + H Y 62.5	.8 .75 .67	22 17 22	1 1 .1	.13 •15 .15	11 .11 11
	1.02	96	1	.97	94
Control

Tabelle 11 SK-MEL-109 Synergismus-Experiment mit natürlichem Gamma-hlFNjjnd hTNF

Natürliches Gamma-hlFN

IFN Einheiten/Kultur 3. Tag 5.. Tag

250

X 125

62.5

Zellen	% lebens fähig	Zellen	% lebens fähig
xlO⁵		xlO⁵
1.2 1.25 1.2	58 70 72	1.08 1.15 1.5	32 43 63

(Einheiten/Kultur) 50

₉ς .8 *87*

Q QI

¹²·⁵ !-/is Il

hTNF(200 Einheiten)

250 ·⁸ \l

125 ¹ ³²

^Synergismus *

*h X + h Y* 62.5 ·⁸⁷⁵ *³¹*

Control ^{1β44 96}

1.	38	87
1.	63	92
1.	73	96

250 125 62.5	hTNF	.875 .8 .775	8 12 * 16	... 00 00 VO UJ Ln	3 6 6
IFN +		(100 Einheiten)
250 125 62.5	hTNF	.825 .8 .825	12 16 18	.83 .925 .95	3 8 16
IFN +	(50 Einheiten)

.85 .9	6 11
.9	14.
4.12	99

Tabelle 12

ME-180 Synergisrnas-Experiment mit natürlichem Gamma-hlFN und hTNF

Natürliches Gaimia-hlFN

IFN Einheiten/Kultur 3. Tag 5. Tag

250

X 125. €2.5

Zellen	% lebens fähig	Zellen	% lebens fähig
XlO⁵		XlO⁵
1.15 1.3 1.33	67 71 75	1.15 1.4 1.35	56 64 67

hTNF (Einheiten/Kultur) ⁵S 2.48 *81* 4.2 *55*

^#5

2.38 86 4.4 59 2.4 89 4.4 63

IFN > hTNF(200 Einheiten)

250 *^{775 6 1<25 4}

:⁵° .775 6 1.15 2

^{6 1}^ 4

IFN + hTNF(100 Einheiten)

250	.83 .8	3 3	1.2 1.23	2 2 2
IFN + hTNF	(50 Einheiten)
250 125 Synergismus	.875	6 16	1.23 1.05 1.08	0 2 7
i·^^—.j Λ	2.69	98	5.61	98

Claims

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem hTNF, gekennzeichnet dadurch, daß in einem ersten Inkubationsschritt menschliche hämatopoietische Zellen in Kulturlösung inkubiert werden, daß anschließend die Zellen von den Lösungsüberständen abgetrennt , gesammelt und in einem zweiten Inkubationsschritt erneut in einer Kulturlösung inkubiert werden, und daß die Überstände gesammelt und tiefgefroren werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurc h, daß bei dem ersten Inkubationsschritt eine RPMI 1640-Kulturlösung verwendet wird, die FCS im Bereich von 0 bis 8 % enthält.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei dem zweiten Inkubationsschritt die Zellen in RPMI 1640-Kulturlösung inkubiert werden.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die hämatopoietischen Zellen menschliche B-Zellen sind.
5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet durch menschliche B-Zellen der Gruppe BE, BI, Cl, CW, DE, DM, DS, EJ, EL, EQ, ER, FC, FD, FG, ARH-77, DAUDI, LUKII, RPMI 1788, RPMI 8226, RPMI 8866 und ARA-10.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellen bei dem ersten Inkubationsschritt in Gegenwart von PMA inkubiert werden.
7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß im Anschluß an den ersten Inkubationsschritt die Zellen in serumfreien R-ITS PREMIX und 2 NM Ethanolamin

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resuspendiert werden, die zellfreien Überstände gesammelt und konzentriert werden, daß das Konzentrat der Überstände einer Trennsäule aufgegeben wird, die zuvor mit einer
Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt wird, und daß die von der Säule abgezogenen, hTNF-aktiven
Fraktionen zusammengefaßt und konzentriert werden.
8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß der gereinigte hTNF ein Molekulargewicht im Bereich von 70.000 Dalton aufweist.
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der gereinigte hTNF in einem pH-Bereich von 6 bis 8 stabil ist.
10. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der gereinigte hTNF eine spezifische Aktivität im Bereich
von 2 bis 5 χ 10 Einheiten / mg Protein wie durch
Mäuse-L-Zellen in vitro Untersuchung bestimmt aufweist.
11. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der gereinigte hTNF bei -78° C und -20° C stabil ist.
13.Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der gereinigte hTNF bei 56° C 60 Minuten stabil ist.