DD236178A1

DD236178A1 - PROCESS FOR DETERMINING OR BZW. PRAEPARATION OF HUMAN SEKRETORIC IGA AND HUMAN SECRETOR COMPONENT

Info

Publication number: DD236178A1
Application number: DD27498685A
Authority: DD
Inventors: Berthold Seidel; Jeanette Maeck; Helmut Fiebig
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1985-04-09
Filing date: 1985-04-09
Publication date: 1986-05-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Praeparation von sIgA und Humaner Sekretorischer Komponente. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur praeparativen Abtrennung sowie zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-sIgA und HSC sowie von Antikoerpern des sIgA-Typs aus biologischen Fluessigkeiten anzugeben, das sich durch hohe Spezifitaet, hohe Sensitivitaet, Reproduzierbarkeit sowie eine moegliche Standardisierung auszeichnet. Die Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von sIgA bzw. HSC in verschiedenen Koerperfluessigkeiten sowie zur praeparativen Isolierung von Human-sIgA bzw. HSC aus biologischen Fluessigkeiten zu schaffen, welches auf der Verwendung eines neuen immunologischen Reagens beruht. Die Aufgabe wird geloest, indem als neues immunologisches Reagens die monoklonalen Antikoerper der Serie BL-HSC/1 bis 3, einzeln oder kombiniert, zum Einsatz kommen. Diese Antikoerper werden von den Hybridomen H-BL-HSC/1 bis 3 sezerniert.The invention relates to a method for the determination and preparation of sIgA and human secretory component. The aim is to provide a method for the preparative separation and for the qualitative and quantitative determination of human sIgA and HSC as well as antibodies of sIgA type from biological fluids, which is characterized by high specificity, high sensitivity, reproducibility and a possible standardization. The object is to provide a method for the qualitative and quantitative determination of sIgA or HSC in different body fluids as well as for the preparative isolation of human sIgA or HSC from biological fluids, which is based on the use of a new immunological reagent. The object is achieved by using, as a new immunological reagent, the monoclonal antibodies of the series BL-HSC / 1 to 3, individually or in combination. These antibodies are secreted by the hybridomas H-BL-HSC / 1 to 3.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung sowie zur Präparation von menschlichem sekretorischem IgA und der Humanen Sekretorischen Komponente. Die Erfindung ermöglicht die Bestimmung von sekretorischem IgA bzw. Antikörpern des slgA-Typs in Körperflüssigkeiten, was Bedeutung für die Diagnostik verschiedener Erkrankungen hat.The invention relates to a method for the qualitative and quantitative determination and for the preparation of human secretory IgA and the human secretory component. The invention makes it possible to determine secretory IgA or antibodies of the slgA type in body fluids, which has significance for the diagnosis of various diseases.

Characteristic of the known technical solutions

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von slgA und HSC kommen in erster Linie Präzipitationsreaktionen zum Einsatz. Neben der Methode der radialen Immundiffusion nach MANCINI kommen auch nephelometrische Methoden in Betracht. Alle diese Methoden haben ihre Grundlage in der spezifischen Bindung des humanen slgA bzw. der HSC durch heterologe Antiseren. Spezifität und Avidität dieser Antiseren bestimmen die Genauigkeit, die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethoden. Solche konventionellen Antiseren haben jedoch den generellen Nachteil, daß ihre Qualität von Tier zuFor the qualitative and quantitative determination of slgA and HSC precipitation reactions are used in the first place. Besides the method of radial immunodiffusion according to MANCINI, nephelometric methods are also possible. All of these methods have their basis in the specific binding of human slgA or HSC by heterologous antisera. The specificity and avidity of these antisera determine the accuracy, sensitivity and reproducibility of the methods of determination. However, such conventional antisera have the general disadvantage of increasing their quality from animal to animal

Tier, selbst von Blutabnahme zu Blutabnahme beim gleichen Tier Schwankungen unterliegt. Außerdem ist das Antiserum einer einmaligen Blutabnahme nur für eine limitierte Zahl von Bestimmungen ausreichend.Animal, even from blood loss to blood collection in the same animal is subject to fluctuations. In addition, the antiserum of a single blood sample is sufficient only for a limited number of determinations.

Nephelometrische Messungen setzen eine kostenintensive apparative Ausrüstung voraus, die nicht zu denNephelometric measurements require costly equipment that is not one of the

Standardausrüstungen in klinisch-immunologischen Einrichtungen gehört. Die MANCINI-Technik ist zwar nicht an solchenStandard equipment in clinico-immunological facilities. The MANCINI technique is not on such

apparativen Aufwand gebunden, erreicht aber weniger Sensitivität. Dazu kommt, daß die quantitative Bestimmung, die auf derbut it achieves less sensitivity. In addition, the quantitative determination made on the

Messung der Durchmesser der Präzipitationshöfe beruht, welche bei der radialen Diffussion des in der Testprobe enthaltenenMeasurement of the diameter of the precipitation court is based, which in the radial diffusion of the contained in the test sample

Antigens in das antiserumhaltige Gel auftreten, auch vom Molekulargewicht des betreffenden Antigens beeinflußt wird. DiesesAntigen in the antiserum gel, is also affected by the molecular weight of the antigen in question. This

ist beim IgA jedoch nicht einheitlich, da neben der monomeren Form (Sedimentationswert von 7 S) auch Aggregate von 9,11,13is not uniform in the case of IgA, however, because in addition to the monomeric form (sedimentation value of 7 S) also aggregates of 9,11,13

und 17 S auftreten können. Da der Anteil dieser Formen in den Testproben unterschiedlich ist, kann auch der Vergleich mit ähnlichen Standards diesen Mangel nicht beheben.and 17 S can occur. Since the proportion of these forms in the test samples is different, the comparison with similar standards can not remedy this shortcoming.

Ein weiterer Mangel der üblichen Verfahren besteht darin, daß sie nicht für die Bestimmung von Antikörpern des slgA-Typs gegen ein beliebiges Ag ausgelegt sind.'Another shortcoming of the conventional methods is that they are not designed for the determination of slgA-type antibodies to any Ag.

Die Präparation von slgA und HSC wird in einer bekannten Kombination verschiedener biochemischer Methoden, einschließlichThe preparation of SLGA and HSC is performed in a known combination of various biochemical methods, including

Aussalzung, verschiedener Formen von Gelfiltration, lonenaustauschchromatografie und Elektrophoresen, ausgeführt. Diese Methoden sind relativ zeit- und materialaufwendig.Salting out, various forms of gel filtration, ion exchange chromatography and electrophoreses. These methods are relatively time and material consuming.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur präparativen Abtrennung sowie zur hochempfindlichen qualitativen und quantitativen Bestimmung von sekretorischem IgA und Sekretorischer Komponente sowie von Antikörpern des slgA-Typs, die in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind, anzugeben, welches außer der hohen Spezifität durch hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine mögliche Standardisierung bei niedrigen Kosten gekennzeichnet ist.The invention aims to provide a process for the preparative separation and for the highly sensitive qualitative and quantitative determination of secretory IgA and secretory component and of antibodies of the SLGA type, which are contained in biological fluids, which in addition to the high specificity by high sensitivity and Reproducibility and possible standardization at low cost.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanem slgA und von Humaner Sekretorischer Komponente in verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie z. B. in mucösen Sekreten, in Speichel oder Kolostrum sowie zur präparativen Isolierung von slgA und HSC aus biologischen Flüssigkeiten zu schaffen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Verfahrensdurchführung ein neues immunologisches Reagens eingesetzt wird, das monoklonal Antikörper der Serie BL-HSC/1 bis 3, einzeln oder kombiniert, enthält. Die o.g. monoklonalen Antikörper haben definierte Bindungseigenschaften, wobei die Spezifität für eine Α-Determinante der Sekretorischen Komponente von entscheidender Bedeutung ist. Die Antikörper der Serie BL-HSC/1 bis 3 werden von den hergestellten Hybridomen H-BL-HSC 1 bis 3 sezerniert und können in praktisch ausreichender Menge zu jeder Zeit hergestellt werden.The invention has for its object to provide a method for the qualitative and quantitative determination of human slgA and of human secretory component in various body fluids such. As in mucous secretions, in saliva or colostrum and for the preparative isolation of slgA and HSC from biological fluids to create. The object is achieved according to the invention in that a new immunological reagent is used to carry out the process, which contains monoclonal antibodies of the series BL-HSC / 1 to 3, individually or in combination. The o.g. Monoclonal antibodies have defined binding properties, with specificity for a Α-determinant of the secretory component being of crucial importance. The antibodies of the series BL-HSC / 1 to 3 are secreted by the produced hybridomas H-BL-HSC 1 to 3 and can be prepared in practically sufficient amount at any time.

Zur präparativen Isolierung von HSC oder slgA werden die monoklonalen Antikörper BL-HSC/1 bis 3 an feste Trägermaterialien (für die Affinitätschromatografie üblichen Materialien wie z. B. Sepharose, Zellulose u. dgl.) gebunden. Die Ankopplung der Antikörper wird bekannterweise durch kovalente Bindung vorgenommen. Dabei ist die Antigenbindungsfähigkeit zu überprüfen. Die in solcher Art unlöslich gemachten Antikörper werden danach mit der slgA- bzw. HSC-haltigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Bei der dabei auftretenden Adsorption sind niedrige Temperaturen zwischen +2⁰C und +4⁰C von Vorteil. Das an die unlöslich gemachten monoklonalen Antikörper spezifisch gebundene Antigen wird von den nicht spezifisch gebundenen Komponenten des Ausgangsmaterials freigewaschen. Durch pH-Veränderungen oder durch Einwirken von Desorbentien wird im Elutionsschritt das slgA bzw. die HSC vom Adsorbens abgelöst und in eine stabile, lagerungsfähige Form überführt. Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanem slgA bzw. HSC werden monoklonale Antikörper der Serie BL-HSC/1 bis 3, einzeln oder kombiniert, verwendet, wobei sie gegebenenfalls mit einem Marker gekoppelt sein können. Das slgA bzw. die HSC muß dazu vorher an eine feste Phase, beispielsweise PVC, adsorbiert werden und gegebenenfalls von störenden Begleitstoffen befreit werden. Das kann insbesondere durch die spezifische Bindung an ein Anti-HSC-Reagens, wie z. B. an einen konventionellen heterologen Anti-HSC-Antikörper realisiert werden oder auch durch Bindung an einen monoklonalen Antikörper der Serie BL-HSC/1 bis 3 und im Falle des slgA-Nachweises auch an einen monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5. Diese Antikörper sind ihrerseits in an sich bekannter Weise an einen festen Träger adsorbiert. Das slgA kann andererseits aber auch als Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet ist, in das Testsystem eingehen. Dabei ist das Antigen selbst entweder direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden. Entscheidend ist, daß bei der technischen Ausführung immer ein Überschuß an adsorptiven Stellen an der festen Phase für das in der Probe enthaltene slgA bzw. HSC bzw. Antikörper vom slgA-Typ vorhanden ist. Damit ist gewährleistet, daß bei ausreichender Zeit für die Diffusion, die nachzuweisenden Komponenten quantitativ gebunden werden. Bei Testproben mit hohem slgA- bzw. HSC werden solche Proportionen durch Verdünnen erreicht. Das gebundene slgA bzw. die HSC wird dann durch monoklonale Antikörper BL-HSC/1 bis 3 nachgewiesen und/oder quantifiziert. Im Falle des slgA-Nachweises können auch monoklonale Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 zum Einsatz gelangen. Dazu werden die monoklonalen Antikörper selbst mit einem Marker gekoppelt, welcher kovalent oder adsorptiv mit dem Immunglobulinmolekül verbunden sein kann. Als diesbezügliche Marker sind geeignet radioaktive Isotope, wie z. B. ¹²⁵I, aber auch Farbstoffe oder Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. Die Ankopplung dieser Marker geschieht in bekannter Art und Weise.For the preparative isolation of HSC or slgA, the monoclonal antibodies BL-HSC / 1 to 3 are bound to solid support materials (materials customary for affinity chromatography, such as, for example, Sepharose, cellulose and the like). The coupling of the antibodies is known to be done by covalent bonding. The antigen binding ability is to be checked. The insolubilized antibodies are then brought into contact with the slgA- or HSC-containing liquid. In the adsorption occurring low temperatures between +2 ⁰ C and +4 ⁰ C are advantageous. The antigen specifically bound to the insolubilized monoclonal antibodies is washed free of the non-specifically bound components of the starting material. As a result of pH changes or the action of desorbents, the slgA or HSC is detached from the adsorbent in the elution step and converted into a stable, storable form. For the qualitative and quantitative determination of human slgA or HSC, monoclonal antibodies of the series BL-HSC / 1 to 3, individually or in combination, are used, wherein they may optionally be coupled with a marker. The slgA or HSC must be previously adsorbed to a solid phase, such as PVC, and optionally be freed of interfering impurities. This may in particular by the specific binding to an anti-HSC reagent such. B. to a conventional heterologous anti-HSC antibody or by binding to a monoclonal antibody series BL-HSC / 1 to 3 and in the case of slgA detection also to a monoclonal antibody of the series BL-lgA / 1 to 5. These antibodies are in turn adsorbed in a conventional manner to a solid support. On the other hand, the slgA can also enter the test system as an antibody directed against a particular antigen. The antigen itself is bound either directly or indirectly to a solid phase. It is crucial that in the technical embodiment, there is always an excess of adsorptive sites on the solid phase for the slgA or HSC or slgA-type antibodies contained in the sample. This ensures that, with sufficient diffusion time, the components to be detected are quantitatively bound. For test samples with high slgA or HSC, such proportions are achieved by dilution. The bound slgA or HSC is then detected and / or quantified by monoclonal antibody BL-HSC / 1 to 3. In the case of slgA detection, monoclonal antibodies of the series BL-IgA / 1 to 5 can also be used. For this purpose, the monoclonal antibodies themselves are coupled to a marker which may be covalently or adsorptively linked to the immunoglobulin molecule. As such markers are suitable radioactive isotopes such. B. ¹²⁵ I, but also dyes or enzymes, such as. Alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. The coupling of these markers is done in a known manner.

Weiterhin ist es aber auch möglich, daß an die monoklonalen Antikörper BL-HSC/1-3 eine Komponente angekoppelt wird, die ihrerseits einen Marker, ζ. B. ein Enzym, bindet. So kann an die BL-HSC-Antikörper kovalent, z. B. durch Glutardialdehyd oder andere Methoden, ein Anti-Enzym-Antikörper gebunden werden. Es ist von Vorteil, wenn dazu ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD Verwendung findet. Dieser Chimärenantikörper ist dann in der Lage, Meerrettichperoxidase spezifisch zu binden, die sich leicht mit Hilfe der entsprechenden Substratumsetzung nachweisen läßt. Es ist aber auch möglich, den zur Bestimmung des slgA bzw. der HSC benutzten monoklonalen Antikörpers BL-HSC/1 bis 3 durch Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper zu quantifizieren. Hierzu ist es notwendig, diesen Doppelantikörper zu markieren. AuchFurthermore, it is also possible that a component is coupled to the monoclonal antibody BL-HSC / 1-3, in turn, a marker, ζ. As an enzyme binds. Thus, the BL-HSC antibodies covalently, z. As by glutaric dialdehyde or other methods, an anti-enzyme antibody can be bound. It is advantageous to use a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody of the BL-POD series. This chimeric antibody is then able to specifically bind horseradish peroxidase, which can easily be detected with the aid of the corresponding substrate conversion. However, it is also possible to quantify the monoclonal antibody BL-HSC / 1 to 3 used to determine the slgA or the HSC by anti-mouse immunoglobulin antibodies. For this it is necessary to mark this double antibody. Also

hier empfiehlt sich der Einsatz solcher Marker wie Radioisotope, Farbstoffe und Enzyme. Eine bevorzugte Variante besteht in der Ankopplung von Meerrettichperoxidase.Here, the use of such markers as radioisotopes, dyes and enzymes is recommended. A preferred variant consists in the coupling of horseradish peroxidase.

Die Herstellung eines Konjugates von Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper mit einem Anti-Enzym-Antikörper ermöglicht die Verwendung von Enzymen mit niedrigem Reinheitsgrad. Besonders geeignet zur Ankopplung sind monoklonale Antikörper gegen Meerrettichperoxidase, wie z. B. die Glieder der Serie BL-POD.Preparation of a conjugate of anti-mouse immunoglobulin antibody with an anti-enzyme antibody allows the use of low purity enzymes. Particularly suitable for coupling are monoclonal antibodies to horseradish peroxidase, such as. As the members of the series BL-POD.

Eine andere Variante besteht darin, daß der Indikatorantikörper BL-HSC/1 bis 3 durch eine Brücke eines Anti-Mausimmuriglobulin-Aiitikörpers mit einem Maus-Anti-Enzym-Antikörper gekoppelt wird, der seinerseits das jeweilige Enzym bindet, welches über die Substratumsetzung die Quantifizierung des slgA bzw. der HSC gestattet. Diese Variante ist besonders dann anzuwenden, wenn ein monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BI-POD benutzt wird. Die monoklonalen Antikörper BL-HSC/1 bis 3 weisen besonders günstige Bindungseigenschaften zum humanen slgA bzw. zur HSC auf. Außerdem können die mbnoklonalen Anti-HSC-Antikörper ständig mit gleichen Eigenschaften reproduziert werden. Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.Another variant is that the indicator antibody BL-HSC / 1 to 3 is coupled by a bridge of an anti-mouse immunoglobulin antibody body with a mouse anti-enzyme antibody, which in turn binds the respective enzyme, which quantification via substrate conversion slgA or HSC. This variant is particularly applicable when a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody series BI-POD is used. The monoclonal antibodies BL-HSC / 1 to 3 have particularly favorable binding properties to human slgA or to HSC. In addition, the anti-HSC mbnoclonal antibodies can be consistently reproduced with the same properties. The invention will be explained in more detail below with reference to exemplary embodiments.

Anwendungsbeispiele -Application examples -

Example 1:

Bestimmung der Konzentration von humanem sekretorischem IgA in Körperflüssigkeiten oder in Zellkulturüberständen durch den monoklonalen Antikörper der Serie BL-HSC mittels Festphasenradioimmuntechnik.Determination of the concentration of human secretory IgA in body fluids or in cell culture supernatants by the BL-HSC monoclonal antibody by means of solid-phase radioimmunoassay.

1. Mikrotiterplatten aus Plast (Polystyren oder Polyvinylchlorid) werden mit dem monoklonalen Antikörper BL-HSC/3 beschichtet. Dazu werden die Vertiefungen der Platte mit BL-HSC/3 gefüllt (Konzentration 1-5ju/ml) und für 12h bei +4⁰C inkubiert.1. Plastic microtiter plates (polystyrene or polyvinyl chloride) are coated with the monoclonal antibody BL-HSC / 3. For this purpose, the wells of the plate with BL-HSC / 3 are filled (concentration 1-5ju / ml) and incubated for 12h at +4 ⁰ C.

2. Dreimaliges Waschen mit0,05%Tween20/PBS(0,15M NaCI, 0,01 M Phosphat, pH 7,4).2. Wash three times with 0.05% Tween20 / PBS (0.15M NaCl, 0.01M phosphate, pH 7.4).

3. Blockierung unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatalem Kälberserum für 15min.3. Block unoccupied adsorptive binding sites of the plastic by incubation with 2% neonatal calf serum for 15 min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.4. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

5. Herstellen einer Verdünnungsreihe von gereinigtem Human-slgA(0,1 ng/ml bis 1 /ig/ml. Von der Testprobe werden ebenfalls Verdünnungen hergestellt, die im optimalen Meßbereich der Methoden liegen, wenn die slgA- bzw. HSC-Konzentration zu hoch ist. Die Verdünnung des slgA-Standards und der Testproben erfolgt in 1 % neonatalem Kälberserum. Jeweils 100μ\ der einzelnen Konzentrationsstufen des slgA-Standards und der Testprobe werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingefüllt und für 12h bei+4⁰C inkubiert.5. Prepare a dilution series of purified human slgA (0.1 ng / ml to 1 μg / ml) Dilutions are also made from the test sample which are within the optimum range of the methods when the slgA or HSC concentration increases is high. the dilution of sIgA standards and the test samples are neonatal calf serum in 1%. each 100 μ \ of the different concentration levels of sIgA standards and the test sample are introduced into the wells of the microtiter plate and incubated for 12 h at + 4 ⁰ C.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.6. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

7. Zugabe von jeweils 100μαβ3¹²⁵Ι-πΐ3Γ^βι1βη monoklonalen Antikörpers BL-lgA/1 und Inkubation für 4-12 h bei +4⁰C zur Quantifizierung des gebundenen Human-slgA. Statt des markierten BL-lgA/1 kann auch ein Antikörper verwendet werden, der eine Determinante erkennt, die auf der L-Kette lokalisiert ist (z. B. mit dem Anti-L-Ketten Antikörper BL-lg-L/1).7. addition of each 100μαβ3 ¹²⁵ Ι-πΐ3Γ ^ βι1βη monoclonal antibody BL-IgA / 1 and incubation for 4-12 hours at +4 ⁰ C for quantification of bound human sIgA. Instead of the labeled BL-IgA / 1, an antibody recognizing a determinant located on the L chain (eg, anti-L chain antibody BL-Ig-L / 1) may also be used.

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.8. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

9. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette. 10. Aufstellung einer Eichkurve an Hand der Zählraten der Vertiefungen mit den unterschiedlichen slgA-Standardkonzentrationen. Die Konzentration des slgA in einer Testprobe wird an Hand der jeweiligen Zählrate mittels der aufgestellten Eichkurve ermittelt.9. Measurement of the radioactivity bound in the individual wells in a gamma-ray measuring chain. 10. Establishment of a calibration curve on the basis of the counting rates of the wells with the different standard slgA concentrations. The concentration of slgA in a test sample is determined on the basis of the respective counting rate by means of the established calibration curve.

Example 2:

Bestimmung der Konzentration von humanem sekretorischem IgA bzw. HSC durch den monoklonalen Antikörper BL-HSC/3 mit Festphasenradionimmunassay.Determination of the concentration of human secretory IgA or HSC by the monoclonal antibody BL-HSC / 3 with solid-phase Radionimmunassay.

1 .-4. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 4 des Beispieles 1.1.-4. Same procedure as in items 1 to 4 of Example 1.

5. Zugabe von jeweils 100 μΙ verschiedener Konzentrationen von Human-slgA (0,1 ng/ml bis 100 ng/ml), der Verdünnungslösung allein und derTestprobe, eventuell in verschiedenen Verdünnungsstufen. Dazu werden jeweils 100μΙ ¹²⁵l-markiertes Human-slgA in geeigneter Konzentration pipettiert. Die beiden Komponenten werden durch Vibration gemischt, und anschließend erfolgt die Inkubation für 12h bei +4°C. _Λ 5. Addition of 100 μΙ each of different concentrations of human slgA (0.1 ng / ml to 100 ng / ml), the dilution solution alone and the test sample, possibly in different dilution stages. For this purpose, in each case 100 μl of ¹²⁵ l-labeled human slgA are pipetted in a suitable concentration. The two components are mixed by vibration and then incubated for 12 h at + 4 ° C. _Λ

7. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette.7. Measurement of the radioactivity bound in the individual wells in a gamma-ray measuring chain.

8. Aufstellung einer Eichkurve durch Auftragen des B/Bo-Quotienten gegen die Konzentration des zur Hemmung eingesetzten slgA-Standards. Der B/Bo-Quotient entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen ¹²⁵l-markierten Human-slgA bei Anwesenheit und Fehlen von nichtmarkiertem slgA.8. Preparation of a calibration curve by plotting the B / Bo ratio against the concentration of the slgA standard used for the inhibition. The B / Bo quotient corresponds to the ratio of the count rate of the bound ¹²⁵ I-labeled human SLGA in the presence and absence of unlabeled SLGA.

9. Bestimmung der Konzentration des in einer Testprobe enthaltenen Human-slgA bzw. HSC an Hand des jeweiligen B/Bo-Qutienten und der Eichkurve (Hemmkurve).9. Determination of the concentration of human slgA or HSC contained in a test sample on the basis of the respective B / Bo Qutienten and the calibration curve (inhibition curve).

Example 3: ·

Bestimmung von slgA-Antikörpern gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalen Antikörper BL-HSC/3 mittels Enzymimmunbrückentechnik.Determination of slgA antibodies against the hemagglutinin antigen of the influenza virus by the monoclonal antibody BL-HSC / 3 by means of enzyme immuno bridging technique.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren Oder Polyvinylchlorid) werden mit dem Hämagglutininantigen des Influenzavirus beschichtet, indem diese in Gebrauchskonzentration in die Vertiefungen der Platte eingefüllt und für 12 h bei +4°C inkubiert wird.1. Plastic microtiter plates (polystyrene or polyvinyl chloride) are coated with the influenza virus hemagglutinin antigen by filling them in the wells of the plate at the concentration of use and incubating for 12 h at + 4 ° C.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.2. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

3. Blockieren unbesetzter adsorptiver Bindungsstellen der Plaste durch Inkubation mit 2% neonatalem Kälberserum für 15 min.3. Block unoccupied adsorptive binding sites of the plastic by incubation with 2% neonatal calf serum for 15 min.

5. Zugabe von jeweils 100μΙ5. Addition of 100μΙ each

a) verschiedener Verdünnungsstufen eines IgA-anti-Hämagglutinin-Antikörper enthaltendes Referenzserums (Positivkontrolle),a) different levels of dilution of an IgA anti-hemagglutinin antibody-containing reference serum (positive control),

b) verschiedener Verdünnungsstufen eines Normalserums (Negativkontrolle),b) different dilution levels of a normal serum (negative control),

c) verschiedener Verdünnungsstufen derTestprobe .Inkubation für 12h beij+4°C._c) different dilution levels of the test sample. Incubation for 12 h at + 4 ° C.

7. Zugabe von jeweils 100μΙ BL-HSC/3in Gebrauchsverdünnung (ca. 50ng/ml. Inkubation für 2-4h bei +4⁰C.7. Add 100 μL BL-HSC / 3 in dilution of use (about 50ng / ml. Incubation for 2-4h at +4 ⁰ C.

9. Zugabe von jeweils 100/J Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchskonzentration (ca. 1:200 verdünnt). Inkubation für 1 h bei +4°C.9. Add 100/J goat anti-mouse immunoglobulin serum at use concentration (diluted approximately 1: 200). Incubate for 1 h at + 4 ° C.

10. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.10. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

11. Zugabe von jeweils 100μ\ monoklonalem Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper BL-POD/11 in Gebrauchskonzentration (ca. 50ng/ml). Inkubation bei +4⁰C für 1h.11. Addition of 100 μl monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody BL-POD / 11 in use concentration (about 50 ng / ml). Incubation at +4 ⁰ C for ¹ h.

12. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.12. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

13. Zugabe von jeweils 100/il Meerrettichperoxidase¹¹ in Gebraw-hsvardurinung. Es können weniger gereinigte Präparate des Enzyms Verwendung finden. Inkubation für 1 h bei +4°C.13. Add 100% each of horseradish peroxidase ¹¹ in Gebraw-hsvardurinung. Less purified preparations of the enzyme can be used. Incubate for 1 h at + 4 ° C.

14. Dreimaliges Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS.14. Wash three times with 0.05% Tween 20 / PBS.

15. Zugabe von jeweils 100μ.Ι Substratgemisch, bestehend aus H₂C>2und ortho-Phenylendiamin.15. Addition of 100 .mu.Ι Substrate mixture, consisting of H ₂ C> 2 and ortho-phenylenediamine.

16. Nach 5-60min Entwicklungszeit wird die Substratumsetzung durch Zugabe von 100μΙ 4N Schwefelsäure abgestoppt und die Extinktion photometrisch bestimmt.16. After 5-60min development time, the substrate conversion is stopped by addition of 100μΙ 4N sulfuric acid and the extinction is determined photometrically.

17. Feststellen des slgA-anti-Hämagglutinin-Titers an Hand der Extinktionswerte der Verdünnungsstufen des Testserums im Vergleich mit den Werten der Positiv-und Negativkontrolle.17. Determination of the slgA-anti-hemagglutinin titer by means of the extinction values of the dilution steps of the test serum in comparison with the values of the positive and negative controls.

¹¹ Die Schritte 11 bis 13 können zu einem einzigen Schritt zusammengefaßt werden, indem man den Antikörper BL-POD/11 in doppelter Gebrauchskonzentration mit gleichem Volumen der Peroxidaselösung, ebenfalls in doppelter Gebrauchsverdünnung, mischt und vor Einsatz 1 h bei Raumtemperatur inkubieren läßt. ¹¹ Steps 11 to 13 can be combined into a single step by mixing the antibody BL-POD / 11 in double use concentration with the same volume of Peroxidaselösung, also in double use dilution, and allowed to incubate for 1 h at room temperature before use.

Example 4:

Bestimmung von SlgA-Antikörpern gegen das Hämagglutininantigen des Influenzavirus durch den monoklonalen Antikörper BL-HSC/3, der kovalent mit Peroxidase gekoppelt ist.Determination of SlgA antibodies to the hemagglutinin antigen of the influenza virus by the monoclonal antibody BL-HSC / 3, which is covalently coupled to peroxidase.

1.-6. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1 bis 6 des Beispieles 3.1st-6th Same procedure as in items 1 to 6 of Example 3.

7. Zugabe von jeweils 100 μΙ BL-HSC/3, gekoppelt mit hochgereinigter Meerrettichperoxidase. Die Kopplung kann mit7. Addition of 100 μΙ BL-HSC / 3, coupled with highly purified horseradish peroxidase. The coupling can with

Glutardialdehyd oder mit Periodat ausgeführt werden. Inkubation für 2 h bei +4⁰C. 8.-11. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 14 bis 17 des Beispieles 3.Glutaric dialdehyde or periodate. Incubate for 2 h at +4 ⁰ C. 8.-11. Same procedure as in items 14 to 17 of Example 3.

Example 5:

Nachweis membrangebundener HSC an sekretorischen Epithelien durch den monoklonalen Antikörper BL-HSC/3 und indirekte Immunfluoreszenz.Detection of membrane-bound HSC on secretory epithelia by the monoclonal antibody BL-HSC / 3 and indirect immunofluorescence.

1. Von dem zu untersuchenden Gewebe werden 5μηη starke Kryostatschnitte hergestellt und auf vorbereitete Mikroskopobjektträger aufgezogen und luftgetrocknet.1. From the tissue to be examined 5μηη strong cryostat sections are prepared and mounted on prepared microscope slides and air-dried.

2. Inkubation des Schnittes für 30 min mit 20 μΙ des monoklonalen Antikörpers BL-HSC/3 in Gebrauchskonzentration (ca, 10μg/ml). Diese Inkubation wird bei +4⁰C in einer feuchten Kammer ausgeführt.2. Incubation of the section for 30 min with 20 μΙ of monoclonal antibody BL-HSC / 3 in use concentration (ca, 10μg / ml). This incubation is carried out at +4 ⁰ C in a humid chamber.

3. Spülen in PBS durch dreimaligen Wechsel.3. Rinse in PBS by changing three times.

4. Inkubation der Zellen mit 20 μΙ FITC-Ziege-anti-Mausgammaglobulin-Antikörpernfür 1 h bei +4⁰C in einer feuchten Kammer.4. Incubate the cells with 20 μM FITC-goat anti-mouse gamma-globulin antibodies for 1 h at +4 ⁰ C in a humidified chamber.

5. Spülen in PBS durch dreimaligen Wechsel.5. Rinse in PBS by changing three times.

6. Eindecken und sofortige fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder vorherige Anfertigung von Dauerpräparaten.6. Cover and immediate fluorescence microscopy evaluation or previous preparation of persuasive preparations.

Examples: ·

Präparative Abtrennung von slgA und HSC aus einer Kolostrumrohfraktion mittels trägerfixiertem monoklonalem Antikörper BL-HSC/3.Preparative separation of slgA and HSC from a colostrum crude fraction using carrier-fixed monoclonal antibody BL-HSC / 3.

1. Sepharose 4 B wird nach der Methode von PORATH et al. (Nature 215 [1967] 1491) mit Zyanbromid aktiviert. Zu 5 ml gepackter Sepharose werden 30 mg BL-HSC/3 gegeben und angekoppelt. Nach Waschen im Kopplungspuffer werden reaktive Gruppen durch einstündige Behandlung mit 0,5 M Ethanolamin pH 8,0 geblockt. Anschließend wird die antikörperbeladene Sepharose in PBS gewaschen und in eine Säule gepackt.1. Sepharose 4B is prepared by the method of PORATH et al. (Nature 215 [1967] 1491) activated with cyanogen bromide. To 5 ml of packed Sepharose, 30 mg BL-HSC / 3 are added and coupled. After washing in the coupling buffer, reactive groups are blocked by treatment with 0.5 M ethanolamine pH 8.0 for 1 hour. Subsequently, the antibody-loaded Sepharose is washed in PBS and packed in a column.

2. Langsames Überleiten einer entfetteten Kolostrumrohpräparation bei +4°C. Bei geschlossenem Ablauf 1 h adsorbieren lassen.2. Slow transfer of a defatted Kolostrumrohpräparation at + 4 ° C. Leave adsorb for 1 h when the process is closed.

3. Waschen mit eiskalter 0,5 M NaCI-Lösung im Durchflußverfahren, bis die Waschlösung proteinfrei ist.3. Wash with ice-cold 0.5 M NaCI solution by flow-through until the wash solution is protein free.

4. Etution mit 0,5M Glyzin/HCL-PufferpH2,8. Sofortige Neutralisation desEluats und Dialyse gegen PBS. Anschließend Einengung durch Ultrafiltration und Bestimmung von Konzentration und Reinheit des slgA bzw. des HSC.4. Etude with 0.5M glycine / HCL buffer pH2.8. Immediate neutralization of the eluate and dialysis against PBS. Then concentration by ultrafiltration and determination of concentration and purity of the slgA or HSC.

(Bei erwünschter Trennung von slgA und HSC kann das Eluat in analoger Art und Weise über ein Immunabsorbens, welches mit BL-lgA/1 gekoppelt wurde, geleitet werden).(In the case of desired separation of slgA and HSC, the eluate may be passed in an analogous manner via an immunoabsorbent coupled with BL-IgA / 1).

Claims

Claim for invention: _x

1. A method for the qualitative and quantitative determination and optionally for the isolation and preparative recovery of human secretory IgA and human secretory component, characterized in that as a detection reagent monoclonal antibody series BL-HSC / 1 to 3 individually or in combination, where appropriate, with are coupled to a marker, are used for direct and indirect detection reactions or monoclonal antibodies BL-HSC / 1-3 coupled to carriers.

2. The method according to item 1, characterized in that by direct, covalent or adsorptive coupling of a marker, such as. As a radioisotope, an organic dye, an enzyme or an anti-enzyme antibody, to a member

"the monoclonal antibody series BL-HSC / 1 to 3, this is used as an indicator reagent for the detection or quantitative determination of human slgA or HSC.

3. The method according to item 1, characterized in that the indicator reagent for human slgA or HSC serving member of the series BL-HSC / 1 to 3 is detected by a component which reacts specifically with these and is provided directly with a marker, or can bind one directly or indirectly.

4. The method according to item 1,2 and 3, characterized in that members of the monoclonal antibody series BL-HSC / 1-3 individually or in combination with each other, coupled directly or indirectly with a marker, for the detection and quantitative determination of antigen-specifically bound slgA Antibodies adsorbed to a test phase loaded with the antigen.

5. The method according to item 1, 2 and 3, characterized in that members of the monoclonal antibody series BL-HSC / 1 to 3 individually or in combination with each other, coupled directly or indirectly with a marker, be used for the detection or quantitative determination of slgA which has been specifically bound by either members of the BL-HSC / 1-3 series or another immunological anti-HSC reagent which itself are coupled to a solid support.

6. The method according to item 1,2,4 and 5, characterized in that the members of the series BL-HSC / 1 to 3 are labeled with ¹²⁵ I.

7. The method according to item 1, 2, 4 and 5, characterized in that the members of the series BL-HSC / 1-3 are coupled with an anti-enzyme antibody.

8. The method according to item 7, characterized in that a monoclonal anti-horseradish peroxidase antibody series BL-POD is used.

9. The method according to item 1,2,4 and 5, characterized in that an enzyme is coupled.

10. The method according to item 9, characterized in that horseradish peroxidase is coupled.

11. The method according to item 1,3,4 and 5, characterized in that an enzyme-anti-mouse immunoglobulin antibody conjugate is prepared by a known method and used to detect the indicator reagents of the series BL-HSC / 1 to 3.

12. The method according to item 11, characterized in that a horseradish peroxidase-anti-mouse immunoglobulin conjugate is used.

13. The method according to item 1, 3, 4 and 5, characterized in that a conjugate of anti-enzyme antibodies and anti-mouse immunoglobulin is prepared by a known method and used to detect the indicator reagents of the BL-HSC / 1-3 series ,

14. The method according to item 13, characterized in that a conjugate of anti-mouse immunoglobulin and a member of the monoclonal antibody series BL-POD is used.

15. The method according to item 1,3,4 and 5, characterized in that the indicator reagents for slgA or HSC series

, BL-HSC / 1 to 3 can be detected or quantitated by an enzyme (anti-enzyme-antibody) complex which is immunospecifically coupled through a bridge of anti-mouse immunoglobulin antibody.

16. The method according to item 15, characterized in that a horseradish peroxidase anti-peroxidase complex is used which contains monoclonal antibodies of the series BL-POD.

17. The method according to item 1, characterized in that for the affinity chromatography of human slgA or HSC, members of the monoclonal antibody series BL-HSC / 1 to 3 individually or in combination with each other are coupled to carriers and these products for affinity chromatography isolation of human slgA or HSC are used. ^x