DD230940A1

DD230940A1 - METHOD FOR THE DETERMINATION AND PRAEPARATION OF HUMAN IGA

Info

Publication number: DD230940A1
Application number: DD25466583A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Dietlind Haedge; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Praeparation von humanem IgA. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur praeparativen Abtrennung sowie zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-IgA bzw. Antikoerpern der IgA-Klasse aus biologischen Fluessigkeiten anzugeben, das sich durch hohe Spezifitaet, hohe Sensitivitaet, Reproduzierbarkeit sowie einer moeglichen Standardisierung auszeichnet. Die Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-IgA im Serum und verschiedenen Koerperfluessigkeiten sowie zur praeparativen Isolierung von Human-IgA aus biologischen Fluessigkeiten zu schaffen, welches auf der Verwendung eines neuen immunologischen Reagens beruht. Die Aufgabe wird geloest, indem als neues immunologisches Reagens die monoklonalen Antikoerper der Serie BL-IgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, zum Einsatz kommen. Diese Antikoerper werden von den Hybridomen H-BL-IgA/1 bis 5 sezerniert.The invention relates to a method for the determination and preparation of human IgA. The aim is to provide a method for the preparative separation and for the qualitative and quantitative determination of human IgA or antibodies of the IgA class from biological fluids, which is characterized by high specificity, high sensitivity, reproducibility and a possible standardization. The object is to provide a method for the qualitative and quantitative determination of human IgA in serum and various body fluids and for the preparative isolation of human IgA from biological fluids, which is based on the use of a new immunological reagent. The object is achieved by using, as a new immunological reagent, the monoclonal antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5, individually or in any desired combination with one another. These antibodies are secreted by the hybridomas H-BL-IgA / 1 to 5.

Description

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Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur präparativen Abtrennung sowie zur hochempfindlichen qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-lgA bzw. Antikörpern der IgA-Klasse, die in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind, anzugeben, welches außer der hohen Spezifität durch hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit sowie eine mögliche Standardisierung bei niedrigen Kosten gekennzeichnet ist.The invention has the aim of a method for the preparative separation and for the highly sensitive qualitative and quantitative determination of human IgA or IgA class antibodies that are contained in biological fluids, specify which in addition to the high specificity by high sensitivity and reproducibility and possible standardization is characterized at low cost.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-lgA in Serum und verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Schleimhautsekreten, Speichel oder Kolostrum sowie zur präparativen Isolierung von Human-lgA aus biologischen Flüssigkeiten zu schaffen, welches auf der Verwendung eines neuen immunologischen Reagens beruht.The invention has for its object to provide a method for the qualitative and quantitative determination of human IgA in serum and various body fluids such. As mucosal secretions, saliva or colostrum as well as for the preparative isolation of human IgA from biological fluids to create, which is based on the use of a new immunological reagent.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß als neues immunologisches Reagens die monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, zum Einsatz kommen.The object is achieved in that the monoclonal antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5, individually or in any combination with one another, are used as new immunological reagent.

Diese monoklonalen Antikörper haben definierte Bindungseigenschaften, wobei die Spezifität für die humane α-Kette von entscheidender Bedeutung ist. Die Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 werden von den an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig hergestellten Hybridomen H-BL-IgA/1 bis 5 sezerniert und können in praktisch ausreichender Menge zu jeder Zeit hergestellt werden.These monoclonal antibodies have defined binding properties, with specificity for the human α chain being critically important. The antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5 are secreted by the hybridomas H-BL-IgA / 1 to 5 prepared at the section Life Sciences of Karl Marx University Leipzig and can be produced in practically sufficient amount at any time.

Zur präparativen Isolierung werden die monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 bis 5 an feste Trägermaterialien gebunden. Dafür eignen sich alle bisher für die Affinitätschromatographie eingesetzten Materialien, wiez. B. Zellulose, Sepharose und dergleichen mehr. Die Ankopplung der Antikörper wird bekannterweise durch kovalente Bindung vorgenommen. Dabei ist zu prüfen, ob die Antigenbindungsfähigkeit der Antikörper erhalten bleibt. Die Antikörper, die in solcher Art unlöslich gemacht wurden, werden danach mit der IgA-haltigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Bei der dabei auftretenden Adsorption wirken sich niedrige Temperaturen zwischen +2 und +6°C günstig aus. Das an die unlöslich gemachten monoklonalen Antikörper gebundene Human- IgA wird von den nicht spezifisch gebundenen Komponenten der Ausgangsmischung freigewaschen. Durch bekannte PH-Veränderungen oder durch Verwendung von Desorbentien wird anschließend das Human-lgA vom Adsorbens abgelöst und in eine stabile, lagerungsfähige Form übergeführt.For preparative isolation, the monoclonal antibodies BL-IgA / 1 to 5 are bound to solid support materials. All the materials previously used for affinity chromatography, such as. Cellulose, sepharose and the like. The coupling of the antibodies is known to be done by covalent bonding. It must be checked whether the antigen-binding capacity of the antibodies is maintained. The antibodies which have been rendered insoluble in such a way are then brought into contact with the IgA-containing liquid. During the adsorption occurring low temperatures between +2 and + 6 ° C have a favorable effect. The human IgA bound to the insolubilized monoclonal antibodies is washed free of the non-specifically bound components of the starting mixture. By known PH changes or by the use of desorbents, the human IgA is subsequently detached from the adsorbent and converted into a stable, storable form.

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanem IgA werden als Nachweisreagens monoklonale Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander, eingesetzt, wobei sie gegebenenfalls mit einem Marker gekoppelt sind.For the qualitative and quantitative determination of human IgA, monoclonal antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5, individually or in any desired combination with one another, are used as detection reagent, wherein they are optionally coupled with a marker.

Das IgA muß dazu vorher an eine feste Phase adsorbiert werden und gegebenenfalls von störenden Begleitstoffen befreit werden. Hierzu eignet sich besonders die spezifische Bindung an ein Anti-lgA-Reagens, wie z. B. ein konventioneller heterologer Anti-lgA-Antikörper oder auch ein oder mehrere Glieder der Serie monoklonaler Antikörper BL-lgA/1 bis 5, die ihrerseits in einer bekannten Weise an einen festen Träger gekoppelt oder adsorbiert sind. Das IgA kann aber auch als Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet ist, welches selbst direkt oder indirekt an eine feste Phase gekoppelt ist, an die Testphase gebunden werden. Entscheidend ist, daß bei der technischen Ausführung immer ein Überschuß an adsorptiven Stellen an der festen Phase für das in der Testprobe enthaltene IgA bzw. Antikörper vom IgA-lsotyp vorhanden ist und somit, bei ausreichender Zeit für die Diffusion, diese Komponenten quantitativ gebunden werden. Bei Testproben mit hohen IgA-Gehalt bzw. Antikörperkonzentrationen werden solche Proportionen durch Verdünnen erreicht.The IgA must first be adsorbed to a solid phase and optionally be freed of interfering impurities. For this purpose, the specific binding to an anti-IgA reagent, such as. A conventional heterologous anti-IgA antibody, or also one or more members of the monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 series, which in turn are coupled or adsorbed to a solid support in a known manner. However, the IgA may also be bound to the test phase as an antibody directed against a particular antigen which itself is directly or indirectly coupled to a solid phase. It is crucial that in the technical embodiment, there is always an excess of adsorptive sites on the solid phase for the IgA contained in the test sample or IgA isotype antibodies present and thus, with sufficient time for diffusion, these components are quantitatively bound. For test samples with high IgA content or antibody concentrations, such proportions are achieved by dilution.

Das gebundene IgA wird dann durch monoklonale Antikörper BL-lgA/1 bis 5 nachgewiesen und/oder quantifiziert. Dazu werden die monoklonalen Antikörper selbst mit einem Marker gekoppelt. Der Marker kann kovalent oder adsorptiv angekoppelt werden. Als diesbezügliche Marker eignen sich Radioisotope, wie z. B. ^12SJod, organische Farbstoffe oder Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. Die Ankopplung dieser Marker geschieht in bekannter Art und Weise. Weiterhin ist es aber auch möglich, daß an die monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 bis 5 eine Komponente angekoppelt wird, die ihrerseits einen Marker bindet. So kann an die BL-lgA-Antikörper ein Anti-Enzym-Antikörper kovalent, z. B. durch Glutardialdehyd oder andere Methoden, gebunden werden. Es ist vorteilhaft, wenn dazu ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD verwendet wird. Dieser Chimärenantikörper ist dann in der Lage, Meerrettichperoxidase zu binden, die ihrerseits durch eine Substratumsetzung als hochempfindlicher Indikator dient.The bound IgA is then detected and / or quantified by monoclonal antibody BL-IgA / 1-5. For this, the monoclonal antibodies themselves are coupled with a marker. The marker can be covalently or adsorptively coupled. As relevant markers are radioisotopes such. As ^12S iodine, organic dyes or enzymes, such as. Alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. The coupling of these markers is done in a known manner. Furthermore, it is also possible that a component is coupled to the monoclonal antibody BL-IgA / 1 to 5, which in turn binds a marker. Thus, an anti-enzyme antibody can covalently bind to the BL-IgA antibodies, e.g. As by glutaric dialdehyde or other methods are bound. It is advantageous to use a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody of the BL-POD series. This chimeric antibody is then able to bind horseradish peroxidase, which in turn serves as a highly sensitive indicator by substrate conversion.

Es ist aber auch möglich, den zur Bestimmung des Human-lgA benutzten Antikörper BL-lgA/1 bis 5 durch Anti-Mausimmunglobuiin-Antikörperzu quantifizieren. Hierzu ist es notwendig, diesen Doppelantikörper zu markieren. Auch hierfür sind Radiosotope, Farbstoffe oder Enzyme geeignet. Eine bevorzugte Variante bestrebt in der Ankopplung von Meerrettichperoxidase.However, it is also possible to quantify the antibody BL-IgA / 1 to 5 used for the determination of human IgG by anti-mouse immunoglobulin antibodies. For this it is necessary to mark this double antibody. Radiosotopes, dyes or enzymes are also suitable for this purpose. A preferred variant endeavors in the coupling of horseradish peroxidase.

Die Herstellung eines Konjugates von Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper mit einem Anti-Enzym-Antikörper ermöglicht die Verwendung von Enzymen mit niedrigen Reinheitsgrad. Besonders geeignet zur Ankopplung sind monoklonale Anti-Enzym-Antikörper, wie z. B. die Glieder der Serie monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper BL-POD. Eine andere Variante besteht darin, daß der Indikatorantikörper BL-lgA/1 bis 5 durch eine Brücke eines Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpers mit einem Maus-Anti-F-^/m-Antikörpers gekoppelt wird, der seinerseits das jeweilige Enzym bindet, welches über die Substratumsetzung die Quantifizierung des Human-lgA gestattet. Diese Variante ist besonders dann anzuwenden, wenn ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD benutzt wird. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 weisen besonders günstige Bindungseigenschaften zum Human-lgA auf. Außerdem können die monoklonalen Anti-lgA-Antikörper ständig mit gleichen Eigenschaften reproduziert werden. Dier Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.Preparation of a conjugate of anti-mouse immunoglobulin antibody with an anti-enzyme antibody allows the use of low purity enzymes. Particularly suitable for coupling are monoclonal anti-enzyme antibodies, such as. B. the members of the series monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody BL-POD. Another variant is that the indicator antibody BL-IgA / 1 to 5 is coupled by a bridge of an anti-mouse immunoglobulin antibody with a mouse anti-F - / m antibody, which in turn binds the respective enzyme, which the substrate conversion allows the quantitation of human IgA. This variant is particularly applicable when a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody series BL-POD is used. The monoclonal antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5 have particularly favorable binding properties to human IgA. In addition, the monoclonal anti-IgA antibodies can be constantly reproduced with the same properties. The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.

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applications

Beispiel 1: Bestimmung der Konzentration von Human-lgA in Körperflüssigkeiten oder in Zellkulturüberständen durch den monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgA mittels Festphasenradioimmuntechnik.Example 1: Determination of the concentration of human IgA in body fluids or in cell culture supernatants by the BL-IgA series monoclonal antibody by means of solid-phase radioimmunoassay technique.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvin ylchlorid) werden mit dem monoklonalen Antikörper BL-lgA/2 beschichtet. Dazu werden die Vertiefungen der Platte mit BL-lgA/2 (1-5цд/тІ) gefüllt und für 12h bei +4⁰C inkubiert.1. Microplates of plastic (polystyrene or Polyvin yl chloride) are coated with the monoclonal antibody BL-IgA / 2. For this purpose, the wells of the plate with BL-IgA / 2 (1-5KD / тІ) are filled and incubated for 12h at +4 ⁰ C.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS (0,15 M NaCI, 0,01 M Phosphat, pH 7,4).2. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS (0.15 M NaCl, 0.01 M phosphate, pH 7.4).

3. Blockierung unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatatem Kälberserum für 15min.3. Block unoccupied adsorptive binding sites of the plastic by incubation with 2% neonatal calf serum for 15 min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.4. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

5. Herstellen einer Verdünnungsreihe von gereinigtem Human-lgA (0,1 ng/ml bis 1цд/тІ). Von der Testprobe werden ebenfalls Verdünnungen hergestellt, die im optimalen Meßbereich der Methode liegen, wenn die IgA-Konzentration zu hoch ist. Die Verdünnung des IgA-Standards und der Testproben erfolgt in 1 % neonatalem Kälberserum. Jeweils 100μΙ der einzelnen Konzentrationsstufen des IgA-Standards und der Testprobe werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingefüllt und für 12 h bei +4⁰C inkubiert.5. Prepare a dilution series of purified human IgA (0.1 ng / ml to 1ct / тІ). Dilutions are also made from the test sample which are within the optimal range of the method if the IgA concentration is too high. The dilution of the IgA standard and the test samples is carried out in 1% neonatal calf serum. Each 100μΙ of the individual concentration levels of the IgA standard and the test sample are filled into the wells of the microtiter plate and incubated for 12 h at +4 ⁰ C.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.6. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

7. Zugabe von jeweils 100μΙ des ¹²⁵J-markierten monoklonalen Antikörpers BL-lgA/1 und Inkubation für4-12h bei +4⁰C zur Quantifizierung des gebundenen Human-lgA. Statt des markierten BL-lgA/1 kann auch ein Antikörper verwendet werden, der eine Determinante erkennt, die auf der L-Kette lokalisiert ist (z. B. mit dem Anti-L-Ketten Antikörper BL-Ig-L/1.).7. Addition of 100 μM of the ¹²⁵ I-labeled monoclonal antibody BL-IgA / 1 and incubation for 4 to 12 h at +4 ⁰ C to quantitate the bound human IgA. Instead of the labeled BL-IgA / 1, it is also possible to use an antibody which recognizes a determinant located on the L chain (eg with the anti-L chain antibody BL-Ig-L / 1). ,

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.8. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

9. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette. 10. Aufstellung einer Eichkurve an Hand der Zählraten der Vertiefungen mit den unterschiedlichen IgA-9. Measurement of the radioactivity bound in the individual wells in a gamma-ray measuring chain. 10. Preparation of a calibration curve based on the counting rates of the wells with the different IgA

Standardkonzentrationen. Die Konzentration des IgA in der Testprobe wird an Hand der jeweiligen Zählrate mittels der aufgestellten E ich kurve ermitteltStandard concentrations. The concentration of IgA in the test sample is determined on the basis of the respective counting rate by means of the established curve

Beispiel 2: Bestimmung der Konzentration von Human-lgA durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 mit Festphasenradioimmunassay. Example 2: Determination of the concentration of human IgA by the monoclonal antibody BL-IgA / 1 with solid phase radioimmunoassay.

1.-4. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 4 des Beispiels 1, wobei jedoch statt des monoklonalen Antikörpers BL-lgA/2 der BL-lgA/1 verwendet wird.1st-4th The same procedure as in items 1 to 4 of Example 1 except that instead of the monoclonal antibody BL-IgA / 2 the BL-IgA / 1 is used.

5. Zugabe von jeweils 100 μΙ verschiedener Konzentration von Human-lgA (0,1 ng/ml bis 100 ng/ml, der Verdünnungslösung allein und der Testprobe, eventuell in verschiedenen Verdünnungsstufen. Dazu werden 100 μΙ ^12SJ-markiertes Human-lgA in geeigneter Konzentration pipettiert. Die beiden Komponenten werden durch Vibration gemischt und anschließend erfolgt die Inkubation für 12h bei +4⁰C.5. Add 100 μΙ each of various concentrations of human IgA (0.1 ng / ml to 100 ng / ml, the dilution solution alone and the test sample, possibly at different dilution levels, using 100 μΙ of ^12S J-labeled human IgA in The two components are mixed by vibration and then incubated for 12 h at +4 ⁰ C.

7. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette.7. Measurement of the radioactivity bound in the individual wells in a gamma-ray measuring chain.

8. Aufstellung einer Eichkurve durch Auftragen des B/B₀-Quotienten gegen die Konzentration des zur Hemmung eingesetzten IgA-Standards. Der B/B₀-Quotient entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen ¹²⁵J-markierten Human-lgA bei Anwesenheit und Fehlen von nichtmarkierten IgA.8. Preparation of a calibration curve by plotting the B / B ₀ ratio against the concentration of the IgA standard used for the inhibition. The B / B ₀ ratio corresponds to the ratio of the count rate of the bound ¹²⁵ I-labeled human IgA in the presence and absence of unlabelled IgA.

9. Bestimmung der Konzentration des in der Testprobe enthaltenem Human-lgA an Hand des jeweiligen B/B₀-Üuotienten und der Eichkurve.9. Determination of the concentration of human IgA contained in the test sample on the basis of the respective B / B ₀ -Uuotienten and the calibration curve.

Beispiel 3: Bestimmung von IgA-Antikörpem gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 mittels Enzymimmunbrückentechnik.Example 3 Determination of IgA Antibodies Against the Hemagglutinin Antigen of the Influenza Virus by the Monoclonal Antibody BL-IgA / 1 Using Enzyme Immuno-bridging Technique.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvinylchlorid) werden mit dem Hämagglutininantigen des Influenzavirus beschichtet, indem dieses in Gebrauchskonzentration in die Vertiefungen der Platte eingefüllt und für 12 h bei +4°C inkubiert wird.1. Microtiter plates made of plastic (polystyrene or polyvinyl chloride) are coated with the hemagglutinin antigen of the influenza virus by filling this in use concentration in the wells of the plate and incubating for 12 h at + 4 ° C.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.2. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

3. Blockierung unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatalem Kälberserum für 15min.3. Block unoccupied adsorptive binding sites of the plastic by incubation with 2% neonatal calf serum for 15 min.

5. Zugabe von jeweils 100μΙ5. Addition of 100μΙ each

a) verschiedener Verdünnungsstufen eines IgA-anti-Hämagglutinin-Antikörper enthaltendes Referenzserums (Positivkontrolle),a) different levels of dilution of an IgA anti-hemagglutinin antibody-containing reference serum (positive control),

b) verschiedener Verdünnungsstufen eines Normalserums (Negativkontrolle),b) different dilution levels of a normal serum (negative control),

c) verschiedener Verdünnungsstufen der Testprobec) different dilution levels of the test sample

Inkubation für 12h bei +4⁰C.Incubation for 12 h at +4 ⁰ C.

'. Zugabe von jeweils 100μΙ BL-lgA/1 in Gebrauchskonzentration (ca.50ng/ml). Inkubation für 2-4h bei +4⁰C.'. Add 100 μL BL-IgA / l each at use concentration (approx. 50ng / ml). Incubation for 2-4h at +4 ⁰ C.

9. Zugabe von jeweils 100μΙ Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchskonzentration (ca. 1 -.200 verdünnt). Inkubation für 1 h bei +4⁰C.9. Add 100μΙ goat anti-mouse immunoglobulin serum at the concentration of use (approx. 1-200 diluted). Incubate for 1 h at +4 ⁰ C.

10. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.10. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

11. Zugabe von jeweils 100μΙ monoklonalem Anti- Meerrettichperoxidase-Antikörper BL-POD/11 in Gebrauchskonzentration (ca.50ng/ml). Inkubation für 1 h bei +4°C.11. Addition of 100 μM monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody BL-POD / 11 in use concentration (about 50 ng / ml). Incubate for 1 h at + 4 ° C.

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12. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.12. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

13. Zugabe von jeweils 100 μΙ Meerrettichperoxidase in Gebrauchskonzentration. Es können weniger gereinigte Präparate des Enzyms verwendet werden. Inkubation für 1 h bei +4⁰C.13. Addition of 100 μΙ horseradish peroxidase in use concentration. Less purified preparations of the enzyme can be used. Incubate for 1 h at +4 ⁰ C.

14. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.14. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

15. Zugabe von jeweils 100μΙ Substratgemisch, bestehend aus H₂O₂ und ortho-Phenylendiamin.15. Addition of 100 .mu.Ι Substrate mixture, consisting of H ₂ O ₂ and ortho-phenylenediamine.

16. Nach 5-60min Entwicklungszeit wird die Substratumsetzung durch Zugabe von 100 μΙ 4N H₂SO₄ abgestoppt und die Extinktion photometrisch bestimmt.16. After a development time of 5-60 min, the substrate conversion is stopped by addition of 100 μM 4N H ₂ SO ₄ and the extinction is determined photometrically.

17. Feststellen des IgA-anti-Hämagglutinin-Titers an Hand der Extinktionswerte der Verdünnungsstufen des Testserums im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle.17. Determination of the IgA anti-hemagglutinin titer by means of the extinction values of the dilution steps of the test serum compared to the negative and positive controls.

Beispiel 4: Bestimmung von IgA-Antikörpern gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalenExample 4 Determination of IgA Antibodies to the Hemagglutinin Antigen of the Influenza Virus by the Monoclonal

Antikörper BL-lgA/1, der kovalent mit Peroxidase gekoppelt istAntibody BL-IgA / 1 covalently linked to peroxidase

1.-6. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 6 des Beispieles 3 1st-6th Same procedure as in items 1 to 6 of Example 3

7. Zugabe von jeweils 100μΙ BL-lgA/1, an den hochgereinigte Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Die Kopplung kann mit 7. Addition of 100 μL BL-IgA / 1 to which highly purified horseradish peroxidase is coupled. The coupling can with

Glutardialdehyd oder Perjodat ausgeführt werden. Inkubation für 2h bei +4⁰C. 8.-11. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 14 bis 17 des Beispieles 3Glutaric dialdehyde or periodate be performed. Incubation for 2h at +4 ⁰ C. 8.-11. Same procedure as in items 14 to 17 of Example 3

Beispiel 5: Nachweis von membrangebundenen oder zytoplasmatischen IgA von Lymphozyten durch den monoklonalen Antikörper BL-lgA/1 und indirekte Immunfluoreszenz. Example 5: Detection of membrane-bound or cytoplasmic IgA of lymphocytes by the monoclonal antibody BL-IgA / 1 and indirect immunofluorescence.

1. Mikroskopobjektträger aus Glas werden mit einer geeigneten polykationischen Substanz zur Vermittlung der Adhärenz lebender Zellen beschichtet.1. Glass microscope slides are coated with a suitable polycationic substance to mediate the adherence of living cells.

2. Auf die so beschichteten Objektträger werden 20 μΙ der zu untersuchenden Zellsuspension (1 — 5- 10^е Zellen/ml) auf getropft. Nach 30min noch nicht adhärierende Zellen werden durch kurzes Eintauchen in PBS abgespült.20 μΙ of the cell suspension to be examined to be 2. On the thus-coated slides (1 - 10 5- ^е cells / ml) dropwise. After 30 min non-adherent cells are rinsed by brief immersion in PBS.

3. Fixierung der Zellen für 10min mit Methanol. Anschließend wird in PBS gespült.3. Fix the cells for 10min with methanol. Then it is rinsed in PBS.

4. Inkubation der adhärierenden Zellen für 30 min mit 20μΙ BL-lgA/1 in Gebrauchskonzentration (ca. 10μg/ml). Diese Inkubation wird bei +4⁰C in einer feuchten Kammer ausgeführt.4. Incubate the adherent cells for 30 min with 20 μL BL-IgA / 1 in use concentration (about 10 μg / ml). This incubation is carried out at +4 ⁰ C in a humid chamber.

5. Spülen in PBS durch dreimaligen Wechsel.5. Rinse in PBS by changing three times.

6. Inkubation der Zellen mit 20μΙ FITC-Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Antikörpemfür 1 h bei +4⁰C in einer feuchten Kammper.6. Incubation of the cells with 20μΙ FITC-goat anti-mouse immunoglobulin Antikörpemfür 1 hour at +4 ⁰ C in a humidified Kammper.

7. Wiederholung von Punkt 5.7. Repeat of point 5.

8. Eindecken und sofortige fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder vorherige Anfertigung von Dauerpräparaten. Beispiel 6: Immunhistologischer Nachweis von Zellen mit zytoplasmatischem IgA durch den monoklonalen Antikörper8. Cover and immediate fluorescence microscopy evaluation or previous preparation of persuasive preparations. Example 6: Immunohistological detection of cells with cytoplasmic IgA by the monoclonal antibody

BL-lgA/1 und indirekte ImmunfluoreszenzBL-IgA / 1 and indirect immunofluorescence

1. Von dem zu untersuchenden Gewebe werden 5μσι starke Kryostatschnitte hergestellt und auf vorbereitete Mikroskopobjektträger aufgezogen. 1. Of the tissue to be examined 5μσι strong cryostat sections are prepared and mounted on prepared microscope slides.

2.-7. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 3 bis 8 des Beispieles 52.-seventh Same procedure as in points 3 to 8 of Example 5

Beispiel 7: Präparative Abtrennung von Human-lgA aus Vollserum mittels trägerfixiertem monoklonalem Antikörper BL-lgA/1. Example 7 Preparative separation of human IgA from whole serum by means of carrier-fixed monoclonal antibody BL-IgA / 1.

1. Sepharose4Bwird nach der Methode von PORATH et al. (Nature 215 [1967] 1491) mit Zyanbromid aktiviert. Zu 30ml gepackter aktivierter Sepharose werden 100 mg BL-lgA/1 gegeben und angekoppelt. Nach Waschen mit PBS werden reaktive Gruppen durch Behandlung für 1 h mit 0,1 % Ethanolamin geblockt. Anschließend wird mit 0,05% Tween 20/PBS gewaschen und die BL- lgA/1-beladene Sepharose in eine Säule gepackt.1. Sepharose4B is prepared by the method of PORATH et al. (Nature 215 [1967] 1491) activated with cyanogen bromide. To 30 ml of packed activated Sepharose, 100 mg of BL-IgA / 1 are added and coupled. After washing with PBS, reactive groups are blocked by treatment for 1 h with 0.1% ethanolamine. It is then washed with 0.05% Tween 20 / PBS and the BL-lgA / 1-loaded Sepharose packed in a column.

2. Langsames Überleiten von 200 ml Humanvollserum bei +4⁰C. Waschen mit 0,05%Tween 20/PBS im Durchflußverfahren bis die Waschlösung proteinfrei ist.2. Slow passing through 200 ml human whole serum at +4 ⁰ flowthrough until the wash solution is free of protein C. washing with 0.05% Tween 20 / PBS.

3. Elution mitO,5MGIyzin/HCI-Puffer(pH2,8). Sofortige Neutralisation des Eluats und Dialyse gegen PBS. Anschließend Einengung durch Ultrafiltration und Bestimmung der IgA-Konzentration sowie der Reinheit.3. Elution with O, 5M glycine / HCI buffer (pH 2.8). Immediate neutralization of the eluate and dialysis against PBS. Then concentration by ultrafiltration and determination of IgA concentration and purity.

Claims

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Invention claim:

1. A method for the qualitative and quantitative determination of human IgA, characterized in that as a detection reagent monoclonal antibodies of the series BL-lgA / 1-5, which react with alpha-chain-specific determinants, individually or in any combination with each other, optionally with coupled to a marker can be used for direct and indirect detection reactions.

2. The method according to item 1, characterized in that by direct, kovafente or adsorptive coupling of a marker, such as. A radioisotope, an organic dye, an enzyme or an anti-enzyme antibody to a member of the monoclonal antibody series BL-IgA / 1 to 5, which is used as an indicator reagent for the detection or quantitative determination of human IgA.

3. The method according to item 1, characterized in that serving as Indicator Reagent for human IgA member of the series BL-IgA / 1 to 5 is detected by a component which reacts specifically with this and is directly provided with a marker, or such bind directly or indirectly.

4. The method according to item 1,2 and 3, characterized in that members of the monoclonal antibody series BL-IgA / 1 to 5 individually or in combination with each other, coupled directly or indirectly with a marker, for the detection and quantitative determination of antigen-specifically bound IgA -Antikörpem, which are adsorbed to a loaded with the antigen test phase can be used.

5. The method according to item 1,2 and 3, characterized in that members of the monoclonal antibody series 3L-IgA / 1 to 5 individually or in combination with each other, coupled directly or indirectly with a marker, be used for the detection or quantitative determination of IgA which has been specifically bound by either BL-lgA / 1-5 series members or another immunological anti-IgA reagent which itself is coupled to a solid support.

6. The method according to item 1,2,4 and 5, characterized in that the members of the series BL-lgA / 1 to 5 are labeled by methods known per se with ¹²⁵ JOd.

7. The method according to item 1,2,4 and 5, characterized in that the members of the series BL-IgA / 1 to 5 are coupled with an anti-enzyme antibody according to known methods.

8. The method according to item 7, characterized in that a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody series BL-POD is used.

9. The method according to item 1,2,4 and 5, characterized in that an enzyme is coupled according to known methods.

10. The method according to item 9, characterized in that horseradish peroxidase is coupled.

11. The method according to item 1,3,4 and 5, characterized in that an enzyme-anti-mouse immunoglobulin antibody conjugate is prepared by a method known per se and used to detect the indicator reagents of the series BL-lgA / 1 to 5 becomes.

12. The method according to item 11, characterized in that a horseradish peroxidase-anti-mouse immunoglobulin conjugate is used.

13. The method according to item 1,3,4 and 5, characterized in that a conjugate of anti-enzyme antibodies and anti-mouse immuno-inulin is prepared by a known method and for the detection of the indicator reagents of the series BL-lgA / 1 to 5 is used.

14. The method according to item 13, characterized in that a conjugate of anti-mouse immunoglobulin and a member of the monoclonal antibody series BL-POD is used.

15. The method according to item 1,2,3,4 and 5, characterized in that the indicator reagents for IgA series BL-IgA / 1 to be detected or quantified by an enzyme (anti-enzyme-antibody) complex, the is immunospecifically coupled through a bridge of anti-mouse immunoglobulin antibodies.

16. The method according to item 15, characterized in that a horseradish peroxidase anti-peroxidase complex is used which contains monoclonal anti-peroxidase antibodies of the BL-POD series.

Field of application of the invention

The invention relates to a method for the qualitative and quantitative determination and for the preparation of human IgA. The invention is for the determination of IgA or antibodies of the IgA isotype in body fluids of patients, which is of importance for the diagnosis of various diseases.

Characteristic of the known technical solutions

For the qualitative and quantitative determination of IgA mainly precipitation reactions are used. Mancini radial immunodiffusion and nephelometric quantitative methods are widely used. All of these methods are based on the specific binding of Jes human IgA by a heterologous anti-IgA serum. The specificity and avidity of this antiserum is responsible for the accuracy, sensitivity and reproducibility of the method of determination. Conventional antisera, however, is subject to the general drawback that the quality of antisera varies from animal to animal and even from blood sampling to blood sampling in the same donor animal. In addition, the antiserum of a single blood sample is sufficient only for a limited number of determinations. The nephelometric detection techniques are tied to costly equipment that is not standard equipment in clinical immunology facilities. Although Mancini's radial immunodiffusion works without these devices, it is less sensitive. In addition, the quantitative determination, which is based on the measurement of the size of the precipitation sites, which occur in the radial diffusion of the IgA contained in the test sample in an anti-IgA serum gel, among other things, on the molecular weight of the antigen is affected. The molecular weight, however, is not uniform in IgA since it can occur in both monomeric form (H ₂ L2 molecule with a sedimentation value of 7S) and in polymeric forms of 9,11,13 and 17S. Since the proportion of these forms in the test samples is different, the comparison with similar standards can not remedy this shortcoming.

Another shortcoming of the conventional methods is that they are not designed for the determination of antibodies of the IgA isotype to any antigen. The preparation of IgA is carried out in a known combination of various biochemical methods including salt precipitation, various forms of electrophoresis, and ion exchange chromatographies. These methods are very time and material consuming.