PT78773B - The effect of human tumor necrosis factor and human interferon on human cancer cells and methods - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

Este invento diz respeito a um processo de tratar cancro humano em humanos utilizando factor de necrose de tumor humano purificado (hTNF), só, ou hTNF em associação, com interferão hu mano (hlFN). Descreve-se um processo de produzir hTNF.

A história do factor de necrose de tumor (TNF) começa há mais de um século com a descoberta de que durante certas infecções bacterianas em humanos, havia uma regressão concomitante de quaisquer tumores humanos presentes in vivo. Durante mais de 40 anos, Coley e outros trataram doenças malignas humanas com filtrados bacterianos isentos de células ou vacinas bacterianas mis turadas, frequentemente com resultados positivos.

Estudos em cobaias e ratos foram também feitos. 0 efeito anti-tumor em animais de experiência é uma reacção hemorrágica grave no centro do tumor, dentro de 4 horas após a administração bacteriana a um sujeito ou animal de experiência. Isto é seguido de um efeito necrozante mais lento, que apresenta uma intensi. dade crescente durante as próximas 48 horas. A massa tumoral s_o fre um escurecimento progressivo na cor, indicativo de morte e hemorragia, levando em muitos casos à regressão completa do tumor. A necrose hemorrágica impressionante induzida em certos tu mores experimentais por bactérias gram negativas ou por endotoxi. na (lipopolisacárido) derivada da sua parede celular tem, desde há muito, sido considerada como o complemento experimental das observações clinicas acima descritas.

Contudo, trabalhos em Sloan-Kettering levaram ã conclusão que a estimulação bacteriana provoca a libertação de um factor, possivelmente de origem macrófoga, que é ele próprio directa ou iddirectamente responsável pela morte de células tumorais. Provas disto provêm de trabalhos que mostram que o soro de ratos BCG-infectados injectado com endotoxina provoca necrose hemorrágica de sarcoma Meth A transplantado e de outros tumores. 0 soro de ratos injectados com BCG ou soro de ratos normais a quem é dado endotoxina é inactivo. A endotoxina isolada carece de toxicidade para a maior parte das células tumorais in vitro.

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Este componente do soro activo foi chamado de factor de necrose de tumor (TNF).

A actividade TNF não pode ser atribuída à endotcxina residual, como medido por pirogenicidade, teste ds-Limulus e análise química para porções de endotoxina. TNF, ao contrário da endotoxina, ê directamente citotóxico para certas células tumorais in vitro? células cultivadas de fontes normais mantêm-se ilesas /~Lloyd 3. Qld, Nem Developments in Câncer Therapy, MSKCC Clinicai Bulletin 6:118 (1976), E. A. Carsu/ell et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 3666-70 Setembro 1975_7· Outros roedores, i.e ratazanas e coelhos, produzem também TNF, com BCG mais a adminis tração de endotoxina. 0 TNF foi encontrado em primeiro lugar no soro de ratos preparados com Bacillus Calmette-Guerin (BCG), e desafiados 2-3 semanas depois com endotoxina de E. Coli. Nem o BCG ou as suas contrapartes (ver abaixo) nem a endotoxina isolada produzem o factor TNF no soro de rato? têm de estar os dois presentes. C. qranulosum, C Parvum, malaria ou Zymosan (paredes celulares de leveduras) os quais como o BCG induzem hiperplasia maciça de macrófagos e outros elementos celulares do sistema reticuloendotelial, podem substituir o BCG em ratos preparados para a libertação de TNF. Estes factores são contrapartes do BCG. 0 soro derivado após tratamento com BCG e endotoxina é atípico pelo facto de que ele não coagula completamente.

Um protocolo para produção éptima e ensaio de TNF em ratos inclui:

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a) BCG: uma inoculação de 2x10 microorganismos viáveis BCG para estimulação máxima e hiperplasia do sistema reticulo-endotelial (RES),

b) endotoxina: 14-21 dias depois, no máximo de estimulação do RES pelo BCG, 0,25-25 microgramas inocul_um de endotoxina (lipopolisacarido ui do E. coli). A dose mais elevada dá os melhores níveis de TNF em ratos,

c) Colecção de TNF:

0 tempo óptimo é de 2 horas após administração de endotoxina (tempos mais prolongados são menos eficientes devido a colapso circulatório produzido por choque), e

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d) ensaios TNF:

1) In Vivo?

0 efeito necrético de soro de rato TNF positivo sobre BALb/ /c Meth A Sarcoma ascites transplantado para (BALb/c x 057 BL/ó) híbrido F^ ê demonstrado da seguinte forma. 7 dias depois o efeito de soro TNF positivo sobre tumor subcutâneo de transplante in vivo é registado visualmente dentro de 24 hr. Uma reacção ê vista pela primeira vez dentro de 3-4 horas. Em transplantes de 7 dias, a resposta necrótica corresponde geralmente com o volume de soro TNF positivo administrado de cerca de 0,1 a 0,5 ml. Uma reacção +++ mos. tra que a massa tumoral foi completamente ou quase completa mente destruída, deixando somente uma orla periférica do te eido tumoral aparentemente viável. Transplantes de 6 dias são menos responsivos, e transplantes de 5 dias não são res ponsivos,

2) In Vitro?

Células L-M TNF sensível foram derivadas de células L929 danadas de rato do American Type Culture Collection (ATCC). Uma linha TNF-resistente de células-L foi derivada através de passagem repetida das células L TNF-sensíveis por meio contendo TNF. 0 TNF é citotóxico para células-L TNF-sensíveis /”L(S)_7 mas não para as células-L TNF resistentes

Z“l(r)_7.

0 ensaio é efectuado utilizando 0,5 ml de meio contendo diluições em série de TNF adicionado a reservatórios (placas Costar de 24 reservatórios) semeadas 2-3 horas antes com 50.000 células-L tipificadas em 0,5 ml de meio Eagle-mínimo essencial e determinando a quantidade de proteína que re sultou em 50% de morte celular, calculada às 48 horas através de microscopia de fase ou azul tripano de exclusão. Por exemplo, para um lote padrão, 1 unidade in vitro de TNF de rato parcialmente purificado é igual a 58 ng ou a uma actividade específica de 20.000 unidades/mg de proteína. Es. te TNF de rato parcialmente purificado não contém qualquer

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IFN. 0 soro original antes da purificação tem algum Interferão (IFN),

Além disso, BCG, C. qranulosum, C. Parvum, Malaria ou Zymosan (parede celular de levedura) podem também ser utilizados como agentes preparadores. Green et al., 3. Nat'l. Câncer Inst. 59.:1519 (1977) relatam que os ratos atingem uma hipersensibilida de máxima à endotoxina seis dias apés injecção de C. Parvum. Nes. se método a administração de endotoxina começa 4 dias apés C. Parvum. As doses de endotoxina são tão pequenas como 0,25 microgramas mas 25 microgramas são utilizadas para provocar a libertação de TNF. A libertação de TNF é máxima 90 minutos apôs a injecção intravenosa de 1 micrograma de endotoxina. A produção de TNF varia com as diferentes estirpes de ratos,

A endotoxina de qualquer bactéria gram negativa tal como E. coli é o agente mais eficaz encontrado até à data para libertar TNF in vivo. (Carstuell et al, Supra). 0 efeito de TNF é observado numa variedade de sistemas tumorais (rato) nomeadamente: Sarcomas S-180 (CD-I Suiço), BP8 (C3H)j Leucémias EL4 (C57B1/6), ASL1 (Estirpe A), RADA-1 (Estirpe A), RLol (BALB/c), e mastocitoma P815 (DBA/2). Meth A é altamente sensível a TNF quando o tumor é injectado intradermicamente como no ensaio in vivo. Tumores com menor resposta foram também relatados: 0 sarcoma de células reticulares RCS5 (S3L) foi resistente, tumores Mamários de (C3H/An x I) F^ foram só minimamente responsivos e AKR leucemias espontâneas foram de intensidade intermediária. Assim TNF de rato tem claramente um efeito terapêutico em tumores de rato. (Carsu/ell et al, Supra).

Fibroblastos murino transformados (Células L) in vitro, em cultura foram os mais sensíveis a TNF comparado com células sarcoma Meth A ou fibroblastos de embrião de rato (MEF), As células viáveis são contadas 48 horas após exposição a TNF. 0 efeito aqui é citotóxico bem como citostático, mas atrasado visto que ele não se observa durante as primeiras 16 horas. 0 efeito no teste Meth A in vivo é um processo de necrose que começa no centro do tumor Meth A espalhando-se para fora deixando uma orla de tecido tumoral aparentemente inalterado. 0 tumor pode

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então começar a crescer outra vez a partir deste resíduo. 0 tra tamento com uma dose óptima de TNF provocará regressão completa numa boa percentagem dos animais assim tratados. Q efeito célula L á a base para o ensaio in vitro, Supra. Uma linha resisteri te de células-L foi tambám desenvolvida, derivada através da pas. sagem repetida de células-L TNF sensíveis em meio contendo TNF.

0 TNF é citotóxico para células-L sensíveis /~L(S)_—~J mas não para células-L resistentes /~L(r)_7. Estes ensaios são também uti. lizados para o ensaio de hTNF (abaixo).

Indicaçães indirectas apontam atê agora para os macrófagos como sendo uma fonts celular de TNF em ratos e coelhos, visto que os macrófagos do fígado e baço passam por uma hiperplasia maciça quando sob a influência de BCG (ou as suas contrapartes) mais a endotoxina.

Resumidamente portanto: l) Agentes que preparam a libejç tação de TNF provocam marcada hiperplasia macrofágica 2) a Lise selectiva de macrófagos esplénicos é observada pouco depois da injecção de endotoxina em ratos BCG-preparados 3) o soro contendo TNF é rico em enzimas de origem lisossómica e os macrófagos activados são característicamente ricos em tais lisossomas.

Linhas clonadas de histiocitomas de rato (3774 mais PU5-1,8) produzem TNF constitutivamente, cuja produção está grandemente aumentada após exposição a endotoxina. Mannel et al (1980) Infect. Immun. 30, 523-530, e Williamson et al não publicado_7.

Como isolado do soro, o TNF de rato ê um glicoproteína que existe em pelo manos duas formas, uma forma de 40-60.000 de peso molecular e outra forma de 150.000 de peso molecular. /""Mannel et al (1980) Infect, Immun. 28., 204-211; Kull et al. (1981) 3. Immunol. 126, 1279-83; Haranaka, K. et al., (l98l)

3pn 3, Exp. Med., 51, 191-194; Green, S. et al. (1976) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 73, 381-385 e não publicada_7. TNF ê está vel quando congelado, de preferência abaixo de -7020. A sua actividade é destruída a 702C durante 30 min. E pirogénica em coe lhos numa gama de 5 a 500 micrograma/kg e não-pirogênica a 5 mi62 744

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crograma/kg. 0 TNF de rato tem sido relatado como tendo um peso molecular de da gama de aproximadamente 39-68 k daltons. Ruff,

M.R. et al. (1980) 3. Immunol. 125, 1671-1677; Mattheu/s, N. et al, (1980) Br. 3. Câncer 42 416-422; Mattheu/s, N. et al. (1978) Brit. 3. Câncer 38, 302-309; Ostroue, 3.M. et al. (1979) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354-358_7.

Interferão proteináceo '^produzido por animais hospedeiros como um resultado de uma infecção virai prévia. 0 interferão hos. pedeiro produzido protege o animal contra infecção virai subsequente. 0 IFN tem mostrado jogar um papel importante no sistema imunoregulador. 0 interferão tem mostrado efectuar as seguintes

funções celulares: Inibição de divisão celular, crescimento tumoral, formação de anticorpo, diferenciação eritróide e diferenciação de adipocitos enquanto aumenta a fagocitose macrofágica, toxicidade dos linfocitos, actividade de célula NK, expressão de antigénio de superfície celular e produção de anticorpo. Verifi cou-se recentemente que o interferão-(lFN) é também um possível agente anti-cancro.

Há três tipos principais de interferão nomeadamente alfa, beta e gama, distinguidas pelas suas propriedades antigénicas e bioquímicas. Alfa ê segregado por leucócitos (glóbulos brancos) beta por fibroblastos e ambos podem ser viralmente induzidos. Gja ma IFN é segregado por células linfóides e é conhecido por inter ferão "imune" Steu/art, W. Ε. II, et al., Nature 286, 110 (l980)_7· As diferenças antigénicas principais formam a base primária para a diferenciação entre as três espécies de IFN. Em adição, os IFN diferem num certo número de propriedades biológicas e fisicoquímicas. Os IFN alfa e beta humanos foram já purificados e as suas sequências aminoácidas foram determinadas parcialmente através de sequenciação aminoácida directa /~Knight,

E. 3r., et al., Science 207, 525-526 (1980); Zoon, K.C., Science 207, 527-528 (l980)_7 e mais completamente através de análise das sequências de ADN complementarmente clonadas ’/~Mantei, N., et al. Gene 10, 1-10 (1980) ; Taniguchi, T., et al., Gene 10, 11-15 (198O)_/. A comparação de sequências de ADN alfa- e beta-IFN clonadas indicou só 29% de homologia entre os dois IFN ao

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nível aminoácido ^""Taniguichi, T., Mantei, N., et al., Nature 285, 547-549 (l980)_/. De entre cada uma das três espécies de IFN principais, pode hauer subespécies moleculares com um menor grau de heterogeneidade. Diversas subespécies de alfa-IFN huma no foram reconhecidas atê agora por comparação com sequências de ADN clonadas. /~Nagata, S., et al., Nature 287 401-408 (198O)_7.

Há muito menos informação disponível acerca de gama-IFN. Este IFN ê pouco frequentemente encontrado em sobrenadantes de culturas de linfocitos expostas a mitogenes - tal como diversas lecitinas ou antigênios específicos em culturas de células sensi. bilizadas. A definição de gama-IFN reside em dois critérios major: (i) ao contrário de alfa- e beta-IFN, a actividade biológi

ca de gama-IFN ê largamente destruída pela exposição a pH 2, e (ii) anti-soros preparados contra alfa e beta IFN não produzem reacção cruzada com gama-IFN. Adicíonalmente, experiências efe£ tuadas com preparações relativamente rudes de gama-IFN sugerem um certo número de diferenças biológicas. Por exemplo, gama-IFN mostrou induzir o estado anti-viral muito mais vagarosamente que o alfa ou beta-IFN /""Dianzani, F,, et al., Nature 283, 400-402 (l980)_7. Em contraste, gama-IFN pode ser mais activo como um agente inibidor do crescimento celular e anti-tumor /~Crane, 0.

L. 0r., et al., 0. Nat. Câncer Insti. 61 871-874 (1973) Gupta et al, Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 76, 4817 (1979) Blalock et al, Cellular Immunology 49:390-394 (l980)__7.

Ensaios clínicos de IFN para terapêutica cancerosa foram impedidos porque não se conseguia produzir quantidade suficiente. Técnicas de engenharia genética têm superado este problema e o National Câncer Institute está a conduzir ensaios em larga escala de interferão humano (hlFN). Assim, ambos os hlFN natural e recombinante são conhecidos e utilizados clinicamente.

0 presdnte invento revela um processo para a produção e pu. rificação de TNF humano (hTNF) pela primeira vez. Um tal proces. so seria útil para ensaios clínicos. Mais de 30 linhas de células humanas em cultura de tecido são seleccionadas para a sua ca pacidade de produzir TNF. Verificou-se ser necessário Phorbol

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-912-miristato, 13-acetato (PMA) para aumentar a produção de hTNF.

0 PMA ê conhecido como um agente promotor de tumor. Linhas de células B com ou sem PMA são as fontes mais promissoras para pjco dução de hTNF, presentemente. Os ensaios padrão TNF acima descritos são utilizados para ensaio para hTNF i.e. o ensaio in vivo para necrose do tumor e o ensaio in vitro para citostase/citotoxicidade de célula-L. As linhas celulares de células-T monocito e promieloatoproduzem pouco ou nenhum TNF. Nem BCG exógeno nem endotoxina exógena são necessários para a produção de hTNF por este método. Um efeito celular anti-tumor sinérgico surpreendejç te verifica-se quando hTNF e quer hlFN recombinante quer natural são utilizados juntamente para matar ou inibir células tumorais humanas. hlFN ou hTNF exibem um efeito anti-tumor individualme_n te, mas o efeito de hTNF utilizado juntamente com hlFN ê superior à soma dos seus efeitos anti-tumor separados.

0 presente invento verifica que linhas celulares humanas podem servir como a fonte para hTNF, Métodos de produção de TNF de rato parecem estar principalmente dependentes nos efeitos de BCG e endotoxina. 0 presente método de produção de cêlulas-B humanas produz TNF sem a adição de BCG ou endotoxina. Assim, es, te TNF está essencialmente isento de endotoxina exógena, bactérias e também de contaminantes do soro. Como se mostra no Quadro I, das células hematopoiéticas testadas, as células B são as melhores produtoras de TNF. Níveis elevados de produção de TNF sem a presença de quer BCG exógeno quer de endotoxina exógena, constituem um resultado inesperado. Pequenas quantidades ou só vestígios de hTNF são encontrados nos sobrenadantes de linhas ce lulares de origem de cêlula-T, monocito ou pró-mielocito. 0 ensaio de célula-L in vitro (Carsu/ell et aí, Supra) determinou níveis de TNF produzidos por células de origem humana. Assim, pela primeira vez, níveis de TNF obtidos neste estudo estão isentos da qualquer contaminação de endotoxina exógena, visto que não há qualquer adição de endotoxina ao sistema de cultura, como abai, xo descrito. Estudos anteriores efectuados por outros no rato, constatam que a presença da endotoxina é um problema, visto que pode ser difícil isentar um sistema da endotoxina.

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-10Linhas de células B EBV transformadas são derivadas de doentes com melanoma. Outras linhas celulares são de colecçCés de bancos celulares de Dr. Lloyd Qld, Dr. Oorgen E. Fogh ou Dr. Peter Ralph do Sloan-Kettering Institute. Células Luk II são obti das do Dr. W. Stewart (Pickering et al (1980) Proc. Nat’l. Acad₀ Sei» USA 77, 5938-5942). Linhas de células B EBU-transformadas sao derivadas de doentes com melanoma (Houghton et al, Proc. Nat‘l. Acad. Sei. USA, 77 4260 (1980)).

Na selecção de células humanas de origem hematopoiética para a produção de TNF (ver Quadro I) 5 x 10³ células por ml são cultivados RPMI 1640 contendo soro fetal de vitelo a 8% (FCS) com e sem PMA /~10 ng/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)_7. 0

Quadro 2 mostra a composição de RPMI 1640. Após incubação durajn te 48 horas a 3720, as células são recolhidas por centrifugação e resuspensas a 1 x 10^ por ml em meio RPMI 1640 sem PMA durante mais 48 horas. Os sobrenadantes isentos de células são recolhidos por centrifugação das cúlturas celulares. Estes sobrenadantes são congelados a -2020 antes de ser determinada a actividade TNF pelo ensaio de célula-L utilizado em sobrenadantes diluídos por metade.

No ensaio in vitro, células L-M de rato derivadas da linha NCTC clone 929 (L) foram obtidas a partir do American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em Eagle’s Minimum Essential Médium (MEM) (GIBCO, Grand Island, N.Y.) suplementado com aminoácidos não-essenciais, penicilina (100 U/ml) estreptomicina (100 g/ml) e soro fetal de vitelo a 8% inactivado pelo calor, a 372C. Uma linha de células L TNF-resistente L(r) de rato foi d£ rivada de células L sensíveis L(S) através de passagens repetidas em meio contendo-TNF de rato. A actividade de hTNF é ensaia da adicionando volumes iguais de meio (tal como 0,5 ml) contendo diluiçães seriadas de TNF para reservatórios (placas Costar de 24-reservatórios) semeados três horas antes com 50.000 células L tipificadas (em 0,5 ml de meio), e determinando a quantidade de proteína que resulta em 50% de células mortas calculadas âs 48 horas através de microscopia de fase ou exclusão de azul tripano»

Como se vê no Quadro I, hTNF como produzido por células B

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humanas ê citotóxico para células L(s) de rato mas não células L(R) de rato no ensaio padrão de TNF de rato in vitro como acima descrito. As células a serem escolhidas para hTNF são cultivadas com e sem agente promotor de crescimento tumoral. Q PMA, por exemplo é eficaz em aumentar por várias vezes a resposta hTNF de células-B como se mostra nas colunas L(S) do Quadro I /"ver colu. na com título "nenhum PMA" J. 0 PMA ê também conhecido por TPA.

+ PMA

Células L-M de rato cultivadas derivadas de L(929) (ATCC) tornado resistente a hTNF através de passagem repetida em meio contendo hTNF (2-3 micrograma todas as semanas continuamente a cerca de 10 células) são também completamente de resistência cruzada para TNF de rato. Isto ê um efeito interessante de resistência cruzada.

Para ensaiar para hTNF in vivo /~BALB/c x C578LÂ, 7j raQ O

tos + F. , (Qackson Labs), injectados intradermicamente 7 dias ari

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tes com 5 x 10 células de sarcoma Meth A, recebem uma única dose intravenosa de hTNF. 24 horas depois, a necrose hemorrágica tumoral é classificada do seguinte modo: nenhum efeito (-), li geiro ( + ), moderado (++), ou extensivo (+++), envolvendo o último 90% da superfície do tumor (ver Carsmell Supra). Assim o hTNF mostra um efeito semelhante em ensaios TNF padrão in vivo e in vitro, embora de uma maneira geral hTNF tenha uma actividade específica superior em células alvo humanas como comparado com TNF de rato.

A endotoxina é determinada através de Limulus Amebocyte Lysate (Microbiological Associates).

Como linhas clona^das de histiocitos de rato produzem TNF, estudos posteriores de histiocitos humanos normais e malignss têm de ser obviamente efectuados para determinar a produção de hTNF por estas células em humanos. Os exemplos de células-B do Quadro I sugerem que células B normais têm também esta capacidade.

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Exemplo de Preparação e Concentração de hTNF (de células Lukll)

5 x 10³ células Luk Il/ml são cultivadas em RPMI 1640 contenda 5% de FCS e 10 ng/ml PMA e incubadas durante 48 horas a 3720. As 48 horas, as células são recolhidas por centrifugação e re-suspensas a 8-10 x 10³/ml em soro isento de R-ITS PREMIX /""insulina (5 microgramas/ml), Transferrina (5 microgramas/ /ml), selénio (5 ng/ml) substituto de soro (Collaborative Research, Waltham Mass)_7 e 2 nM de etanolamina e incubadas durante mais 48 horas. Os sobrenadantes são centrifugados, isentos de células e congelados a -202C. Os sobrenadantes Luk II são concentrados por células agitadas Amicon (membrana PM 10), e aplicados a uma coluna DEAE-Sephadex A-50 (40 x 2,6 cm) equilibrada com Tris 0,05M, NaCl 0,15 M tampão, pH 7,3 a 52C. Fracções de 5 ml são eluídas com o mesmo tampão. A actividade TNF é deteGtada nas fracções iniciais que atravessam e tais fracções pico são recolhidas. Este processo resulta num aumento de 25 vezes em .actividade específica (2-5 x 10^ unidades/mg proteína). As fracções hTNF-activas, como determinado pelo ensaio in vitro de célula-L, são recolhidas e concentradas por células Amicon.

A actividade específica das fracções recolhidas de hTNF está aproximadamente dentro da gama de IxlO^-lxlO^ no caso de células crescidas em meios suplementados com soro fetal de vitelo (FCS). A actividade espefiífica das fracções recolhidas de hTNF está aproximadamente dentro da gama de 2-5x10^ microgramas no caso de células crescidas em meio isento de soro.

A injecção I.V. de DEAE fraccionado hTNF provocou necrose hemorrágica de tumores Meth A pelo teste in vivo, Supra. 300 microgramas produziram necrose +++ em l/5 dos ratos e necrose ++ nos restantes 4/5, 150 microgramas de hTNF produziram necro

se ++ em 5/7 dos ratos e necrose + em 2/7 dos ratos. 75 microgramas de hTNF produziram necrose ++ em l/5 dos ratos e necrose + em 4/5 dos ratos. Não se observou qualquer necrose em três dos três (3/3) ratos de controle após a injecção de fracções DEAE comparáveis de meio de cultura (RPMI 1640). Assim hTNF é completamente activo in vivo e in vitro em testes padrão utilizados para determinar actividade TNF.

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Quer cultivados com ou sem FCS, o peso molecular de hTNF é aproximadamente de 70.000 daltons como determinado em cromatografia de coluna Sephacryl 5-200. pH elevado ou baixo durante, por exemplo, 12 horas, destrói a actividade do hTNF; p.e. aproximadamente 90% de perda de actividade a pH 2,0, 55% de activida de á destruída a pH 4,0, e aproximadamente 45% de perda a pH 10. A actividade de hTNF á estável na gama de aproximadamente 6-8.

Em relação à estabilidade com o calor, a actividade de hTNF é destruída pela exposição a 7Q2C durante 60 min. mas á estável a 5620 durante 60 min. A actividade ê mantida mesmo após longos períodos de armazenamento a -782C ou -202C.

A actividade IFN de 100 unidades por ml á encontrada no sobrenadante não-fraccionado de células LUKII PMA-estimuladas. Não se detectou qualquer actividade interferão nas fracções rec_o lhidas de hTNF purificado derivado de cromatografia DEAE, nem no TNF de rato purificado utilizado. A actividade de interferão hu mano ê medida através da inibição do efeito citopático do virus da estomatite vesicular em células WISH ou GM 2767 /""Steuiart W. Ε. II (1979) The Interferon System (Springer, Viena)_/ e compara da com um padrão internacional no caso de alfa-IFN recombinante humano (Hoffman-La Roche) e o padrão laboratorial no caso de ga ma-IFN natural humano. Alfa-hIFN recombinante (2-4 x 10 unidades/mg de proteína) é obtido a partir de Hoffman-La Roche, o alfa-hIFN (derivado de leucócitos) (0,64 x 10^ unidades/mg de proteína) ê preparado para o programa de avaliação do Sloan-Kettering Institute pelo Laboratório Kocher, Berna, Suiça, beta-hlFN natural (l x 10' unidades/mg de proteína) é obtido de Rosu/ell Park Memorial Institute (RPMI) e gama-hIFN natural (deri

γ

vado de leucócitos) (l x 10 unidades/mg de proteína) ê obtido a partir do Dr. Berish Rubin, Sloan-Kettering Institute. Nem TNF humano nem de rato como parcialmente purificados, têm actividade IFN detectável. Os diversos hlFN carecem actividade hTNF detectável como se mostra pela falta de citotoxicidade ou citostase em células L(s) no ensaio in vitro, Supra.

0 hTNF produzido tem diferentes efeitos em linhas celulares diferentes como apresentado no Quadro 3. A citotoxicidade é

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-14notada utilizando uma redução de 35/ ou mais na viabilidade celular após sete dias enquanto a citostase ó notada utilizando uma redução de 35/ ou mais no número de células após sete dias. Para este estudo e para todos os outros estudos, como se mostra na descrição, utiliza-se hTNF como produzido pela linha celular LUKIX como acima descrito. Este lote de exemplos específicos é só para fins de referência e não serve para limitar o invento. Outra linha de cálulas-B hTNF, bem como TNF de outras fontes celulares em humanos, podem obviamente ser utilizados numa varieda de de células humanas in vivo e in vitro. Será evidente para os entendidos na arte, vero efeito do BCG e os seus complementos bem como a endotoxina da produção de TNF de células humanas in vitro e in vivo.

0 efeito de hTNF em linhas celulares de mama humana (Qua dros 3 & 4) ê semelhante àquele do TNF do rato visto que ambos são citotóxicos para a maioria das linhas celulares do cancro da mama de origem testado. Células de pulmão e melanoma são também afectados por hTNF mas aqui o efeito predominante é citoestático. Das quatro linhas celulares normais testadas com hTNF, pulmão, rim, pulmão fetal e pele fetal, nenhuma é sensível a hTNF. Portanto, o efeito citotóxico, citoestático ou necrose hemorrágica do hTNF ou células humanas parece estar confinado a células turno rais humanas. 0 hTNF tem uma actividade específica maior em células alvo humanas comparado com TNF de rato.

0 interferão humano, quer recombinante ou natural, quer alfa, beta ou gama, tem um efeito inibidor sobre o crescimento de células tumorais como é bem sabido, e aqui apresentado, por exemplo para quatro linhas de células tumorais, Quadros 5, 6 e 9. Em geral, o número de unidades anti-virais de IFN necessárias para provocar um efeito citotóxico ou citoestático de 35/ ou mais, é mais elevado com alfa-hIFN que com beta ou gama-hIFN. Nenhuma das preparações de IFN mostrou citotoxicidade ou citostase em células L(S) de rato in vitro, indicando deste modo ausência de actividade hTNF. No entanto, estes dois produtos celulares quando purificados e utilizados em conjunto, apresentam um efeito superior à soma dos seus efeitos separados como se pode ver nos exemplos apresentados nos quadros 7 e 8. 0 efeito

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Ref: SK 283-Port

-15

citotóxico combinado de IFN e hTNF é também sinergico pelo método sugerido por Clarke (Clark, D.A. (1958) Ann. N.Y. Acad. Sei. 76 915-921) i.e. farmacològicamente sinérgico. Ver Quadros 10, 11 e 12. Este resultado inesperado pode ser de enorme valor no tratamento de tumores humanos.

Segue-se um exemplo de um método utilizado para exibir o efeito do hTNF, hlFN ou uma combinação dos dois. As células são tipificadas, enxaguadas duas vezes, colocadas em placas a 4-5x10 / /reservatório (placas Gostar de 24 reservatórios) em MEM contendo 8% de FCS e incubados a 372C. 16 a 24 horas depois, o meio é

aspirado e 1 ml de diluição de ou hTNF DEAE-fraccionado, ou IFN, o hTNF mais IFN é então adicionado. 0 número total de células (viáveis e não viáveis) ê determinado nos dias 3, 5 e 7 por microscopia de fase. As cúlturas^So refeitas no dia 5 com meio fresco contendo as mesmas concentrações de hTNF e/ou hlFN. Este método é utilizado para os resultados nos Quadros 3-9«, 0 proto- .

colo de acordo com Clark, Supra para seleccionar o sinergismo ou potenciação da droga ê de testar dois factores, X e Y aqui hlFN (X) e hTNF(Y) só e em combinação. Inibição de tumor aumentada ou toxicidade celular leva a testes de l/4X + l/4Y ou aqui l/4 hIPN + l/4 hTNF para ver se esta combinação de um quarto de dose é comparável à dose total de qualquer um deles isolado e se é, 0 sinergismo dos dois factores X e Y, aqui hlFN e hTNF está demons trado. Isto vê-se nos Quadros 10, 11 e 12 nos quais 0 mesmo método que para os exemplos dos quadros 4-8 ê utilizado somente nos dias 3 e 5. 0 sinergismo é claramente mostrado no l/4 hlFN +

+ l/4 hTNF cujo efeito é superior que quer TNF isolado ou hlFN isolado para as três linhas celulares nos quadros 10, 11 e 12.

Assim os dois, hTNF e hlFN, podem ser utilizados como aci ma'ou em conjunto em diversas combinações para tratar tumores hu manos e cancro visto que eles provocam uma maior actividade cito tóxica no cancro em conjunto que qualquer um deles isolado. De facto, ê óbvio que para obter máximo efeito terapêutico, os doeri tes cancerosos devem ser estimulados para produzir ambos TNF e/ /ou IFN, ou tratados com diversas combinações das espécies terapêuticas acima (TNF e IFN), alternando-as talvez para um benefí62 744

Ref: SK 283-Port

-16-

cio máximo, ou utilizando sequências com tempos diferentes, etc.. Se outros factores tal como TNF são necessários para acçâo IFN máxima, o fornecimento desta deficiência pode levar a actividade IFN aumentada contra o cancro. Acçâo aumentada de IFN pode ser devida ao hTNF estar a funcionar como um modificador da resposta biológica do sistema imunitário. Torna-se então óbvio, para os entendidos na arte, tentar a acçâo de hlFN contra células cancerosas humanas em conjunção com outros modificadores da resposta biológica, só ou em combinação, tais como hormonas ou outras moléculas modificadoras da resposta imune que são tipo-hormona, tais como IL-2, ou outras citoquinas, ou linfoquinas ou linfotoxina. De facto, está indicado testar diversas combinaçães dos diferentes IFN e tais moléculas contra o cancro. A estes métodos pode-se adicionar o teste de hTNF ou hI^FN de diferentes fontes celulares contra o cancro.

SEGUEM-SE QUADROS 1 a 12

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-17-

QUADRO I

SELECÇÃO DE LINHAS CELULARES HUMANAS DE ORIGEM HEMATOPQIETICA PARA__A PRODUÇÃO DE hTNF

$ de Viabilidade de Célula-L In Vitro

Linha celular L (S) L_LRl

Nenhum PMA

Célula B	Nenhum PMA	+ PMA	+ PMA	Nenhum PMA	+ PMA
BE*	47$	20$	2,3	100$	100$
BI*	57$	43$	1,3	100$	98$
CL*	95$	37$	2,6	100$	97$
CW*	28$	8$	3,5	100$	100$
DE*	45/o	18$	2,5	100$	100$
DM*	18$	11$	1,6	100$	100$
DS*	88$	38$	2,3	100$	100$
EO*	27$	2.6 /3	1,7	100$	100$
EL*	70$	16$	4,4	100$	100$
EQ*	15$	11$	1,4	100$	100$
ER*	47$	22$	2,1	100$	100$
FC*	19$	8$	2,4	100$	100$
FD*	44$	16$	2,8	97$	100$
FG*	80$	30$	2,7	100$	97$
ARH-77	68$	12$	5,7	100$	100$
DAUDI	97$	97$	—	N.T.	N.T.
LuK II	20$	13$	1,5	100$	100$
RPMI 1788	78$	35$	2,2	100$	100$
RPMI 8226	96$	94$	1,1	100$	86$
RPMI 8866	32$	10$	3,2	100$	98$
5K-LY-16	98$	100$	—	100$	100$
SK-LY-18	99$	100$	—	100$	98%
ARA-1O	77$	39$	2,0	100$	97$
BALL-1	100$	100$	—	100$	100$
Célula T
CCRF-CEM	100$	100$		100$	100$
P-12	95$	9455	—	99$	98$
MOLT-4	100$	100$	--	99/Ó	96$
T-45	100$	100$	—	100$	100$
HPB-ALL	100$	97$	--	100$	100$
TALL-1	96$	94$	--	96$	96$
Monocito
0111	100$	100$		99$	98$
THP	96$	8 0$	__	99$	99$
0-937	100$	100$	—	99$	99$
Promielocito
HL-60	96$	97$	—	99$	98$

* Linhas celulares EBV-transformadas derivadas do sangue periférico

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-18QUADRO 2

RPMI 1640 Liquido (IX)

Componente mq/L

SAIS INORGÂNICOS:

Ca(N0₃)₂.4H₂0 100,00

KC1 400,00

MgS0₄.7H₂0 100,00

NaCl 6000,00

NaHCOj 2000,00

Na₂HP0₄.7H₂0 1512,00

OUTROS COMPONENTES:

D-Glucose 2000,00

Glutationa (reduzida) 1,00

AMINOACIDOS:

L-Arginina (isenta de base) 200,00

L-Asparagina 50,00

L-Acido aspártico 20,00

L-cistina 50,00

L-ácido glutâmico 20,00

L-Glutamina 300,00

Glicina 10,00

L-Histidina (isenta de base) 15,00

L-Hidroxiprolina 20,00

L-Isoleucina (isenta de Alio) 50,00

L-Leucina (isenta de Metionina) 50,00

L-Lisina HC1 40,00

L-Metionina 15,00

L-Fenilalanina 15,00

L-Prolina (isenta de hidróxi L-Prolina) 20,00

L-Serina 30,00

L-Trionina (isenta de Alio) 20,00

L-Triptofano 5,00

L-Tirosina 20,00

L-Valina 20,00

VITAMINAS:

Biotina 0,20

D-pantotenato de Ca 0,25

Cloreto de colina 3,00

Acido Fálico 1,00

i-Inositol 35,00

Nicotinamida 1,00

Acido para-aminobenzfiico 1,00

Piridoxina HC1 1,00

Riboflavina 0,20

Tiamina HC1 1,00

Vitamina B 0,005

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-19QUADRO 3

EFEITO DO hTNF EM LINHAS CELULARES HUMANAS

Citotóxico

SK-MG-4 (Astrocitoma)

MCF-7 (Ca Mama)

BT-20 (Ca Mama)

SK-BR-3 (Ca Mama)

Me-180 (Ca Cervix)

SK-CO-1 (Ca Cólon)

RPMI 7931 (Melanoma)

Citoestâtico

SK-LU-1 (Ca pulmão)

RPMI 4445 (Melanoma)

SK-MEL-29 (Melanoma)

SK-MEL-1O9 (Melanoma)

SK-OV-3 (Ca Ovário)

Nenhum efeito

T-24 (Ca Bexiga)

5637 (Ca Bexiga)

MDA-MB-361 (Ca Mama)

S-48 (Ca Colon)

SK-LC-4 (Ca pulmão)

SK-LC-6 (Ca pulmão)

SK-LC-12 (Ca pulmão)

SK-MEL-19 (Melanoma)

SK-UT-1 (Ca Otero)

SAOS-2 (Sarcoma' Osteogênico)

U20S (Sarcoma Osteogêhico)

WI-38 (pulmão fetal normal)

MY (Epitólio de rim normal) F-136-35-56 (pulmão fetal normal) F-136-35-56 (pele fetal normal)

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-20QUADRO

EFEITO DO hTNF EM QUATRO LINHAS CELULARES TUMORAIS HUMANAS (DIA 0 - 5 X 10⁴ CÉLULAS COLOCADAS EM PLACA COM hTNF)

Microorganis

	mos hTNF	DIA	3	DIA	5	DIA	7
inha	proteína/cul
Slular	tura
		% de cê	cresci	% de cê	cresci	/o de cê	cresci
		lulas	mento	lulas	mento	lulas	mento
		viáveis	celular	viáveis	celular	viáveis	celular

xlO⁵ xlO⁵ xlO⁵

Unidades

		TNF
j'	48	1263	24/0	1,03	16/	1,55	Ct7 5/o	1,45
	19,2	505	30	1,08	19	1,43	7	1,38
F—2 0	9,6	253	45	1,05	21	1,53	10	1,3
Rama)	4,8	126	49	1,03	30	1,6	18	1,23
sitotó'	1,2	32	50	1,05	53	1,8	61	2,43
<ieo)	Controle	0	93	0,99	94	2,23	96	3,39
	24,5	645	83	1,78	52	2,7	49	6,33
	9,8	258	83	1,73	57	2,83	49	7,38
E-180	4,9	129	80	1,75	70	3,48	58	8,03
jervix)	2,45	63	81	1,73	76	4	63	3,23
jitotó«ico)	Controle	0	98	1,62	97	4,48	97	1,01
	24,5	645	91	0,8	86	1,63	72	1,68
i-MEL-	9,8	258	96	1,15	90	1,93	91	2,68
39	4,9	129	94	1,35	93	2,13	90	2,93
lelanoma) 2,45	63	94	1,25	93	2,1	92	3,13
'itoes:ático)	Controle	0	98	2,19	98	3,89	99	9,78
	48	1263	95	2,58	98	4,6	99	7,75
*24 lexiga	19,2	5 05	96	2,83	97	4,55	98	8,58
9,6	253	97	2,78	98	4,65	98	8,33
snhum	4,8	126	98	3,25	99	4,55	98	8,33
•eito)	Controle	0	100	3,23	98	4,53	99	8,38

KV

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-21QUADRO 5

EFEITO DE INTERFERÃO ALFA HUMANO RECOMBINANTE EM QUATRO LINHAS CELULARES HUMANAS

(DIA O - 5 x 1Q⁴ CÉLULAS COLOCADAS EM PLACA COM IFN)

UNIDADES

, u IFN por _{DIft 3 DIft 5} DIA ₇

Inha cultura

slular _ _ _ _

	% de cé	cresci	% de cé	cresci.	% de cé	cresci.
	lulas	mento	lulas	mento	lulas	mento
ί	viáveis	celular	viáveis	celular	viáveis	celular
		& células		It células		# células
		xlO5		xlO5		xlO5
50,000	83	0,6	31	0,65	28	0,9
12,500 Γ-20 3,125	85	0,65	47	0,95	38	0,925
83	0,72	74	1,15	65	1,37
781	83	0,75	75	1,32	70	1,4
Controle	95	1,04	93	2,3	97	5,4

	50,000 12,500	85 91	1,02 1,18	78 86	1,67 1,92	62 79	2 3,4
-180	3,125	90	1,3	91	2,02	87	4,2
	781	95	1,42	93	2,7	90	4,9
	Controle	98	1,87	98	5,91	98	7,8

!í 5 0,000	62	0,6	15	1,35	10	1,25
i-MEL- 12,500	58	0,65	34	1,77	37	2,1
(9 3,125	67	1,12	52	1,8	54	2,4
781	79	1,42	69	2,37	74	2,5
Controle	97	2,2	98	3,6	98	6,8

50,000	95	1,6	94	4,1	83	4,8
»24 12,500	94	1,7	96	4,7	89	5,3
3,125 781	94	1,98	95	4,8	90	5,9
97	2,72	94	4,97	90	7,4
Controle	98	3,43	96	6,05	93	7,9

62 744

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-22

QUADRO 6

EFEITO DE INTERFERÃO GAMA HUMANA NATURAL EM QUATRO LINHAS CELULARES HUMANAS

	(DIA 0 - 5xl04	CÉLULAS	COLOCADAS	EM PLACA	COM IFN)
	Unidades
»nha	-hlFN por	. DIA 3	DIA 5 DIA 7
ilular	cultura
	% de cé	cresci	/o de cê	cresci. /□ de cê. cresci.
		lulas	mento	lulas	mento lulas mento
		viáveis	celular	viáveis	celular viáveis celular
t			-ff células		ff células ff células
			xlO5		xlO5 xlO5
	250 unidades	73	1,33	79	2,2 58 2,83
’~20	125 unidades	81	1,43	81	2,43 66 3,15
	31,25 unidades	84	1,78	86	2,7 79 4,03
	7,8 unidades	86	1,93	93	2,78 87 3,83
•	Controle	95	1,64	97	3,61 97 5,44
	250 unidades	67	1,15	49	1,23 22 1,95
í-180	125 unidades	69	1,2	56	1,3 26 1,9
	31,25 unidades	72	1,32	61	1,3 34 1,78
	7,8 unidades	79	1,55	67	1,38 50 2,65
	Controle	98	2,45	98	5 96 7,75
Í-MEL-	250 unidades	55	1	51	1,73 23 2,3
►09	125 unidades	67	1	61	2 38 2,78
	31,25 unidades	74	1,18	82	3,02 61 3,35
	7,8 unidades	85	1,15	90	3,28 77 5,45
	Controle	98	2,05	98	3,53 96 5,43
*24	2000 unidades	100	1,75	95	2,58 93 2,48
	500 unidades	100	2,08	95	2,52 94 3,1
	125 unidades	99	2,4	95	2,9 96 3,52
	31,25 unidades	99	3,03	98	4,95 98 6,45
	7,8 unidades	99	3,35	98	7 98 9,45
	Controle »	99	4	98	7,35 99 10,4

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-23QUADRO 7

EFEITO DE hTNF INTERFERÃO ALFA HUMANO RECOMBINANTE EM QUATRO LI

NHAS CELULARES TUMORAIS HUMANAS

(DIA O - 5 x 10⁴ CÉLULAS MAIS hTNF E IFN)

/ DE CÉLULAS VIÁVEIS

		DIA 3	DIA 5	DIA
	hTNF + IFNx	26	6	5
	hTNF 4 U	74	64	62
BT-20	IFN 3125 U	83	74	65
	Controle	95	93	97
	hTNF + IFNx	53	25	20
	hTNF 16 U	85	82	70
ME-180	IFN 3125 U	90	91	87
	Controle	98	98	98
	hTNF + IFN*	33	19	25
SK-MEL-	hTNF 33 U	96	96	96
109	IFN 781 U	79	69	74
	Controle	97	98	98
	hTNF + IFNx	97	93	85
	hTNF 33 U	98	95	88
T-24	IFN 781 U	94	95	90
	Controle	98	96	93
(x Mesmas	quantidades de hTNF e	hlFN utilizadas em	combinação

como utilizadas isoladamsnte para cada linha celular). U = Unidadss.

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-24QUADRO 8

EFEITO DE hTNF E INTERFERÃO GAMA HUMANO NATURAL EM QUATRO LINHAS

CELULARES	TUMORAIS HUMANAS
(DIA 0-5	x 104 CÉLULAS & hTNF	E hlFN)
		% DE	CÉLULAS VIÁVEIS
		DIA 3	DIA 5	DIA 7
	hTNF + IFNx	11	10	6
	hTNF 25 U	56	46	31
BT-20	IFN 31,25 U	84	86	79
	Controle	95	97	97
	hTNF + IFNx	2	4	5
	hTNF 50 U	77	72	60
ME-180	IFN 125 U	69	56	26
	Controle	98	98	96
	hTNF + IFNx	9	6	2
SK-MEL-	hTNF 100 U	95	93	92
109	IFN 125 U	67	61	38
	Controle	98	98	96
	hTNF + IFNx	99	94	94
	hTNF 200 U	97	97	96
T-24	IFN 125 U	99	97	93
	Controle	99	98	93
(x Mesmas	quantidades de hTNF e	hlFN utilizados em combinação
como utilizadas isoladamente	para cada	linha celular)	•

U = unidades

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Ref: SK 283-Port

-25-

		CD CO ca +3 co CD 0 -P •P 0
o		□
o		0
c
•H		CD
a		u (fl
E		E
CD		•P o
CO		•P
o		X
c		0
<0		-P
E		0
□		-P
12		•P C_3
CO
CD		CD
		T3
P
CD
Cu		lh
P		ΙΛ
CD
+5		O
c		n
Ή		C (fl
CD		0
Ό		0 >
O		0
ϋ		P
•P		□.
*fl		co
-P		•P
CD		cfl
CD		P
O		p
-P	•
P	co	I
o	(0	•P
	C	+5
CD	ca	c
	E	c£
o	23
o	12	03
Ή		(D
X	co	"O
Ό	03	(fl
-P	P	*□
O	ca	•P
-p	P	c
•P	O	23
O	P
	CD	03
O	0	Ό
-P
•P	co	O
(D	ca	P
0-	12	CD
m	C	E
	♦fi	VD
0	rH	2

Ch

o

CE

Q

eX

Ξ3

tor

					O
					0
					0				o
					•		a		C2t
					0		M3		(23
		tn		O	tn		P		CM
		ω		m	Zx				/X
	co			CM
	m
	1				a		0
	1—1			O	0		0
	-S>	ρ-		O O	0 •		a •		(23 O
		ω		•	0		tn		O
				O LTl fi**	X 0		CM /X		CM z\
				a	0		O\		tn
		tn		0	0		ο-		CM
		ω		tn	*		χ/
	0·			•	VO
	CM 1 H			1—1	rp
			a	O		0
			a	O		C3
		ρ-		0	O		tn		(23
		ω		•	•		•		0
			a	a		CM		a
CO 03				cn /X			Λ		Λ
P
ca	cn				rp
P	0	cn			co		cn		P-
23	>p	ω		VO			Ο-		CM
P	1			CM		Χ/
CD
a	Ld
	s
CD	1			O	0
ca	XC	1—		cn	a		cn		CM
12	cn	ω		CM	o-		ο-		CM
c			1—I	P		Χ/
•P
					rp				CO
		cn		0	co		cn		·»
	a co	ω		rp rp	ç?
	1—t
	l
	Ld				0
	«r				0
		Ρ-		O	a
		ω		O	•		0		00
				in	0·		MO
				VO	0-		CM		X?
					rp
		cn			co		cn		CM
	O	ω		in CM			&		P-
	CM
	1
	H
	cn				tn				O
		ρ-		0	CM		cn
		ω		P-	P		ο-		tn
				CM	tn		ν		P
							P
		ο		rp	p|		cfl		1—i
		c		(fl	E		P		(fl
		ca		P	E 03		23		P
		E		n	C3 -P		-P		n
		n		-P	□ C		Cfl		-P
		12		cfl	03 Cfl		c		cfl
				c	P C				c
		O
		J(fl		2	2				2
		P		Lu	Lu		Lu		Lu
		(D		1-1	1-1		t-t		1—1
		f|_		I	1		1		I
		P 03	ca	Ή	Cfl	co		cfl	ixo
		-P	tp	0-	-P	E
		c	rp		Γ—1	03		ca
		1—1	Cfl		(tf	oa		ω

o

o

X

Ό

-P

O

-P

•r-4

CJ

H

CJ

Citoestático

1

cn

ω

62 744

Ref: SK 283-Port

-26-

qUADRQ 10

EXPERIENCIA DE 5INERGISM0 BT-20 COM hlFN-GAMA NATURAL MAIS hTNF

IFN

(unidades/cultura)

250

125

62,5

DIA 3 DIA 5

cálu las	/0 viável	^céljj las	z··1 viável
xlO5		5 xlO2
1,08	*74*	1,4	*64*
1,03	76	1,83	79
0,95	84	1,73	83

hTNF

(unidades/cultura)

*

'2 Y 4 Y

50

25

1,15	*48*	1,75	*37*
1,1	52	1,98	47
0,98	59	2,28	54

r l/2 Y '2 X + 1/2 Y 4 X + Y

+ 1/2 Y 2 X + 1/2 Y 4 X + l/2 Y

12,5

IFN + hTNF (50 unidades

250 125 62,5 IFN + hTNF (25 unidades)
250
125
62,5
IFN + (12,5	hTNF unidades)

0,75	3	1,05	5
0,75	10	1,05	5
0,7	7	1,05	9

0,85	12	1,05	5
0,73	14	1	7
0,75	13	0,8	12

+ l/4 Y 2 X + 1/2 Y inergismo*

/4 X + l/4 Y*

P-"250

125

62,5

Controle

0,8	22	1,13	11
0,75	17	1,15	11
0,67	*22*	1,15	*11*
1,02	96	1,97	94

62 744

Ref: SK 283-Port

-27QUADRO 11

EXPERIENCIA DE SINERGI5MQ SK-MEL-109 COM hlFN-GAMA NATURAL MAIS hTNF

hlFN-Gama natural

Sinergismox /4 X + 1/4 Y

	DIA	3	DIA	5
IFN (unidades/cultura)	Φ célu las	c/ za viável	4tcélu las	viável
xlO5		5 xlO?
x25 0x	1,2	x58x	1,08	x32x
125	1,25	70	1,15	43
62,5	1,2	72	1,5	63
hTNF (unidades/cultura)
x200x	0,8	x87x	1,38	x87x
100	0,8	91	1,63	92
50	1,15	91	1,73	96
IFN + hTNF (200 unidades)
250	0,875	8	0,9	3
125	0,8	12	0,85	6
62,5	0,775	16	0,83	6
IFN + hTNF (lOO unidades)
250	0,825	12	0,83	3
125	0,8	16	0,925	8
62,5	0,825	18	0,95	16
IFN + hTNF (50 unidades)
250	0,8	19	0,85	6
125	1	32	0,9	11
x62,5x	0,875	x31x	0,9	xl4x
Controle	1,44	96	4,12	99

62 744

Ref: SK 283-Port

-28QUADRO 12

EXPERIENCIft DE SINERGISMO ME-180 COM hlFN-GAMA NATURAL MAIS hTNF

hlFN-Gama natural

IFN

(unidades/cultura)

x250x

125

62,5

hTNF

(unidades/cultura)

*200*

100

50

IFN + hTNF (200 unidades)

250

125

62,5

IFN + hTNF (lOO unidades)

250

125

62,5

IFN + hTNF (50 unidades)

250

125

ainergismox

í/4 X + 1/4 Yx 62,5

Controle

DIA 3 DIA 5

cálu las	- nf zQ viável	# cálu las	viável
xlO5		xlO5
1,15	x67x	1,15	x56x
1,3	71	1,4	64
1,33	75	1,35	67
2,48	x81x	4,2	x55x
2,38	86	4,4	59
2,4	89	4,4	63

0,775 6 1,25 4

0,775 6 1,15 2

0,775 6 1,25 4

0,83 3 1,2 2

0,8 3 1,23 2

0,8 12 1,15 2

0,875	6	1,23	0
0,85	12	1,05	2
0,8	xl6x	1,08	x7x
2,69	98	5,61	98

62 744

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-29-

Claims (51)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de hTNF purificado, possuindo um peso molecular dentro da gama de cerca de 70,000 daltons, estável a um pH da ordem de 6-8, possuindo uma actividade específi ca dentro da gama de 2-5 x 10^ unidades/mg Proteína como determi nado pelo ensaio de célula-L de rato in vitro, estável a -782C e -2Q2C e estável a 5620 durante 60 min., caracterizado pelo facto de compreender: (i) a incubação de células hematopoiéticas humanas inicialmente em cultura de tecido; (ii) a separação de sobrenadante de cultura celular das ditas células; (iii) a recolha das ditas células; (iv) a resuspensão das ditas células;

   (v) a sua re-incubação; (vi) a recolha do sobrenadante celular; e (vii) o congelamento do sobrenadante sem as ditas células.
2. 2 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto da incubação inicial da etapa (i) ser um meio RPMI 1640 contendo FCS numa variação de cerca de 0-8%.
3. 3 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto da incubação inicial ser durante cerca de 48 horas a 372C.
4. 4 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto da etapa de separação (ii) ser por centrifugação.
5. 5 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizja do pelo facto das células serem re-incubadas na etapa (iv) em meio RPMI 1640.
6. 6 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto das células serem re-incubadas na etapa (v) durante 48 horas a 372C,
7. 7 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto das células hematopoiéticas serem células B humanas .
8. 8 - Processo de acordo com a Reivindicação 7, caracteriza do pelo facto das células B humanas serem seleccionadas a partir

   62 744

   Ref: SK 283-Port

   -30

   do grupo de BE, BI, CL, CW, DE, DM, DS, EO, EL, EQ, ER, FC,FD,

   FG, ARH-77, DAUDI, LUKII, RPMI 1788, RPMI 8226, RPMI 8866 e ARA-10.
9. 9 - Processo de acordo com a Reivindicação Γ, caracteriza do pelo facto das células serem cultivadas na etapa (i) na presença -de PMA.
10. 10 - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracteriza do pelo facto da concentração de PMA ser de 10 ng/ml.
11. 11 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de serem incubadas inicialmente na etapa (i)

    5

    aproximadamente 5 x 10 células por ml.
12. 12 - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo facto de após a etapa (i) de incubação inicial as ditas células serem resuspensas em R-ITS PREMIX isento de soro e 2 nM etanolamina, sendo os sobrenadantes isentos de células recolhidos e concentrados, sendo o sobrenadante das células concentrado colocado em contacto com uma coluna de separação equilibrada com tampão e sendo as fracçães HTNF-activas obtidas da dita coluna recolhidas e concentradas.
13. 13 - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracteri

    5

    zado pelo facto de 8-10 x 10 células serem resuspensas por ml.
14. 14 - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracteri. zado pelo facto do sobrenadante isento de células e as fracçães hTNF-activas serem concentradas numa célula. Amicon agitada pos. suindo uma membrana PM10.
15. 15 - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracteri. zado pelo facto da coluna de separação ser uma coluna DEAE Sepha dex A-50.
16. 16 - Processo de acordo com a Reivindicação 15, caracteri zado pelo facto da coluna DEAE Sephadex A-50 ser de 40 x 2,6 cm.
17. 17 - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracteri. zado pelo facto do tampão ser Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M a pH 7,3,
18. 18 - Processo de preparação de uma composição compreendeji do hTNF e hlFN.

    62 744

    Ref: SK 283-Port

    -3119 - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracteri zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 1.
19. 20 - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo processo da Reivindicação 9.
20. 21 - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 12.
21. 22 - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracteri. zado pelo facto do hlFN ser seleccionado a partir do grupo de al, fa-hIFN, beta-hIFN, gama-hIFN e suas misturas.
22. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri zado pelo facto do hlFN ser uma hlFN natural,
23. 24 - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracteri zado pelo facto do hlFN ser hlFN recombinante.
24. 25 - Processo para a distinção de células normais de células malignas numa mistura, caracterizado pelo facto de compreender a colocação em contacto das ditas células com hTNF e a observação de um efeito inibidor de crescimento nas células malignas,
25. 26 - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 1.
26. 27 - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 9.
27. 28 - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 12.
28. 29 - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracteri. zado pelo facto do efeito inibidor do crescimento ser selecciona do a partir do grupo de citoestase, citotoxicidade, necrose he62 744

    Ref: SK 283-Port

    -32-

    morrágica, inibição do crescimento e suas combinações.
29. 30 - Processo para distinguir células normais de malignas numa mistura que compreende a colocação em contacto as ditas células com uma composição compreendendo hTNF e hlFN e observando um efeito inibidor de crescimento nas células malignas.
30. 31 - Processo de acordo com a Reivindicação 30, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 1.
31. 32 - Processo de acordo com a Reivindicação 30, caracteri zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 9.
32. 33 - Processo de acordo com a Reivindicação 30, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo cem o processo da Reivindicação 12.
33. 34 - Processo de acordo com a Reivindicação 30, caracteri. zado pelo facto do efeito de inibição de crescimento ser seleccionado a partir do grupo de citoestase, citotoxicidade, necrose hemorrágica, inibição de crescimento e suas combinações.
34. 35 - Processo de acordo com a Reivindicação 30, caracteri. zado pelo facto do hlFN ser seleccionado a partir do grupo de al fa-hIFN, beta-hIFN, gama hlFN e suas misturas.
35. 36 - Processo de acordo com a Reivindicação 35, caracteri. zado pelo facto do hlFN ser hlFN natural.
36. 37 - Processo de acordo com a Reivindicação 35, caracteri zado pelo facto do hlFN ser hlFN recombinante.
37. 38 - Processo de preparação de células L(R) de rato resis tente a hTNF através de passagem repetida de células L(S) de rato através de meio.contendo hTNF.
38. 39 - Processo de acordo com a Reivindicação 38, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 1.
39. 40 - Processo de acordo com a Reivindicação 38, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 9.

    62 744

    Ref: SK 283-Port
40. 41 - Processo de acordo com a Reivindicação 38, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o método da Reivindicação 12.

    12 - Processo para a inibição do crescimento de células cancerosas humanas caracterizado pelo facto de compreender a exposição das células cancerosas humanas a quantidades de hTNF suficientes para inibir o crescimento das ditas células.
41. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracteri zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 1.
42. 44 - Processo de acordo com a Reivindicação 42, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 9.
43. 45 - Processo de acordo com a Reivindicação 42, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 12.
44. 46 - Processo para inibir o crescimento de células cancerosas humanas caracterizado pelo facto de se expor as células cancerosas humanas a uma composição constituída por hTNF e hlFN suficiente para inibir o crescimento das ditas células.
45. 47 - Processo de acordo com a Reivindicação 46, caracteri. zado pelo facto do efeito inibidor do crescimento ser sinérgico.
46. 48 - Processo de acordo com a Reivindicação 46, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido de acordo com o processo da Reivindicação 1.
47. 49 - Processo de acordo com a Reivindicação 46, caracteri. zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 9.
48. 50 - Processo de acordo com a Reivindicação 46, caracteri zado pelo facto do hTNF ser produzido pelo método da Reivindicação 12.
49. 51 - Processo de acordo com a Reivindicação 46, caracteri. zado pelo facto do hlFN ser seleccionado a partir do grupo de

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    Ref: SK 283-Port

    -34alfa-hlFN, beta-hIFN, gama-hIFN e suas misturas.
50. 52 - Processo de acordo com a Reivindicação 51, caracteri zado pelo facto do hlFN ser hlFN natural.
51. 53 - Processo de acordo com a Reivindicação 51, caracteri. zado pelo facto do hlFN ser hlFN recombinante.