DD232432A5

DD232432A5 - Verfahren zur herstellung des wirkstoffes eines immunomodulator-medikamentes

Info

Publication number: DD232432A5
Application number: DD84266389A
Authority: DD
Inventors: Ives M Page; Christine Vanderhoven
Original assignee: Lipha
Priority date: 1983-08-17
Filing date: 1984-08-17
Publication date: 1986-01-29
Also published as: SU1487815A3; FR2550707B1; MA20203A1; AU564652B2; DK393884D0; PT79090A; HU193217B; IN161616B; NZ209171A; IL72589A; IL72589A0; EP0139551A3; DK160807C; HUT35013A; ZA846151B; CA1229566A; ES535213A0; EP0139551B1; DK393884A; EP0139551A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffes eines immunomodulierenden Arzneimittels, indem man eine erste Beimpfung eines geeigneten Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer bestimmten Gattung vornimmt, im Verlaufe der Wachstumsphase die Bakterien durch Einfuehrung ihrer homologen Phagen infiziert, die Entwicklung der Lyse bis zu einer festgelegten Stufe verfolgt, dann eine zweite Beimpfung des Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer anderen Gattung vornimmt, im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien der zweiten Gattung diese Bakterien durch Einfuehrung ihrer homologen Phagen infiziert, die Entwicklung der Lyse dieser Bakterien der zweiten Gattung bis zu einer festgesetzten Stufe verfolgt, schliesslich die nicht lysierenden Bakterien entfernt und das aus den beiden Bakterien erhaltene Lysefiltrat gewinnt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Wirkstoffe können zu Immunomodulator-Medikamenten .biologischen 0 Ursprungs für die Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin verarbeitet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zahlreiche Präparate, die die Immunreaktion durch Fraktionen oder Extrakte lysierter mikrobieller Körper modulieren, sind bekannt. Man kann insbesondere die Produkte nennen, die in den französischen Patentschriften 2 374 042, 2 396 018 und

17 0 C- ι η. j η- r·. ,

ι / υ. υ ν "Ui ^; / L·' \

_ 2 _ 2 426 470 beschrieben sind.

Diese Lysate oder Extrakte werden allgemein durch physikalische, chemische und seltener durch enzymatische Verfahren erhalten. Obwohl die Mehrzahl dieser Präparate eine gewisse immunomodulierende Wirkung beim Tier besitzt, sind die therapeutischen Wirkungen beim Menschen noch immer Gegenstand zahlreicher Arbeiten (Immunopharmacologie clinique. Realites et Perspectives G. Renoux. Pharmacologie et therapeutique. R.P. 1982, 32, Seiten 41 bis 42).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung neuer besserer Wirkstoffe für das Immunsystem modulierende Medikamente.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffen zu bekommen, die in Medikamenten eine .geeignete Waffe bieten, um immer dann benutzt zu werden, wenn es darum geht, die Immunabwehr wiederherzustellen oder zu verstärken.

Diese Medikamente, die die Immunreaktion modulieren und deren Wirkstoff von den Lyseprodukten oder einer Fraktion dieser Produkte durch Bakteriophagen lysierter Bakterien nach der Erfindung gewonnen wurde, enthalten als Wirkstoff die - Lyseprodukte von wenigstens zwei mit Hilfe homologer Bakteriophagen lysierter Bakterien'.

Es wurde nämlich ein neues Herstellungsverfahren gefunden, das-Bakteriophagen verwendet. Die Benutzung der Bakteriophagen, die"" in vitro ein ausgezeichnetes Mittel für Bakterien-5 iyse sind, ist für die Herstellung immunomodulierender Präparate mit unterschiedlichen Bakteriengattungen und -arten wirksam. Diese Technik der Bakterienlyse mit Bakteriophagen ist unbegrenzt bezüglich der Bakteriengattung oder -art. Sie

gestattet es, Medikamente zu erhalten, die durch ihre Eigenschaften der Modulation von Immunsystemen bemerkenswert sind und aus einem oder mehreren Bakterienkeimen oder einem Gemisch dieser Bakterienkeime hergestellt werden. Diese.Medikamente besitzen vor allem eine Fähigkeit, Überlagerungen zu induzieren.

Unter den Bakterien kann man ohne Beschränkung beispielsweise •Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae oder Staphylococcus aureus nennen. Das unter Verwendung von Bakterien der Gattungen Klebsiella und Escherichia erhaltene Präparat erweist sich als besonders interessant.

Das erhaltene Medikament kann mit einer antibiotischen Substanz, wie Tetracyclinen, einer antiviralen Substanz, wie synthetischen Nucleosiden, die bei den Viren die Nucleinsäuresynthese stören, einer gegen Pilze gerichteten Substanz, wie Buclosamid, oder einer antiparasitären Substanz, wie Chloroquin, kombiniert werden

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Bei einer anderen Ausführungsform kann das nach der Erfindung hergestellte Medikament mit anderen pharmazeutischen Produkten und Zusammensetzungen kombiniert werden, wie einem Antitumormittel (einem zytostatischen Mittel), einem immunitätsunterdrückenden Mittel (gegen Lymphozyten gerichtete Immunoglobuline), einem gegen Mitose gerichteten Mittel, wie den Folsaurederivaten, oder einem entzündungshemmenden Mittel, wie Indomethacin.

0 Das nach der Erfindung hergestellte Medikament kann in unterschiedlichen Formen vorliegen im Hinblick auf percutane, transcutane, perlinguale, örtliche, enterale, parenterale Verabreichung oder Verabreichung in Luft. Fallweise wird das Medikament mit einem geeigneten Trägermittel zubereitet, 5 wie in der Form einer wäßrigen oder alkoholischen Lösung oder einer Suspension in einem öligen Träger, sei es in lyophilisierter Form oder in der Form von Aerosolen oder Salben.

Die nützliche Dosierung unterliegt großen Veränderungen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Medikaments, der verordneten Indikation, der Verabreichungsweise und dem Alter des behandelten Patienten. Die Bestimmung der nützlichen Dosen ist der Beurteilung des Humanmediziners oder Tierarztes überlassen, wie dies die übliche Praxis bei den Behändlungen von Modulationen der Immunreaktion ist.

Beispielsweise kann die tägliche Dosierung bei der Behandlung chronischer oder rezidivierender Infektionen der Luftwege, bei der Vorbeugung postoperativ.er infektiöser Komplikationen oder bei der Prophylaxe gegen Infektionen der Harnwege Dosen von 1 bis 50 ml umfassen, je nach der Konzentration des immunomodulierenden. Präparates

. .

Das nach der Erfindung hergestellte Medikament wird ausgezeichnet toleriert, seine Toxizität ist gering, wie der

LD,.«—Test zeigt, der im Hinblick auf die Magenkapazität der benutzten Tiere (Mäuse, Ratten) nur peroral durchführbar 0 war.

Die nach der Erfindung erhaltenen Medikamente sind besonders für die Behandlung "von Unregelmäßigkeiten der Immunreaktion für- die Vorbeugung oder die Behandlung bakteriell, viral, durch Pilze oder Parasiten hervorgerufener infektiöser Angriffe sowie in der Rheumatologie und für die Narbenbildung oder den Wundschutz indiziert.

Die Erfindung hat zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes vom Bakterienlysetyp, das auf einer. Folge von wenigstens zwei unerläßlichen Stufen beruht, nämlich einer bakteriophagen Lyse, anschließender Entfernung von nicht lysierten Bakterien und der Bakterienreste nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren, wie durch Filtrati-5 on, Zentrifugieren usw.

Nach einer Ausführungsform des Verfahrens, die von einem

Bakterium ausgeht, impft man ein Kulturmedium, das für eine

Bakterienbeimpfung geeignet ist, infiziert dann im Lauf der Wachstumsphase die Bakterien durch Einführung ihrer homologen Phasen, verfolgt die Entwicklung der Lyse mit Hilfe einer vorher geeichten Zellenzähleinrichtung bis zu einer festgesetzten Stufe entsprechend einer Bakterienanzahl je Milliliter Kulturmedium, fährt dann fort mit der Entfernung der nichtlysierten Bakterien und der Bakterienreste und sammelt das Lysefiltrat, welches das immunomodulierende Präparat darstellt

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Das Verfahren nach der Erfindung kann.unter aufeinanderfolgender Benutzung von Bakterien unterschiedlicher Gattungen durchgeführt werden.

In diesem Fall macht man eine erste Impfung eines geeigneten Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer bestimmten Gattung, infiziert im Verlauf der Wachstumsphase die Bakterien durch Einführung ihrer homologen Phagen, verfolgt die Entwicklung der Lyse bis zu einer feststehenden Stufe in dergleichen Weise wie oben, macht dann eine zweite Impfung des Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer anderen Gattung, infiziert im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien der zweiten Gattung diese Bakterien durch Einführung ihrer homologen Phagen, verfolgt die Entwicklung der Bakterienlyse dieser zweiten Gattung bis zu einer festgesetzten Stufe, entfernt schließlich die nichtlysierten Bakterien und die Bakterienreste nach für diese Trennweise an sich

^: bekannten Methoden und sammelt das aus den beiden Bakterien erhaltene Lysefiltrat. Nach diesem Verfahren kann man ein Medikament herstellen, indem man nacheinander beispielsweise Bakterien der Gattungen Klebsiella und Escherichia benutzt.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Herstellung aus einem_Bakterium_der_Gattung_Escherichia

Das benutzte Bakterium ist von der Gattung Escherichia, von der Art coli, Serumtype 0119: B 14, verzeichnet von dem Institut Pasteur, Paris unter der Nummer 62.23.

Der coli-Phage gehört zu der morphologischen Gruppe G-^ (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bakteriophagen beim International Committee for Taxonomy of Virus der I.A.M.S.), er hat einen isometrischen Kopf, einen sehr kurzen Schwanz, der schwer sichtbar zu machen ist, eine Hülle und ein Endblättchen, die nicht feststellbar sind. Auf einem Agarmedium haben die Lysebereiche einen Durchmesser von 1 bisΊ,5 mm, eine runde Form, regelmäßige Konturen, ein trübes Zentrum und zusammenfließende Sorten ^r .

Das Kulturmedium besteht je Liter aus 2,5 g Rinderextrakt, 4,1 g Peptone, 7,0 g Natriumchlorid und dem Rest doppelt destilliertem Wasser.

Das Kulturmedium wird mit einem Bakterieninoculum beimpft, das sich in exponentieller Wachstumsphase befindet, und die Anfangsdichte der Kultur beträgt 1 · 10 Bakterien je Milliliter. Die Inkubation erfolgt bei 37° C unter mäßigem Rühren.

in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase, etwa 60 min nach der Beimpfung, werden die Bakterien mit ihren homologen Phagen infiziert. Die Infektionsanzahl ist 0,02.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe einer vorher geeichten Zellenzähleinrichtung verfolgt. Wenn weniger als 1000 Bakterien je Milliliter übriggeblieben sind, führt man eine sterile Filtration durch Hindurchführen durch eine Filtermembran mit einer Porosität von etwa 0,22 μπι durch. Das Lysefiltrat^ stellt selbst das immunomodulierende Präparat'dar. 35

Beispiel 2

Herstellung aus einem Bakterium der Gattung Streptococcus

Man benutzt ein Bakterium der Gattung Streptococcus, Art faecalis, Modifikation zymogenes, verzeichnet von dem Institut Pasteur, Paris unter der Nummer 53.152.

Der Phage gehört zu der morphologischen Gruppe A, (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bakteriophagen des International Committee for Taxonomy of Virus der I.A.M.S.)·,. sein Kopf ist isometrisch, sein Schwanz lang, die Hülle ist sichtbar und das Endblättchen ist komplex. Auf Agar-Medium sind die Lysebereiche rund, kleiner als 0,8 mm, ihre Umrisse sind regelmäßig, und ihr Zentrum ist klar. Es gibt keine

r+ Sorte , oder es gibt nur eine.

Je Liter hat das Kulturmedium folgende Zusammensetzung: 0,3 g Rinderextrakt, 1,0 g Tryptase, 1,0 g Dextrose, 0,5 g Natriumchlorid, Rest doppelt destilliertes Wasser.

Das Medium wird mit einem Bakteriuminoculum beimpft, das sich in stationärer Phase befindet, und die.Anfangsdichte beträgt 1-10 Bakterien je Millili unter mäßigem Rühren dunkel gehalten.

beträgt 1 · ΙΟ⁷ Bakterien je Milliliter. Es wird bei 37° C

Am Anfang der exponentiellen Wachstumsphase, etwa 4 0 min nach der Beimpfung, werden die Bakterien mit ihren homologen Phagen infiziert. Die Infektionsanzahl ist 0,1.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe einer Zellenzähleinrichtung verfolgt. Wenn weniger als 10 Bakterien je Milliliter verblieben sind, wird die Kultur mit 5000 G steril zentrifugiert, um die aufgelösten Bakterien und die nichtlysierten Bakterienkörper' zu entfernen. Das oben Schwimmende stellt das immunomodulierende Präparat dar.

Beispiel^ 35

Herstellung unter_aufeinanderfolgender_Verwendung_von_Bakte-

Das Bakterium der Gattung Klebsieila, Art pneumoniae, ist von dem Institut Pasteur, Paris unter der Nummer 58.5 verzeichnet.

Die Eigenschaften des Bakteriums der Gattung Escherichia sind jene, die im Beispiel !beschrieben sind.

Der Phage homolog zu Klebsieila, gehört zu der morphologischen Gruppe C, (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bkteriophagen des International Committee for Taxonomy of Virus der I.A.M.S.), er' hat einen Kopf in Ikosaederform, einen schwer sichtbar zu machenden kurzen Schwanz, die Hülle und das Endblättchen sind nicht feststellbar. Auf einem Agar-Medium sind die Lysebereiche 0,5 bis 3 mm und haben eine sehr unregelmäßige Form mit verwischten Konturen und einem klaren Zentrum. Die Sorten^r sind selten.

Die coliphagen Eigenschaften sind im Beispiel 1 beschrieben.

0 Je Liter hat das Kulturmedium folgende Zusammensetzung: 3 g Rinderextrakt, 5 g Peptone, 7 g Natriumchlorid, Rest doppelt destilliertes Wasser.

Das Medium wird mit einem Inoculum von Klebsiella pneumoniae beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte ist 1 · 10 Bakterien je Milliliter. Die Kultur wird mit mäßigem Rühren bei 37° C inkubiert.

Am Ende der Latenzphase, etwa 60 min nach der Beimpfung, 0 werden die Bakterien mit ihren homologen Phagen infiziert, die Infektionsanzahl ist 0,03.

Die Entwicklung der Lyse wird, mit Hilfe einer Zeilzähleinrichtung verfolgt. Wenn weniger als 10 Bakterien je Milliliter verblieben sind, wird das Medium erneut mit einem Inoculum von Escherichia beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte dieser neuen Kultur ist 5 · 10⁷ Escherichia je Milliliter.

Am Ende der Latenzphase, bei diesen experimentellen Bedin-' gungen 2 0 min nach der zweiten Beimpfung, werden die Bakterien mit den coli-Phagen infiziert. Die Infektionsanzahl ist 0,1.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe einer Zellenzähleinrichtung verfolgt. Wenn nur noch 10 Escherichia je Milliliter verblieben sind, wird die Kultur durch Passieren durch ein sterilisierendes Filter von 0,22 um gestoppt. Das aus zwei Bakterien, Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli, erhaltene Lysefiltrat stellt das immunomodulierende Präparat dar.

Beispiel 4 15

Herstellung unter _Verwend_ung__ eines _B_a_kte_riu_m__der__Gattung

Das Bakterium der Gattung Staphylococcus, Art aureus, Serumtype 1 ist von dem Institut Pasteur, Paris unter der Nummer 65.6 verzeichnet.

Der homologe Staphylococcusphage. gehört der morphologischen Gruppe A, an (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bakteriophagen des International Committee for Taxonomy of Virus der I.A.M.S.). Er hat einen oktaedrischen Kopf und einen Schwanz, der mit einer Hülle und einem komplexen Endblättchen bedeckt ist. Auf Agar-Medium haben die Lysebereiche einen Durchmesser von 1 bis 2 mm, sie sind rund

und regelmäßig, ihr Zentrum ist klar. Es gibt keine Sorte r+

Die Bakterien werden auf einem festen Medium aufgetragen, das je Liter 10,0 g Proteosepeptone Difco Nr. 3, 1,2 g Dextrose, 6,0 g lösliche Stärke,- 3,0 ~g Natriumchlorid, 2,0 g Natriumdiphosp'hat, 13,0 g Bacto-Gelatine, 6,0 g Bacto-Agar, Rest gereinigtes Wasser,, enthält.

-ΙΟΙ Nach 24 Stunden bilden die Keime einen dichten Bakterienteppich, werden steril geerntet, numeriert und wieder in einem Medium suspendiert, das je Liter 2,5 g Rinderextrakt, 4,1 g Peptone, 7,0 g Natriumchlorid, Rest doppelt destilliertes Wasser, enthält, um Milliliter zu haben.

Wasser, enthält, um eine Dichte von 5 · 10 Bakterien je

Gleichzeitig werden die homologen Phagen in das Medium eingeführt-. Die Infektionsanzahl ist 0,01.

. '

Die Entwicklung der Ly.se wird mit Hilfe einer Zellenzählein-

richtung verfolgt. Wenn nur weniger als 10 Bakterien je Milliliter verblieben sind, erfolgt eine Filtration durch eine Membran mit einer Porosität nahe 0,22 um. Das Lysefiltrat selbst bildet das immunomodulierende Präparat. ·

Pharmakologische Untersuchung

Die Wirkungen von Präparaten nach der Erfindung auf das Tier werden mit einem Präparat entsprechend einem Lysefiltrat von Escherichia coli erläutert, das·nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Das Filtrat wurde lyophilisiert und.dann in sterilem destilliertem Wasser wieder aufgelöst. Der Konzentrationsfaktor dieser neuen Lösung wird in Bezug auf das Präparat vor dem Lyophilisieren ausgedrückt.

Schutzwirkung gegen eine akute Bakterieninfektion

Dieser Test, der eine Gesamtstimulierung des Immunsystems sichtbar macht, wurde mit infizierenden Keimen durchgeführt, die von denen verschieden waren, die in das Präparat kamen. Dies geschieht, um zu zeigen, daß das Präparat nicht durch eine eventuelle Impffähigkeit oder durch ein direktes bakte-5 riophages Phänomen wirksam ist, sondern durch eine Stimulierung der Immunabwehr.

Zwei Keime wurden getestet, Klebsiella pneumoniae, .ein Bak-

terium mit intrazellulärer Entwicklung, und Staphylococcus aureus, ein Bakterium mit extrazellulärer Entwicklung.

Die infizierenden Bakterien wurden einer Gruppe von zehn weiblichen Swiss-Mäusen mit einem mittleren Körpergewicht von 18 g am Tag J_Q auf intraperitonealem Weg in einem Volumen von 0,5 ml verabreicht.

Das immunomodulierende Präparat wurde am Tag vor der Infektion, J_2_/ injiziert. Es handelt sich also um die Ermittlung einer präventiven Wirkung. Das Präparat wurde auf intraperitonealem oder intravenösem Weg verabreicht, um ein eventuelles positives Resultat auszuschließen, das dadurch bedingt ist, daß das Präparat direkt die. infizierenden Keime am Injektionspunkt beeinträchtigt.

Um die Virulenz des infizierenden Stammes kennenzulernen, der in beachtlichen Grenzen von einem Versuch zum anderen - variieren kann, wurde sein LD_5n bei jedem der Tests festgestellt. .

Die Schutzwirkung des Präparates gegen eine akute Bakterieninfektion ergibt sich aus der nächfolgenden Tabelle I.

- -12-Tabelle I

Behandlung

Dosis, Konzentrations· Bakterien DL₅₀ Weg Volumen faktor

überlebende

Infizierende

10 Klebsieila

behan- Kon-

delt trolle (n=10) Cn=IO)

"³

I.P. 1,0 ml

10³ I.P. 1,0 ml "⁴

10

I.P. 1,0 ml

Staphylococcus aureus

10 ² I.V

10"³ I.V

ΙΟ"⁴ I.V.

10~² I.P

ΙΟ"³ i.p.

10 ² i.v

io~³ i.v.

0,5 ml 0,5 ml

0,5 ml

1, 0 ml 1,0 ml.

0, 5 ml 0,5 ml

1 χ

• 1 χ

1 χ

1 χ 1 χ 1 χ

1 χ

Ix

1 χ

70 100

20

80

100

10

. 80

10 100

10 30 20

10 20 20

10 10

20 30

NS \ 0,050 0,001

NS

0,025 0,000.

NS 0,001

Stimulierung der Pha^ytenwirkunq von

Der Test von Halpern (C. stiffel, 1958, J. Phys. 58, Seiten SU bis 949) besteht darin, daß man Mäusen auf intravenösem »ege kolloidale. Kohlenstoffteilchen injiziert, die durch Endothel-Retikulum-Zellen hauptsächlich der Leber und der Mxlz phagozytiert wurden, ihre Reinigungsschnelligkeit ist repräsentativ, für die Phagozytenwxrkung. Sie wird gemessen, indem man durch Photometrie in Abhängigkeit von der Zeit' die -frei ^.im Blut verbleibenden Teilchen dosiert.' Die LPS ein aus Endobakterien extrahiertes Lipopolysaccharid-Endotoxxn und kräftiger Makrophagenaktivator, wird als Bezugssubstanz verwendet.

Der Test wird.folgendermaßen durchgeführt:

- 0,6 ml F.iltrat von Escherichia coli oder einer LPS-Lösung (Lipopolysaccharide) mit 0,625 μg/ml werden Gruppen von fünf weiblichen^ Swiss-Mäusen mit einem mittleren Körpergewicht von 24 g auf intraperitonealem Weg injiziert.

- 24 Stunden später werden 0,12 ml einer kolloidalen Kohlenstoff suspension, dosiert mit 32 mg/ml Kohlenstoff in 4 %iger Gelatine, den Mäusen intravenös injiziert.

- 20 μΐ des Blutes werden alle 2 min während 12 min dem Retroorbitalraum entnommen. Diese Blutentnahme wird sofort mit 4 ml 1 %igem Na₃CO₃ verdünnt. Die Lösung wird dann photometriert.

- Die Ablesung der Extinktion erfolgt bei 620 mm.

- Die Konzentration an kolloidalem Kohlenstoff im Blut zur Zeit t· des Versuches erhält man unter Bezugnahme auf eine vorher ermittelte Eichgerade. Der Phagozytenindex errechnet sich nach folgender Formel: ·

TP- log C ₀ - log C _n

¹^ · T-T

^T2 ^Tl

C_ und C-, bedeuten jeweils die Blutkonzentration an kolloidalem Kohlenstoff während der letzten und ersten Blutentnahme, T_ und T-, bedeuten den Augenblick dieser Entnahmen.

Die in der Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen, 0 daß die Wirkung von peritonealen Makrophagen der Mäuse nach einer intraperitonealen Verabreichung des Präparates stimuliert ist.

-14-Tabelle II

Behandlung . Injiziertes.;Volumen I.P.

Präparat (Bakteriophagenlysefiltrat von Escherichia coli) 0,6 ml 0,028 + 0,003

Nicht beimpfte Kulturbrühe (ne-

gative Kontrolle) 0,6 ml 0,012 + 0,001

.LPS (positiver Bezug) . 0,6 ml . 0,025 + 0,002

Induzierende Wirkung von Serum-Interferon (Serum-IFN)

Das IFN ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht zwisehen 10 000 und 20 000 Dalton. Es hat zahlreiche immunomodulierende Wirkungen, insbesondere stimuliert es die Aktivität von NK-Zellen (Natural Killer). Seine Wirkungsweise wird noch erforscht. Sein Anteil an der antiviralen Abwehr ist wohl bekannt.

Zwei Stunden nach einer Verabreichung des Präparates wurden von acht weiblichen Swiss-Mäusen mit einem Körpergewicht von 25 g 0,3 ml Blut abgenommen, bei jeder von ihnen mit einer nicht heparinisierten Röhre. Das Serum-IFN wird in üblicher Weise dosiert, indem man die zytopathische Wirkung von Virus VSV (Vesicular Stomatitis Virus) mißt, der Murine L-Zellen infiziert, die während 24 st in Gegenwart des zu testenden Serums kultiviert wurden (E,A. Hävell und J. ViI-

. cek, Antimicrob. Agents Chemotherapy 2, Seite 476 bis 484, 1972). Die Schutzwirkung des induzierten IFN wird mit derjenigen von murinem IFN, einer internationalen Bezugssubstanz, die von dem National Institut of Health, Bethesda, USA, kommt, verglichen.

Die Induktion des Serum-IFN-Präparates bei Mäusen, zwei Stunden nach ihrer intraperitonealen, intravenösen oder oralen Verabreichung, ist wie in Tabelle III augeführt.

Tabelle III

	Volumen	Konzentra	i.e. IFN/ml
Produkt	1,5 ml	tionsfaktor	1058
Präparat	1,5 ml	80	0
Placebo	0,7 ml	80	950
Präparat ·	0,7 ml	80	0
Pacebo	1,0 ml	80	1200
Präparat	1,0 ml	1000	0
Placebo	1000

I.P.

I.V.

P.O.

Die Wirkung beim Menschen wurde mit einem Präparat nach Beispiel 3 getestet, das erst Freiwilligen und dann Kranken verabreicht wurde.

Ein Doppelblindversuch, der mit 15 freiwilligen Patienten durchgeführt wurde, gestattete es, sichtbar zu machen, daß die orale Verabreichung des Präparates nach zehn Behandlungstagen eine signifikante Erhöhung der Immunreaktionen mit Zellenvermittlung mit sich brachte. '

Eine zweite Untersuchung, die mit 25 Patienten durchgeführt wurde, zeigte, daß eine einzige orale Verabreichung des Präparates in unterschiedlichen Dosen es gestattete, nach 24 Stunden eine Serumlymphokine vom Typ MIF-LIF zu induzieren. Diese Induktion ist dosisabhängig.

Mehrere Untersuchungen gestatteten es, die Stimulierung der IFN-Produktion durch menschliche Lymphozyten und Monozyten, die durch Zytopherese erhalten und in Mikroplättchen gezüchtet wur-

den, sichtbar zu machen. Das durch das Präparat induzierte IFN konnte gekennzeichnet werden, indem man Antiseren Anti-IFN α, β oder γ benutzte. Deren Produktion ist von der benutzten Dosis abhängig.

5 ·

Beispielhalber sind nachfolgend einige klinische Berichte aufgeführt.

Vorbeugung und Behandlung von chronischen und rezidivierenden Infektionen der Atemwege

Zwei Gruppen von 25 Patienten, die von chronischen oder rezidivierenden bakteriellen Bronchien-Lungeninfektionen befallen waren, wurden jeweils 20 Tage je Monat während drei Monaten oral behandelt, die eine'Gruppe mit 15 ml des oben genannten Präparates, die andere Grupp.e durch Behandlungen mit üblichen Antibiotika. Die Verringerung der akuten Infektionsdauer während der sechs Monate, während derer der Versuch dauerte, ist bedeutend größer in der mit dem Präparat behandelten Gruppe als in der in üblicher Weise mit'Antibiotika behandelten Gruppe.

Vorbeugung gegen postoperative Infekti

onen

Eine orale Verabreichung von 20 ml des Präparates gestattete es, in signifikanter Weise postoperative infektiöse Komplikationen bei 106 Patieten im Vergleich mit 72 anderen üblich behandelten. Kranken zu vermindern.

Vorbeugung und Behandlung von Infektionen der Harnwege

Vier Autoritäten haben auf klinischer "Ebene das obige Präparat bei einer Population von Patienten untersucht, die von einer chronischen oder rezidivierenden Infektion der Harnwege befallen war. Eine orale Verabreichung von 15 ml je Tag, Tage je Monate während drei Monaten gestattete es, die Häufigkeit und Dauer infektiöser Perioden sowie den Verbrauch antiinfektiöser Mittel während sechs Monaten der Be-

1 obachtung im Vergleich mit den der Behandlung vorausgehenden sechs Monaten signifikant zu vermindern.

In allen diesen Versuchen wurde die Toleranz des Präparates 5 durch den Arzt und den Patienten (Freiwillige oder Kranke) als ausgezeichnet beurteilt.

Claims

-18-Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffes eines immunomodulierenden Arzneimittels, gekennzeichnet dadurch, daß man eine erste Beimpfung eines geeigneten Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer bestimmten Gattung vornimmt, im Verlaufe der Wachstumsphase die Bakterien durch Einführung ihrer homologen Phagen infiziert, die Entwicklung der Lyse bis zu einer festgelegten Stufe verfolgt, dann eine zweite Beimpfung des Kulturmediums mit einer Bakterienbeimpfung einer anderen Gattung vornimmt, im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien der zweiten Gattung diese Bakterien durch Einführung ihrer homologen Phagen infiziert," die Entwicklung der Lyse dieser Bakterien der zweiten Gattung bis zu einer festgesetzten Stufe verfolgt, schließlich die nichtlysierten Bakterien entfernt und das aus den beiden Bakterien erhaltene Lysefiltrat gewinnt.

0

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als die der Lyse mit homologen Bakteriophagen unterzogenen Bakterien solche der Gattungen Klebsiella und/oder Escherichia verwendet.