NO843274L - Fremgangsmaate for fremstilling av et immunomodulatormedikament - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører immunomodulator-medikamenter av biologisk opprinnelse og deres fremgangsmåte for fremstilling.

Tallrike preparater som modulerer immunrespons via frak-sjoner eller ekstrakter av lyserte mikroorganismer er kjent.

Man kan spesielt nevne produktene beskrevet i de franske pa-tentene nr. 2 374 042, 2 396 018 og 2 426 470.

Disse lysater eller ekstrakter fås generelt via fysiske, kjemiske og mer sjelden enzymatiske fremgangsmåter. Hvis fles-teparten av disse preparater har en bestemt immunomodulerende aktivitet, brakt for dagen hos dyr, er de terapeutiske aktivi-teter hos menneske ennå mer mål for tallrike arbeider (Immuno-pharmacologie clinique. Réalités et Perspectives G. RENOUX. Pharmacologie et thérapeutique. R.P. 1982, 32_, 41-42).

Det er altså viktig å forske etter medikamenter som"tilbyr like mye til human-som til veterinær-medisin et våpen egnet til å anvendes hver gang det dreide seg om å gjenopprette eller for-sterke immunforsvaret.

Det er blitt funnet en ny fremgangsmåte for fremstilling

som anvender bakteriofag. Bakteriofagen representerer in vitro et utmerket redskap for bakteriell lysis; dens anvendelse til fremstilling av immunomodulerende preparater har vært effektiv med forskjellige bakterieslekter og -arter. Denne teknikk for bakteriell lysis ved hjelp av bakteriofag vedrører uten begrens-ning bakterieslekter eller -arter. Denne fremgangsmåte har. gitt--få medikamenter som er bemerkelsesverdige ved deres evne til modulering av immunsystemet, fremstilt ut:ifra ett eller flere bakteriekim eller en blanding av disse bakteriekim. Disse medikamenter har spesielt en evne til å indusere interferoner.

Disse medikamenter som modulerer immunresponsen hvis aktive prinsipp består av lysis-produktene eller en fraksjon av disse produkter av lysert bakterie via bakteriofag, i henhold til oppfinnelsen, inneholder som aktivt prinsipp lyseringspro-duktene fra minst to lyserte bakterier via homolog bakteriofag.

Blant bakteriene kan man på en ikke begrensende måte nevne Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. Preparatene erholdt ved anvendelse av bakterier fra slektene Klebsiella og Escherichia viser seg å være spesielt interessante.

Medikamentet i henhold til oppfinnelsen kan være assosiert med et antibiotisk stoff, slik som tetracykliner, antivirale slik som syntetiske nukleosider som interfererer"medrden virale nukleinsyresyntese, antisoppdyrkende, slik som buklosamid, eller antiparasittære,slik som klorokin.

I en annen form for utførelsen kan medikamentet i henhold til oppfinnelsen være assosiert med andre produkter og farmasøy-tiske sammensetninger, slik som et anti-tumoralt stoff (cyto-statika) , et immuno-suppressivt stoff, (antilymfocytære immuno-globuliner) et antimytotisk stoff, slik som folinsyrederivater eller anti-inflammatorisk, slik som indometasin.

Medikamentet fra oppfinnelsen kan presenteres i mange for-mer fra perkutan, transkutan, perlingual, topisk, enteral, parenteral eller luftveisadministrering. Avhengig av tilfellet, er medikamentet fabrikert med et passende bindemiddel, slik som i form av en vandig eller alkoholisk løsning eller i suspensjon i et oljebindemiddel, enten i lyofilisert eller aerob-form eller salver.

Den anvendte dosering er mottagelig for store variasjoner

i funksjon av sammensetningen av medikamentet, den foreskrevne indikasjon, av administrasjonsmåten, og av alderen til det be-handlede tilfelle. Bestemmelsen av behandlingsdosene bør over-lates til legens eller veterinærens vurdering, som er vanlig praksis i behandlinger av moduleringer av immunrespons.

Som et eksempel kan den daglige dosering innbefatte behandling av kroniske eller residiverende infeksjoner i respirasjonsveiene, i forebyggelse av postoperative infeksiøse komplikasjoner, eller i profylakse av urinveisinfeksjoner, i doser på 1 til 50 ml, avhengig av konsentrasjonen av det immunomodulerende preparat.

Medikamentet i henhold til oppfinnelsen tolereres på en utmerket måte, dets toksisitet er svak hvilket LD^^-testen viser, hvilket ikke har kunnet forventes per os tatt i betraktning mave-kapasiteten til det anvendte dyr (mus, rotter).

Medikamentene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er spesielt indikert i behandling av dysreguleringer av immunrespons,

i forebyggelse eller behandling av infeksiøse utbrudd av

bakteriell, viral, sopp eller parasittær art, slik som i reuma-tologi og i arrdannelse eller i beskyttelse av sår.

Oppfinnelsen har likeledes som mål å gi en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament av typen bakteriell lysis, som svarer til en frekvens på minst to uunnværlige stadier, dvs. en bakteriofaglysis, så eliminering av ikke-lyserte bakterier og bakterierester ved hjelp av en for spesialister kjent fremgangsmåte, slik som filtrering, sentrifugering etc.

I henhold til en måte for iverksettelse av fremgangsmåten ut ifra en bakterie, poder man et tilpasset kulturmiljø med et bakterieinokulum, så i løpet av vekstfasen infiserer man bakteriene ved tilsetning av deres homologe fager, man følger utviklingen av lyseringen, ved hjelp av et cellulært telleapparat, på forhånd justert til et fiksert stadium, som tilsvarer et antall bakterier pr. ml i miljøet, så fortsetter man med elimine-ringen av ikke-lyserte bakterier og bakterierester, og man samler opp lyseringsfiltratet som utgjør det immunomodulerende preparat .

Fremgangsmåten for oppfinnelsen kan iverksettes med suksessiv anvendelse av bakterier av forskjellige slekter.

I dette tilfelle foretar man en første poding i et tilpasset kulturmiljø med et bakterie-inokulum av en bestemt slekt i løpet av vekstfasen, man infiserer bakteriene ved å tilsette deres homologe fager, man følger utviklingen av lyseringen inntil et fastsatt stadium, på samme måte som foran, så foretar man altså en annen poding av kulturmiljøet med et inokulum av bakterier av en annen slekt, i løpet av vekstfasen av bakteriene av den andre slekt, infiserer man disse bakterier ved å tilsette deres homologe fager, man følger utviklingen av lyseringen av bakteriene av denne andre slekt inntil et fastsatt stadium, til slutt eliminerer man de ikke-lyserte bakterier og bakterieres-tene ved hjelp av kjente metoder for denne type separering, og man samler opp filtratet av lyseringen fått ut ifra de to bakteriene. I henhold til denne fremgangsmåte kan man fremstille et medikament ved å anvende suksessivt, f.eks., bakterier av slektene Klebsiella ogEscherichia.

Det er heretter gitt eksempler som illustrerer oppfinnelsen på en ikke-begrensende måte.

EKSEMPEL 1

Fremstilling ut ifra en bakterie av

slekten Escherichia.

Den anvendte bakterie er av slekten Escherichia, arten coli, serotypen 0119: B 14, registrert ved Pasteur-instituttet i Paris under referanse 62.23.

Colifagen som hører til en morfologisk gruppe C, (nomenklatur av underkomiteen for Taxonomie des Bactériophages av International Committee forTaxonomy of Virus av I.A.M.S.), det har et isometrisk hode, en meget kort hale, vanskelig å bringe for dagen, en kapsel og en terminalplaque som ikke kan oppdages. I agarkultur har lysisplaqueneen diameter på fra 1 til 1,5 mm, en rund form, regelmessige konturer, et tilsløret senter og sammenløpende kloner r<+>.

Kulturmiljøet består pr. liter av: biffekstrakt 2,5 g, pepton 4,1 g, natriumklorid 7,0 g, utfylt med bidestillert vann.

Miljøet blir podet med et bakterie-inokulum som befinner seg i en eksponentiell vekstfase og utgangstettheten i kulturen er på 1.10 6 bakterier pr. ml. Inkuberingen fortsettes ved 37 nC under moderert røring.

Midt i den eksponentielle vekstfasen, dvs. omtrent 60 minutter etter innpoding, blir bakteriene infisert med sine homologe fager. Infeksjons-multiplisiteten er på 0,02.

Utviklingen av lyseringen følges ved hjelp av et cellulært telleapparat, på forhånd justert. Når det er igjen mindre enn 1000 bakterier pr. ml, blir en steriliserende filtrering utført ved passasje gjennom en filtermembran med porestørrelse nær 0,22 nm. Lyseringsfiltratet utgjør selv det immunomodulerende preparat.

EKSEMPEL 2

Fremstilling ut ifra en bakterie av

slekten Streptococcus.

Man anvender en bakterie av slekten Streptococcus, arten faecalis, varietet synogenes, registrert ved Pasteur-instituttet i Paris under referanse 53.152.

Fagen tilhører en morfologisk gruppe A^(nomenklatur av under-komitéen for Taxonomie des Bactériophages av International Committes for Taxonomy of Virus av I.A.M.S.), dens hode er isometrisk, dens hale lang, kapselen er synlig og terminalplaquen er kompleks. På agarkultur er lysisplaquene runde, mindre enn 0,3 mm, deres konturer er regulære og deres senter klart.

Det finnes ingen klon r + hvor det er bare én.

Pr. liter har kulturmiljøet som sammensetning: 0,3 g biffekstrakt, 1,0 g tryptase, 1,0 g dekstrose, 0,5 g natriumklorid, utfylt med ; 2 x destillert vann.

Miljøet ble podet med et bakterieinokulum som befinner seg

i en stasjonær fase, og utgangstettheten er på 1.IO<7>bakterier pr. ml. Det ble plassert i mørke og ved 3 7°C, under moderat røring.

I begynnelsen av den eksponentielle vekstfasen, dvs. omtrent 40 minutter etter innpodning, ble bakteriene infisert med sine homologe fager. Infeksjons-multiplisiteten er på 0,1.

Utviklingen av lyseringen ble fulgt ved hjelp av et cellulært telleapparat. Når det er igjen 10 bakterier pr. ml, blir kulturen sentrifugert sterilt ved 5000 G for å eliminere de lysogene bakterier og de ikke-lyserte bakterieorganismer. Super-natanten utgjør det immunomodulerende preparat.

EKSEMPEL 3

Fremstilling med suksessiv anvendelse av bakterier

av slektene Klebsiella og Escherichia.

Bakterien av slekten Klebsiella, arten pneumoniae, er registrert av Pasteur-instituttet i Paris under referanse 58.5.

Karakteristikaene av bakterien av stamme Escherichia er de som er beskrevet i eksempel 1.

Fagen, homolog med Klebsiella, tilhører en morfologisk gruppe C-^(nomenklatur av under-komitéen for Taxonomie des Bactériophages av International Committee for Taxonomy of Virus av I.A.M.S.), det har et ikosaedrisk hode, en kort hale, vanskelig å bringe for dagen, kapselen og terminalplaquen_£r det ikke mulig å oppdage. På agarkultur er lysisplaquene påO,5-3 mm, og er av meget irregulær form, med utviskede konturer og et klart sentrum. Klonene<r+>er sjeldne.

Karakteristikaene til coli-fagen er beskrevet i eksempel 1.

Pr. liter har kulturmiljøet som sammensetning: 3 g biffekstrakt, 5 g pepton, 7 g natriumklorid, utfylt med 2 x destillert vann.

Miljøet ble podet med et inokulum av Klebsiella pneumoniae som befinner seg i en stasjonær vekstfase. Utgangstettheten er på 1.10<7>bakterier pr. ml. Kulturen blir plassert ved 37°C under moderat røring.

På slutten av latensfasen , dvs. omtrent 60 minutter etter innpoding, blir bakteriene infisert med sine homologe fager, infeksjons-multiplisiteten er på 0,03.

Utviklingen av lysis ble fulgt ved hjelp av et cellulært

telleapparat. Når det er igjen mindre enn 10 bakterier pr. ml, blir miljøet på nytt inseminert med et inokulum av Escherichia som befinner seg i en stasjonær vektfase. Utgangstettheten av denne nye kultur er på 5.10 7 Escherichia pr. ml.

På slutten av latentfasen, dvs. under disse forsøksbeting-elser, 20 minutter etter den andre innpoding, blir bakteriene infisert med colifager. Infeksjons-multiplisiteten er på 0,1.

Utviklingen av lysis ble fulgt ved hjelp av et cellulært telleapparat. Når det er igjen mindre enn 10 3 Escherichia pr. ml, blir kulturen stoppet ved passasje gjennom et steriliserende membranfilter på 0,22 nm. Lysisfiltratet fått ut ifra de to bakterier, Klebsiella pneumoniae og Escherichia coli, utgjør det immunomodulerende preparat.

EKSEMPEL 4

Fremstilling ved å anvende en bakterie av slekten Staphylococcus.

Bakterien av slekten Staphylococcus, arten aureus, sero-type 1, er registrert av Pasteur-instituttet i Paris under referanse 65.6.

Den homologe fag til Staphylococcus tilhører en morfologisk gruppe (nomenklatur av under-komitéen for Taxonomie des Bactériophages av International Committee for Taxonomy of Virus av I.A.M.S.); det har et oktaedrisk hode og en hale dek-ket av en kapsel og en kompleks terminalplaqtie. På agarkultur har lysisplaquene en diameter på 1-2 mm, de er runde og regulæ-r+

re, deres sentrum er klart,det finnes ingen klon

Bakteriene blir spreclt i et fast miljø som inneholder pr. liter: 10,0 g 3 Difco peptonproteose, 1,2 g dekstrose, 6,0 g løselig amidon, 3,0 g natriumklorid, 2,0 g natriumdifosfat, 13,0 g bacto-gelatin, 6,0 g bacto-agar, renset vann q.s.

Etter 24 timer blir kimene som danner et tett bakterie-teppe, innhøstet sterilt, tellet og resuspendert i et miljø som

inneholder pr. liter: 2,5 g biffekstrakt, 4,1 g pepton,

7,0 natriumklorid, 2.x destillert vann q.s., for å få en tetthet på 5.10 bakterier pr. ml.

Samtidig blir de homologe fagene tilsatt til miljøet. Infeksjons-multiplisiteten er på 0,01.

Utviklingen av lyseringen blir fulgt ved hjelp av et cellulært telleapparat. Når det er igjen mindre enn 10 2 bakterier pr. ml, blir en filtrering over en membran med porestørrelse nær 0,22 pm utført. Lyseringsfiltratet utgjør selv det immunomodulerende preparat.

Farmakologisk studium:

Virkningene på dyr av preparater i henhold til oppfinnelsen er illustrert med preparat som svarer til et lyseringsfiltrat av Escherichia coli erholdt i henhold til metoden beskrevet i eksempel 1. Filtratet ble lyofilisert, så gjenoppløst i destillert vann. Konsentrasjonsfaktoren av denne nye løsning er ut-trykt i forhold til preparatet før lyofilisering.

Beskyttende virkning mot en akutt bakterieinfeksjon:

Denne testen som bringer for dagen en total stimulering av immunsystemet, er blitt utført med infiserende kimer forskjellig fra de som inngår i preparatet. Dette for å bevise at preparatet ikke er virksomt via en eventuell vaksinerende evne eller via et direkte bakteriofagisk fenomen, men virkelig via en stimulering av immunforsvaret.

To kimer er blitt testet, Klebsiella pneumoniae, en bakterie med intracellulær utvikling og av Staphylococcus aureus,

en bakterie méd ekstracellulær utvikling.

De infiserende bakterier ble administrert til grupper på 10 "Swiss" hunnmus, med en gjennomsnittsvekt på 18 g, på dag D^, via intraperitoneal vei i et volum på 0,5 ml.

Det immunomodulerende preparat ble injisert dagen før infeksjonen, påD_^/det dreier seg altså om undersøkelsen av en preventiv virkning. Preparatet ble administrert via intraperitoneal eller intravenøs vei, for å fjerne et eventuelt posi-tivt resultat forårsaket av en direkte interferens av preparatet med de infiserende kimer på injeksjonsstedet.

For å finne virulensen av den infiserende stamme, som kan variere innen betraktelige grenser fra et forsøk til et annet, ble dens letale dose 50 påvist for hvert av forsøkene. Den beskyttende aktivitet av preparatet mot en akutt bakterieinfeksjon er vist i tabell I nedenfor.

Stimulering av den fagocytære virkning av makrofager

Halperns test (C. Stiffel, 1958, J. Phys. 58, 911-949) består i å injisere mus via intravenøs vei med kolloidale kar-bonpartikler som blir fagocytert av de retikulo-endoteliadé, celler i leveren og milten hovedsakelig. Deres rensningshastig-het er representativ for den fagocytære aktivitet. Den blir målt ved å bestemme kvantitativt via fotometri i funksjon av tiden, partiklene som er forblitt frie i blodet. LPS, en lipo-polysakkarid-endotoksinekstrakt av enterobakterier og sterk ak-tivator av makrofager, ble anvendt som referansestoff.

Testen ble utført på følgende måte:

0,6 ml av et filtrat av Escherichia coli eller en løsning av LPS (lipopolysakkarider) på 0,625 ug/ml blir injisert til grupper på 5 "Swiss"-hunnmus, med en gjennomsnittsvekt på 24 g via intraperitoneal vei.

24 timer senere blir 0,12 ml av en suspensjon av kolloidalt karbon dosert til 32 mg/ml karbon i 4 % gelatin injisert til

mus via intravenøs vei.

En blodprøve på 20 i-il ble tatt fra sinus tetro-orbitale annethvert minutt i 12 minutter. Denne blodprøve blir øyeblik-kelig løst i 4 ml 1 % Na2C0^ Løsningen er altså fotometrisk.

Avlesningen av ekstinksjonen gjøres ved 620 nm. Konsentrasjonen av kolloidal karbon i blodet ved tid t

i forsøket fåes ved å referere seg til et standard-sted valgt på forhånd. Den fagocytære indeks regnes ut i henhold til føl-gende formel:

C2 og representerer henholdsvis blodkonsentrasjonen av kolloidal karbon i andre av første blodprøve, T2og representerer tiden for disse blodprøver.

Resultatene opptegnet i tabell II viser at virkningen av

de peritoneale makrofager hos mus blir stimulert etter en intraperitoneal administrering av preparatet.

^ Induserende virkning av serisk interferon ( serisk IFN)

IFN er et glykoprotein med molekylvekt mellom 10 000 og 20 000 dalton. Den har tallrike immunomodulerende virkninger,

spesielt stimulerer den virkningen av NK-celler (Natural Killer). Dens virkningsmåte er under studium. Dens deltagelse i det antivirale forsvar er riktignok påvist.

To timer etter en administrering av preparatet hos 8 "Swiss"-hunnmus på 25 gram, blir 0,3 ml blod samlet opp fra hver av dem på et rør uten heparin. Serisk IFN blir målt kvantitativt på en klassisk måte ved å måle den cytopatiske effekt av virus VSV (Vesikulært Stomatitis Virus) som infiserer murin L.-celler dyrket i 24 timer i nærvær av serumet som skulle testes.

(E.A. Havell og J.Vilcék, Antimicrob. Agents Chemotherapy, 2, 476-484, 1972). Den beskyttende virkning av det induserte IFN blir sammenlignet med den til det murineIFN, idet den interna-sjonale referanse kommer fra National Institute of Health, Bethesda, USA.

Preparatet induseres serisk IFN hos mus 2 timer etter dens intraperitoneale administrering, intravenøst eller oralt, som angitt i tabell III.

Virkningen hos menneske er blitt testet med et preparat i henhold til eksempel 3, administrert først til frivillige, så til syke.

Et dobbelt blindstudium utført med 15 frivillige pasienter har tillatt å bringe for dagen at den orale administrering av preparatet etter 10 dagers behandling medførte en betydelig for-økning av immunresponsen ved cellulær transmisjon.

Et annet studium utført på 25 pasienter har bevist at en enkelt oral administrering av forskjellige doser av preparatet etter 24 timer tillot å indusere et serisk lymfokin av type MIF-LIF. Denne indusering er avhengig av dosen.

Flere studier har tillatt å bringe for dagen stimulering av produksjon av IFN av humane lymfocytter og monocytter erholdt ved cytoferese og dyrket i speener.

IFN indusert av preparatet har kunnet karakteriseres ved å anvende antisera anti-IFN a, j3 eller y. Dets produksjon er avhengig av den anvendte dose.

Som eksempler er noen kliniske arbeider referert heretter.

Forebyggelse og behandling av kroniske eller recidiverende infeksjoner i respirasjonsveiene.

To grupper på 25 pasienter angrepet av kroniske eller recidiverende bakterieinfeksjoner på .bronko-pulmonært nivå ble behandlet oralt henholdsvis, den ene med 15 ml av det ovenfor nevnte preparat, 20 dager i måneden i 3 måneder, den andre med de klassiske antibiotiske behandlinger. Minkningen i antall akutte infeksiøse tilfeller i løpet av de seks måneder som for-søket varte, er betydelig større i gruppen behandlet med preparatet enn i gruppen behandlet klassisk med antibiotika.

Forebyggelse av post- operative infeksjoner:

En oral administrering på 20 ml av preparatet har på en betydelig måte tillatt å minke de infeksiøse post-operative komplikasjoner hos 106 pasienter sammenlignet med 72 andre syke behandlet på klassisk måte.

Forebyggelse og behandling av urinveisinfeksjoner: Fire forskere har på det kliniske plan studert preparatet ovenfor, hos en populasjon av pasienter angrepet av kronisk eller recidiverende urinveisinfeksjon. En oral administrering på 15 ml pr. dag, 20 dager i måneden i løpet av 3 måneder har på en betydelig måte tillatt å redusere frekvensen og varigheten av infeksiøse tilfeller og også forbruxet av anti-infeksiøse stoffer i løpet av de seks månedene av observasjonen sammenlignet med de seks månedene forut for behandlingen.

I alle forsøkene er toleransen av preparatet blitt utmerket vurdert av legen og pasienten (frivillig eller syk).

Claims (9)

1. Immunomodulerende medikament av biologisk opprinnelse, hvis aktive prinsipp består av lysisprodukter eller en fraksjon av disse produkter av lysert bakterie via bakteriofag, karakterisert ved at det som aktivt prinsipp inneholder lysisproduktene av minst to lyserte bakterier via homolog bakteriofag.

2. Immunomodulerende medikament i henhold til krav 1, karakterisert ved at det som aktivt prinsipp inneholder lysisproduktene via homolog bakteriofag fra bakteriene av slektene Klebsiella og Escherichia.

3. Immunomodulerende medikament i henhold til krav 2, karakterisert ved at de valgte bakterier er Klebsiella pneumoniae og Escherichia coli.

4. Medikament i henhold til krav 1, karakterisert ved at det dessuten inneholder et antibiotisk, anti-viralt, antisopp- eller antiparasittært stoff.

5. Medikament i henhold til krav 1, karakterisert ved at det dessuten inneholder et anti-tumoralt eller immuno-suppressivt stoff.

6. Medikament i henhold til krav 1, karakterisert ved at det dessuten inneholder et anti-mitotisk eller anti-inflammatorisk stoff.

7. Medikament i henhold til krav 1, karakterisert ved at det aktive prinsipp er assosiert med et bindemiddel tilpasset med henblikk på perkutan, transkutan, perlingual, topisk, enteral, parenteral eller luftsveis-administrering.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av medikamentet i henhold til krav 1, karakterisert ved at man foretar en første innpoding i et tilpasset kulturmiljø med et inokulum av bakterier av en bestemt slekt, i løpet av vekstfasen infiserer man bakteriene ved å tilsette deres homologe fager, man følger utviklingen av lysis til et fastsatt stadium, så foretar man en innpodning nummer to i kulturmiljøet med et inokulum av bakterier av en annen slekt,i løpet av vekstfasen av bakteriene av den andre slekt infiserer man disse bakterier ved å tilsette deres homologe fager, man følger utviklingen av lysis av disse bakterier av den annen stamme til et fastsatt stadium, til slutt eliminerer man de ikke-lyserte bakterier, man samler opp lyseringsfiltratet ut ifra de to bakterier.

9. Anvendelse av medikamentene i kurativ eller forebyggende terapi av bakterier, virale, sopp-eller parasitære infeksjoner; i antimitotisk eller anti-inflammatorisk terapi; i egenskap av adjuvans i immuno-suppressiv eller anti-cancerøs terapi.